CN115433692A - 一株腐植酸降解细菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一株腐植酸降解细菌，所述腐植酸降解细菌为坚强芽孢杆菌Bacillusfirmus HA‑X4菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 24269。本发明还提供该菌株在降解腐植酸中的应用。本发明的坚强芽孢杆菌Bacillusfirmus HA‑X4 CGMCC 24269菌株能够有效降解废水中的腐植酸。当腐植酸降解细菌菌液的加入量为体积百分比4％时，降解腐植酸的效果最佳。

Description

一株腐植酸降解细菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株腐植酸降解细菌及其应用。

背景技术

遏制城市水污染日益加重的趋势，黑臭水体形成原因的研究越发重要。

水体的致黑致臭是物理、化学及生物学等多方面共同作用的结果，不同的水质、环境因子、水力条件等都会导致水体黒臭机理存在差异。Fe、Mn、S被认为是主要的致黑致臭原因：大量有机物进入水体后，缺氧环境迅速形成，厌氧降解过程中产生了硫化氢、胺、氨、硫醇等发臭物质和FeS、MnS等黑色物质，造成了水体发黑发臭。受污水体的悬浮物中除了包含H₂S、NH₃、胺类、硫醇类物质外，学者们还发现大量腐植酸的存在。

腐植酸主要由碳、氢、氧、氮、硫等元素组成，是一种无固定组成结构的缩聚物。由于含有羧基、醇羟基、酚羟基、醌基、半醌基、甲氧基、羰基等官能团，腐植酸具有可溶解、胶体吸附、较好的亲水性、受热粉解、呈弱酸性、可光解等独特的物理化学性质。腐植酸在水生体系中，如同人体血液里的“白细胞”一样，不可失衡，适量的腐植酸能够发挥“绿色”效应，对水环境中碳的循环、金属离子的络合、有机化合物的迁移与转化有促进作用。腐植酸含量过高时，将会产生异色异味，并与水处理产生的氯气结合，生成致癌的含氯化合物；还会和重金属、生物杀灭剂络合，使得它们在水体中的移动加强；另外还会降低低分子有机化学物质、无机污染物的吸附率、吸附平衡容量。

腐植酸的结构复杂，是造成水污染的主要成分之一。腐植酸的存在会影响饮用水的口感，在饮用水加氯消毒过程中，腐植酸会与水中残留的余氯反应产生有毒的消毒副产物三氯甲烷(THMs)、卤乙酸(HAAs)等，对人体健康造成不利的影响。

近年来，由于水中天然有机污染负荷增加而带来的色度、嗅等问题，以及由于氯消毒而产生的THMs等共同引起饮用水安全问题，越来越得到人们的重视。

利用高级氧化技术处理腐植酸备受关注，虽能有效去除腐植酸，但花费成本较大。控制水中HA的方法主要有物理法和化学氧化法等。物理法通过混凝、絮凝和吸附等过程将HA从水中去除，但此法仅是将HA转移至固相，仍需进行后续固废处理。化学氧化法因可快速分解矿化HA而备受关注，常见化学氧化法有光催化、芬顿氧化和电化学氧化等，但它们普遍存在反应条件苛刻，操作复杂等缺点。而微生物降解具有成本低、效率高、无二次污染等独特的优越性,同时微生物降解有机物还具有来源广泛、选用便利、操作简单等优点。因此在自然界中分离筛选出腐植酸高效降解菌，并对影响高效腐植酸降解菌降解性能的腐植酸初始浓度、pH、接菌量等因素进行探讨有重要的现实意义，为建立使高效腐植酸降解菌成为生物活性炭上优势菌的技术提供应用基础。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一株腐植酸降解细菌，本发明还提供该菌株在降解腐植酸中的应用。

本发明提供一株腐植酸降解细菌，所述腐植酸降解细菌为坚强芽孢杆菌Bacillusfirmus HA-X4菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No. 24269。

本发明还提供腐植酸降解细菌菌液，是将坚强芽孢杆菌Bacillusfirmus HA-X4菌株扩大培养得到的。

作为优选，所述扩大培养具体为：将坚强芽孢杆菌菌株HA-X4接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中30℃摇床培养18-30h。

