CN116555068A - 一株内生铜绿假单胞菌hb-10及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物病害生物防治技术领域，涉及一株内生铜绿假单胞菌(Pseudomonas aer uginosa)HB‑10及其应用。本发明从健康药用菊花中分离筛选获得一株内生铜绿假单胞菌HB‑10，安全无毒性，该菌株于2022年11月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M20221828，保藏地址是湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学保藏中心。该菌株对小麦纹枯病菌和小麦全蚀病菌抑菌作用强，能够显著减轻小麦纹枯病和小麦全蚀病的发生；同时能对草莓炭疽病、番茄灰霉病、棉花枯萎病、苹果腐烂病、苹果轮纹病、水稻恶苗病、水稻弯孢霉叶斑病等作物生产的重要真菌病害均具有抑制作用，抑菌谱广，为植物真菌病害的生物防治提供了新的选择。
Description
技术领域
本发明属于植物病害生物防治技术领域，具体的一株内生铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)HB-10及其应用。
背景技术
植物生长发育的过程中或遭遇各种病虫害，常见的植物病害防治方法包括化学防治、物理防治、生物防治、抗病育种等。化学防治是控制植物病害的有效方法，具有见效快、杀菌谱广、成本低、使用简便等优点，但化学杀菌剂的长期大量使用会造成土壤、大气等环境污染、破坏生态平衡。物理防治和抗病育种的效率较低，时间长，很难达到快速控制病害的目的。生物防治因其对环境无污染、对人类和其他动物安全、产品无残留、对病原菌特异性强等优点得到世界各国的广泛重视并发挥越来越重要的作用。目前，细菌、放线菌、真菌等有益微生物及其代谢产物已成功应用于植物病害生物防治中，在有害生物综合治理中发挥了重要作用。
小麦是世界四大主食之一，也是我国的一种重要粮食作物。我国小麦分布地域广泛，大部分省份均有种植。目前我国每年小麦播种面积处于3至4亿亩之间，据国家统计局报告，2021年度我国小麦产量达13434万吨。然而小麦生长期间也会受到生物胁迫影响，各种病原菌的侵染都可能造成重大的产量损失。小麦纹枯病和小麦全蚀病是小麦生产中的常发病害，据农业部数据显示，我国小麦纹枯病和小麦全蚀病常年发病面积都达数千万亩，是小麦产区中非常严重的病害。
小麦纹枯病和小麦全蚀病为典型的土传病害，防治十分困难。目前，生产中以化学药剂防控为主，但杀菌剂利用带来残留引发环境的不安全，及可能增加病原菌抗药性风险的产生。并且由于小麦矮轩多穗品种的大面积种植和施肥量加大等原因，小麦纹枯病和小麦全蚀病在许多地区都有明显加大的趋势，已经严重威胁到我国小麦作物的健康生产和品质。
植物内生菌是指存在于植物各组织和器官内部，对植物无明显危害，与宿主植物稳定共生的生物菌群，通常具有促进植物生长，帮助植物抵御外界胁迫等作用，是植物微生态系统的重要组成部分。内生菌能够增强植物宿主对病原生物的抗性，这样就能够在很大程度上实现对宿主的保护，防止宿主受到危害和侵害。因此，筛选高效低毒、高选择性、对生态环境友好的微生物菌株，利用具有杀菌活性微生物，研制小麦生物药剂是解决目前小麦杀菌剂影响环境安全问题的有效方法。根据报道，目前对小麦纹枯病有一定防治作用的有蜡质芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌、土地类芽孢杆菌、木霉菌等。CN201810442369.6公开了一株萨拉曼卡假单胞菌能够防治水稻纹枯病、稻曲病、水稻恶苗病、小麦赤霉病、小麦纹枯病、小麦全蚀病、番茄灰霉病、草莓灰霉病、草莓炭疽病、葡萄溃疡病等病原菌都有强烈的抑制活性，且抗菌效果持久、稳定。