CN106282068A - 抵抗力可控型芽孢杆菌芽孢的制备方法 - Google Patents

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尹焕才
田晶晶
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Abstract

本案涉及抵抗力可控型芽孢杆菌芽孢的制备方法，包括：低抵抗力菌株筛选、菌株培养条件适应性调节和不同抵抗力的芽孢的诱导制备。本案在保证制备的芽孢数量和芽孢率的同时，通过培养条件及营养的改变，可有效控制调节芽孢的抵抗力，实现芽孢抗力可控调节；通过本案工艺可简单有效控制芽孢抗力，制备适用于灭菌效果监测的指示微生物芽孢；如嗜热脂肪芽孢杆菌，运用本方法，可实现D值1‑7min可控调节；本案操作简单，简化程序，工艺易于放大，易于重复，易于工业化生产；可实现芽孢产量：109个/平板；芽孢产率99％；抗力范围：D值1‑7min可控。

Description

抵抗力可控型芽孢杆菌芽孢的制备方法
技术领域
本发明涉及一种微生物芽孢制备领域，具体涉及一种抵抗力可控型芽孢杆菌芽孢的制备方法。
背景技术
芽胞是细菌营养细胞在营养物质缺乏时，在细胞内形成的含水量极低抗逆性极强的休眠体。芽孢对不良环境如高温、低温、干燥、光线和化学药物等有很强的抵抗力。由于芽孢极强的抗逆性，且抗力强于大多数微生物，因此芽孢作为指示微生物被广泛应用于消毒灭菌效果的监测。比如，嗜热脂肪芽孢杆菌(ATCC 7953)芽孢被用于监测压力蒸汽灭菌、过氧化氢低温等离子体灭菌等，枯草芽胞杆菌黑色变种(ATCC 9372)芽胞被用于监测环氧乙烷灭菌、干热灭菌等。芽孢抗力的稳定性是准确评价各种因子对医疗器械消毒与灭菌效果的前提。
作为指示菌株，依据中国药典要求，其芽孢的抵抗力，必需在一定范围内才能较好的反映灭菌效果，抵抗力大小通常以D值(就是在一定的处理环境中和在一定的热力致死温度条件下某细菌数群中每杀死90％原有残存活菌数时所需要的时间)。如压力蒸汽灭菌中，嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢D值为1.5-3min；环氧乙烷灭菌中，枯草芽胞杆菌黑色变种芽孢在一定的灭菌条件下D值需大于2.5min。
目前，芽孢生产制备的方案较多，主要集中在提高产孢数量和芽孢产率方面。在现有研究中，利用菌株制备芽孢的同时，对芽孢抵抗力实现可控调节均未涉及。
发明内容
针对现有技术的不足之处，本发明的目的在于提出一种抵抗力可控型芽孢杆菌芽孢的制备方法，其通过调节芽孢制备中的营养成分、及变换培养条件，在保证芽孢的产量和产率的同时，实现了制备不同抵抗力芽孢的培养方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案概述如下：
一种抵抗力可控型芽孢杆菌芽孢的制备方法，其包括以下步骤：
1)低抵抗力菌株筛选：
向基础营养培养基中添加琼脂，制成固体培养平板；将嗜热脂肪芽孢杆菌接种于所述固体培养平板，50℃培养，实时监测菌落形态，挑选最先转化成芽孢的菌落，再次接种于基础营养培养基，在50℃、150-250rpm下培养12h后，收集菌株，得到低抵抗力菌株；为后续高D值调节提供种子，因为由低向高调节比较容易。
2)菌株培养条件适应性调节：
将所述低抵抗力菌株以1:5-20的比例，接种于液体抗力调节培养基，在50℃-60℃、150-250rpm下培养12h后，得到菌株悬液；这一步的目的是使菌株逐步适应培养条件及营养环境的变化，防止营养的突变，导致菌体死亡，优胜劣汰，达到优选目的同时扩大菌体数量。
3)不同抵抗力的芽孢的诱导制备：
向抗力调节培养基中添加琼脂，制成抗力调节培养基平板；将所述菌株悬液涂布接种于抗力调节培养基平板表面，50-60℃培养48-60h，收集平板表面的菌苔，根据抗力调节培养基的不同成分，即可获得具有不同抵抗力的芽孢杆菌芽孢。本案发现，培养温度越高，生成芽孢抗力越大；钙离子浓度越高，抗力越大；蛋白胨等营养越多，抗力越大；Mn2+、Mg2 +离子，是超氧化物歧化酶、L-阿拉伯糖异构酶等许多酶的辅助因子或者酶的激活剂，参与多种酶促反应，是微生物生长和芽孢形成所需的一种微量元素，主要与芽孢数量与芽孢率有关。
