CN108410758A - 三氮唑降解菌及其在含三氮唑废水处理中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株三氮唑降解菌及其在含三氮唑废水处理中的应用。本发明以用于去除三氮唑的活性污泥反应器中的活性污泥作为筛选菌源，采用以三氮唑为唯一碳源和氮源的筛选培养基进行富集，采用培养基划线的方法进行分离纯化，得到了一株三氮唑降解菌株，经分子生物学鉴定为Raoultella，命名为Raoultella sp.NJUST42，保藏编号为CCTCC NO：M 2018050。本发明的三氮唑降解菌，可以利用三氮唑为唯一碳源和氮源进行代谢和生长。将Raoultellasp.NJUST42接种至含三氮唑的实际工业废水中，在108小时内三氮唑去除率达50％以上，在三氮唑的废水处理中具有良好的应用前景。

Description

三氮唑降解菌及其在含三氮唑废水处理中的应用
技术领域
本发明属于环境有机污染物生物处理技术领域，具体涉及一株三氮唑降解菌及其在含三氮唑废水处理中的应用。
背景技术
三氮唑，作为一种重要的具有广谱生物活性的氮杂环类化合物，可生产合成多种化合物，包括杀虫剂、除草剂、杀菌剂、植物生长调节剂以及抗肿瘤、抗病毒和抗菌剂等，广泛应用于医药、农药、化工等行业。已报道的三氮唑类衍生物超过二十万种，三氮唑及其衍生物结构稳定，不易水解，易在土壤和地下水之间转移，具有生物毒性、致癌和致畸特性。因此，修复受三氮唑及其衍生物污染的土壤和水环境，已成为目前环境治理领域的重要课题之一。
目前，含三氮唑及其衍生物废水的处理方法包括电化学法、光催化法等高级氧化法、吸附法、生物处理法，等。其中，高级氧化和吸附等物理化学方法处理含三氮唑废水成本较高，二次污染严重。生物处理技术具有经济、高效、二次污染小等诸多优点，可实现无害化治理，是应用最广的废水处理技术。但是，由于三氮唑的毒性和难降解特性，需要寻找能够耐受三氮唑生物毒性、具有降解功能的菌株。
发明内容
本发明的目的在于提供一株能以三氮唑为唯一碳源和氮源进行代谢和生长的三氮唑降解菌Raoultella sp.NJUST42。
发明人从用于处理三氮唑废水的活性污泥为菌源，利用以三氮唑为唯一碳源和氮源的筛选培养基，进行菌株的富集、纯化和分离，得到一株可以利用三氮唑为唯一碳源和氮源的三氮唑降解功能菌株，经分子生物学鉴定为Raoultella，命名为Raoultella sp.NJUST42，GenBank登录号为MG999508。该菌株已于2018年01月22日在中国典型物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO： M 2018050。
本发明还提供上述Raoultella sp.NJUST42在含三氮唑的废水处理中的应用，该菌株为首株可以利用三氮唑为唯一碳源和氮源进行代谢和生长，同时实现三氮唑降解的Raoultella菌株。
上述Raoultella sp.NJUST42在含有三氮唑的废水处理中的应用，具体方法为：将Raoultella sp.NJUST42种子液接种到含有三氮唑废水中，培养温度为30℃～35℃，培养pH为6.5～7.5。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明的Raoultella sp.NJUST42，可以利用三氮唑为唯一碳源和氮源进行代谢和生长。在含三氮唑的工业废水中，加入Raoultella sp.NJUST42进行处理，能够在108小时内，实现三氮唑的去除率达到50％以上。
附图说明
图1是Raoultella sp.NJUST42在固体培养基平板中生长的菌落图。
图2是Raoultella sp.NJUST42的扫描电镜图。
图3是Raoultella sp.NJUST42在三氮唑初始浓度为48.9-52.4mg L-1的液体培养基中对三氮唑的降解效果图。
图4是Raoultella sp.NJUST42降解三氮唑时，温度对其降解效果的影响结果图。
图5是Raoultella sp.NJUST42降解三氮唑时，初始pH对其降解效果的影响结果图。
图6是Raoultella sp.NJUST42在实际含三氮唑的工业废水中对三氮唑的降解效果图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明。
实施例1
Raoultella sp.NJUST42的筛选分离及鉴定。
(1)菌株的分离
从实验室现有的用于处理三氮唑废水的活性污泥反应器中取10mL活性污泥，加入到100mL生理盐水中搅拌均匀，静置两个小时。取1mL上清液加入到50mL无机盐培养基中，在恒温震荡培养箱中富集培养三天(180转/分钟)，连续三次富集后，取培养液用无菌水梯度稀释至10-4-10-10倍。制备无机盐琼脂固体培养基平板，将稀释后的培养液20μL分别涂布于无机盐琼脂固体培养基上，置于生化培养箱中30℃培养三天。挑选培养皿上具有明显差异的单菌落，采用平板划线分离的方法进行纯化培养，连续纯化五次后，得到单一菌株，进行斜面保存。配制含有三氮唑的无机盐液体培养基装入三角瓶中，121℃高温灭菌后接种分离纯化得到的纯菌株，在恒温震荡培养箱中180转/分钟和 35℃的条件进行培养，监测培养过程中三氮唑的浓度变化。选取能有效去除培养基中三氮唑的菌株，命名为NJUST42，将其进行斜面保存和-80℃低温保存。
LB培养基的组成如下：胰蛋白胨(10g L-1)，酵母提取物(5g L-1)，氯化钠(10g L-1)。
