CN105802894B - 一株吡啶降解菌及其在含吡啶废水处理中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株吡啶降解菌及其在含吡啶废水处理中的应用。本发明从用于去除吡啶的SBR反应器中取出的成熟好氧颗粒污泥直接筛选，并以吡啶为唯一碳源、氮源的筛选培养基进行分离，得到了吡啶降解特效菌株，经分子生物学鉴定为Pseudofulvimonas gallinarii，命名为Pseudofulvimonas gallinarii NJUST27，保藏编号为CCTCC NO：M 2016012。本发明的吡啶降解菌，可以以吡啶为唯一碳源和氮源进行生长。在吡啶工业废水中加入Pseudofulvimonas gallinarii NJUST27进行处理，吡啶降解率、COD去除率和氨氮转化率分别为100％、87.35％和24.57％。该菌株具有高效的吡啶降解能力、高矿化能力以及对吡啶的毒性具有很好的适应能力及耐受性能，在高浓度吡啶废水的处理中具有良好的应用前景。

Description

一株吡啶降解菌及其在含吡啶废水处理中的应用
技术领域
本发明属于环境有机污染物生物处理技术领域，具体涉及一株吡啶降解菌及其在含吡啶废水处理中的应用。
背景技术
吡啶，作为一种重要的化工原料，可生产合成多种化合物，包括杀虫剂、除草剂、药品、消毒剂、染料等，广泛应用于医药、农药、化工等行业。吡啶水溶性强，易在土壤和地下水之间转移；结构稳定，具有生物毒性、致畸和致癌特性。因此，修复受吡啶类杂环化合物污染的土壤和水环境，已成为目前环境治理领域的重要课题之一。
目前，吡啶废水的处理技术主要为吸附、焚烧和氧化等物理化学处理技术。然而，物化处理技术成本普遍偏高，只适用于高浓度吡啶废水的处理，而且处理后的废水中吡啶仍可能大量残余，难以实现达标排放。相比于物理化学方法，生物降解法具有经济、高效且无二次污染等优点，可实现全无害化治理，是应用最广的废水处理技术。但是，由于吡啶的生物毒性，吡啶的生化处理具有很大的技术难度，需要在特定条件下、利用特定微生物方可实现。目前已报导的吡啶降解特效菌属包括Arthrobacter，Rhodococcus opacus，Pseudomonas，Shinella，Bacillus，Paracoccus，Streptomyces，Shewanella，Nocardiodes等，但大部分吡啶降解菌对吡啶的耐受浓度低(小于1000mg/L)，降解性能受到限制，难以满足实际工程应用的要求。
因此，筛选降解效率高、耐受浓度高、适应真实环境的吡啶降解菌，对于解决吡啶废水污染问题，具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一株吡啶降解菌Pseudofulvimonas gallinariiNJUST27，能够克服现有的吡啶降解菌株数量有限，而且对吡啶耐受浓度低，处理效率低，菌株种类较为单一的不足。
发明人从实验室中已经运行两年的用于去除吡啶的SBR反应器中取出的成熟好氧颗粒污泥直接筛选，并以吡啶为唯一碳源、氮源的筛选培养基进行分离，得到了吡啶降解特效菌株NJUST27，经分子生物学鉴定为Pseudofulvimonas gallinarii，命名为Pseudofulvimonas gallinarii NJUST27，GenBank登录号为KU051385。该菌株已于2016年1月6日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2016012。
本发明还提供上述Pseudofulvimonas gallinarii NJUST27在含吡啶废水处理中的应用，该菌株为首株可用于吡啶废水处理的Pseudofulvimonas菌。
上述吡啶降解菌Pseudofulvimonas gallinarii NJUST27在含吡啶废水处理中的应用，具体方法为：将Pseudofulvimonas gallinarii NJUST27种子液接种到含吡啶废水中培养，培养的温度为25℃～35℃，含吡啶废水的pH为中性。
上述的吡啶降解菌Pseudofulvimonas gallinarii NJUST27在含吡啶废水处理中的应用中，培养的温度优选为30℃。
本发明的Pseudofulvimonas gallinarii NJUST27，可以以吡啶为唯一碳源和氮源进行生长。在吡啶工业废水中加入Pseudofulvimonas gallinarii NJUST27进行处理，吡啶降解率、COD去除率和氨氮转化率分别为100％、87.35％和24.57％。该菌株具有高效的吡啶降解能力、高矿化能力以及对吡啶的毒性具有很好的适应能力及耐受性能，在高浓度吡啶废水的处理中具有良好的应用前景。
附图说明
图1是本发明菌株Pseudofulvimonas gallinarii NJUST27的透射电镜图。
图2是本发明菌株Pseudofulvimonas gallinarii NJUST27在吡啶初始浓度为1000mg/L的MSM中对吡啶的降解和降解过程中氨氮的释放情况结果图。
具体实施方式
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
Pseudofulvimonas gallinarii NJUST27的筛选分离及鉴定。
