CN111004754A - 一种具有抗氧化乳酸菌制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有抗氧化乳酸菌制剂的制备方法,包括以下步骤:(1)将冷冻保存的Lb.plantarum ST‑III菌种接种于MRS液体培养基中厌氧培养,循环传代培养;(2)称绿茶样品2g,加入纯净水浸泡取上清液,经无菌滤膜过滤得绿茶浸出物;(3)配制果薯‑TE混合培养基:将番茄汁和甘薯提取物混合后灭菌,自然冷却至室温后加入所得绿茶浸出物;(4)离心所得菌体培养物得菌体;(5)将收集的菌体经生理盐水清洗三次后重悬于步骤(3)所得的果薯‑TE混合培养基中,充分摇匀后静置发酵;(6)将所得发酵菌体离心、无菌生理盐水洗涤3次离心、去上清,即得具有抗氧化富硒乳酸菌制剂。本发明的优点是采用发酵手段从绿茶中高效富集有机硒并获得具有抗氧化功能的乳酸菌制剂。
Description
技术领域
本发明涉及乳酸菌制剂的技术领域,尤其涉及一种具有抗氧化乳酸菌 制剂及其制备方法。
背景技术
硒是人体必需的微量矿质元素,是维持生命正常生长代谢的重要元 素;已被联合国粮食与农业组织(Food and Agriculture Organization,FAO) 和世界卫生组织(WorldHealth Organization,WHO)共同确认为人体必 需的一种重要微量元素,与机体正常生理功能的维持以及多种疾病的发生 发展密切相关,是哺乳动物体内许多酶活性中心的必需组分,如谷胱甘肽 过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)、脱碘酶(iodothyroninedeiodinases,ID)等,具有保护细胞膜的结构和功能免受过度氧化损伤, 抗癌、解毒、保肝和提高人体免疫力的生理功能。硒在人体无法长期贮存, 也无法合成,人体必须从膳食中不断获得硒元素来供机体需要。据统计我 国有2/3的人口居住在低硒或缺硒的地区,约有3亿人处于缺硒状态, 因而人工补硒方法已受到国内外有关专家的广泛关注。
传统的补硒的方法是用无机的亚硒酸钠制成口服制剂,但亚硒酸钠具 有较强的毒副作用。有研究表明无机硒经生物转化后的有机硒化合物毒性 低且吸收率更高,对于我国推广并用以改善硒缺乏的状态有极大的意义。
近年来富硒乳酸菌已经成为乳酸菌领域一个重要的研究方向,有望取 代富硒酵母成为首选的高效富硒微生态制剂。从相关的知识产权布局来 看,目前对于富硒乳酸菌的研究还仅仅局限于有限的几株乳杆菌;更为重 要的是,已有的研究均为乳酸菌在合成培养基中对于化学无机硒试剂(主 要为硒酸钠)的富集情况,相关结果对于食品行业的指导意义有限。
发明内容
为了解决上述问题,本发明的目的是公开一种具有抗氧化乳酸菌制剂 及其制备方法,在植物乳杆菌ST-III的基础上,采用发酵手段从绿茶中高 效富集有机硒;其中植物乳杆菌ST-III菌种在公告号为CN 1207382C的 发明专利,发明名称为植物乳杆菌ST-III菌株及其在调节血脂方面的应用 中公开。
本发明是通过以下技术方案实现的:
具体地,一方面,提供了一种具有抗氧化乳酸菌制剂的制备方法,包 括以下步骤:
(1)活化菌种:将冷冻保存的Lb.plantarum ST-III菌种接种于MRS 液体培养基中,在37℃下厌氧培养18-22h,循环传代培养2-3次,得菌 体培养物;
(2)制备绿茶浸出物:称取绿茶样品2g,加入100℃、100mL的 纯净水浸泡10min取上清液,经无菌滤膜过滤,得绿茶浸出物;
(3)配制果薯混合培养基:由番茄汁和紫薯提取物混合而成;
其中番茄汁的制备过程为:成熟番茄清洗,去皮,榨汁,过滤取汁, 煮沸10分钟,6000g离心10分钟,取上清;
甘薯提取物的制备过程为:取新鲜甘薯(带皮)洗净后切成约0.5cm3小块,按照100mL/100g的比例加入纯净水,煮沸5分钟,6000g离心5分 钟,取上清;
将上述番茄汁和甘薯提取物按10:1的体积比混合后经115℃10分钟 灭菌,冷却至室温,即得果薯混合培养基;
