CN114381391A - 一株铜绿假单胞菌及其在抑制黄瓜土传病害中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物农药技术领域，提供了一株铜绿假单胞菌及其在抑制黄瓜土传病害中的应用。所述铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的菌株号为ZM‑1，于2021年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23987。本发明所述铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），对病原菌展现出了显著拮抗作用，为黄瓜土传病害的生物防治提供高效菌株资源。铜绿假单胞菌ZM‑1可产生铁载体、纤维素酶和蛋白酶，铁载体可以通过减少根际微生物区系中可用的铁离子数量来抑制病原菌的生长。

Description

一株铜绿假单胞菌及其在抑制黄瓜土传病害中的应用
技术领域
本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一株铜绿假单胞菌及其在抑制黄瓜土传病害中的应用。
背景技术
黄瓜广泛分布于世界各地，是主要的设施蔬菜产品之一。黄瓜土传病害是黄瓜生产中所需面临的主要问题之一，此类病害在土壤中传播，病原菌随病残体生活在土壤中，当条件适宜时从植株根部或茎部侵染植株发病。并且黄瓜土传病害在防治上有许多苦难，田间一旦出现，病原菌会在土壤中连年累积，导致发病越发严重。
黄瓜常见土传病害有黄瓜立枯病、黄瓜枯萎病、黄瓜猝倒病、黄瓜疫病等，黄瓜枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌黄瓜专化型，主要由厚壁孢子和菌丝体随病残体在土壤中越冬。该致病菌具有致病力强、分布广的特点，不仅可以在寄主植物中生存，而且在空气和土壤中也能生存。黄瓜疫病的病原体是德氏疫霉。病原菌以菌丝体、厚壁孢子和卵孢子的形式在土壤或粪便中越冬。它主要通过雨水和灌溉水传播，也可以通过施肥和农业活动传播。当环境条件合适时，从伤口或自然气孔侵入植物引起发病。发病后通过气流、雨水和灌溉水传播并反复侵染，病害循环1次仅需20-25小时。保护地黄瓜种植的肥水管理不规范、以及连作重茬栽培是引起土传病害发生的重要因素，并且致病数量逐年增多，病害日益严重。
目前还没有研究发现黄瓜土传病害的特效防治方法，但随着研究的进展也不断开发出了有效的防治措施和防治因子，为黄瓜土传病害的防治提供了许多新的思路。目前黄瓜土传病害的防治措施主要以化学防治为主，农业防治以及生物防治等措施为辅的综合防控措施。
农业防治可以通过选用抗病品种，与非瓜类作物实行4年以上轮作，以及采用云南黑籽南瓜作砧木进行嫁接等方式进行防治，加强田间水肥管理，注意田间温湿度也是防治过程中重要一环。
目前用于防治黄瓜土传病害的生防微生物有很多，如芽孢杆菌属（Bacillus）、黄杆菌属（Xanthomonas）、木霉属（Trichoderma）、假单胞菌属（Pseudomonas）、放线菌（Actinomycetes）等。生防微生物种类的增加，为黄瓜土传病害的防治提供了更多的选择和资源，例如：文献《木霉分生孢子和厚垣孢子对黄瓜叶片抗氧化系统及枯萎病防效的影响》（廉华,马光恕,靳亚忠,李梅,张帆.[J].干旱地区农业研究,2021,39(04):71-79.），该文献中测定了3株木霉菌对黄瓜枯萎病的盆栽防效，其中拟康氏木霉菌对黄瓜枯萎病的防效达到了81.46%。并且3株木霉菌均能提高黄瓜保护酶活性，改善黄瓜幼苗叶片抗氧化能力，提高对黄瓜枯萎病的防治效果。
文献《解淀粉芽孢杆菌JF-1对黄瓜的防病促生作用》（张德珍,李婷婷,代惠洁,迟文娟,乔宁. [J].北方园艺,2020(10):16-21.），该文献中公开了：解淀粉芽孢杆菌可以明显降低黄瓜枯萎病的发病率和病情指数,防效可达到75.15%,其发酵液稀释500倍后对种子进行处理，可提高黄瓜种子的活力指数，增加黄瓜幼苗的侧根数、叶面积和叶片绿色度。文献《黄瓜疫病菌拮抗细菌的分离及鉴定》（伍善东,刘冬华,郭照辉,单世平. [J].安徽农业科学,2014,42(20):6692-6693.），该文献中公开了：从土壤中筛选出一株枯草芽孢杆菌，该拮抗菌对黄瓜疫病致病菌的抑制率为81.2%，具有很好的开发前景。文献《黄瓜疫霉菌拮抗菌的筛选及鉴定》（周珍,向阳,解娜,易图永. [J].湖南农业科学,2015(06):31-34.），该文献中公开了从作物根际土壤中筛选出多株对黄瓜疫病病原菌具有较好拮抗作用的放线菌，其中一株菌其5倍发酵稀释液对黄瓜疫霉的抑制率仍然可以达到70.00%以上，并初步将其鉴定为绛红褐链霉菌(Streptomyces purpeofuscus)。
