CN107674847A - 一种卤代苯甲酸降解菌株及其生产的菌剂和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种卤代苯甲酸降解菌株及其生产的菌剂和应用。一株卤代苯甲酸降解菌H8，于2017年04月28日保存于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO.M 2017222。一种用所述的卤代苯甲酸降解菌H8生产的卤代苯甲酸降解菌剂。本发明提供一株能够高效、快速降解卤代苯甲酸的细菌H8。降解菌H8具有较广的降解谱，可降解3,5‑二溴‑4‑羟基苯甲酸、3‑溴‑4‑羟基苯甲酸、3,5‑二氯‑4‑羟基苯甲酸和3‑氯‑4‑羟基苯甲酸等多种卤代芳烃。能够在治理卤代苯甲酸污染中应用。

Description

一种卤代苯甲酸降解菌株及其生产的菌剂和应用
技术领域
本发明属于生物高技术领域，涉及一种卤代苯甲酸降解菌株及其生产的菌剂和应用。
技术背景
卤代芳烃类化合物多具有化学性质稳定，化学性能优越的优点，可作为农药、阻燃剂、染 料、药物及各类中间体，被广泛运用于工农业生产，产生了巨大的经济和社会价值，大大改善 了人类的生活。但卤代芳烃同时也具有高毒性、高稳定性的特点，可在环境中长期稳定存在， 有一定刺激性、致癌性、致畸性与神经和生殖毒性等。卤代芳烃污染对生态系统以及人类健康 造成了严重的威胁，因此卤代芳烃污染物的治理已成为严峻的环境科学问题。
卤代苯甲酸是一类重要的化工中间体，也是复杂的卤代芳烃在环境中代谢的重要中间产 物。由于卤素元素的电负性极强，易于生命细胞中的酶系统结合，导致这类化合物稳定性高、 毒性强，易在环境中迁移，造成土壤和水体严重的面源污染。3,5-二溴-4-羟基苯甲酸 (3,5-dibromo-4-hydroxybenzoate,DBHB)是重要的一类重要的化工中间体，比如是抗痛风药苯 溴马隆的合成前体。同时，DBHB是除草剂溴苯腈的主要中间代谢物，由于溴苯腈的大量使用 导致DBHB在环境中被广泛检出，对环境与人类健康有较大威胁。
微生物是环境中污染物降解的主力军，利用微生物降解消除土壤中的卤代芳烃进行原位 修复是一种经济的、安全的、有效的和无二次污染的方法，具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明针对环境修复的实际问题与重要需求，开发研制出一种新型的卤代苯甲酸污染修复 菌剂，使用本菌剂可以使土壤和水体中3,5-二溴-4-羟基苯甲酸和3-溴-4-羟基苯甲酸的残留量 降低95％以上，且生产成本较低。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
本发明提供一株高效降解卤代苯甲酸的菌株。该菌株为革兰氏染色反应阴性菌株H8(2017 年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC M 2017222),经鉴定为Pigmentiphaga sp.(图2)。菌株H8的形态学特征为：LB平板上生长时菌落呈淡黄色，圆形， 小而凸起，表面湿润光滑，边缘整齐，不透明；透射电子显微镜下菌株H8呈短棒状(0.8μm× 1.6μm)，无鞭毛(图1)。菌株H8的生理生化特征为：需氧，不能运动，革兰氏染色呈阴性； 吲哚反应为阳性，不能水解淀粉水解酶反应为阴性，氧化葡萄糖产酸，使石蕊牛乳凝固；对链 霉素，壮观霉素以及氯霉素有耐受性。菌株H8能以3,5-二溴-4-羟基苯甲酸和3-溴-4-羟基苯甲 酸为唯一碳源生长，在实验室摇瓶培养条件下降解率皆达99％以上。该菌可以用发酵工业通用 发酵设备进行生产。
一种用本发明所述的卤代苯甲酸降解菌生产的卤代苯甲酸降解菌剂。
本发明所述的卤代苯甲酸降解菌剂，优选通过以下方法生产而成：斜面种－摇瓶种－种子 罐－生产罐－产品(包装剂型为液体菌剂或固体吸附菌剂)。
本发明的详细实施步骤为：
1)将卤代苯甲酸降解菌H8的试管种接种于LB培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；
2)将上述培养好的菌液按10％的接种量接种入种子罐，培养至对数生长期，种子罐 所用的培养基配方为：葡萄糖8g/L，酵母膏5g/L，K2HPO4 1g/L，NaCl 5g/L，CaCO3 2g/L，MgSO4 0.2g/L，大豆油0.1％(v/v)，pH值7.2-7.5；