CN202111430838.0公开了林芝假单胞菌2270，为假单胞菌属新菌种，对多种病原菌具有抑制作用，对小麦纹枯病的室内防效达到79.22％，还能水解有机磷、分解钾长石，产蛋白酶、铁载体、NH3，分泌IAA。然而，对于小麦纹枯病和小麦全蚀病有防治作用的铜绿假单胞菌尚未见报告。筛选更多有效的微生物菌对于小麦等农作物仍然具有积极的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中植物真菌病害防治的不足，提供一株内生铜绿假单胞菌HB-10。该HB-10菌株分离自健康药用菊花植株，对小麦纹枯病和小麦全蚀病等多种植物真菌病害病原菌具有显著的抑制作用。
本发明提供了一株铜绿假单胞菌HB-10，该菌株已于2022年11月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M20221828，保藏地址是湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学保藏中心。
本发明的菌株是从采集自安徽省阜阳市临泉县安农大新农院皖西北综合试验站健康药用菊花杭白菊植株样本，经分离纯化筛选获得。该菌株的16S rRNA的核苷酸序列长度为1422bp，经NCBI中BLAST比对，该菌株与铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa同源性为99％，根据16S rRNA序列构建的系统进化树，鉴定其为铜绿假单胞菌，命名Pseudomonasaeruginosa HB-10。
本发明的铜绿假单胞菌HB-10对小麦纹枯病和小麦全蚀病菌的菌丝生长有很强的抑菌作用，能够显著减轻小麦纹枯病和小麦全蚀病的症状发生；同时对番茄灰霉病菌Botrytis cinerea、棉花枯萎病病菌Fusarium oxysporium、苹果腐烂病病菌Valsa mali、苹果轮纹病病菌Physalospora piricola、水稻恶苗病病菌Fusarium moniliforme、水稻弯孢霉叶斑病病菌Curvularia lunata、玉米弯孢霉叶斑病病菌Curvularia clavata、玉米小斑病病菌Cochliobolus heterostrophus、油菜菌核病病菌Sclerotinia sclerotiorum、稻瘟病病菌Magnaporthe oryzae.、烟草赤星病病菌Alternaria alternata、玉米纹枯病病菌Rhizoctonia solani和烟草黑胫病病菌Phytophthora parasitica等病原菌也具有很强的抑制作用，抑制率在56.36～90.34％之间。
本发明还提供了铜绿假单胞菌HB-10在防治植物真菌病害方面的应用，尤其是在防治小麦、水稻、玉米、苹果、棉花、油菜和烟草真菌病害方面的应用。优选的，所述植物为小麦、水稻、玉米、苹果、棉花、油菜和烟草。优选的所述植物真菌为小麦纹枯病、小麦全蚀病、草莓炭疽病、番茄灰霉病、棉花枯萎病、苹果腐烂病、苹果轮纹病、水稻恶苗病、水稻弯孢霉叶斑病、玉米弯孢霉叶斑病、玉米小斑病、油菜菌核病、玉米纹枯病、稻瘟病、小麦全蚀病、烟草赤星病和烟草黑胫病病菌。
本发明还提供了提供铜绿假单胞菌HB-10在制备防治植物真菌病害生物制剂方面的应用。
本发明还提供了一种含有铜绿假单胞菌HB-10的生物制剂。优选地，所述生物制剂包含铜绿假单胞菌HB-10菌体和/或菌液。所述生物制剂也可以铜绿假单胞菌HB-10的代谢产物。可以将内生铜绿假单胞菌HB-10菌株接种于液体培养基中发酵培养以获得菌体、菌液、发酵产物。优选的，将铜绿假单胞菌HB-10接种于LB液体培养基中，28℃、180rpm条件下培养48h制备获得菌体或菌液或发酵产物。
本发明提供了一种利用含有铜绿假单胞菌HB-10的生物制剂防治植物真菌病害的方法，所述方法是将铜绿假单胞菌HB-10菌体、菌液或发酵产物施加于受试植物上以预防或控制植物真菌病害。优选地，所述植物为小麦、水稻、玉米、苹果、棉花、油菜和烟草。