(1)菌株的筛选及分离
从现有的用于处理吡啶废水的SBR反应器中取出成熟好氧颗粒污泥，用研钵充分研碎之后用无菌水采用梯度稀释法分别稀释至104-1010倍。制备LB固体培养基，灭菌后趁热倒入同样灭过菌90×90cm的培养皿中，待冷却凝固后分别涂布20μL先前稀释的样品，置于生化培养箱中在30℃的条件下培养3d。挑选培养皿上菌落特征具有明显差异的菌株，采用平板划线分离的方法进行纯化，连续纯化三次后，得到单一菌株，并进行斜面保存。挑取分离所得到的单菌落，分别接入含吡啶为唯一碳源和氮源的无机盐培养基MSM中，放入全温振荡培养箱中在30℃，180r/min条件下培养，监测吡啶的浓度值。选取使得培养基内吡啶发生明显降解的菌株，命名为NJUST27，将其进行斜面保存和-80℃的低温保存。
无机盐培养基MSM的组成如下：Na2HPO4·12H2O(1.529g/L)，KH2PO4(0.372g/L)，MgSO4·7H2O(0.1g/L)，CaCl2(0.05g/L)，微量元素溶液SL-4(10mL/L)。微量元素SL-4组成：EDTA(0.5g/L)，FeSO4·7H2O(0.2g/L)，微量元素SL-6(100mL/L)。微量元素SL-6组成：ZnSO4·7H2O(0.01g/L)，MnCl2·4H2O(0.03g/L)，H3BO4(0.3g/L)，CoCl2·6H2O(0.2g/L)，CuCl2·2H2O(0.01g/L)，NiCl2·6H2O(0.02g/L)，Na2MoO4·2H2O(0.03g/L)。
(2)菌株的鉴定
对细菌进行形态学、生理生化测试。测定菌株的16S rDNA序列，将菌株的16S rDNA基因序列与国际GenBank数据库中的序列进行网上同源性比较，最终从分子水平上确定该菌的种属。
①形态特征：NJUST27菌落呈黄色，表面光滑不透明，边缘整齐，有光泽，在液体培养基中呈扩散性混浊。该菌株细胞呈杆状，尺寸为2.94-6.27μm×576-715nm。图1为细菌的透射电镜照片。
②生理生化特征：革兰氏阴性，非发酵型细菌，接触酶阳性，氧化酶阳性。碳源利用情况见表1。
③分子生物学鉴定：以NJUST27菌的核DNA为模板，以16S rRNA基因的PCR扩增的通用引物为引物，进行PCR扩增，测定其全序列。将菌株的16S rDNA基因序列提交至GenBank数据库(GenBank登陆号为KU051385)，与GenBank数据库中的序列进行网上同源性比较，结果表明，NJUST27与Pseudofulvimonas gallinaii strain Sa15的序列相似度高达95％以上。
根据NJUST27的形态学、生理生化测试以及分子生物学分析，NJUST27鉴定为Pseudofulvimonas gallinaii，命名为Pseudofulvimonas gallinarii NJUST27。
表1 Pseudofulvimonas gallinarii NJUST27菌株碳源利用情况
实施例2
Pseudofulvimonas gallinarii NJUST27菌株对吡啶的降解性能研究。
将吡啶降解菌株Pseudofulvimonas gallinarii NJUST27接种至添加1000mg/L吡啶的LB培养基，30℃条件下以180r/min的转速摇床培养，进行NJUST27的富集培养，待菌体进入对数生长期后期(约3d)，将所得菌体用8000rpm的转速离心15分钟，撇去上清液，采用涡旋震荡的方法将菌体重新悬浮于无菌液体MSM，离心。重复洗涤过程三次后，将菌体重新悬浮于无菌液体MSM(调节加入的MSM量，控制菌悬浮液OD600约为1.0)，得到种子液。本发明采用的LB培养基为本技术领域常规使用的培养基。
配制含有1000mg/L吡啶的液体MSM作为模拟废水，将上述种子液加入模拟吡啶废水中，接种量为5％，30℃条件下以180r/min的转速摇床培养，观测降解过程中废水中吡啶浓度、氨氮浓度以及降解终点时的TOC浓度。设立未接种NJUST27的空白对照。实验结果如图2所示。由图2可知，1000mg/L吡啶可于115h内完全降解；吡啶降解过程中，吡啶结构中的氮以氨氮的形式释放出来，吡啶降解结束后氨氮的得率约为50.27％；TOC显著降低，去除率可高达84.63％；而在未接种NJUST27的对照样中，吡啶未得到明显降解。
本实施例说明分离得到的Pseudofulvimonas gallinarii NJUST27可以利用吡啶为唯一碳源和氮源进行生长繁殖，并可实现吡啶的矿化。
实施例3
Pseudofulvimonas gallinarii NJUST27对含吡啶工业废水的处理。
将Pseudofulvimonas gallinarii NJUST27种子液以5％的接种量接入含吡啶的实际工业废水(含吡啶989mg/L，COD1328mg/L，总磷55mg/L)，在30℃条件下以180r/min的转速摇床培养。监测废水处理前后COD值、吡啶以及氨氮浓度。
由表2可知，含吡啶工业废水经菌株Pseudofulvimonas gallinarii NJUST27处理98h后，实现了吡啶的完全降解，COD值降为168mg/L，氨氮释放量为43.54mg/L。吡啶降解率、COD去除率和氨氮转化率分别为100％、87.35％和24.57％。
