CN114686471A - 一种亚硝化菌剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种亚硝化菌剂及其制备方法。本发明提供的亚硝化菌剂，包括亚硝酸细菌类微生物和吸附载体，所述吸附载体包括包埋了碳酸钙的交联壳聚糖和异养菌。本发明还提供了一种亚硝化菌剂的制备方法，包括以下步骤：（1）制备吸附载体；（2）培养亚硝酸细菌类微生物；（3）将微生物和吸附载体混合制得亚硝化菌剂。本发明提供的该亚硝化菌剂具有繁殖速度快，生物浓度高的特点，且应用过程中不易流失。
Description
技术领域
本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一种亚硝化菌剂及其制备方法。
背景技术
硝化过程的主要功能微生物是硝化细菌属于化能营养型微生物。生物细胞只能利用以ATP等形态保存的能量，在好氧代谢中，ATP主要通过呼吸链的氧化磷酸化作用合成。氨氧化磷酸化效率很低，所能产生的ATP非常有限，这些能量主要用于电子跃迁到较高能级，这使得硝化细菌生长很缓慢。硝化细菌又分为氨氧化细菌（亚硝酸细菌）和亚硝酸盐氧化细菌（硝酸细菌），近年来发展的新型生物脱氮技术如短程硝化-反硝化及短程硝化-厌氧氨氧化都需要将硝化反应进行到亚硝酸阶段而终止，希望氨氮被亚硝酸细菌转化为亚硝酸盐氮后不再继续被氧化而直接进行反硝化脱氮。CN201110315549.6公开了一种短程硝化反硝化颗粒污泥的培养方法，其中定期投加5-15mg/L羟胺；CN201010168453.7公开了一种快速启动缺氧氨氧化生物滤池的方法，其中投加羟胺，诱导接种污泥向缺氧氨氧化生物膜转变。上述方法主要是利用羟胺对硝酸细菌的抑制作用，促进短程硝化作用，但是对生长缓慢的亚硝酸细菌自身生长没有促进作用。CN201410585640.3公开了一种硝化细菌富集培养方法，所使用的生长促进剂中含有羟胺，CN201410585421.5公开了一种氨氧化细菌生长促进剂及其制备方法和应用，所用的生长促进剂是使用无机酸羟胺和Na2SO3配合加入，羟胺的作用不仅作为底物直接参与氨氧化细菌的代谢过程，缩短酶促反应进程，而且可以作为羟胺氧还酶的激活剂加速细胞生长，提高氨氧化细菌的生长速率。上述方法主要是通过提高将羟胺转化为亚硝酸盐的酶的活性来加速酶促反应的进行、促进细胞生长。
生物修复技术因其安全、环保、低耗而受到重视，在污水处理系统受到冲击后硝化功能的重新建立常常需要长达十几天甚至一个月的时间，菌剂的投加可以快速恢复，现有液体菌剂在应用过程中也会因为条件的限制而存在流失风险。CN201910228586.X公开了一种微生物菌剂及其制备方法和应用，其中微生物菌剂包括吸附载体和混合微生物，混合微生物包括胶冻样芽孢杆菌、欧文氏菌和敏捷食酸菌。其制备方法为：制备包含胶冻样芽孢杆菌、欧文氏菌、敏捷食酸菌的混合微生物发酵液和吸附载体；将混合微生物发酵液和吸附载体混合得到微生物菌剂。该微生物菌剂可原位固定化重金属镉离子，有效降低土壤中镉离子的生物有效性，抑制作物对镉离子的吸收，同时还可作为钾肥促进作物生长，可应用于土壤中重金属的吸附和去除、提高作物产量。但不适合处理含氨氮污染物的废水。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种亚硝化菌剂及其制备方法。本发明提供的亚硝化菌剂制备时间短，生物浓度高，应用过程中不易流失，污水处理效果好。
本发明提供了一种亚硝化菌剂，包括亚硝酸细菌类微生物和吸附载体，所述吸附载体包括包埋了碳酸钙的交联壳聚糖和异养菌。
上述技术方案中，所述亚硝酸细菌类微生物是指能够将氨氮转化为亚硝酸盐的微生物。
上述技术方案中，所述亚硝化菌剂中，亚硝酸细菌类微生物的质量含量为50%-70%，吸附载体的质量含量为30%-50%。
上述技术方案中，所述吸附载体中，以质量分数计，异养菌占吸附载体质量的5%-50%，优选10%-30%，包埋了碳酸钙的交联壳聚糖占吸附载体质量的50%-95%，优选70%-90%。所述包埋了碳酸钙的交联壳聚糖中，壳聚糖与碳酸钙的质量比为1-5：0.5-5。