优选的是，所述的抵抗力可控型芽孢杆菌芽孢的制备方法，其中，所述基础营养培养基包括：8重量份的胰蛋白胨、5重量份酵母提取物、5重量份的氯化钠和1000重量份的蒸馏水。
优选的是，所述的抵抗力可控型芽孢杆菌芽孢的制备方法，其中，所述基础营养培养基的pH为7.2-7.5。
优选的是，所述的抵抗力可控型芽孢杆菌芽孢的制备方法，其中，所述抗力调节培养基包括：8重量份的胰蛋白胨、5重量份酵母提取物、5重量份的氯化钠、1-10重量份的大豆蛋白胨、0.05-0.5重量份的MnSO4·H2O、0.05-0.5重量份的MgSO4·2H2O、0.001-0.1重量份的CaCl2·2H2O和1000重量份的蒸馏水。
优选的是，所述的抵抗力可控型芽孢杆菌芽孢的制备方法，其中，所述抗力调节培养基的pH为7.2-7.5。
优选的是，所述的抵抗力可控型芽孢杆菌芽孢的制备方法，其中，所述抗力调节培养基中还包括有0.1-0.2重量份的CoCl2。
优选的是，所述的抵抗力可控型芽孢杆菌芽孢的制备方法，其中，所述抗力调节培养基中还包括有0.1-0.2重量份的AlCl3。
本发明的有益效果是：
1、本案在保证制备的芽孢数量和芽孢率的同时，通过培养条件及营养的改变，可有效控制调节芽孢的抵抗力，实现芽孢抗力可控调节；
2、通过本案工艺可简单有效控制芽孢抗力，制备适用于灭菌效果监测的指示微生物芽孢；如嗜热脂肪芽孢杆菌，运用本方法，可实现D值1-7min可控调节；
3、本案操作简单，简化程序，工艺易于放大，易于重复，易于工业化生产；可实现芽孢产量：109个/平板；芽孢产率99％；抗力范围：D值1-7min可控。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1
1.低抵抗力菌株筛选：
每升基础营养培养基，添加15重量份琼脂，压力蒸汽灭菌，制备为固体培养平板。将嗜热脂肪芽孢杆菌(ATCC 7953)划线接种于固体培养平板，培养皿用保鲜膜包裹密封，50℃培养倒置培养，通过显微镜，实时监测菌落及菌体形态，挑取最先转化成芽孢的菌落。
再次接种于液体基础营养培养基，50℃，250rpm/min条件下培养12h后，收集菌株。即为低抵抗力菌株。
2.菌株培养条件适应性调节：
取上述菌株悬液2ml，以1:5比例，接种于液体抗力调节培养基(不加琼脂)，50℃，250rpm/min条件下培养12h后，收集菌株。
3.不同抗力芽孢诱导制备：
取上述菌株悬液，约1ml，涂布接种于抗力调节培养基平板表面50℃-60℃培养48-60h，收获平板表面菌苔，依据抗力调节培养基成分不同，即可获得具有不同抗力的芽孢。
3.1抗力调节培养基
每升抗力调节培养基中，固定Mn2+、Mg2+离子浓度为0.25wt％，培养温度为55℃条件下，通过改变大豆蛋白胨及Ca2+添加浓度，实现的芽孢抗力的调节结果，如下表1。抗力结果以D值(min)表示。
其中，基础营养培养基包括：8重量份的胰蛋白胨、5重量份酵母提取物、5重量份的氯化钠和1000重量份的蒸馏水。
抗力调节培养基包括：8重量份的胰蛋白胨、5重量份的酵母提取物、5重量份的氯化钠、1-10重量份的大豆蛋白胨、0.05-0.5重量份的MnSO4·H2O、0.05-0.5重量份的MgSO4·2H2O、0.001-0.1重量份的CaCl2·2H2O和1000重量份的蒸馏水。
表1
实施例2
抗力调节培养基中还包括有0.1-0.2重量份的CoCl2，其余与实施例1相同。
实施例3
抗力调节培养基中还包括有0.1-0.2重量份的AlCl3，其余与实施例2相同。
表2列出实施例2的抗力结果。(每升抗力调节培养基中，固定Mn2+、Mg2+离子浓度为0.25wt％，Ca2+离子浓度为0.01％，培养温度为55℃)
表2
表3列出实施例3的抗力结果。(每升抗力调节培养基中，固定Mn2+、Mg2+离子浓度为0.25wt％，Ca2+离子浓度为0.01％，Co2+离子浓度为0.01％，培养温度为55℃)
表3
需要说明的是，虽然上述数据中对各离子进行了浓度限定，但本案的方案绝不仅限于上述限定的浓度，上述数据只是给出了一些具体的例子来反应由不同离子的引入所给抗力结果(D值)带来的影响变化趋势。并且，这种变化曲线是(或接近)线性的。这给对抗力结果进行可控性设计带来了可能。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (7)