3)将种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相 同；
4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.6－1.2，搅拌速度为180 －240转/分，培养温度为35℃，全流程培养时间为96-108小时,发酵结束后菌体数 量达到10亿个/mL以上,发酵液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或 采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
本发明所述的卤代苯甲酸降解菌株H8在降解卤代苯甲酸中的应用，优选降解土壤中卤代 对羟基苯甲酸的应用。
其中，所述的卤代对羟基苯甲酸优选3,5-二溴-4-羟基苯甲酸、3-溴-4-羟基苯甲酸、3,5-二 氯-4-羟基苯甲酸或3-氯-4-羟基苯甲酸，进一步优选3,5-二溴-4-羟基苯甲酸。
有益效果
本发明提供一株能够高效、快速降解卤代苯甲酸的细菌H8。降解菌H8具有较广的降解 谱，可降解3,5-二溴-4-羟基苯甲酸、3-溴-4-羟基苯甲酸、3,5-二氯-4-羟基苯甲酸和3-氯-4-羟基 苯甲酸等多种卤代芳烃。降解菌H8具有较高的降解效率，可在24小时内完全降解0.2mM的3,5-二溴-4-羟基苯甲酸、3-溴-4-羟基苯甲酸、3,5-二氯-4-羟基苯甲酸和3-氯-4-羟基苯甲酸。具 有广泛的应用潜力和价值。使用该细菌生产的降解菌剂具有生产使用成本低，使用方便，修 复效果好的优点，适合在全国受卤代芳烃污染的化工园区、农业生产区、粮油蔬菜生产出口 基地或有绿色食品商标标志的地方大面积推广使用。本发明对于治理卤代苯甲酸污染，保护 生态环境，防治地下水污染，保护人民的身体健康等方面具有重要的意义。
本发明成功地解决了工农业生产活动中造成的卤代苯甲酸的污染问题，从而保护生态环 境，维护人类健康。
附图说明
图1菌株H8在LB平板上的菌落形态(A)和电镜照片(B)
图2菌株H8的16S rRNA基因系统发育分析
图3菌株H8对3,5-二溴-4-羟基苯甲酸的生长和降解曲线
图4环境因素对菌株H8降解3,5-二溴-4-羟基苯甲酸的影响
生物材料保藏信息
H8，分类命名为Pigmentiphaga sp.H8，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为 CCTCC NO.M 2017222，保藏日期为2017年04月28日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
具体实施方式
实施例1、菌株的分离与鉴定
本发明提供一种能高效降解卤代苯甲酸的菌株及其生产的菌剂，所用菌株为革兰氏染色 阴性菌H8，分离自江苏苏州某农药厂厂区的土壤中。菌株具体的分离筛选方法为：
取土样5.0g加入到100ml含有0.2mM 3,5-二溴-4-羟基苯甲酸的无机盐(以下简称MM) 培养基，30℃、150rpm摇床培养5d，以5％接种量(v/v)转接至新鲜的同一培养基中，连续富集培养四次。将第五代富集液在含有0.2mM 3,5-二溴-4-羟基苯甲酸的MM固体培养基上 稀释涂布，30℃培养4d，挑取平板上的单菌落于3ml液体LB试管培养基中，然后保存并转接至20mL含有0.2mM 3,5-二溴-4-羟基苯甲酸的MM培养基中，30℃培养5d，用等体积的 二氯甲烷萃取，紫外分光光度计检测效果，从而获得3,5-二溴-4-羟基苯甲酸降解菌株。
2017年04月28日寄存于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC M2017222，经 鉴定属于Pigmentiphaga sp.。菌株H8的形态学特征位为在LB平板上呈微黄色菌落，菌落圆形， 小而凸起，表面湿润光滑，边缘整齐，不透明。主要生物学特性为G-，菌体为短杆状，大小约 1.6μm长，0.8μm宽，无鞭毛(图1)，好氧；吲哚反应阳性；不能水解淀粉，氧化葡萄糖产 酸，使石蕊牛乳凝固。菌株H8对链霉素，壮观霉素以及氯霉素有耐受性。将菌株H8的16S rRNA 基因序列在数据库EzBilCloud中比对分析，结果显示菌株H8与属亲缘关系最近，其中与 Pigmentiphaga kullae K24T相似性达99.71％，与Pigmentiphagadaeguensis K110T相似性达 99.64％。结合菌落形态特性、生理生化特征以及16S rRNA基因系统发育分析，菌株H8初步鉴 定为Pigmentiphaga属(图2)。