上述技术方案中，所述异养菌可以选自酵母菌、乳酸菌、硫酸盐还原菌中的至少一种，优选为酵母菌。所述的酵母菌选自假丝酵母、隐球酵母、汉逊氏酵母属、毕赤氏酵母、红酵母、球拟酵母或丝孢酵母中的至少一种，优选热带假丝酵母菌。所述的乳酸菌选自乳杆菌、双歧杆菌、乳球菌中的至少一种。所述的硫酸盐还原菌选自脱硫单胞菌、脱硫线菌中的至少一种。
本发明还提供了一种亚硝化菌剂的制备方法，包括以下步骤：（1）制备吸附载体；（2）培养亚硝酸细菌类微生物；（3）将微生物和吸附载体混合制得亚硝化菌剂。
上述技术方案中，步骤（1）中吸附载体的制备方法为：将包埋了碳酸钙的交联壳聚糖投加到利用有机碳源的异养菌培养体系进行吸附生长，培养至对数生长后期停止，取出固体物干燥得到。
上述技术方案中，步骤（1）中吸附载体的制备过程中，交联壳聚糖可以采用本领域常规的制备方法获得。交联的方法主要可以采用直接交联、交联中进行化学修饰。直接交联法常用的交联剂有环氧氯丙烷、戊二醛﹑甲醛﹑冠醚类或京尼平中的至少一种，优选采用京尼平对壳聚糖直接进行交联制备的交联壳聚糖载体。交联是壳聚糖与交联剂分子之间发生交联反应，使壳聚糖分子由直链变成网状结构，通过交联可以改善壳聚糖的比表面积和孔结构等物理性能，有效地提高壳聚糖的稳定性。
上述技术方案中，所述包埋了碳酸钙的交联壳聚糖可以采用常规方法制备，即在交联剂与壳聚糖反应制备交联壳聚糖时引入纳米碳酸钙，制得包埋了碳酸钙的交联壳聚糖。交联的方法主要可以采用直接交联、交联中进行化学修饰。直接交联法常用的交联剂有环氧氯丙烷、戊二醛﹑甲醛﹑冠醚类和京尼平，优选采用京尼平对壳聚糖直接进行交联制备的交联壳聚糖。
上述技术方案中，将包埋了碳酸钙的交联壳聚糖投加到利用有机碳源的异养菌培养体系进行吸附生长，是指异养菌培养过程初期就投加包埋了碳酸钙的交联壳聚糖进行异养菌边培养边吸附生长。包埋碳酸钙的交联壳聚糖的加入量占总反应体积的20%-30%。其中异养菌培养所需有机碳源根据选择的具体菌种确定，选择异养菌常规培养的含碳有机物；有机碳源优选为葡萄糖、己糖、木糖、蔗糖、淀粉中的至少一种。所述有机碳源按照加入后体系中质量浓度为1-5g/L进行投加。异养菌的培养条件为：温度20-38℃，优选20-30℃，pH为6.0-8.5，优选6.0-7.0；静置发酵（优选地，静置发酵培养每隔30-60min进行搅拌）或者摇床培养（优选地，摇床培养转速为200-600r/min）。
上述技术方案中，异养菌是利用有机碳源培养的异养菌，优选为酵母菌、乳酸菌、硫酸盐还原菌中的至少一种，再优选为酵母菌。所述的酵母菌选自假丝酵母、隐球酵母、汉逊氏酵母属、毕赤氏酵母、红酵母、球拟酵母或丝孢酵母中的至少一种，优选热带假丝酵母菌。所述的乳酸菌选自乳杆菌、双歧杆菌、乳球菌中的至少一种。所述的硫酸盐还原菌选自脱硫单胞菌、脱硫线菌中的至少一种。
上述技术方案中，所述吸附载体制备过程中，培养至对数生长后期，一般是培养24-80h。所述的干燥温度为25-50℃，干燥时间为1-5h。
上述技术方案中，优选地，步骤（2）所述亚硝酸细菌类微生物的培养方法为：首先将富含硝化细菌的活性污泥接种到具有搅拌和曝气功能的反应器内，采取批次补料并逐步提高补料中氨氮浓度的操作方式进行亚硝酸细菌的富集培养，结束培养的条件为：亚硝化率达90%以上，结束菌体培养过程，收获菌体；
其中，在亚硝酸细菌培养过程中，每一批次补料的同时均加入羟胺类物质和辅酶，当氨氮去除率达95%以上，结束当前批次，补料进入下一批次培养；当前批次的亚硝化率达30%以上，优选50%-60%时，从下一批次起向培养体系内通入NO和/或NO2气体。
上述技术方案中，所述亚硝酸细菌类微生物的培养方法中，所述的富含硝化细菌的活性污泥按照污泥浓度为2000-5000mg/L进行接种。活性污泥可以取自任何含有氨氮污染物的污水处理场。
上述技术方案中，所述亚硝酸细菌类微生物的培养方法中，所述具有搅拌和曝气功能的反应器，其中，亚硝酸细菌培养过程是在搅拌条件下进行的，曝气是用于维持培养体系内的溶氧量。
上述技术方案中，所述亚硝酸细菌类微生物的培养方法中，所述的辅酶包括选自辅酶Ⅰ、辅酶Ⅱ中的至少一种和辅酶Q10，其中辅酶Ⅰ为NADH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸），辅酶Ⅱ为NADPH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）。其中，选自辅酶Ⅰ、辅酶Ⅱ中的至少一种与辅酶Q10的质量比为8：1-1：8，优选为5：1-1：5。