本发明还提供上述的腐植酸降解细菌或腐植酸降解细菌菌液在制备降解腐植酸的产品中的应用。

作为优选，降解腐植酸时，将所述腐植酸降解细菌菌液加入到含腐植酸物料中进行降解。

作为优选，所述降解温度为30℃。

作为优选，在降解腐植酸时，所述腐植酸降解细菌菌液的加入量为体积百分比2-6％。

作为进一步优选，在降解腐植酸时，所述腐植酸降解细菌菌液的加入量为体积百分比 4％。

作为优选，在降解腐植酸时，初始pH为8。

作为优选，在降解腐植酸时，降解时间为70-75h，优选降解时间为72h。

本发明的坚强芽孢杆菌Bacillusfirmus HA-X4 CGMCC 24269菌株能够有效降解废水中的腐植酸。当腐植酸降解细菌菌液的加入量为体积百分比4％时，降解腐植酸的效果最佳。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为初筛得到的5株细菌对腐植酸的去除率。

图2为复筛得到的腐植酸降解细菌HA-X4在PDA固体培养基上的形貌。

图3为菌株HA-X4的系统发育进化树。

图4为腐植酸初始浓度对腐植酸降解性能的影响。

图5为初始pH对腐植酸降解性能的影响。

图6为菌液投加量对腐植酸降解性能的影响。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1

1材料与方法

1.1取样

土样采自兰州理工大学彭家坪校区腐木下方5cm处土壤与人工湖底泥。

1.2培养基

(1)富集培养基：牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸馏水1L，琼脂20g，pH＝7.0-7.2。

(2)驯化培养基1：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl 0.5g，腐植酸0.005g，蒸馏水1L，琼脂20g，pH＝7.0-7.2。

(3)驯化培养基2：牛肉膏0.1g，蛋白胨0.1g，NaCl 0.05g，腐植酸0.015g，蒸馏水1L，琼脂20g，pH＝7.0-7.2。

(4)驯化培养基3：腐植酸0.03g，蒸馏水1L，琼脂20g，pH＝7.0-7.2。

1.3腐植酸溶液的配制

称取1g腐植酸，加入900mL去离子水中，充分搅拌使其完全溶解，先加入去离子水稀释至1L，再调节pH为7，储存在棕色瓶中备用。

1.4实验仪器及设备

电子天平；高压蒸汽灭菌锅；无菌操作台；电热恒温培养箱；紫外可见分光光度计；pH计；光学显微镜；普通冰箱；可调试电热板；恒温气浴振荡器；扫描电子显微镜；便携式色度测定仪。

1.5土壤稀释度的选择

取10g采集的土样，放入装有90mL水的锥形瓶中，加入2-3颗玻璃珠，常温下150r/min 摇床振荡1小时，静置20min后取上清液，即得到10^-1稀释度的土壤悬液，依次稀释，制得10^-2,10^-3，10^-4,10^-5稀释度的土壤悬液，并将各稀释度的菌液吸取100μL分别涂在牛肉膏蛋白胨培养基上，每个稀释度设置3个平行样，30℃培养3d，根据菌的长势选择合适的稀释度，以便容易挑出不同菌落并将其纯化。发现10^-3稀释度下培养基中各菌落分布较为均匀，容易挑出单菌落，因此选10^-3稀释度的土壤悬液做后续细菌筛选实验。

1.6腐植酸降解细菌的初筛

将10^-3稀释度的牛肉膏蛋白胨固体培养基上的细菌分离纯化，得到20株细菌，将分离纯化出的菌株接种在驯化培养基1中，30℃培养一定时间，将长出的菌落转接至驯化培养基2中，进行梯度驯化。待驯化培养基2中的菌落长出，再转接至驯化培养基3中转接筛选培养，初步筛选得到菌落较大的5株腐植酸降解细菌，依次编号为HA-X1、HA-X2、 HA-X3、HA-X4、HA-X5。