(4)配制果薯-TE混合培养基:向步骤(3)所得的果薯混合培养基中 加入步骤(2)所得绿茶浸出物;其中所述绿茶浸出物加入果薯-TE混合培养 基的质量浓度为0.10%;
(5)收集菌体:离心步骤(1)所得的菌体培养物,得菌体;
(6)发酵菌体:将步骤(5)收集的菌体经生理盐水清洗三次后重悬 于步骤(3)所得的果薯-TE混合培养基中,充分摇匀后静置37℃发酵 24-48h;
(7)将步骤(6)所得的发酵菌体离心、无菌生理盐水洗涤3次,离 心、去上清,即得所述具有抗氧化富硒乳酸菌制剂。
通过上述技术方案,所得发酵菌体富含硒元素,含硒量可达12.8mg/g。
进一步地,在步骤(2)中,所述无菌滤膜的孔径为0.44μm。
通过上述技术方案,达到除菌效果的同时,减少了高温灭菌对绿茶中 有效成分的破坏。
进一步地,在步骤(6)中,发酵时间为48h。
进一步地,在步骤(4)中,绿茶浸出物的添加量为30mL/L-50mL/L。
进一步地,所述MRS液体培养基的组成为:10g蛋白胨、10g牛肉 膏、5g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸 三钠、1g吐温80、200mg硫酸镁、54mg硫酸锰与1000mL蒸馏水; 所述MRS液体培养基的pH值为6.5,灭菌温度为121℃,灭菌时间为15min。
通过上述技术方案,使得浸出物中含有硒,从而为乳酸菌提供硒的来 源。
另一方面,本发明还提供了一种具有抗氧化富硒乳酸菌制剂,其由上 述的具有抗氧化乳酸菌制剂的制备方法直接制得。
通过上述技术方案,所得的制剂中富含有机硒元素,可以更好的发挥 硒元素的健康功效;同时含有甘薯中的花青素等抗氧化成分。
与现有技术相比,本发明具有以下优点:
①、本发明采用发酵手段从绿茶中高效富集有机硒;
②、本发明中制得的乳酸菌制剂能在富集的同时对硒元素进行转化, 形成有机硒。
③、本发明所得的制剂同时富含花青素等抗氧化成分,可与有机硒发 挥协同作用,提高健康功效。
附图说明
图1是富硒植物乳杆菌ST-III菌泥(ST-III)和富硒鼠李糖乳杆菌GG(L GG)菌泥外观效果图;
图2是富硒乳酸菌的抗氧化能力(Ctrl为普通的乳酸菌,Se+为富集 过硒的乳酸菌);
图3是富硒乳酸菌的抗氧化能力(LGG为富集了硒的鼠李糖乳杆菌 GG,ST-III为富集过硒的植物乳杆菌ST-III);
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制 在所述实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照 常规方法和条件,或按照商品说明书选择。
下述实施例的原料,如未作具体说明,均为市售购买所得。
实施例1
一种具有抗氧化乳酸菌制剂的制备方法,包括以下步骤:
(1)活化菌种:将冷冻保存的Lb.plantarum ST-III菌种接种于MRS 液体培养基中,在37℃下厌氧培养18-22h,循环传代培养2-3次,得菌 体培养物;
(2)制备绿茶浸出物:称取绿茶样品2g,加入100℃、100mL的 纯净水浸泡10min取上清液,经0.44μm无菌滤膜过滤,得绿茶浸出物;
(3)配制果薯混合培养基:由番茄汁和紫薯提取物混合而成;
其中番茄汁的制备过程为:成熟番茄清洗,去皮,榨汁,过滤取汁, 煮沸10分钟,6000g离心10分钟,取上清;
甘薯提取物的制备过程为:取新鲜甘薯(带皮)洗净后切成约0.5cm3小块,按照100mL/100g的比例加入纯净水,煮沸5分钟,6000g离心5分 钟,取上清;
将所述番茄汁和甘薯提取物按10:1的体积比混合后经115℃10分钟 灭菌,冷却至室温,即得果薯混合培养基;
(4)配制果薯-TE混合培养基:向步骤(3)所得的果薯混合培养基中 加入步骤(2)所得绿茶浸出物;其中绿茶浸出物加入的质量浓度为0.10%;
(5)收集菌体:离心步骤(1)所得的菌体培养物,得菌体;
(6)发酵菌体:将步骤(5)收集的菌体经生理盐水清洗三次后重悬 于步骤(3)所得的果薯-TE混合培养基中,充分摇匀后静置37℃发酵48h;