上述技术方案中，所述亚硝酸细菌类微生物的培养方法中，所述的补料是指补加培养液，批次补料是指补加培养液的方式是每批加一次。本发明所使用的培养液是本领域技术人员所熟知的，其中的基质是氨氮，可以是硫酸铵、尿素等一切含氨氮的物质；培养液中还含有金属盐。所述的金属盐可以是钙盐、亚铁盐和铜盐等，所述钙盐可以为CaSO4或者CaCl2；亚铁盐为FeSO4或者FeCl2，优选FeSO4；铜盐为CuSO4或者CuCl2。所述的金属盐可以按照Ca2+、Fe2+和Cu2+的摩尔比为（8-12）:（2-6）:（1-4）进行配制，使用浓度为0.01-1.0mg/L。
上述技术方案中，所述亚硝酸细菌类微生物的培养方法中，所述的逐步提高补料中氨氮浓度的操作方式如下：初始氨氮浓度为20-100mg/L，每次提高氨氮浓度的幅度为10-50mg/L，提高氨氮浓度的条件如下：对于同一氨氮浓度的补料，连续3-5批次使氨氮去除率均达到95%以上且每一批次所用时间与这几批次平均所用时间相差在10%以内，优选5%以内，即可提高下一批次补加料液的氨氮浓度。
上述技术方案中，所述亚硝酸细菌类微生物的培养方法中，所述羟胺类物质为羟胺、盐酸羟胺、硫酸羟胺或者磷酸羟胺中的至少一种，优选为磷酸羟胺。羟胺类物质按照加入后在培养体系内的浓度为1-5mg/L进行投加，辅酶按照加入后在培养体系内的浓度为0.001-0.01mg/L进行投加。
上述技术方案中，所述亚硝酸细菌类微生物的培养方法中，NO和/或NO2气体的加入量占所通入气体总体积的0.001%-0.01%。在亚硝酸细菌培养过程中，所通入气体常规为空气，用于维持体系中的溶解氧量。
上述技术方案中，所述亚硝酸细菌类微生物的培养方法中，亚硝酸细菌的富集培养条件如下：温度为18-40℃，溶解氧为0.1-3.0mg/L，pH值为7.0-9.0，优选如下：温度为25-35℃，溶解氧为0.5-2.0mg/L，pH值为7.5-8.5。
上述技术方案中，所述亚硝酸细菌类微生物的培养方法中，结束培养的条件优选为：连续3-5批次亚硝化率均达90%以上，结束菌体培养过程，收获菌体。
上述技术方案中，步骤（3）将微生物和载体混合后的产物脱水至含水率（所述的含水率是指微生物和载体混合后的浓缩液所含水分重量占浓缩液总重量的百分比）30%-50%，在压力为1-2kPa、温度为35-50℃条件下进行真空干燥，制备成固体菌剂便于保藏和运输。脱水可以采用重力沉降、离心或过滤中的至少一种方式。
本发明提供的亚硝化菌剂，按照0.1-2g/L投加到待处理废水中去除含氮污染物和有机污染物。可以实现系统的快速启动、快速修复，特别适用于短程硝化反硝化和短程硝化厌氧氨氧化等工艺过程，能够实现含氮污染物和有机污染物的同时去除。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明提供的亚硝化菌剂中，采用带有正电荷的交联壳聚糖与利用有机碳源的异养菌作为吸附载体，菌体与载体的协同作用不仅可以降低交联壳聚糖对亚硝化菌的不利影响，而且可以使亚硝化菌易于吸附到载体上实现快速生长，使制备的菌剂生物浓度高，应用过程中不易流失。
（2）本发明提供的亚硝化菌剂中，发明人创造性地在亚硝酸细菌培养过程中加入羟胺类物质和辅酶，并控制NO和/或NO2气体的加入方式，通过调控细胞分裂和蛋白质合成速率，使细胞分裂和蛋白质合成能够同步进行，从而实现亚硝酸细菌的快速繁殖，实现菌剂的快速制备。
（3）本发明提供的亚硝化菌剂制备方法简单，可应用于工业化生产，菌剂应用时生物量不会降低，更有利于污水处理场冲击后的快速修复过程。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方法和效果作进一步详细说明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均可从生化试剂商店购买得到。