文献《复合菌剂PB12防治黄瓜疫病效果评价以及对土壤酶活性的影响》（葛红莲,张福丽,刘志华. [J].中国生物防治学报,2015,31(02):229-235.），该文献公开了：制备的复合菌剂在温室环境下对黄瓜疫病防效可达 70.00%以上。并且提高了黄瓜过氧化物酶活性，促进了黄瓜幼苗的生长。大田试验结果表明，复合菌剂对黄瓜疫病防治效果为 68.8%，使黄瓜增产 38.1%。随着植物病害生物防治的推广应用，越来越多的生防菌剂以及微生物有机肥产品问世，这将为黄瓜土传病害的绿色防控以及黄瓜有机生产提供保障。
铜绿假单胞菌作为生防菌株的应用可以追溯到1987年比利时的Verstraete团队首次从大麦根际分离到的铜绿假单胞菌7NSK2,该菌株发酵液处理种子和土壤后, 可以明显促进作物的生长, 并改善作物根际菌群结构。此后越来越多的根际来源的铜绿假单胞菌生防菌株被分离和鉴定出来，
文献《A Biocontrol Strain of Pseudomonas aeruginosa CQ-40 PromoteGrowth and Control Botrytis cinerea in Tomato 》（Wang Xingyuan,Zhou Xinan,CaiZhibo,Guo Lan,Chen Xiuling,Chen Xu,Liu Jiayin,Feng Mingfang,Qiu Youwen,ZhangYao,Wang Aoxue. [J]. Pathogens,2020），该文献中公开了：从番茄根际土壤中分离筛选出一株拮抗菌。经鉴定该菌为铜绿假单胞菌，施用后可显著提高番茄幼苗的株高、茎粗和鲜重等指标，离体和盆栽试验表明，菌株能有效防治番茄灰霉病，对番茄叶片和果实的防治效果达74.4%和66%。
铜绿假单胞菌生防菌株显著的抗菌活性主要得益于其丰富的次生代谢产物。 目前报道的抗菌代谢物主要包括吩嗪类、铁载体、胞外多糖、藤黄菌素和抗生素等多种代谢物。
文献《铜绿假单胞菌ZJ1999对水稻纹枯病的防治及其在水稻上的定殖》（任小平,谢关林,王笑. [J].中国生物防治,2006(01):54-57.），该文献中利用铜绿假单胞菌的粗提液防治水稻纹枯病，取得了良好的防治效果，其抑菌活性随着提取液浓度的增加和处理时间的延长而增强。文献《Mechanisms of plant growth promotion and diseasesuppression by Pseudomonas aeruginosa strain 2apa 》（P. Hariprasad,S.Chandrashekar,S. Brijesh Singh,S. R. Niranjana. [J]. Journal of BasicMicrobiology,2014），该文献中：从番茄根际分离出一株铜绿假单胞菌2apa，该菌株可产生吲哚乙酸（IAA）、水杨酸和铁载体等促生抑菌物质，抑制多种病原微生物的生长。经进一步纯化和结构鉴定，该菌株产生的抗菌物质为吩嗪。菌株2apa对叶部病害的防治作用的是通过诱导植物产生系统抗性，并通过增强酚类物质的积累、诱导脂氧合酶活性和茉莉酸水平来增强植株的抗病能力。
文献《Maximization of Siderophores Production from Biocontrol Agents,Pseudomonas aeruginosa F2 and Pseudomonas fluorescens JY3 Using Batch andExponential Fed-Batch Fermentation 》（Gaber Attia Abo-Zaid,Nadia Abdel-MohsenSoliman,Ahmed Salah Abdullah,Ebaa Ebrahim El-Sharouny,Saleh Mohamed Matar,Soraya Abdel-Fattah Sabry. [J]. Processes,2020），该文献中通过发酵优化增加了铜绿假单胞菌和荧光假单胞菌发酵液中铁载体含量，从而增加了菌株对尖孢镰刀菌的抑制能力。铜绿假单胞菌代谢产物是其作为生防菌株研究的主要方向，通过对其代谢产物的发酵培养，生产含有主要抑菌物质的防治剂，可解决防止过程中生防菌株存活时间短的问题，从而达到稳定的防治效果。
在黄瓜种植过程中，连作障碍和土传病害一直是降低黄瓜产量和品质的主要问题，在造成了大量的经济损失的同时也影响了农业环境。栽培措施的不完善，化肥的常年施用以及农药的不合理使用都是导致土传病害发生严重的主要原因，并且传统的化学防治措施和农业防控措施通常会带来环境污染问题和食品安全等问题，因此对于连作障碍和土传病害的治理受到了多种因素的制约。因此黄瓜土传病害生物防治手段日益受到人们重视，微生物有机肥因其绿色环保、肥药双效、改善土壤等特点成为了防治黄瓜土传病害的新方向，通过施用微生物有机肥可以长效增强土壤肥力，改良土壤环境及理化性质，减轻土传病害的发生，为植物病害的防治以及土壤生态环境的改善提供新思路。