实施例2、实验室降解实验
2.1菌株H8对3,5-二溴-4-羟基苯甲酸的生长利用和降解
高效液相色谱法检测3,5-二溴-4-羟基苯甲酸：取1mL样品，12000rpm离心5min，小心 吸取上清，上清经孔径为0.22μm水相滤膜过滤后用HPLC检测。检测条件：高效液相色谱仪 为岛津RID-10A；色谱柱为C18反相柱，规格250mm×4.6mm；柱温40℃；流动相为乙腈:水:乙酸(50:50:0.5,V:V:V)，流速为1.0mL/min；检测波长为221nm和250nm。
将菌株H8按终浓度0.06-0.08(OD600值)的接种量接至含有0.2mM 3,5-二溴-4-羟基苯甲 酸的100mL MM中，30℃、150rpm摇床培养，每隔4h取样2mL，取至28h。其中1mL用 于检测菌体的浓度(OD600值)，绘制菌株生长曲线；另外1mL用于高效液相色谱(HPLC)检 测3,5-二溴-4-羟基苯甲酸的浓度，绘制其降解曲线。结果如图2所示，菌株H8可在24h完全 降解0.2mM的3,5-二溴-4-羟基苯甲酸，并能以其为唯一碳源生长，菌体浓度(OD600值)由初 的0.07增至0.13。
2.2种子液制备
挑取菌株H8单菌落至100mL添加有0.2mM 3,5-二溴-4-羟基苯甲酸的LB液体培养基中， 30℃，160rpm摇床培养至菌体生长对数期，6000rpm离心5min收集菌体，用灭菌的MM培 养基洗涤菌体2次，再用10mL灭菌的MM培养基重悬，此即为菌体种子液。
2.3环境因素对菌株H8降解3,5-二溴-4-羟基苯甲酸的影响
在装有20mL MM液体培养基的50mL锥形瓶中添加0.2mM的3,5-二溴-4-羟基苯甲酸作 为唯一碳源，接种种子液至初始菌体浓度为OD600＝0.15，混合均匀后立即取1mL菌液，12000 rpm，离心5min取上清，作为对照。然后分别置于不同温度(15℃、20℃、25℃、30℃、37℃ 和42℃)的摇床中，160rpm培养6h后取样1mL离心，取上清，与对照上清液同时经孔径为0.22μm水相滤膜过滤后用HPLC检测，计算3,5-二溴-4-羟基苯甲酸降解率。每种处理设三个重复。结果如图4(A)所示，菌株H8对3,5-二溴-4-羟基苯甲酸的最适降解温度为30℃。
在装有20mL不同pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0)MM液体培养基的50mL锥形瓶中添加0.2mM的3,5-二溴-4-羟基苯甲酸为唯一碳源，接种种子液至初始菌体浓度为OD600＝0.15，混合均匀后立即取1mL菌液，12000rpm，离心5min取上清，作为对照。30℃、160rpm摇床培养6h后取样1mL离心，取上清，与对照上清液同时经孔径为0.22μm水相滤 膜过滤后用HPLC检测，计算3,5-二溴-4-羟基苯甲酸降解率。每种处理设三个重复。结果如图4(B)所示，菌株H8在pH 7.0时对3,5-二溴-4-羟基苯甲酸的降解效果最好。
在装有20mL不同NaCl浓度(1g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L)的MM培养 基中添加0.2mM的3,5-二溴-4-羟基苯甲酸为唯一碳源，接种种子液至初始菌体浓度为 OD600＝0.15，混合均匀后立即取1mL菌液，12000rpm，离心5min取上清，作为对照。30℃、 160rpm摇床培养6h后取样1mL离心，取上清，与对照上清液同时经孔径为0.22μm水相滤 膜过滤后用HPLC检测，计算3,5-二溴-4-羟基苯甲酸降解率。每种处理设三个重复。结果如图 4(C)所示，菌株H8在NaCl浓度为1g/L时对3,5-二溴-4-羟基苯甲酸的降解效果最好。