本发明实施例中，氨氮浓度采用GB7478-87《水质-铵的测定-蒸镏和滴定法》测定；硝酸盐氮浓度采用GB 7480-1987《水质-硝酸盐氮的测定-酚二磺酸分光光度法》测定；亚硝酸盐氮浓度采用GB 7493-1987《水质-亚硝酸盐氮的测定-分光光度法》测定。
本发明实施例中，氨氮去除率是指原料水中氨氮浓度与排出水中氨氮浓度的浓度差占原料水中氨氮浓度的百分数，氨氮去除率（%）=（原料水中氨氮浓度-排出水氨氮浓度）/原料水氨氮浓度×100%。亚硝化率是指氨氮被氧化为亚硝酸盐氮浓度占总的硝化产物浓度的百分数，亚硝化率（%）=排出水中亚硝酸盐氮浓度/（排出水中亚硝酸盐氮浓度+排出水中硝酸盐氮浓度）×100%。
实施例1
亚硝化菌剂的制备方法如下：
（1）吸附载体的制备：交联壳聚糖的制备具体过程为：首先将2%(W/V)的壳聚糖溶解于1% (V/V)的醋酸溶液共计500mL，加入CaCO3纳米颗粒 10g，加入5倍体积食用油，加入10mL司班-80激烈搅拌。加入京尼平至其在水相中终浓度为 20mM，持续搅拌24小时，离心分离沉淀，并用丙酮、热水、冷水清洗数次，以除去残留在微球表面的油相及杂质。最后再用丙酮脱水2次，并将所得产物在室温下晾干，得到微黄色粉末，即为包埋了碳酸钙的壳聚糖微载体。将上述壳聚糖载体投加到利用木糖的热带假丝酵母的培养体系进行吸附生长，木糖加入后的质量浓度为2g/L。培养条件为：温度25℃，pH为6.0-7.0，在200r/min的摇床上发酵培养48h后停止，取出固体物在40℃干燥时间为3h，制得吸附载体。经检测，异养菌占载体质量的30%。
（2）亚硝酸细菌类微生物的培养：在5L具有搅拌和曝气功能的有机玻璃反应器内按照污泥浓度（MLSS）为2000mg/L接种富含硝化细菌的活性污泥。在温度为28℃，溶解氧为2.0mg/L，pH值8.0的条件下，采取批次补料的方式进行亚硝酸细菌的富集培养。所使用的培养液中含有氨氮和金属盐，氨氮为硫酸铵，金属盐为CaCl2、FeSO4和 CuSO4，其中Ca2+、Fe2+和Cu2+按照摩尔比为8:2:1进行配制，使用浓度为0.1mg/L；培养液的初始氨氮浓度为30mg/L。当氨氮去除率达95%以上，结束当前批次，补料进入下一批次培养，每一批次补料的同时均按照1mg/L的浓度加入磷酸羟胺并按照0.001mg/L的浓度加入辅酶Ⅰ NADH和辅酶Q10（质量比为1：1）。培养过程中连续3个批次使氨氮去除率均达95%以上时所用时间基本相同，下一个批次氨氮浓度提高30mg/L。培养到第10个批次亚硝化率达56.9%，第11个批次起按照占所通入气体总体积的0.01%通入NO气体，继续培养到第20个批次，此时基质氨氮浓度为180mg/L，亚硝化率达95.2%，继续培养三个批次亚硝化率均高于90%，结束菌体培养过程收获菌体，分析MLSS为2800mg/L。
（3）亚硝化菌剂的制备：按照亚硝酸细菌类微生物的质量含量为60%、吸附载体的质量含量为40%的配比，将制备的载体加入到上述菌体中混合均匀，采用离心脱水至含水率40%，在压力为1.5kPa、温度为38℃条件下进行真空干燥，制备成固体菌剂A。
实施例2
亚硝化菌剂的制备方法同实施例1，所不同的是亚硝化菌剂的制备过程中，按照亚硝酸细菌类微生物的质量含量为50%、吸附载体的质量含量为50%的配比，将制备的载体加入到上述菌体中混合均匀，采用离心脱水至含水率45%，在压力为2kPa、温度为42℃条件下进行真空干燥，制备成固体菌剂B。
实施例3
亚硝化菌剂的制备方法同实施例1，所不同的是亚硝化菌剂的制备过程中，按照亚硝酸细菌类微生物的质量含量为70%、吸附载体的质量含量为30%的配比，将制备的载体加入到上述菌体中混合均匀，采用离心脱水至含水率35%，在压力为2kPa、温度为45℃条件下进行真空干燥，制备成固体菌剂C。
实施例4
亚硝化菌剂的制备方法如下：
（1）吸附载体的制备：交联壳聚糖制备的具体过程同实施例1，所不同的是利用木糖的热带假丝酵母的培养体系进行吸附生长，木糖加入后的质量浓度为3g/L。培养条件为：温度30℃，pH为6.8。在200r/min的摇床上发酵培养48h后停止，取出固体物在42℃干燥时间为2h，制得吸附载体。经检测，异养菌占载体质量的27%。