本实施例说明分离得到的Pseudofulvimonas gallinarii NJUST27可成功应用于含吡啶工业废水的生化处理，实现含吡啶工业废水中吡啶和COD的高效去除。
表2 含吡啶工业废水处理前后各项指标的变化情况
SEQUENCE LISTING
<110> 南京理工大学
<120> 一株吡啶降解菌及其在含吡啶废水处理中的应用
<130> 2016
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1411
<212> DNA
<213> Pseudofulvimonas
<400> 1
tgcaagtcga acggcagcgc gggcttcggc ctggcggcga gtggcggacg ggtgaggaat 60
gcatcggaat ctgccccgac gtgggggata acgtagggaa acttacgcta ataccgcata 120
cgtcctacgg gggaaagcgg gggatcttcg gacctcgcgc ggcgggatga gccgatgccg 180
gattagctag ttggtggggt aaaggcctac caaggcgacg atccgtagct ggtctgagag 240
gatgatcagc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg 300
gaatattgga caatgggggc aaccctgatc cagcaatgcc gcgtgtgtga agaaggcctt 360
cgggttgtaa agcactttta tcggggacga aatccggaag gttaataccc gtccgggatg 420
acggtacccg aggaataagc accggctaac ttcgtgccag cagccgcggt aatacgaagg 480
gtgcaagcgt taatcggaat tactgggcgt aaagggtgcg taggcggttt gttaagttcg 540
atgtgaaagc cctgggctca acctgggaat ggcatcgaag actggcagac tggagtgcgg 600
tagaggatgg tggaattccc ggtgtagcgg tgaaatgcgt agagatcggg aggaacacca 660
gtggcgaagg cggccatctg gaccagcact gacgctgagg cacgaaagcg tggggagcaa 720
acaggattag ataccctggt agtccacgcc ctaaacgatg cgaactggat gttgtgggca 780
actaggccct cagtatcgaa gctaacgcgt taagttcgcc gcctggggag tacggtcgca 840
agactgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagtat gtggtttaat 900
tcgatgcaac gcgaagaacc ttacctggcc ttgacatgtc gcgaatcctg cagagatgcg 960
ggagtgcctt cgggaatgcg acacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcctgag 1020
atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttgtcct tattggccag cacggtaatg 1080
gtgggaactc tagggagacc gccggcgaca agccggagga aggtggggat gacgtcaagt 1140
catcatggcc cttacggcca gggctacaca cgtactacaa tggggcgtac agagggtagc 1200
gagaccgcga ggtggagcca atcccagaaa acgtctctca gtccggatcg gagtctgcaa 1260
ctcgactccg tgaagtcgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg 1320
ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag tgggctgctc cagaagccgt 1380

Claims (4)

1.一株吡啶降解菌，为Pseudofulvimonas gallinarii NJUST27，保藏编号为CCTCCNO：M 2016012。
2.如权利要求1所述的吡啶降解菌在含吡啶废水处理中的应用。
3.如权利要求2所述的吡啶降解菌在含吡啶废水处理中的应用，其特征在于，具体方法为：将吡啶降解菌Pseudofulvimonas gallinarii NJUST27种子液接种到含吡啶废水中培养，培养温度为25℃～35℃，含吡啶废水的pH为中性。
4.如权利要求3所述的吡啶降解菌在含吡啶废水处理中的应用，其特征在于，所述的培养温度为30℃。
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