无机盐培养基(MSM)的组成如下：Na2HPO4·12H2O(3.057gL-1)，KH2PO4(0.760 gL-1)，MgCl2·4H2O(0.136gL-1)，CaCl2(0.05gL-1)，微量元素溶液SL-4(10mLL-1)。微量元素SL-4组成：EDTA(0.5gL-1)，FeSO4·7H2O(0.2gL-1),微量元素SL-6(100mLL-1)。微量元素SL-6组成：ZnSO4·7H2O(0.01gL-1)，MnCl2·4H2O(0.03gL-1)，H3BO4(0.3gL-1)， CoCl2·6H2O(0.2gL-1)，CuCl2·2H2O(0.01gL-1)，NiCl2·6H2O(0.02gL-1)，Na2MoO4·2H2O (0.03gL-1)。三氮唑的量根据实验需要投加。
在液体培养基的基础上加入2gL-1的琼脂粉，在灭菌锅内121℃高压灭菌20分钟后，倒入无菌培养皿中冷却至室温后获得无机盐琼脂固体培养基。
(2)菌株的鉴定
对菌株NJUST42进行形态学、生理生化测试。测定菌株的16S rRNA基因序列，将菌株的16S rRNA基因序列与GenBank数据库中的基因序列进行同源性比较并分析结果，从分子生物学水平上确定该菌的种属。
①形态学特征：NJUST42菌落呈成微黄色，表面光滑不透明，边缘整齐，有光泽，在液体培养基中程扩散性混浊。该菌株细胞呈杆状，尺寸为0.47-0.60μm×0.83-1.83μm。图1和图2分别为细菌NJUST42的固体培养基平板菌落图和扫描电镜图。
②生理生化特征：革兰氏阴性，催化酶阴性，氧化酶阴性，接触酶阳性，好氧，不运动，最适降解初始pH范围为6.5-7.5，最适生长温度为35℃。
③分子生物学鉴定：以NJUST42菌株的核DNA为模板，以细菌扩增的通用引物进行PCR扩增，测定菌株NJUST42的基因序列。将菌株的16S rRNA基因序列提交到 GenBank数据库(GenBank登录号为MG999508)进行同源性比较，结果表明，NJUST42 与Raoultellasp.UIWRF0516的序列相似度达96％以上。
根据NJUST42的形态学、生理生化测试以及分子生物学分析，NJUST42鉴定为Raoultella菌属，命名为Raoultella sp.NJUST42。
实施例2
菌株Raoultella sp.NJUST42对三氮唑的降解性能。
将菌株Raoultella sp.NJUST42接种至含有50mg L-1三氮唑的LB培养基中，35℃条件下180转/分钟摇床培养，进行NJUST42菌株富集，待菌株进入对数生长期后(约 48小时)，将所得菌液用离心机离心10分钟(6000转/分钟)，得到沉积菌体，用灭菌后的无机盐液体培养基重悬，离心，重复洗涤三次，将菌体重悬于无菌液体无机盐培养基中，得到种子液(控制OD600约为1.5)。
配制以50mg L-1三氮唑为唯一碳源和氮源的无机盐液体培养基作为模拟废水，将上述种子液加入到模拟三氮唑废水中，接种量为5％，35℃条件下以180转/分钟的转速摇床培养，监测培养过程中三氮唑的浓度变化。设立未接种NJUST42的空白对照。由图3 可知，在96小时内三氮唑去除率达60％以上。而在未接种NJUST42的空白对照实验中，三氮唑浓度没有明显的变化。
本实施例说明分离得到的菌株Raoultellasp.NJUST42可以利用三氮唑为唯一碳源和氮源进行代谢和生长，同时实现三氮唑的高效去除。
实施例3温度与初始pH值对三氮唑降解性能的影响。
配制三氮唑浓度为50mg L-1，初始pH值为7.0的三氮唑模拟废水，将Raoultellasp. NJUST42种子液以5％的接种量接入模拟废水，分别置于温度为20℃、25℃、30℃、35℃与40℃的摇床中培养。由图4所示，在培养温度为30℃～35℃的条件下，Raoultella sp.NJUST42可实现三氮唑的高效去除，且在培养温度为35℃条件下对三氮唑的去除效果最好；在培养温度为20℃、25℃和40℃的条件下，Raoultella sp.NJUST42也可实现三氮唑的去除，但去除速率明显变慢。
配制三氮唑浓度为50mg L-1，初始pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的三氮唑模拟废水，将Raoultella sp.NJUST42种子液以5％的接种量接入模拟废水。由图5所示，在初始pH为7.0与8.0的条件下，Raoultella sp.NJUST42可实现三氮唑的高效去除，且在初始pH为7.0时对三氮唑的去除效果最好；在初始pH为6.0与9.0的条件下，Raoultella sp.NJUST42也可实现三氮唑的去除，但去除速率明显较慢；而在初始pH为5.0与10.0 的条件下，三氮唑去除率低至10％左右。
本实施例说明菌株Raoultella sp.NJUST42降解三氮唑的最佳培养温度为35℃，最佳初始pH值为中性。过低和过高的温度与pH值都会抑制菌株Raoultella sp.NJUST42 对三氮唑的降解效果。
实施例4
菌株Raoultella sp.NJUST42在实际含三氮唑的化工废水中对三氮唑的去除效果。
将Raoultella sp.NJUST42种子液以5％接种量接入经预处理后含三氮唑的实际化工废水(含三氮唑98.3-100.7mg L-1)中，在35℃、180转/分钟的条件下培养。监测废水处理前后三氮唑的浓度变化。
如图6所示，经预处理后实际含三氮唑的化工废水中接种菌株Raoultella sp.NJUST42，经108小时左右的处理后，三氮唑去除率达50％以上。
本实施例说明分离得到的菌株Raoultella sp.NJUST42可成功应用于含有三氮唑的工业废水的生化处理，实现废水中三氮唑的高效去除。
序列表
<110> 南京理工大学
<120> 三氮唑降解菌及其在含三氮唑废水处理中的应用