（2）亚硝酸细菌类微生物的培养：在5L具有搅拌和曝气功能的有机玻璃反应器内按照污泥浓度（MLSS）为2000mg/L接种富含硝化细菌的活性污泥。在温度为28℃，溶解氧为2.0mg/L，pH值8.0的条件下，采取批次补料的方式进行亚硝酸细菌的富集培养。所使用的培养液中含有氨氮和金属盐，氨氮为硫酸铵，金属盐为CaCl2、FeSO4和 CuSO4，其中Ca2+、Fe2+和Cu2+按照摩尔比为8:2:1进行配制，使用浓度为0.1mg/L；培养液的初始氨氮浓度为30mg/L。当氨氮去除率达95%以上，结束当前批次，补料进入下一批次培养，每一批次补料的同时均按照1mg/L的浓度加入磷酸羟胺并按照0.005mg/L的浓度加入辅酶ⅠNADH和辅酶Q10（质量比为3：1）。培养过程中连续3个批次使氨氮去除率均达95%以上时所用时间基本相同，下一个批次氨氮浓度提高30mg/L。培养到第10个批次亚硝化率达55.6%，第11个批次起按照占所通入气体总体积的0.01%通入NO气体，继续培养到第20个批次，此时基质氨氮浓度为180mg/L，亚硝化率达93.8%，继续培养三个批次亚硝化率均高于90%，结束菌体培养过程收获菌体，分析MLSS为2700mg/L。
（3）亚硝化菌剂的制备方法和过程同实施例1，制备成固体菌剂D。
实施例5
亚硝化菌剂的制备方法如下：
（1）吸附载体的制备同实施例1，不同在于：有机碳源采用等质量的蔗糖代替木糖，异养菌采用脱硫单胞菌代替热带假丝酵母。
（2）亚硝酸细菌类微生物的培养：在5L具有搅拌和曝气功能的有机玻璃反应器内按照污泥浓度（MLSS）为3000mg/L接种富含硝化细菌的活性污泥。在温度为30℃，溶解氧为1.0mg/L，pH值7.8的条件下，采取批次补料的方式进行亚硝酸细菌的富集培养。所使用的培养液中含有氨氮和金属盐，氨氮为硫酸铵，金属盐为CaCl2、FeSO4和 CuSO4，其中Ca2+、Fe2+和Cu2+按照摩尔比为10:2:2进行配制，使用浓度为0.1mg/L；培养液的初始氨氮浓度为50mg/L。当氨氮去除率达95%以上，结束当前批次，补料进入下一批次培养，每一批次补料的同时均按照2.5mg/L的浓度加入磷酸羟胺并按照0.01mg/L的浓度加入辅酶ⅠNADH和辅酶Q10（质量比为5：1）。培养过程中连续3个批次使氨氮去除率均达95%以上时所用时间基本相同，下一个批次氨氮浓度提高30mg/L。培养到第10个批次亚硝化率达50%，第11个批次起按照占所通入气体总体积的0.001%通入NO气体，继续培养到第20个批次，此时基质氨氮浓度为170mg/L，亚硝化率达92.1%，继续培养三个批次亚硝化率均高于90%，结束菌体培养过程收获菌体，分析MLSS为2720mg/L。
（3）亚硝化菌剂的制备方法和过程同实施例1，制备成固体菌剂E。
实施例6
（1）包埋了碳酸钙的壳聚糖微载体的制备同实施例1。将上述壳聚糖载体投加到利用木糖的热带假丝酵母的培养体系进行吸附生长，木糖加入后的质量浓度为2g/L。培养条件为：温度25℃，pH为6.0-7.0，静置培养，静置培养每隔60min进行搅拌，发酵培养48h后停止，取出固体物在40℃干燥时间为3h，制得吸附载体。经检测，异养菌占载体质量的30%。
（2）亚硝酸细菌类微生物的培养：在5L具有搅拌和曝气功能的有机玻璃反应器内按照污泥浓度（MLSS）为4000mg/L接种富含硝化细菌的活性污泥。在温度为25℃，溶解氧为3.0mg/L，pH值7.7的条件下，采取批次补料的方式进行亚硝酸细菌的富集培养。所使用的培养液中含有氨氮和金属盐，氨氮为硫酸铵，金属盐为CaCl2、FeSO4和 CuSO4，其中Ca2+、Fe2+和Cu2+按照摩尔比为8:2:2进行配制，使用浓度为0.1mg/L；培养液的初始氨氮浓度为50mg/L。当氨氮去除率达95%以上，结束当前批次，补料进入下一批次培养，每一批次补料的同时均按照5mg/L的浓度加入磷酸羟胺并按照0.005mg/L的浓度加入辅酶ⅠNADH和辅酶Q10（质量比为1：5）。培养过程中连续3个批次使氨氮去除率均达95%以上时所用时间基本相同，下一个批次氨氮浓度提高30mg/L。培养到第10个批次亚硝化率达50%，第11个批次起按照占所通入气体总体积的0.005%通入NO气体，继续培养到第20个批次，此时基质氨氮浓度为190mg/L，亚硝化率达90.0%，继续培养三个批次亚硝化率均高于90%，结束菌体培养过程收获菌体，分析MLSS为2740mg/L。