作为一种具体的方法，一种利用含有铜绿假单胞菌HB-10的生物制剂防治植物真菌病害的方法，是将含有铜绿假单胞菌HB-10的生物制剂通过灌根的方式接种于植物以防治植物真菌病害。
有益效果
1.本发明的铜绿假单胞菌HB-10生物制剂抑菌谱广泛，对危害小麦生产中的小麦纹枯病菌和小麦全蚀病等多种重要的植物病原真菌均具有抑菌活性，是具有良好开发应用前景的广谱性微生物菌剂/菌肥，对小麦、水稻、玉米、苹果、棉花、油菜和烟草病害的绿色防控具有重要意义。
2.本发明铜绿假单胞菌HB-10生物制剂培养条件简单，繁殖速度快，易于保存和运输。
3.本发明铜绿假单胞菌HB-10，是从健康药用菊花植株内分离、纯化获得，其本身安全无毒性，对环境友好。
附图说明
图1：HB-10菌株A：菌落形态B：革兰氏染色
图2：HB-10菌株生理生化特性
图3：图1菌株HB-10的平板抑菌效果，其中A：小麦纹枯病菌对照组；BC：小麦纹枯病菌试验组D：小麦全蚀病菌对照组；EF：小麦全蚀病菌试验组。
图4:HB-10菌株基于16SrRNA的系统发育树。
图5：菌株HB-10与多种病原菌拮抗效果。
图6：HB-10菌株对小麦纹枯病盆栽试验的防治效果，其中A：对照组；B：HB-10菌株处理组。
图7：HB-10菌株对小麦全蚀病盆栽试验的防治效果，其中A：对照组；B：HB-10菌株处理组。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。本发明所述技术方案，如未特别说明均为本领域的常规方式，所述试剂或材料，如未特别说明，均为常规试剂，来源于商业渠道。实施例1内生铜绿假单胞菌HB-10的分离纯化、制备及对小麦纹枯病菌和小麦全蚀病的抑菌活性测定
1.1培养基配制
PDA培养基：马铃薯200.0g,葡萄糖20.0g,琼脂粉20.0g,蒸馏水1.0L,121℃灭菌20min；
LB培养基：酵母浸粉5.0g，胰蛋白胨10.0g,NaCl5.0g，蒸馏水1.0L，121℃灭菌20min；
NA培养基：牛肉粉3.0g,蛋白胨10.0g,氯化钠5.0g,琼脂粉20.0g，蒸馏水1.0L,PH7.2,121℃灭菌25min。
麦粒砂培养基:小麦1000mL，沙子500mL，葡萄糖20g；麦粒用水浸泡12h后煮沸1h，然后将小麦粒与沙子和葡萄糖混匀，121℃高压蒸汽灭菌1h。
1.2内生细菌HB-10的分离、纯化及制备
于安徽省阜阳市临泉县安农大新农院皖西北综合试验站选取健康药用菊花杭白菊带回实验室，采集杭白菊茎秆冲洗后剪成1cm左右小段，先经22.5％的次氯酸钠表面消毒5min，再用75％酒精浸泡3min，最后用无菌水漂洗5次。茎秆自然晾干放入研钵，加入5ml的无菌水研磨。研磨完毕后静置15min,以上清液为母液分别稀释10、100、1000倍，各取0.1ml稀释液涂布于LB固体培养基平板上，原液进行三区划线，各浓度3次重复。放入28℃恒温黑暗培养24h。根据菌落形态挑取单菌落进行纯化并计算每个培养皿菌落数。同时，将最后一次漂洗样品的无菌水取0.1ml做平板涂布对照，并重复3次，若平板没有菌落长出，则说明样品表面消毒彻底。挑取LB平板上的单菌落采用平板划线法在LB培养基平板上进一步纯化获得内生细菌菌株HB-10，保存待用。将筛选获得的拮抗菌HB-10菌株接种至NA培养基，培养48h后，菌落呈圆形，表面及边缘粗糙，呈黄绿色，并且菌落表面有金属光泽(图1中A)。HB-10菌株革兰氏染色结果表明，该菌体为革兰氏阴性菌株(图1中B)。
生理生化试验结果如图2表明，HB-10菌株对接触酶、明胶液化、氧化酶、麦芽糖、葡萄糖、山梨糖、半乳糖、山梨醇、甘露醇、甲基红、V-P试验、柠檬酸盐利用反应呈阳性。对淀粉水解、色氨酸脱氨酶、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、肌醇、吲哚反应呈阴性，综合对HB-10菌株的生长特性及形态特征观察，判断其为假单胞菌属菌株。