发明内容
本发明为了克服现有技术中存在的问题，提供了一株铜绿假单胞菌及其在抑制黄瓜土传病害中的应用。
本发明由如下技术方案实现的：一株铜绿假单胞菌，所述铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的菌株号为ZM-1，于2021年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23987。
制备所述的铜绿假单胞菌的发酵液的方法，包括以下步骤：
（1）种子液的制备：活化后的菌株ZM-1单菌落接入LB 液体培养基中，37℃，200 r/min振荡培养24h，稀释涂布平板法测定菌液菌含量，用无菌水将菌液浓度重悬到1×108作为种子液备用；
（2）发酵液的制备：LB液体培养基作为菌株ZM-1发酵的基础培养基，然后以蔗糖作为发酵培养的碳源、胰蛋白胨作为发酵培养的氮源、K2HPO4作为发酵培养的无机盐，培养基配方为：LB液体培养基为基础培养基，加入胰蛋白胨10g/L、蔗糖5 g/L、K2HPO410g/L，控制发酵温度为25℃，pH值为7.5，发酵时间为48h，接种量2%。
所述的铜绿假单胞菌在抑制黄瓜土传病害中的应用。
所述铜绿假单胞菌发酵液的无菌滤液在抑制黄瓜枯萎病菌（Fusarium ox- ysporum.sp.cucumebrium Owen）、黄瓜疫病病菌（Phytophthora drechsleri Tucker）中的应用。
所述的铜绿假单胞菌在抑制西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. niveum(E.F.Smith) Snyder et Hansen）中的应用。
本发明从水稻、黄瓜、芝麻等作物根际土壤中稀释分离，采用平板对峙法筛选出对黄瓜枯萎病、西瓜枯萎病和黄瓜疫病致病菌具有显著拮抗作用的菌株ZM-1，从芝麻根际土壤中分离出，鉴定为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），对病原菌展现出了显著拮抗作用，为黄瓜土传病害的生物防治提供高效菌株资源。铜绿假单胞菌ZM-1可产生铁载体、纤维素酶和蛋白酶，铁载体可以通过减少根际微生物区系中可用的铁离子数量来抑制病原菌的生长。
附图说明
图1为拮抗菌的初筛结果，图中：a为菌株YM-7和YM-15；图b为菌株HG-64；图c为菌株ZM-1和HG-35；
图2为拮抗菌ZM-1对三种病原菌的拮抗作用，图中：由左到右依次为黄瓜枯萎病病原菌、黄瓜疫病病原菌、西瓜枯萎病病原菌；
图3为无菌滤液和挥发性气体对病原菌的抑制作用；图中：a为黄瓜疫病；b为黄瓜枯萎病；c为西瓜枯萎病；
图4为拮抗菌产抑菌促生物质能力；图中：A氨生产；B淀粉酶；C磷酸盐增溶；D纤维素酶；E淀粉酶；F果胶酶；G铁载体；
图5为菌株ZM-1平板单菌落形态，图中右图放大倍数为10倍；
图6为菌株ZM-1多基因扩增电泳结果图；图中标注为各泳道扩增片段所用的引物名称；
图7为菌株ZM-1系统发育树；
图8为菌株ZM-1生长曲线；
图9为基础培养基筛选结果；
图10为菌株碳源筛选结果；
图11为菌株氮源筛选结果；
图12为菌株无机盐的筛选结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一、菌株筛选
1、材料
土壤样品：2020年9月在天津市静海区、西青区和宝坻区温室大棚以及河北省廊坊市、河南省开封市露地采集健康作物根际土壤样品15份，并自然晾干、低温保存。分离出的菌株命名采用作物名称首字母缩写与数字组合命名。具体采集情况如表1所示。
表1：采集土壤样品情况
Figure 461392DEST_PATH_IMAGE002
供试菌株：黄瓜枯萎病菌（Fusarium ox-ysporum.sp.cucumebrium Owen）、黄瓜疫病病菌（Phytophthora drechsleri Tucker）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. niveum (E.F.Smith) Snyder et Hansen）均由天津农学院植物保护实验室提供。
培养基：PDA培养基；LB培养基。
纤维素酶检测培养基：K2HPO4 1.00g，MgSO4·7H2O 0.25g，酵母粉2.00g，琼脂糖1.50g，羧甲基纤维素（CMC）2.00g，蒸馏水100mL。