1.一种抵抗力可控型芽孢杆菌芽孢的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)低抵抗力菌株筛选：
向基础营养培养基中添加琼脂，制成固体培养平板；将嗜热脂肪芽孢杆菌接种于所述固体培养平板，50℃培养，实时监测菌落形态，挑选最先转化成芽孢的菌落，再次接种于基础营养培养基，在50℃、150-250rpm下培养12h后，收集菌株，得到低抵抗力菌株；
2)菌株培养条件适应性调节：
将所述低抵抗力菌株以1:5-20的比例，接种于液体抗力调节培养基，在50℃-60℃、150-250rpm下培养12h后，得到菌株悬液；
3)不同抵抗力的芽孢的诱导制备：
向抗力调节培养基中添加琼脂，制成抗力调节培养基平板；将所述菌株悬液涂布接种于抗力调节培养基平板表面，50-60℃培养48-60h，收集平板表面的菌苔，根据抗力调节培养基的不同成分，即可获得具有不同抵抗力的芽孢杆菌芽孢。
2.根据权利要求1所述的抵抗力可控型芽孢杆菌芽孢的制备方法，其特征在于，所述基础营养培养基包括：8重量份的胰蛋白胨、5重量份酵母提取物、5重量份的氯化钠和1000重量份的蒸馏水。
3.根据权利要求1所述的抵抗力可控型芽孢杆菌芽孢的制备方法，其特征在于，所述基础营养培养基的pH为7.2-7.5。
4.根据权利要求1所述的抵抗力可控型芽孢杆菌芽孢的制备方法，其特征在于，所述抗力调节培养基包括：8重量份的胰蛋白胨、5重量份的酵母提取物、5重量份的氯化钠、1-10重量份的大豆蛋白胨、0.05-0.5重量份的MnSO4·H2O、0.05-0.5重量份的MgSO4·2H2O、0.001-0.1重量份的CaCl2·2H2O和1000重量份的蒸馏水。
5.根据权利要求1所述的抵抗力可控型芽孢杆菌芽孢的制备方法，其特征在于，所述抗力调节培养基的pH为7.2-7.5。
6.根据权利要求4所述的抵抗力可控型芽孢杆菌芽孢的制备方法，其特征在于，所述抗力调节培养基中还包括有0.1-0.2重量份的CoCl2。
7.根据权利要求6所述的抵抗力可控型芽孢杆菌芽孢的制备方法，其特征在于，所述抗力调节培养基中还包括有0.1-0.2重量份的AlCl3。
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