表1菌株HB-10生理生化特性Tab1 The physiological and biochemicalcharacteristics of strain HB-10
内生细菌菌株HB-10，经液体发酵制备获得其生物制剂，具体为：将内生细菌菌株HB-10于28℃、180r/min恒温摇床中培养36h后即获得其生物制剂菌液。
1.3内生细菌HB-10对小麦纹枯病菌的抑菌活性测定
供试靶标菌株：小麦纹枯病菌Rhizoctonia cerealis、小麦全蚀病Gaeumannomyces graminis，抑菌谱菌株：番茄灰霉病菌Botrytis cinerea、棉花枯萎病病菌Fusarium oxysporium、苹果腐烂病病菌Valsa mali、苹果轮纹病病菌Physalosporapiricola、水稻恶苗病病菌Fusarium moniliforme、水稻弯孢霉叶斑病病菌Curvularialunata、玉米弯孢霉叶斑病病菌Curvularia clavata、玉米小斑病病菌Cochliobolusheterostrophus、油菜菌核病病菌Sclerotinia sclerotiorum、稻瘟病病菌Magnaportheoryzae.、烟草赤星病病菌Alternaria alternata、玉米纹枯病病菌Rhizoctonia solani和烟草黑胫病病菌Phytophthora parasitica等病原菌由安徽农业大学植物保护学院提供。
以小麦纹枯病菌和小麦全蚀病菌为靶标，采用平板对峙法进行内生细菌HB-10抑菌活性的测定。
以小麦纹枯病菌和小麦全蚀病菌为靶标菌进行拮抗内生细菌的初筛。将病原菌接种于的PDA平板中央，在菌饼2.5cm处对称接种上述分离的菌株，以仅接种病原菌的平板为空白对照，在25℃恒温培养箱中倒置培养，待对照中的菌落长至超过2/3皿，观察并记录菌株对病原菌的抑菌效果。在对有抑菌效果的菌株进行复筛。将病原菌接种于PDA平板中央，在菌饼两边2.5cm处接种相同初筛菌株，以仅接种病原菌的平板为空白对照，在25℃恒温培养箱中倒置培养，待对照中的菌落长至超过2/3皿，用十字交叉法测定小麦纹枯病菌和小麦全蚀病菌的长度，计算内生细菌HB-10对小麦纹枯病菌的抑制率。
内生菌HB-10对小麦纹枯病菌和小麦全蚀病菌的抑菌效果如图3。结果表明，内生细菌HB-10对小麦纹枯病菌和小麦全蚀病菌的菌丝生长抑制作用强，抑制率分别为75.14％和91.71％。HB-10能够抑制靶标菌的菌丝生长。
实施例2内生细菌HB-10的分子鉴定
2.1培养基配制
培养基配制同实施例1中1.1。
2.2内生细菌HB-10的分子鉴定
提取HB-10菌株基因组DNA，并以其为模板，进行PCR扩增
引物序列：27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行16S rRNA扩增。
PCR扩增体系(25μL)：2×TaqMasterMix 12.5μL、上下游引物各1μL、DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。
PCR反应条件为：94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃60s，34个循环；72℃5min。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物送往上海擎科生物公司测序，将获得的基因序列拼接后在NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行同源性比较分析，下载同源性较高的菌种序列信息，利用MEGA7软件构建系统发育树如图4。