淀粉酶检测培养基：可溶性淀粉2.00g，蛋白胨0.50g，NaCl 0.50g，琼脂粉2.00g，蒸馏水100mL，pH值7.0。果胶酶检测培养基：果胶2g、(NH4)2SO4 1.00g、MgSO4 0.50g、KH2PO40.50g,琼脂粉2.00g，蒸馏水100mL。
蛋白酶检测培养基：脱脂牛奶1.00g，牛肉膏0.30g，蛋白胨1.00g，NaCl 0.50g，蒸馏水100mL。
铁载体检测培养基：CAS检测培养基购于青岛海博生物技术有限公司。
乙酰胺培养基：购于青岛海博生物技术有限公司。
2、拮抗菌的筛选
A、土壤中拮抗菌分离纯化：采用稀释土壤法分离根际土壤中的细菌，取10g土壤样品放入装有100mL无菌水的250mL锥形瓶中，放入摇床200r/min培养1h，静置后，取100μL上清液逐级稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，取10-4、10-5、10-6这三个浓度梯度的土壤稀释液100μL涂布到LB培养基平板上，每个浓度设置3个重复。再对菌落形态不一样的菌株进行转接纯化，-20℃冰箱冷冻保存。
B、拮抗菌的初筛：采用平板对峙法，以黄瓜枯萎病菌为指示菌，于 PDA 培养基中心接种黄瓜枯萎病病原菌菌饼（直径5mm），在距菌饼四周2cm处的4个点接种纯化后的拮抗菌，以无菌水作为对照，置于28 ℃恒温箱培养7d，查看抑菌效果。
从土壤样品中总共分离出细菌256株，其中天津等地土壤样品中分离出细菌137株，河南土壤样品中分离出63株，河北土壤样品中分离出56株。这些菌株对指示菌黄瓜枯萎病菌具有一定抑制作用的菌株共有21株。其中抑菌带宽为1-2mm的菌株为5株，抑菌带宽为2-4mm的菌株共11株，抑菌带宽为4-6mm的菌株共3株（HG-64、YM-7、YM-15），抑菌带宽为6-8mm的菌株共 2株（ZM-1、HG-35），后续试验主要对抑菌带在4mm以上的这5株拮抗菌进行复筛，挑选出对致病菌拮抗效果最好的菌株。5株菌来源土壤如表2所示。
表2：5株菌来源土壤
Figure DEST_PATH_IMAGE003
C、拮抗菌的复筛：以黄瓜枯萎病、黄瓜疫病和西瓜枯萎病3种病原菌为指示菌，对上一步选择的拮抗作用较强的5个菌株进行重新筛选，测定抑菌圈直径，计算菌丝生长抑制率。抑制率(%)=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/对照组菌落直径×100%。
以黄瓜枯萎病菌、黄瓜疫病病菌和西瓜枯萎病菌为指示菌进行复筛的结果如表3、图2所示，结果表明，拮抗菌ZM-1对3种病原菌都有较强的抑制作用，对黄瓜疫病致病菌的抑菌率最高达到65.88%，对黄瓜枯萎病和西瓜枯萎病的抑制率分别为60.49%和64.36%。其次为拮抗菌HG-35，该菌对三种病原菌的抑制率分别为50.62%、51.76%和57.47%，略低于菌株ZM-1。结合拮抗菌初筛和复筛的结果来看，菌株ZM-1抑菌能力最强。
表3：拮抗菌的复筛结果
Figure 316215DEST_PATH_IMAGE004
Figure DEST_PATH_IMAGE005
3、菌株抑菌能力测定
A、菌株ZM-1挥发性气体对病原菌的抑制作用：将活化后的拮抗菌ZM-1菌液接种在LB固体平板培养基上，37℃培养24小时，然后将接种了致病菌的PDA培养基倒扣在接种了拮抗菌的LB固体平板上，并用封口膜将两个培养基密封，同样用不接种拮抗菌的平板作为对照。放入28℃培养箱中7d后观察气体对病原菌的抑制作用计算菌株抑菌率。
无菌滤液和挥发性气体对病原菌的抑制作用如图3、表4所示，由图3可知，菌株ZM-1的无菌滤液与其产生的挥发性气体均会对3种致病菌产生抑制作用，与对照相比其中无菌滤液对三种致病菌的抑制率为50.00%、47.50%、45.00%，但菌株的挥发性气体对病原菌的抑制能力较弱，对西瓜枯萎病和黄瓜枯萎病的抑制率仅为20%左右，对黄瓜疫病抑制率最高也仅为47.50%。三种病原菌中菌株ZM-1对黄瓜疫病抑制效果最好，无菌滤液与挥发性气体均有不错的抑制效果。
B、菌株无菌滤液对病原菌的抑制作用：将筛选出的拮抗菌ZM-1接种于LB液体培养基中，30℃、200r/min摇床培养48h。将培养的发酵液放入离心机中，10000r/min离心20分钟。离心后吸取取上清液，用0.22μm一次性微孔膜过滤，制成无菌滤液后放入4℃冰箱保存备用。
将无菌滤液按照10%的比例加入到融化后的PDA培养基中，注意培养基温度不宜过高，以防次生代谢物质不耐高温失活。将病原菌接种至PDA培养基中央，28℃培养箱中培养7d，进行3 次重复，以加入无菌水的PDA培养基为对照，计算抑菌率。结果如表2所示。
表4：拮抗菌ZM-1对三种病原菌的抑菌能力测定