<130> 2018
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1296
<212> DNA
<213> Raoultella sp.
<400> 1
tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgtagcattc tgatctacga 60
ttactagcga ttccgacttc atggagtcga gttgcagact ccaatccgga ctacgacata 120
ctttatgagg tccgcttgct ctcgcgaggt cgcttctctt tgtatatgcc attgtagcac 180
gtgtgtagcc ctactcgtaa gggccatgat gacttgacgt catccccacc ttcctccagt 240
ttatcactgg cagtctcctt tgagttcccg accgaatcgc tggcaacaaa ggataagggt 300
tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatt tcacaacacg agctgacgac agccatgcag 360
cacctgtctc agagttcccg aaggcaccaa agcatctctg ctaagttctc tggatgtcaa 420
gagtaggtaa ggttcttcgc gttgcatcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg 480
gcccccgtca attcatttga gttttaacct tgcggccgta ctccccaggc ggtcgactta 540
acgcgttagc tccggaagcc actcctcaag ggaacaacct ccaagtcgac atcgtttaca 600
gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt tgctccccac gctttcgcac ctgagcgtca 660
gtctttgtcc agggggccgc cttcgccacc ggtattcctc cagatctcta cgcatttcac 720
cgctacacct ggaattctac ccccctctac aagactcaag cttgccagtt tcaaatgcag 780
ttcccaggtt gagcccgggg atttcacatc tgacttaaca aaccgcctgc gtgcgcttta 840
cgcccagtaa ttccgattaa cgcttgcacc ctccgtatta ccgcggctgc tggcacggag 900
ttagccggtg cttcttctgc gagtaacgtc aatcactaag gttattaacc ttaacgcctt 960
cctcctcgct gaaagtactt tacaacccga aggccttctt catacacgcg gcatggctgc 1020
atcaggcttg cgcccattgt gcaatattcc ccactgctgc ctcccgtagg agtctggacc 1080
gtgtctcagt tccagtgtgg ctggtcatcc tctcagacca gctagggatc gtcgcctagg 1140
tgagccatta ccccacctac tagctaatcc catctgggca catctgatgg catgaggccc 1200
gaaggtcccc cactttggtc ttgcgacgtt atgcggtatt agctaccgtt tccagtagtt 1260
atccccctcc atcaggcagt ttcccagaca ttactc 1296

Claims (4)

1.三氮唑降解菌，为Raoultella sp.NJUST42，保藏编号为CCTCC NO：M 2018050。
2.如权利要求1所述的三氮唑降解菌在含三氮唑废水处理中的应用。
3.如权利要求2所述的三氮唑降解菌在含三氮唑废水处理中的应用，其特征在于，具体方法为：将Raoultella sp.NJUST42种子液接种到含有三氮唑废水中，培养温度为30℃～35℃，培养pH为6.5～7.5。。
4.如权利要求3所述的三氮唑降解菌在含三氮唑废水处理中的应用，其特征在于，所述的Raoultella sp.NJUST42的接种量为5％。
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Application publication date: 20180817

Assignee: JIANGSU YIYU ENVIRONMENTAL PROTECTION TECHNOLOGY CO.,LTD.

Assignor: NANJING University OF SCIENCE AND TECHNOLOGY

Contract record no.: X2023980030534

Denomination of invention: Triazole degrading bacteria and its application in triazole wastewater treatment

Granted publication date: 20200731

License type: Exclusive License

Record date: 20230111