（3）亚硝化菌剂的制备方法和过程同实施例1，制备成固体菌剂F。
实施例7
亚硝化菌剂的制备方法如下：
（1）吸附载体的制备同实施例1，不同在于：有机碳源采用等质量的葡萄糖代替木糖，异养菌采用乳杆菌代替热带假丝酵母。
（2）亚硝酸细菌类微生物培养所使用的反应器和培养过程及条件均同实施例1，所不同的是当培养到第11个批次起按照占所通入气体总体积的0.005%通入NO2气体，继续培养到第20个批次，此时基质氨氮浓度为150mg/L，亚硝化率达92.7%，继续培养三个批次亚硝化率均高于90%，结束菌体培养过程收获菌体，分析MLSS为2710mg/L。
（3）亚硝化菌剂的制备方法和过程同实施例1，制备成固体菌剂G。
对比例1
同实施例1，不同在于菌剂制备过程中没有使用吸附载体，亚硝酸细菌类微生物培养完成后，按照步骤（3）制备成菌剂DA。
对比例2
同实施例1，不同在于：在亚硝酸细菌类微生物培养过程中，每一批次补料的同时没有加磷酸羟胺，培养到第14个批次后当亚硝化率达52%时按照占所通入气体总体积的0.01%通入NO气体，继续培养到第28个批次，基质氨氮浓度为180mg/L，亚硝化率达90.3%，继续培养三个批次亚硝化率均高于90%，结束菌体培养过程，按照步骤（3）制备成菌剂DB。
对比例3
同实施例1，不同在于：在亚硝酸细菌类微生物培养过程中，培养到第10个批次亚硝化率达56.9%后，体系内并没有通入NO气体，继续培养到第20个批次时基质氨氮浓度为150mg/L，亚硝化率只有70%，继续培养三个批次亚硝化率仍然只有72%，结束菌体培养过程，按照步骤（3）制备成菌剂DC。
对比例4
同实施例1，不同在于：在亚硝酸细菌类微生物培养过程中，每一批次补料的同时不加辅酶Ⅰ，培养过程中连续3个批次使氨氮去除率均达95%以上时所用时间基本相同，下一个批次氨氮浓度提高30mg/L；培养到第16个批次亚硝化率才达50.7%，从第17个批次起按照占所通入气体总体积的0.01%通入NO气体，继续培养到第30个批次，此时基质氨氮浓度为150mg/L，亚硝化率达90%，继续培养三个批次亚硝化率均高于90%，结束菌体培养过程，收获菌体。按照步骤（3）制备成菌剂DD。
对比例5
同实施例1，不同在于：步骤（3）是将包埋了碳酸钙的壳聚糖微载体与亚硝酸细菌类微生物按质量比6：4混合均匀，采用离心脱水至含水率40%，在压力为1.5kPa、温度为38℃条件下进行真空干燥，制备成固体菌剂DE。
对比例6
同实施例1，不同在于：按照菌剂中亚硝酸细菌类微生物的质量含量为30%，吸附载体的质量含量为70%制备菌剂DF。
测试例1
取13个1000mL的摇瓶，各加入700mL氨氮浓度为75mg/L的废水，然后按照2g/L分别加入实施例1-7制备的菌剂A-G和对比例1-6制备的菌剂DA-DF，在溶解氧为2mg/L、温度为28℃的条件下进行处理，24h后分析处理效果，具体如表1所示。由表1可知，本发明方法制备的亚硝化菌剂处理效果较好。
表1 不同亚硝化菌剂处理后效果对比
| 菌剂编号 | 氨氮去除率/% | 亚硝化率/% |
| A | 96.7 | 95.6 |
| B | 94.9 | 94.3 |
| C | 93.2 | 92.4 |
| D | 93.1 | 92.1 |
| E | 94.3 | 92.7 |
| F | 93.7 | 92.9 |
| G | 94.1 | 93.1 |
| DA | 80.5 | 60.7 |
| DB | 91.5 | 77.5 |
| DC | 86.1 | 76.3 |
| DD | 87.4 | 79.8 |
| DE | 83.4 | 75.6 |
| DF | 85.1 | 68.9 |
测试例2
实验室准备2个5L的小型曝气反应器，按照2g/L分别接种菌剂A和菌剂DE后进行长期使用效果考察。试验采用连续运行方式，每天处理水量为5L。试验进行一个月后，A菌剂处理后出水氨氮去除率和亚硝化率均高达90%以上，DE菌剂处理后出水氨氮去除率由最初的91.2%降低至70.3%、亚硝化率由最初的91.1%降低至55.2%。由此可见本发明菌剂长期使用后亚硝酸细菌不易流失。