(7)将步骤(6)所得的发酵菌体离心、无菌生理盐水洗涤3次,离 心、去上清,即得具有抗氧化富硒乳酸菌制剂。
按以下方法测定硒含量:按GB 5009.93—2017《食品中硒的测定》 中氢化物原子荧光光谱法进行测定。具体的富硒量按如下公式计算:
富硒量(mg/g)=菌体细胞内硒含量(mg)/菌体中细胞干重(g)
经测定,本实施例1所得的富硒乳酸菌菌泥中的硒含量为12.8mg/g 菌泥。
所得乳酸菌制剂的抗氧化能力测定:乳酸菌的抗氧化能力是用铁氰化 钾/普鲁士蓝法测定的总还原力来进行评估,将磷酸盐缓冲液(2.5mL,0.2 M,pH 6.6)和2.5ml 10mg/mL铁氰化钾溶液与0.5mL菌悬液混合;然后 将混合物在50℃下孵育20分钟,冷却至室温后,向混合物溶液中添加2.5 mL三氯乙酸(100mg/mL),并在1000g下离心10分钟;然后向上清液中添加2.5mL dH2O和0.5mL氯化铁(1.0mg/mL),在室温下孵育10分 钟后,在590nm处测量混合物的吸光度,以此表征总抗氧化能力,关于 普通的乳酸菌和富集过硒的乳酸菌,其抗氧化能力的结果见附图1所示。
实施例2
一种具有抗氧化乳酸菌制剂的制备方法,包括以下步骤:
(1)活化菌种:将冷冻保存的Lb.rhamnosus GG菌种 (Immunomodulatoryconsequences of oral administration of Lactobacillus rhamnosus strain GG inhealthy volunteers.Schultz M,Linde HJ,Lehn N, Zimmermann K,Grossmann J,FalkW,J.J Dairy Res.2003 May;70(2):165-73)接种于MRS液体培养基中,在37℃下厌氧培养 18-22h,循环传代培养2-3次,得菌体培养物;
(2)制备绿茶浸出物:称取绿茶样品2g,加入100℃、100mL的 纯净水浸泡10min取上清液,经0.44μm无菌滤膜过滤,得绿茶浸出物;
(3)配制果薯混合培养基:由番茄汁和紫薯提取物混合而成;
其中番茄汁的制备过程为:成熟番茄清洗,去皮,榨汁,过滤取汁, 煮沸10分钟,6000g离心10分钟,取上清;
甘薯提取物的制备过程为:取新鲜甘薯(带皮)洗净后切成约0.5cm3小块,按照100mL/100g的比例加入纯净水,煮沸5分钟,6000g离心5分 钟,取上清;
将所述番茄汁和甘薯提取物按10:1的体积比混合后经115℃10分钟 灭菌,冷却至室温,即得果薯混合培养基;
(4)配制果薯-TE混合培养基:向步骤(3)所得的果薯混合培养基中 加入步骤(2)所得绿茶浸出物;其中绿茶浸出物加入的质量浓度为0.10%;
(5)收集菌体:离心步骤(1)所得的菌体培养物,得菌体;
(6)发酵菌体:将步骤(5)收集的菌体经生理盐水清洗三次后重悬 于步骤(3)所得的果薯-TE混合培养基中,充分摇匀后静置37℃发酵24h;
(7)将步骤(6)所得的发酵菌体离心、无菌生理盐水洗涤3次,离 心、去上清,即得具有抗氧化富硒乳酸菌制剂。
硒含量测定方法同实施例1;
经测定,所得的具有抗氧化富硒乳酸菌菌泥中的硒含量为7.6mg/g 菌泥。
所得乳酸菌制剂的抗氧化能力:乳酸菌的抗氧化能力是用铁氰化钾/ 普鲁士蓝法测定的总还原力来进行评估,将磷酸盐缓冲液(2.5mL,0.2M, pH 6.6)和2.5ml 10mg/mL铁氰化钾溶液与0.5mL菌悬液混合;然后将混 合物在50℃下孵育20分钟,冷却至室温后,向混合物溶液中添加2.5mL 三氯乙酸(100mg/mL),并在1000g下离心10分钟;然后向上清液中添加2.5mL dH2O和0.5mL氯化铁(1.0mg/mL),在室温下孵育10分钟后, 在590nm处测量混合物的吸光度,以此表征总抗氧化能力,关于富集硒 的鼠李糖乳杆菌GG和富集过硒的植物乳杆菌ST-III,其抗氧化能力的结 果见附图2所示。
对比实施例1