在装有20mL MM(不含MgSO4)培养基的50mL锥形瓶中添加0.2mM的3,5-二溴-4-羟基 苯甲酸为唯一碳源，分别加入0.2mM的不同金属(Al3+、Co2+、Cu2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、Ni2+、Mg2+、Fe3+和Fe2+)，以不添加金属离子处理为对照组。接种种子液至初始菌体浓度为 OD600＝0.15，混合均匀后立即取1mL菌液，12000rpm，离心5min取上清，作为对照。30℃、 160rpm摇床培养6h后取样1mL离心，取上清，与对照上清液同时经孔径为0.22μm水相滤 膜过滤后用HPLC检测，计算3,5-二溴-4-羟基苯甲酸降解率。每种处理设三个重复。结果如图 4(D)所示，Co2+、Cu2+、Mn2+和Ni2+能强烈抑制菌株H8对3,5-二溴-4-羟基苯甲酸的降解 能力，其它金属离子不影响降解效果。
在装有20mL MM液体培养基的50mL锥形瓶中加入0.2mM的3,5-二溴-4-羟基苯甲酸， 再分别添加1g/L的麦芽糖、木糖、蔗糖、山梨醇、乙酸钠、葡萄糖和乳糖作为外加碳源，以 不添加外源碳源的处理为对照组，分别接种种子液至初始菌体浓度为OD600＝0.15，30℃，160 rpm摇床培养6h，分别测定不同处理下3,5-二溴-4-羟基苯甲酸的降解率。每种处理设三个重 复。结果如图4(E)所示，蔗糖、山梨醇、乙酸钠和葡萄糖能促进菌株对,5-二溴-4-羟基苯甲 酸的降解。
在装有20mL MM液体培养基(不含NH4NO3)的50mL锥形瓶中分别添加1g/L的不同 氮源(尿素、酵母膏、蛋白胨、硝酸钠和硫酸铵)，再分别加入0.2mM的,5-二溴-4-羟基苯甲 酸作为唯一碳源，以不添加氮源的培养基为对照组。接种种子液至初始菌体浓度为OD600＝0.15， 混合均匀后立即取1mL菌液，12000rpm，离心5min取上清，作为对照。30℃、160rpm摇床培养6h后取样1mL离心，取上清，与对照上清液同时经孔径为0.22μm水相滤膜过滤后 用HPLC检测，计算3,5-二溴-4-羟基苯甲酸的降解率。每种处理设三个重复。结果如图4(F) 所示，与不添加氮源营养的对照相比，添加氮源可以促进菌株H8对3,5-二溴-4-羟基苯甲酸的降解，其中酵母粉、蛋白胨、硝酸钠和硫酸铵对3,5-二溴-4-羟基苯甲酸的降解的促进作用明显， 尿素对3,5-二溴-4-羟基苯甲酸降解的促进作用较小。
2.4菌株H8的降解底物谱
菌株H8的种子液分别接种到含0.2mM不同卤代芳烃类化合物(3,5-二溴-4-羟基苯甲酸、 3-溴-4-羟基苯甲酸、3,5-二氯-4-羟基苯甲酸、3-氯-4-羟基苯甲酸、2,6-二氯-4-硝基苯酚、2-氯苯 甲酸、2-氯-4-硝基苯酚、溴苯腈、2,4,6-三氯苯酚、2,6-二氯-4-氨基苯酚)的20mL MM液体培 养基中，30℃、160rpm摇床振荡培养48h后HPLC检测不同卤代芳烃类化合物的降解情况。 结果显示菌株H8在48h后可完全降解3,5-二溴-4-羟基苯甲酸、3-溴-4-羟基苯甲酸、3,5-二氯 -4-羟基苯甲酸和3-氯-4-羟基苯甲酸，但不能降解2,6-二氯-4-硝基苯酚、2-氯苯甲酸、2-氯-4- 硝基苯酚、溴苯腈、2,4,6-三氯苯酚、2,6-二氯-4-氨基苯酚。
实施例3、土壤降解实验
采取菜园土作为供试土样。将土样过2mm筛，分别取一定量的3,5-二溴-4-羟基苯甲酸、 3-溴-4-羟基苯甲酸、3,5-二氯-4-羟基苯甲酸和3-氯-4-羟基苯甲酸粉剂溶于100mL甲醇中，然 后浸泡硅藻土，使农药被完全吸附。浸泡后的硅藻土置于通风橱中吹干，将其拌入土壤中，使 土壤中农药的浓度约为50mg/kg。每一种土样各取500g，按10％的接种量接入种子液，于30℃ 恒温培养箱中培养，以接入等量无菌MM液体的土样作为对照，土壤的持水量保持在60％。 分别于0、1、3和5d取样，每种处理每次取3个样品，每个样重20g。样品用等体积的甲醇 震荡萃取2次，合并两次的甲醇，氮气吹干后，使用20mL甲醇重溶样品，然后HPLC检测测 定四种卤代对羟基苯甲酸的残留量。测定结果如表1所示，3天后检测不出土壤中的3-溴-4- 羟基苯甲酸和3-氯-4-羟基苯甲酸，说明已被菌株H8完全降解；而3,5-二溴-4-羟基苯甲酸和3,5- 二氯-4-羟基苯甲酸3d后仍然能检出，但浓度已低于5mg/kg；5d后3,5-二溴-4-羟基苯甲酸和 3,5-二氯-4-羟基苯甲酸也被完全降解。
表1 菌株H8在土壤中对四种卤代对羟基苯甲酸的降解
本发明的详细实施步骤为：