1.7腐植酸降解细菌的复筛

将HA-X1、HA-X2、HA-X3、HA-X4、HA-X5这5株腐植酸降解细菌分别制成OD₆₀₀为0.6的菌悬液，按体积比2％加入初始浓度为25mg/L，初始pH为7的腐植酸废水中， 150r/min，30℃摇床培养，设置一个对照组，三个平行样，每隔24h测定其UV₂₅₄(UV₂₅₄表示水中的芳香烃类等有机物污染物在紫外光波长值为253.7nm处的吸收值，这些化合物通常是具有复杂结构天然有机物的主要成分，可用在该波长下的吸光度间接来表示这些化合物的浓度)。实验结果显示在72h时对腐植酸的降解率最高，此时HA-X1、HA-X2、 HA-X3、HA-X4、HA-X5对腐植酸的降解率分别为43.18％，28.21％，31％，47.59％，19.69％，因此最终选取降解率在45％以上的HA-X4，并将后续实验的测定时间定为72h。

图1为初筛得到的5株细菌对腐植酸的去除率。

1.8菌液的配制

将步骤1.6中的菌株HA-X4接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中30℃摇床培养，24h后将新鲜培养物加入装有灭菌生理盐水的离心管中，将菌液浓度稀释为10⁸CFU·mL^-1，于4℃冰箱内保存备用。

1.9腐植酸降解细菌的形态观察与鉴定

1.9.1形态观察

观察可知HA-X4在牛肉膏蛋白胨培养基上菌落成车轮装，表面光滑，杏色，中间成半透明。

图2为复筛得到的腐植酸降解细菌HA-X4在PDA固体培养基上的形貌。

1.9.2鉴定

对HA-X4进行测定，菌株“HA-X4”与多个菌株的16S rDNA同源性为100.00％。查阅文献可知Bacillus firmus与Bacillus oceanisediminis的16S rDNA序列十分接近，因此要进一步进行形态区分，最终鉴定HA-X4为Bacillus firmus(坚强芽孢杆菌)。将该菌株Bacillus firmus HA-X4于2022年1月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.24269。

图3为菌株HA-X4的系统发育进化树。

HA-X4的16S rDNA基因序列为：

2腐植酸高效降解细菌坚强芽孢杆菌CGMCC 24269的降解特性

2.1腐植酸降解细菌坚强芽孢杆菌CGMCC 24269的降解实验

2.1.1腐植酸初始浓度

分别配制浓度为5mg/L、15mg/L、25mg/L、35mg/L、45mg/L、55mg/L的腐植酸废水，调节pH为7，分别加入2％体积的CGMCC 24269菌液，于30℃，150r/min摇床培养，72 小时测其UV254，VIS400和色度。

2.1.2初始pH

分别配制腐植酸初始浓度为25mg/L，初始pH为3、4、5、6、7、8、9、10的腐植酸废水，分别加入2％体积的CGMCC 24269菌液，于30℃，150r/min摇床培养，72小时测其UV254，VIS400和色度。

2.1.3菌液投加量

配制腐植酸初始浓度为25mg/L，初始pH为8的腐植酸废水，分别加入0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％体积的CGMCC 24269菌液，于30℃，150r/min摇床培养，72小时测其UV254,VIS400和色度。

2.2腐植酸高效降解细菌坚强芽孢杆菌CGMCC 24269的降解实验结果。

2.2.1腐植酸初始浓度

在腐植酸初始浓度为25mg/L时，HA-X4对腐植酸降解率达到最高，UV254，VIS400(利用紫外可见分光光度法以超纯水为空白对照，测量样品溶液在400nm出的吸光度值。VIS400是用来表征复杂有机物中的显色基团的含量)和色度的去除率分别为43.26％、52.02％、62.56％。