Figure 33635DEST_PATH_IMAGE006
4、菌株抑菌物质测定
A、产纤维素酶能力检测：将菌株ZM-1接种于纤维素酶检测培养基，放入35℃培养箱中培养72h，待菌落长出后，在培养基表面中加入0.1%刚果红染液进行染色，染色静置1h后，倾去刚果红，用适量的1mol/L的氯化钠溶液反复清洗，观察是否有水解圈产生。
B、产淀粉酶能力检测：将菌株ZM-1接种于淀粉酶检测培养基，放入35℃培养箱中培养48h，观察生长状况，用1%革兰氏碘液进行染色，观察是否产生透明圈。
C、产果胶酶能力检测：将菌株ZM-1接种于果胶酶检测培养基，放入35℃培养箱中培养72h，挑选长势良好的菌株，用0.1%的刚果红染液染色，再用1mol/L的氯化钠溶液反复冲洗，观察水解圈的产生。
E、产铁载体能力检测：将菌株ZM-1接种于CAS检测培养基，放入35℃培养箱中培养24h，观察菌落周围是否有黄色晕圈产生。
F、产蛋白酶能力检测：将菌株ZM-1接种于蛋白酶检测培养基,置于35℃培养箱培养48h。观察菌落周围是否产生透明圈。
G、菌株促生物质测定：使用PKV琼脂培养基检测菌株磷酸盐溶解活性（KumarTarun,Kang Sun Chul,Maheshwari Dinesh Kumar. Nematicidal Activity of SomeFluorescent Pseudomonads on Cyst Forming Nematode, Heterodera cajani andGrowth of Sesamum indicum var. RT1[J]. Journal of Applied BiologicalChemistry,2005）。检测氨生产试验使用乙酰胺培养基与钠氏试剂，将菌株接种于灭菌后的乙酰胺培养基中培养48h，培养完成后接入1-2滴钠氏试剂，观察是否有颜色变化。
检测结果见表5，图4，实验结果显示，在抑菌物质方面，菌株具有产纤维素酶、蛋白酶、铁载体的能力，但不能产生果胶酶和淀粉酶，由图可以看出，菌株产纤维素酶能力较弱，但产铁载体、蛋白酶能力较强。菌株在促生物质方面可以产生氨并溶解磷酸盐。
表5：拮抗菌产生抑菌促生物质能力测定
Figure DEST_PATH_IMAGE007
注：“﹢”表示阳性反应，“﹣”表示阴性反应。
二、拮抗菌的鉴定
1、菌株的形态学观察测定：根据《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠和蔡妙英2001）观察菌落的大小、颜色、形态及湿润度等，并进行生理生化试验分析。
对菌株ZM-1的单菌落进行观察可以发现，菌株ZM-1平板单菌落形态如图5所示，该菌株菌落平坦湿润，边缘不规则，呈灰绿色。生理生化结果见表6所示，结果显示，菌株ZM-1为革兰氏阴性菌，氧化酶、柠檬酸盐、明胶液化、硝酸盐和N2反应为阳性，V-P试验、甲基红和接触酶试验反应为阴性。
表6：菌株生理生化试验结果
Figure 865063DEST_PATH_IMAGE008
注：“﹢”表示阳性反应，“﹣”表示阴性反应。
2、菌株DNA提取：采用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒提取该菌株DNA。
菌株ZM-1多基因扩增及序列分析：选取细菌通用16SrDNA基因以及管家基因（atpD基因、gapA基因、rpoA基因），设计引物进行PCR扩增，将 PCR 产物送至华大基因公司测序，对测序结果进行整理，然后将各基因测序结果使用DNAman软件按顺序进行拼接，在NCBI官网上进行BLAST比对后，下载相关序列用MEGA软件进行序列分析，构建系统发育树，分析其亲缘关系。
反应体系为：H2O 9.5ul；Taq Master mix 12.5ul；Primer1 1ul；Primer2 1ul；DNA 1ul；总体积25ul。反应程序如表7所示。菌株分子鉴定各基因引物序列如表8所示。
表7：PCR扩增反应程序
Figure DEST_PATH_IMAGE009
表8：菌株分子鉴定各基因引物序列
Figure DEST_PATH_IMAGE011