Claims (23)
1.一种亚硝化菌剂，包括亚硝酸细菌类微生物和吸附载体，所述吸附载体包括包埋了碳酸钙的交联壳聚糖和异养菌。
2.根据权利要求1所述的亚硝化菌剂，其特征在于，所述亚硝化菌剂中，亚硝酸细菌类微生物的质量含量为50%-70%，吸附载体的质量含量为30%-50%。
3.根据权利要求1所述的亚硝化菌剂，其特征在于，所述吸附载体中，以质量分数计，异养菌占吸附载体质量的5%-50%，优选10%-30%，包埋了碳酸钙的交联壳聚糖占吸附载体质量的50%-95%，优选70%-90%；所述包埋了碳酸钙的交联壳聚糖中，壳聚糖与碳酸钙的质量比为1-5：0.5-5。
4.根据权利要求1所述的亚硝化菌剂，其特征在于，所述异养菌选自酵母菌、乳酸菌、硫酸盐还原菌中的至少一种，优选为酵母菌；所述的酵母菌选自假丝酵母、隐球酵母、汉逊氏酵母属、毕赤氏酵母、红酵母、球拟酵母或丝孢酵母中的至少一种，优选热带假丝酵母菌；所述的乳酸菌选自乳杆菌、双歧杆菌、乳球菌中的至少一种；所述的硫酸盐还原菌选自脱硫单胞菌、脱硫线菌中的至少一种。
5.一种亚硝化菌剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备吸附载体；
（2）培养亚硝酸细菌类微生物；
（3）将微生物和吸附载体混合制得亚硝化菌剂。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中吸附载体的制备方法为：将包埋了碳酸钙的交联壳聚糖投加到利用有机碳源的异养菌培养体系进行吸附生长，培养至对数生长后期停止，取出固体物干燥得到。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述包埋了碳酸钙的交联壳聚糖的制备方法为在制备交联剂与壳聚糖反应制备交联壳聚糖时引入纳米碳酸钙，制得包埋了碳酸钙的交联壳聚糖。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，将包埋了碳酸钙的交联壳聚糖投加到利用有机碳源的异养菌培养体系进行吸附生长，是指异养菌培养过程初期就投加包埋了碳酸钙的交联壳聚糖进行异养菌边培养边吸附生长；包埋碳酸钙的交联壳聚糖的加入量占总反应体积的20%-30%。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述异养菌培养所需有机碳源为葡萄糖、己糖、木糖、蔗糖、淀粉中的至少一种；所述有机碳源按照加入后体系中质量浓度为1-5g/L进行投加。
10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述异养菌的培养条件为：温度20-38℃，优选20-30℃，pH为6.0-8.5，优选6.0-7.0；静置发酵或者摇床培养。
11.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述异养菌为酵母菌、乳酸菌、硫酸盐还原菌中的至少一种，再优选为酵母菌；所述的酵母菌选自假丝酵母、隐球酵母、汉逊氏酵母属、毕赤氏酵母、红酵母、球拟酵母或丝孢酵母中的至少一种，优选热带假丝酵母菌；所述的乳酸菌选自乳杆菌、双歧杆菌、乳球菌中的至少一种；所述的硫酸盐还原菌选自脱硫单胞菌、脱硫线菌中的至少一种。
12.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述吸附载体制备过程中，培养至对数生长后期，培养24-80h；所述的干燥温度为25-50℃，干燥时间为1-5h。
13.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述亚硝酸细菌类微生物的培养方法为：首先将富含硝化细菌的活性污泥接种到具有搅拌和曝气功能的反应器内，采取批次补料并逐步提高补料中氨氮浓度的操作方式进行亚硝酸细菌的富集培养，结束培养的条件为：亚硝化率达90%以上，结束菌体培养过程，收获菌体；