图4为腐植酸初始浓度对腐植酸降解性能的影响。

2.2.2初始pH

在初始pH为酸性条件下UV254，VIS400和色度的去除率较高，且在初始PH为3时，UV254，VIS400和色度的去除率分别为81.4％、90.32％、97.63％，但TCOD(总化学需氧量)的去除率仅为30.28％，基本没有去除。因此在pH为酸性时，UV254，VIS400和色度的高去除率是由于腐植酸在酸性条件下析出所导致，并不是菌株HA-X4对腐植酸的降解作用。而在初始pH为8时，UV254,VIS400和色度的去除率分别为47.34％、54.39％、 65.29％，TCOD的去除率达到最高，为52.79％。因此菌株HA-X4生长的适宜pH为8。

图5为初始pH对腐植酸降解性能的影响。

2.2.3菌液投加量

在菌液投加量为4％体积时，HA-X4对腐植酸降解率达到最高，UV254、VIS400、色度的去除率分别为54.67％、61.86％、72.83％。

图6为菌液投加量对腐植酸降解性能的影响。

2.3结论

配制浓度为25mg/L的腐植酸废水，调节pH为8，加入4％体积的坚强芽孢杆菌CGMCC24269菌液，于30℃，150r/min摇床培养。上述条件下对腐植酸的降解率达到最佳。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 兰州理工大学

<120> 一株腐植酸降解细菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1378

<212> DNA

<213> 坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)

<400> 1

tgggagcttg ctccctgaag tcagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg caacctgcct 60

gtaagactgg gataactccg ggaaaccggg gctaataccg gataattctt tccctcacat 120

gagggaaagc tgaaagatgg tttcggctat cacttacaga tgggcccgcg gcgcattagc 180

tagttggtga ggtaacggct caccaaggca acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc 240

ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt 300

ccgcaatgga cgaaagtctg acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg 360

taaaactctg ttgttaggga agaacaagta ccggagtaac tgccggtacc ttgacggtac 420

ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag 480

cgttgtccgg aattattggg cgtaaagcgc gcgcaggcgg ttccttaagt ctgatgtgaa 540

agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactgggg aacttgagtg cagaagagaa 600

gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca ccagtggcga 660

aggcgactct ttggtctgta actgacgctg aggcgcgaaa gcgtggggag caaacaggat 720

tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta agtgttagag ggtttccgcc 780

ctttagtgct gcagcaaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacggcc gcaaggctga 840

aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc 900

aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat ctcctgacaa ccctagagat agggcgttcc 960

ccttcggggg acaggatgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt 1020

tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt tgccagcatt cagttgggca 1080

ctctaaggtg actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg 1140

ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatggatgg tacaaagggc tgcgagaccg 1200

cgaggttaag cgaatcccat aaaaccattc tcagttcgga ttgcaggctg caactcgcct 1260

gcatgaagcc ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg 1320

gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt cggtgggg 1378

Claims (10)

1.一株腐植酸降解细菌，其特征在于：所述腐植酸降解细菌为坚强芽孢杆菌Bacillusfirmus HA-X4菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 24269。

2.腐植酸降解细菌菌液，其特征在于：是将坚强芽孢杆菌Bacillusfirmus HA-X4菌株扩大培养得到的。

3.根据权利要求2所述的腐植酸降解细菌菌液，其特征在于：所述扩大培养具体为：将坚强芽孢杆菌菌株HA-X4接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中30℃摇床培养18-30h。

4.权利要求1所述的腐植酸降解细菌或权利要求2所述的腐植酸降解细菌菌液在制备降解腐植酸的产品中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：降解腐植酸时，将所述腐植酸降解细菌菌液加入到含腐植酸物料中进行降解。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述降解温度为30℃。

7.根据权利要求4-6任一项所述的应用，其特征在于：在降解腐植酸时，所述腐植酸降解细菌菌液的加入量为体积百分比2-6％。

8.根据权利要求7任一项所述的应用，其特征在于：在降解腐植酸时，所述腐植酸降解细菌菌液的加入量为体积百分比4％。

9.根据权利要求4-6任一项所述的应用，其特征在于：在降解腐植酸时，初始pH为8。

10.根据权利要求4-6任一项所述的应用，其特征在于：在降解腐植酸时，降解时间为70-75h，优选降解时间为72h。

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