菌株ZM-1多基因扩增及序列分析：将多基因PCR 产物送至华大基因公司测序，测序结果按顺序拼接，在NCBI官网上进行BLAST比对后，发现比对结果均为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），然后用MEGA软件进行序列分析，构建系统发育树，分析其亲缘关系。菌株ZM-1多基因扩增电泳结果如图6所示，菌株ZM-1系统发育树如图7所示；系统发育树结果显示，该菌株ZM-1与假单胞菌属（Pseudomonas）的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）聚于同一分支。当单独使用16SrDNA引物进行扩增时，通过Blast比对结果发现菌株为假单胞菌属（Pseudomonas），但是不能准确鉴定到种的级别，所以挑选了三个该菌株的管家基因，将管家基因与16SrDNA扩增序列拼接起来，在NCBI官网上进行BLAST比对，比对结果均为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），并且同源性均达到100%，再参考菌落形态与生理生化试验结果，综合以上多种因素鉴定该菌株为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。
植物根际土壤中存在着大量对植物生长有促进作用且对病原菌具有拮抗作用的有益微生物，这些微生物统称为PGPR（植物根际促生菌）。假单胞菌属(Pseudomonas)细菌是植物根际促生菌的主要种类之一，其中荧光假单胞菌( Pseudomonas fluorescens) 在许多植物的根际都是优势菌株，比例可达60%以上，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，原称绿脓杆菌，在自然界中分布广泛，是土壤中存在的最常见的细菌之一。铜绿假单胞菌也是动物和人类的条件性致病菌，通常会引起肺部及尿道感染，或造成烧伤、伤口等感染。
自从铜绿假单胞菌生防菌株被发现，其作为生防菌株资源得到了广泛应用。文献《西瓜枯萎菌拮抗细菌的筛选、鉴定及防效测定》（岳菊,刘邮洲,张荣胜,刘永锋,王治林,陈志谊. [J].中国生物防治学报,2011,27(03):428-432.），该文献中公开了：从作物根际分离出一株铜绿假单胞菌PL-82，该菌对西瓜枯萎病病原菌和辣椒疫霉菌生长抑制率分别为55.3%和60.5%，与本试验中对致病菌抑制率相近。
文献《In vitro study of biocontrol potential of rhizosphericPseudomonas aeruginosa against Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum》（Md.Ariful Islam,Zulkar Nain,Md. Khasrul Alam,Nilufa Akhter Banu,Md. RezuanulIslam. [J]. Egyptian Journal of Biological Pest Control,2018），从作物根际土壤中分离出的铜绿假单胞菌对黄瓜枯萎病有较强拮抗活性，该菌株能够产生多种拮抗化合物，例如铁载体和VOCs，并且表现出较好的促生潜力。
铜绿假单胞菌生防菌株的显著抑菌活性引起了研究者们极大的关注。其次生代谢产物种类丰富，随着研究的深入，菌株一系列的抑菌次生代谢产物被分离和鉴定。目前报道的抑菌代谢产物主要有嗜铁素类、吩嗪类、藤黄绿脓菌素类、胞外多糖类以及抗生素等，其中以吩嗪−1−羧酸（PCA）作为主要成分的申嗪霉素（shenqinmycin）是我国上海交通大学开发的微生物源农用杀菌剂，可有效防治水稻纹枯病、西瓜枯萎病和甜椒疫病等多种作物病害。
本发明分离筛选出的铜绿假单胞菌ZM-1可产生铁载体、纤维素酶和蛋白酶，铁载体可以通过减少根际微生物区系中可用的铁离子数量来抑制病原菌的生长。也有研究人员指出，铜绿假单胞菌的抗生素产生及其拮抗活性可能是由于铁载体的产生。该菌株也具有较强的产蛋白酶能力，可以通过分解细胞壁中的蛋白物质从而达到抑制病原菌生长的效果。菌株产生的纤维素酶可以作用于致病菌的细胞壁，降解病原真菌细胞壁，失活或钝化病原菌的胞外酶，抑制病菌生长并引起菌丝体畸变，从而达到控制植物病害的目的，并且菌株可以产生氨和溶解难溶的磷酸盐，磷是农作物生长和增产所需的关键矿质营养素之一，溶磷菌通过分泌有机酸或酶来溶解自然界中的矿物磷酸盐转化为植物可以利用的形态，而菌株产生的氨，可以为作物生长补充N元素，促进作物生长。
16S rDNA 序列分析在细菌的鉴定和系统分类研究中早已广泛应用，但16Sr DNA基因序列在对于近缘种的鉴定上存在着弊端，16S rDNA 基因序列分析只能鉴定到属这一级别并不能精准鉴定细菌的种名。
本发明在进行16SrDNA基因鉴定的同时，再挑选一些管家基因，将多基因扩增结果拼接后再进行序列分析，并结合形态学、生理生化特性，就可以得到更加可靠、精确的鉴定结果。本发明筛选出的对黄瓜土传病害具有较好防治效果的拮抗菌ZM-1，通过 16S rDNA、gapA、rpoA和atpD四基因联合建树，以及形态学观察、生理生化分析，准确地将其鉴定为铜绿假单胞菌。
三、ZM-1的培养基成分、发酵条件优化