将本发明的卤代苯甲酸降解菌H8的原种在培养皿上活化，并接种于试管斜面上备用。 试管种接种于含200mL LB培养基(LB培养基配方：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠5g/L， pH 7.4)的1000mL摇瓶中，恒温振荡培养至对数期，准备接种一级种子罐。一级种子罐50 L，投料量40L，培养基配方为：葡萄糖8g/L，酵母膏5g/L，K2HPO4 1g/L，NaCl 5g/L，CaCO3 2g/L，MgSO4 0.2g/L，大豆油0.1％(v/v)，pH值7.2-7.5；投料完毕后高压蒸汽灭菌，冷却 至35℃后，将上述培养好的摇瓶菌种按10％的接种量接种入50L一级种子罐，培养至对数 生长期，搅拌速度为220转/分，无菌空气通入量为1:0.6-1.2。将到达对数期的种子液按10％ 的接种量接入二级种子罐。二级种子罐500L，投料量400L，培养基配方和培养条件与一级 种子罐一致。将到达对数期的种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成 分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后的生产罐高压蒸汽灭菌， 灭菌后冷却至35℃，通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐温度控制在35℃，生 产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.6－1.2，搅拌速度为220转/分，整个工艺流程培 养时间为96-108小时。发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上。
发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包 装袋分装成固体菌剂剂型。

Claims (7)

1.一株卤代苯甲酸降解菌H8，其特征在于该菌株于2017年04月28日保存于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO.M 2017222。
2.一种用权利要求1所述的卤代苯甲酸降解菌H8生产的卤代苯甲酸降解菌剂。
3.根据权利要求2所述的卤代苯甲酸降解菌剂，其特征在于是通过以下方法生产而成：
1)将H8试管种接种于LB培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；
2)将上述培养好的菌种按10％的接种量接种入种子罐，培养至对数生长期，种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖8g/L，酵母膏5g/L，K2HPO4 1g/L，NaCl 5g/L，CaCO3 2g/L，MgSO40.2g/L，大豆油0.1％(v/v)，pH值7.2-7.5；
3)将种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；
4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1：0.6－1.2，搅拌速度为180－240转/分，培养温度为35℃，全流程培养时间为96-108小时,发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上,发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
4.权利要求1所述的卤代苯甲酸降解菌H8在降解卤代对羟基苯甲酸中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的卤代对羟基苯甲酸选自3,5-二溴-4-羟基苯甲酸、3-溴-4-羟基苯甲酸、3,5-二氯-4-羟基苯甲酸或3-氯-4-羟基苯甲酸中的任意一种。
6.权利要求2所述的卤代苯甲酸降解菌剂在治理卤代苯甲酸污染中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的卤代对羟基苯甲酸选自3,5-二溴-4-羟基苯甲酸、3-溴-4-羟基苯甲酸、3,5-二氯-4-羟基苯甲酸或3-氯-4-羟基苯甲酸中的任意一种。
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