结果表明：内生细菌HB-10经PCR扩增获得的16S rRNA，经NCBI比对，与铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa的同源性最高，为99％。内生细菌HB-10鉴定为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa，命名为铜绿假单胞菌HB-10，该菌株已于2022年11月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M20221828，保藏地址是湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学保藏中心。
实施例3内生细菌HB-10抑菌谱测定
3.1培养基的配制
培养基配制同实施例1中1.1。
3.2供试菌株
抑菌谱供试菌株：番茄灰霉病菌Botrytis cinerea、棉花枯萎病病菌Fusariumoxysporium、苹果腐烂病病菌Valsa mali、苹果轮纹病病菌Physalospora piricola、水稻恶苗病病菌Fusarium moniliforme、水稻弯孢霉叶斑病病菌Curvularia lunata、玉米弯孢霉叶斑病病菌Curvularia clavata、玉米小斑病病菌Cochliobolus heterostrophus、油菜菌核病病菌Sclerotinia sclerotiorum、稻瘟病病菌Magnaporthe oryzae.、烟草赤星病病菌Alternaria alternata、玉米纹枯病病菌Rhizoctonia solani和烟草黑胫病病菌Phytophthora parasitica等病原菌由安徽农业大学植物保护学院提供。
3.3利用平板对峙法进行抑菌谱测定
方法同实施例1中1.3。
内生菌HB-10对草莓炭疽病、番茄灰霉病、棉花枯萎病、苹果腐烂病、苹果轮纹病、水稻恶苗病、水稻弯孢霉叶斑病、玉米弯孢霉叶斑病、玉米小斑病、油菜菌核病、玉米纹枯病、稻瘟病、烟草赤星病和烟草黑胫病病原菌的抑菌效果如图5。抑菌谱测定结果表明：内生细菌HB-10生物制剂不仅抑菌作用强，抑菌谱广泛，对上述14种供试病菌的菌丝生长的均有很强的抑制，与内生菌HB-10接触的14种病原真菌菌落边缘的菌丝生长稀疏或停止生长，如苹果腐烂病菌的菌丝生长完全被内生菌HB-10抑制，内生菌HB-10对上述植物病害的抑制率如表2
表2.HB-10菌株对多种病原真菌的抑制作用Table2.TheinhibitionofstrainHB-10onplantpathogenicfungi
注：同列不同字母表示差异显著性(P<0.05)
实施例4内生细菌HB-10的盆栽防效测定
4.1培养基配制
培养基配制同实施例1中1.1。
4.2内生细菌HB-10的盆栽防效测定
植物材料小麦品种：济麦22。
选择颗粒饱满的种子，用自来水冲洗干净，1％次氯酸钠溶液浸泡消毒10min，无菌水冲洗3～5次。小麦纹枯病菌和小麦全蚀病菌按常规方法培养、保存在PDA培养基上。并接种于PDA平板上25℃培养7d，将长满纹枯菌的PDA培养基划成碎片放入麦粒沙培养基中并轻轻摇动使碎片埋于谷粒中间至于25℃培养箱中培养4-5d后每天摇动三角瓶以利于菌丝生长20d后备用。将培养好的病原菌与灭菌沙土按合适比例混匀。内生细菌采用土壤浇灌法，具体方法如下：将在麦粒沙培养基上培养好的病原菌和灭菌沙按1:10的比例混匀。将催芽后的小麦种子播种于直径为7cm的花盆中，每盆播种10颗，每处理五个重复。温室培养20天后，接种小麦纹枯病菌20d后根据下列的方法调查小麦纹枯病级并计算出病情指数及防治效果。
0-整个小麦植株正常；
1-小麦植株茎基部的叶鞘出现典型的小麦纹枯病病斑但是并没有侵染到小麦的茎秆；
3-病原菌侵入小麦茎秆，但是病斑的宽度环茎方向不超过整个小麦茎秆周长的1/2；