富硒绿茶浸出物的制备:称取恩施富硒绿茶样品2g,加入100mL纯 净水(100℃)浸泡10分钟取上清液,经无菌滤膜(0.44μm)过滤即得 无菌的绿茶浸出物。按GB 5009.93—2017《食品中硒的测定》中氢化物原 子荧光光谱法对其中的硒含量进行测定,测定结果为0.27mg/L。
按实施例1中所述方法,获得硒含量为17.5mg/g的菌泥。取0.1g菌 泥重悬于1mL蒸馏水中,取154μL稀释到1L蒸馏水中,记得硒浓度近似 为0.27mg/L的菌液。
对上述绿茶浸出物与同样含硒量的菌液进行抗氧化能力测定。抗氧化 能力的测定表明,在含硒量相似的前提下,实施例1所得乳酸菌制剂比本 对比实施例得到的单纯富硒茶抗氧化性能更高(结果见附图3所示)。故 实施例1所得制剂比单纯富硒茶效果更优。
以上所述实施方式仅表达了本发明的一种或多种实施方式,其描述较 为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指 出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下, 还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种具有抗氧化乳酸菌制剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)活化菌种:将冷冻保存的Lb.plantarum ST-III菌种接种于MRS液体培养基中,在37℃下厌氧培养18-22h,循环传代培养2-3次,得菌体培养物;
(2)制备绿茶浸出物:称取绿茶样品2g,加入100℃、100mL的纯净水浸泡10min取上清液,经无菌滤膜过滤,得绿茶浸出物;
(3)配制果薯混合培养基:由番茄汁和紫薯提取物混合而成;
其中番茄汁的制备过程为:成熟番茄清洗,去皮,榨汁,过滤取汁,煮沸10分钟,6000g离心10分钟,取上清;
甘薯提取物的制备过程为:取新鲜甘薯(带皮)洗净后切成约0.5cm3小块,按照100mL/100g的比例加入纯净水,煮沸5分钟,6000g离心5分钟,取上清;
将所述番茄汁和甘薯提取物按10:1的体积比混合后经115℃10分钟灭菌,冷却至室温,即得果薯混合培养基;
(4)配制果薯-TE混合培养基:向步骤(3)所得的果薯混合培养基中加入步骤(2)所得绿茶浸出物;其中所述绿茶浸出物加入果薯-TE混合培养基的质量浓度为0.10%;
(5)收集菌体:离心步骤(1)所得的菌体培养物,得菌体;
(6)发酵菌体:将步骤(5)收集的菌体经生理盐水清洗三次后重悬于步骤(3)所得的果薯-TE混合培养基中,充分摇匀后静置37℃发酵24-48h;
(7)将步骤(6)所得的发酵菌体离心、无菌生理盐水洗涤3次,离心、去上清,即得所述具有抗氧化富硒乳酸菌制剂。
2.根据权利要求1所述的富硒乳酸菌制剂的制备方法,其特征在于,在步骤(2)中,所述无菌滤膜的孔径为0.44μm。
3.根据权利要求1所述的具有抗氧化乳酸菌制剂的制备方法,其特征在于,在步骤(6)中,发酵时间为48h。
4.根据权利要求1所述的具有抗氧化乳酸菌制剂的制备方法,其特征在于,在步骤(4)中,绿茶浸出物的添加量为30mL/L-50mL/L。
5.根据权利要求1所述的具有抗氧化乳酸菌制剂的制备方法,其特征在于,所述MRS液体培养基的组成为:10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1g吐温80、200mg硫酸镁、54mg硫酸锰与1000mL蒸馏水;所述MRS液体培养基的pH值为6.5,灭菌温度为121℃,灭菌时间为15min。
6.一种具有抗氧化富硒乳酸菌制剂,其特征在于,其由权利要求1~5任一项所述的具有抗氧化乳酸菌制剂的制备方法直接制得。
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GR01 | Patent grant | ||
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