供试菌株：铜绿假单胞菌（ P aeruginosa ）ZM-1；供试培养基：LB 液体培养基、NB培养基、PDB培养基、KB 液体培养基。
1、种子液的制备：挑取活化后的菌株ZM-1单菌落接入装液量为100mL/250 mL LB液体培养基中，37℃，200 r/min振荡培养24h，稀释涂布平板法测定菌液菌含量，用无菌水将菌液浓度重悬到1×108作为种子液备用。
2、菌株ZM-1生长曲线的测定：将菌株种子液按照1%的接种量接种至装液量为100mL/250Ml的基础培养基中，37 ℃、200 r/min摇床培养72h。每隔2 h取一次样，使用紫外分光光度计测定发酵液在波长600nm条件下的OD值，并绘制菌株的生长曲线。
菌株ZM-1生长曲线如图8所示，由菌株的生长曲线可以看出，开始培养后前两个小时为菌株迟缓期，曲线平坦稳定，菌株繁殖极少，从2h-24h这一阶段内为细菌指数生长期，活菌数直线上升，之后菌量增长较为平缓逐渐进入稳定期，在培养时间达到42h时，菌液OD600达到最大值。此时为菌株摇床培养的最佳时间。
3、基础培养基的筛选：将种子液按照1%的接种量接种于各个装液量为100 m L/250 mL的基础培养基（LB液体培养基、NB液体培养基、PDB液体培养基、KB液体培养基）中，摇床37℃、200r/min培养48 h后，采用稀释涂布平板法测定不同发酵础培养基在相同培养条件下活菌数，确定最佳发酵基础培养基。
表9、图9为基础培养基筛选结果，结果显示，四种基础培养基中，LB液体培养基培养的ZM-1菌液活菌数最高，大约是NB培养基和KB培养基活菌数的两倍，PDB培养基菌量较低于LB培养基为1.86×109 cfu/ml，所以选择LB液体培养基作为菌株ZM-1发酵的基础培养基。
表9：菌株基础培养基的筛选
Figure 617118DEST_PATH_IMAGE012
4、最佳碳源的筛选：以等量的秸秆粉、玉米粉、麸皮、蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖分别代替最佳基础培养基中的碳源，其他成分不变，以发酵基础培养基为CK，采用稀释涂布平板法测定不同碳源培养条件下的活菌数，确定最佳碳源。
菌株碳源筛选结果如表10、图10所示，在相同的培养条件下，利用秸秆粉、可溶性淀粉、玉米粉、麸皮、葡萄糖、蔗糖等碳源代替原培养基中的碳源酵母粉对菌株进行培养，其中秸秆粉、可溶性淀粉、玉米粉、麸皮、葡萄糖五种碳源制作的培养基菌液活菌数均在1×108 cfu/ml以上，均低于对照酵母粉，只有碳源蔗糖和对照酵母粉的活菌数达到了1×109cfu/ml以上，活菌数分别为4.03×109和1.94×109cfu/ml，碳源蔗糖制作的培养基菌液菌含量为对照的两倍以上，所以选择蔗糖为菌株ZM-1发酵培养的最佳碳源。
表10：菌株碳源筛选
Figure DEST_PATH_IMAGE013
5、最佳氮源的筛选：与碳源筛选方法相同。氮源：蛋白胨、豆粕、牛肉粉、菜粕、黄豆粉、硫酸铵。
利用上一步筛选出的最佳碳源蔗糖制作的氮源筛选培养基对菌株进行培养，氮源筛选结果如表11、图11所示。其中氮源硫酸铵不能被菌株利用，该培养基中菌株没有生长，其余5种氮源蛋白胨、豆粕、牛肉粉、菜粕、黄豆粉制作的培养基菌液活菌数均低于对照胰蛋白胨，只有牛肉粉和胰蛋白胨培养基活菌数在1×109 cfu/ml以上，蛋白胨、豆粕、菜粕、黄豆粉制作的培养基菌液活菌数在1×108 cfu/ml以上，所以菌株ZM-1发酵培养的最佳氮源为胰蛋白胨。
表11：菌株氮源筛选
Figure 377264DEST_PATH_IMAGE014
6、最佳无机盐的筛选：与碳源筛选方法相同。无机盐：K2HPO4、CaCl2、KCl、MnSO4、MgSO4。菌株无机盐的筛选结果如表12、图12所示，在菌株ZM-1最佳无机盐的筛选中，无机盐K2HPO4制作的培养基活菌数最高，为3.99×109 cfu/ml，其次为对照NaCl，为3.05×109cfu/ml，CaCl2与MnSO4培养基菌株不生长，KCl与MgSO4培养基菌液活菌数均显著低于K2HPO4培养基，所以选择K2HPO4作为菌株ZM-1发酵培养的最佳无机盐。
表12：菌株无机盐的筛选
Figure 581980DEST_PATH_IMAGE016
7、发酵条件的正交优化：为进一步确定菌株ZM-1的最优发酵条件，采用正交试验L9（34）方法，如表13所示，对接种量、pH、发酵温度、发酵时间4个发酵条件进行优化，采用稀释涂布平板法测定各处理菌液活菌数，确定菌株ZM-1的最优发酵条件。
表13：菌株发酵条件优化因素与水平
Figure DEST_PATH_IMAGE017