5-病原菌侵入茎秆，但是环绕茎秆扩展的病斑的宽度占整个小麦植株茎秆周长的1/2-3/4；7-病原菌已经侵入到小麦的茎秆，但是病斑环绕小麦茎秆的宽度为整个小麦植株茎秆周长的3/4以上，或者表现为茎秆已经出现明显的软腐状态；
9-小麦表现为枯孕穗和枯白穗。
盆栽试验中HB-10菌株对小麦纹枯病的生防效果如图6，盆栽试验结果表明，病原菌处理对照组的小麦叶鞘部有云纹状褐色花纹，根系及茎基部严重变黑腐烂，根系不发达，发病严重，内生细菌HB-10预处理而后拌土接种小麦纹枯病的处理组的小麦植株生长良好，发病株数和程度远远小于对照组，相对防效为69.42％。
接种小麦全蚀病菌20d后根据下列的方法调查小麦全蚀病级并计算出病情指数及防治效果。
1级：受害根变褐色面积占总面积1/2以下；
2级：受害根变褐色面积占总面积1/2以上，但是没有黑斑；
3级：受害根变褐色面积占总面积1/2以上，并且根有小段变黑，变黑部分占总面积1/4以下；4级：受害根变褐色面积占总面积1/2以上，并且根有小段变黑，变黑部分占总面积在1/4-1/2之间；
5级：受害根变褐色面积占总面积1/2以上，并且根有小段变黑，变黑部分占总面积的1/4-1/2，但根没有全部变黑；
6级：根全部变黑，但植株并未死亡；
7级：根腐烂，植株死亡。
盆栽试验中HB-10菌株对小麦全蚀病的生防效果如图7，盆栽试验结果表明，病原菌处理对照组的小麦叶近地面茎秆变黑，根系及茎基部严重变黑腐烂，发病严重，内生细菌HB-10预处理而后拌土接种小麦全蚀病菌的处理组的小麦植株生长良好，发病株数和程度远远小于对照组，相对防效为72.14％。
以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。
Claims (10)
1.一株内生铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)HB-10，其特征在于，已于2022年11月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M20221828，保藏地址是湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学保藏中心。
2.权利要求1所述的内生铜绿假单胞菌HB-10在防治植物真菌病害方面的应用。
3.权利要求1所述的内生铜绿假单胞菌HB-10在制备防治植物真菌病害生物制剂中的应用。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述植物真菌病害为小麦、水稻、玉米、苹果、棉花、油菜和烟草真菌病害。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物真菌为小麦纹枯病、小麦全蚀病、草莓炭疽病、番茄灰霉病、棉花枯萎病、苹果腐烂病、苹果轮纹病、水稻恶苗病、水稻弯孢霉叶斑病、玉米弯孢霉叶斑病、玉米小斑病、油菜菌核病、玉米纹枯病、稻瘟病、烟草赤星病和烟草黑胫病。
6.一种生物制剂，其特征在于，所述生物制剂中含有权利要求1所述内生铜绿假单胞菌HB-10。
7.根据权利要求6所述的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂包含内生铜绿假单胞菌HB-10菌体和/或菌液。
8.一种利用权利要求6所述生物制剂防治植物真菌病害的方法，其特征在于，给受试植物施加含内生铜绿假单胞菌HB-10的生物制剂以预防或控制植物真菌病害。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述生物制剂中含内生铜绿假单胞菌HB-10的菌体和/或菌液。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述植物为小麦、水稻、玉米、苹果、棉花、油菜和烟草。
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