其中，在亚硝酸细菌培养过程中，每一批次补料的同时均加入羟胺类物质和辅酶；当氨氮去除率达95%以上，结束当前批次，补料进入下一批次培养；当前批次的亚硝化率达30%以上，优选50%-60%时，从下一批次起向培养体系内通入NO和/或NO2气体。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述亚硝酸细菌类微生物的培养方法中，所述的富含硝化细菌的活性污泥按照污泥浓度为2000-5000mg/L进行接种。
15.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述亚硝酸细菌类微生物的培养方法中，所述具有搅拌和曝气功能的反应器，其中，亚硝酸细菌培养过程是在搅拌条件下进行的，曝气是用于维持培养体系内的溶氧量。
16.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述亚硝酸细菌类微生物的培养方法中，所述的辅酶包括选自辅酶Ⅰ、辅酶Ⅱ中的至少一种和辅酶Q10，其中辅酶Ⅰ为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，辅酶Ⅱ为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；选自辅酶Ⅰ、辅酶Ⅱ中的至少一种与辅酶Q10的质量比为8：1-1：8，优选为5：1-1：5。
17.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述亚硝酸细菌类微生物的培养方法中，所述的补料是指补加培养液，批次补料是指补加培养液的方式是每批加一次；所使用的培养液中，基质是氨氮，还含有金属盐；所述的金属盐是钙盐、亚铁盐和铜盐，所述的金属盐按照Ca2+、Fe2+和Cu2+的摩尔比为（8-12）:（2-6）:（1-4）进行配制，使用浓度为0.01-1.0mg/L。
18.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述亚硝酸细菌类微生物的培养方法中，所述的逐步提高补料中氨氮浓度的操作方式如下：初始氨氮浓度为20-100mg/L，每次提高氨氮浓度的幅度为10-50mg/L，提高氨氮浓度的条件如下：对于同一氨氮浓度的补料，连续3-5批次使氨氮去除率均达到95%以上且每一批次所用时间与这几批次平均所用时间相差在10%以内，优选5%以内，即提高下一批次补加料液的氨氮浓度。
19.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述亚硝酸细菌类微生物的培养方法中，所述羟胺类物质为羟胺、盐酸羟胺、硫酸羟胺或者磷酸羟胺中的至少一种，优选为磷酸羟胺；所述羟胺类物质按照加入后在培养体系内的浓度为1-5mg/L进行投加，辅酶按照加入后在培养体系内的浓度为0.001-0.01mg/L进行投加。
20.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述亚硝酸细菌类微生物的培养方法中，NO和/或NO2气体的加入量占所通入气体总体积的0.001%-0.01%。
21.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述亚硝酸细菌类微生物的培养方法中，亚硝酸细菌的富集培养条件如下：温度为18-40℃，溶解氧为0.1-3.0mg/L，pH值为7.0-9.0，优选如下：温度为25-35℃，溶解氧为0.5-2.0mg/L，pH值为7.5-8.5。
22.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述亚硝酸细菌类微生物的培养方法中，结束培养的条件为：连续3-5批次亚硝化率均达90%以上，结束菌体培养过程，收获菌体。
23.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）将微生物和载体混合后的产物脱水至含水率30%-50%，在压力为1-2kPa、温度为35-50℃条件下进行真空干燥，制备成固体菌剂；所述脱水采用重力沉降、离心或过滤中的至少一种方式。
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