在筛选出的最佳培养基的基础上进行培养基的制作，并通过正交试验的方法进行试验设计，对发酵条件进行优化，如表14所示共9个处理组，其中第2组发酵条件下菌液活菌数最高，该发酵组合条件下培养出来的菌液活菌数达到了 1.63×1010cfu/mL。
表14：正交试验优化结果
Figure 154782DEST_PATH_IMAGE018
由表格所知，各个培养条件对菌株生长和活性有着不同的影响，其影响程度大小顺序为pH值>发酵时间>发酵温度>接种量，其中对菌株影响最大的发酵因素为pH值，并且我们在对菌株进行实验过程中也发现，菌株ZM-1在酸性环境中生长量很低，因此正交实验选择的pH值范围在7-8弱碱性范围内。通过正交试验优化后菌株ZM-1最适发酵条件为发酵温度25℃，pH值为7.5，发酵时间为48h，接种量2%，培养出的发酵液活菌数可达 1×1010 cfu/mL以上。与优化前的LB培养基相比，菌液活菌数明显增加，提高了一个量级单位。
发酵条件的优化是指改变培养基中的一些成分和发酵环境，从而促进培养物的生长和产物的表达，是一种提升发酵产物产量最关键的方式之一。研究表明，通过培养基优化，可以显著提高生防菌菌量和发酵产物产量，从而提高生防菌株的发酵效率及其抑菌效果。进行菌株发酵条件优化，不仅提高了发酵效率与发酵产量，还降低了发酵成本，为后续生物有机肥的生产奠定了基础。
有效菌含量是评价生物有机肥产品质量的一项重要指标，若要求更好的抑菌活性，活菌含量是前提，菌株发酵条件优化是提高生物有机肥的有效菌含量和抑菌效果以及节约生产成本的关键环节，也是生防菌株从实验室走向市场的重要步骤。
目前，微生物发酵条件优化的方法有多种，主要有单因素试验优化法、正交设计优化法及响应面优化法等。在发酵条件的优化的过程中需要考虑发酵温度、转速、时间、成分、pH值等多种因素，这些因素对菌株发酵过程的影响通常不是单一的，而是通过各个因素之间的交互作用共同影响，所在在优化过程，通常使用多种方法结合分析菌株的最适生长条件。正交试验设计就是一种研究多因素多水平的试验设计方法，它是根据正交性从全面试验中挑选出分布得很均匀的点进行试验，这些点能反映全面情况，具有典型性、代表性，是一种高效、快速且经济的实验设计方法。
本发明采用单因素法和正交试验相结合的方法对菌株ZM-1培养基成分及培养条件进行优化。结果表明最优培养基成分为胰蛋白胨10g/L、蔗糖5 g/L、K2HPO410g/L，最优培养条件为发酵时间48h、发酵温度25℃、接种量2%、pH值为7.5，有效菌含量可以达到1.63×1010 CFU/mL。本试验菌株经发酵优化后活菌数为1×1010 CFU/mL以上，达到目前摇瓶发酵菌含量基本水平。发酵液有效菌含量已经达到制作微生物有机肥的需求。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (5)

1.一株铜绿假单胞菌，其特征在于：所述铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的菌株号为ZM-1，于2021年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23987。
2.制备权利要求1所述的铜绿假单胞菌的发酵液的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）种子液的制备：活化后的菌株ZM-1单菌落接入LB 液体培养基中，37℃，200 r/min振荡培养24h，稀释涂布平板法测定菌液菌含量，用无菌水将菌液浓度重悬到1×108作为种子液备用；
（2）发酵液的制备：LB液体培养基作为菌株ZM-1发酵的基础培养基，然后以蔗糖作为发酵培养的碳源、胰蛋白胨作为发酵培养的氮源、K2HPO4作为发酵培养的无机盐，培养基配方为：LB液体培养基为基础培养基，加入胰蛋白胨10g/L、蔗糖5 g/L、K2HPO410g/L，控制发酵温度为25℃，pH值为7.5，发酵时间为48h，接种量2%。
3.权利要求1所述的铜绿假单胞菌或权利要求2所述方法制备的铜绿假单胞菌发酵液在抑制黄瓜土传病害中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述铜绿假单胞菌在抑制黄瓜枯萎病菌（Fusarium ox-ysporum.sp.cucumebrium Owen）、黄瓜疫病病菌（Phytophthora drechsleri Tucker）中的应用。
5.权利要求1所述的铜绿假单胞菌在抑制西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. niveum (E.F.Smith) Snyder et Hansen）中的应用。
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