CN103333843B - 一种油菜假单胞菌及其培养方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种油菜假单胞菌及其培养方法和应用，该油菜假单胞菌分类命名为油菜假单胞菌(Pseudomonas brassicacearum)，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.6774，将油菜假单胞菌接种到液体培养基中，在24-28℃下培养得到假单胞菌产品；所述液体培养基含有3-5％重量的可溶性淀粉、0.1-0.3％重量的无水硫酸镁，1-3％重量的蛋白胨，0.2-0.4％重量的磷酸氢二钾，余量为水，所得假单胞菌产品用作生防菌剂的活性成分，与现有技术相比，本发明具有所用原料组成简单、价格低廉、来源广泛，而且生产过程中无污染性废料、废渣和废气的产生，非常环保等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一株生防菌株，尤其是涉及一种油菜假单胞菌及其培养方法和应用。
背景技术
油菜假单胞菌(Pseudomonas brassicacearum)是一种重要的植物根际促生细菌，从植物根围分离到的油菜假单胞菌大部分都具有防病增产作用，因而可能用于植物病害的生物防治。该类菌株对油菜立枯病菌、黄瓜霜霉病和白粉病菌、小麦根腐病菌、水稻纹枯病病菌、菜豆炭疽病菌、番茄叶霉病菌、小麦全蚀病菌、白菜黑斑病菌、烟草黑胫病菌、番茄灰霉病菌和芦笋茎枯病菌等多种蔬菜和粮食作物病原真菌均有较强的抑制作用，并且能够在多种作物根际进行定殖，显示了在生物防治中应用的潜力。
发明内容
本发明的目的就是为了提供一种所用原料组成简单、价格低廉、来源广泛，而且生产过程中无污染性废料、废渣和废气的产生，非常环保的油菜假单胞菌及其培养方法和应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种油菜假单胞菌，其特征在于，该油菜假单胞菌分类命名为油菜假单胞菌(Pseudomonas brassicacearum)，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.6774。
本发明油菜假单胞菌通过以下技术路线来实现：
分离一株假单胞菌株，筛选步骤如下：
1)2010年从安徽徐州、江西新余、江苏南通及上海松江等蔬菜种植基地采集25个土样，利用牛肉膏蛋白胨培养基进行分离，共分离得到300多菌株。
2)然后进行平板拮抗实验，得到对番茄灰霉病有较好拮抗效果的菌株25株。
3)通过盆栽试验，进一步筛选对番茄灰霉病具有相对稳定的拮抗复筛细菌5菌株。
4)该生防菌株nlsy003是复筛细菌中对番茄灰霉病拮抗作用最强的一株。根据菌株的形态特征、培养特征和生理生化特征，参照杰氏细菌鉴定手册，对该菌株进行鉴定，初步确定属于假单胞菌属，它采自于江西新余。
所述的油菜假单胞菌为直的杆菌，大小为0.7-0.8X2.3-2.8微米，不产芽孢，革兰氏染色阴性；在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上培养时菌落圆形，边缘整齐规则，表面湿润光滑，菌落半透明、土黄色，菌苔薄。
一种培养油菜假单胞菌的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：将油菜假单胞菌接种到液体培养基中，在24-28℃下培养得到假单胞菌产品；所述液体培养基含有3-5％重量的可溶性淀粉、0.1-0.3％重量的无水硫酸镁，1-3％重量的蛋白胨，0.2-0.4％重量的磷酸氢二钾，余量为水。
所述的液体培养基含有3％重量的可溶性淀粉、0.2％重量的无水硫酸镁，2.5％重量的蛋白胨，0.2％重量的磷酸氢二钾，余量为水。
所述的培养的温度为26℃。
一种油菜假单胞菌的应用，其特征在于，以油菜假单胞菌为活性成分的生防菌剂。
将培养得到的假单胞菌株nlsy003产品可配成浓度为10×109个/毫升的细菌悬浮液，保存在14℃～16℃左右的环境中，保存期一年，作为生防菌剂使用时，将该悬浮剂稀释500-1000倍使用。
与现有技术相比，本发明的nlsy003假单胞菌株对黄瓜霜霉病、自粉病、番茄叶霉病、水稻纹枯病、稻瘟病、小麦全蚀病、棉花枯萎病等具有良好的抑制效果。该菌剂液体发酵工艺中所用原料组成简单、价格低廉、来源广泛，而且生产过程中无污染性废料、废渣和废气的产生，非常环保。用该产品防治蔬菜和农作物病害，可以减少化学农药对环境的污染，而且对人畜十分安全。
油菜假单胞菌nlsy003对植物病原菌具有高效广谱的抑菌作用，对油菜立枯病(L)、小麦根腐病(G)、水稻纹枯病(W)、菜豆炭疽病(T)、番茄叶霉病(M)、小麦全蚀病(Q)、白菜黑斑病(B)、烟草黑胫病(Y)、番茄灰霉病(F)、芦笋茎枯病(J)的抑菌试验结果见下表：
| 病原菌 | L | G | W | T | M | Q | B | Y | F | J |
| EC50(mg/L) | 0.72 | 0.80 | 0.37 | 0.54 | 2.78 | 1.20 | 1.76 | 2.44 | 2.35 | 0.85 |
EC50为半致死浓度，浓度越低，表示抑菌作用越强。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：筛选生防菌株Pseudomonas brassicacearum nlsy003(保藏号：CGMCC NO.6774)
2010年从江西新余蔬菜种植基地采集5个土样，利用牛肉膏蛋白胨培养基进行分离，共分离得到25个菌株；然后进行平板拮抗实验，得到对番茄灰霉病有较好拮抗效果的菌株5株；通过盆栽试验，进一步筛选对番茄灰霉病具有相对稳定的拮抗复筛细菌nlsy003(保藏号：CGMCC NO.6774)。
实施例2：培养生防菌株Pseudomonas brassicacearum nlsy003(保藏号：CGMCC NO.6774)
采用液体发酵大量的生防菌产品：将菌株接种到液体培养基中，在26℃下培养得到假单胞菌产品。液体培养基含有3％重量的可溶性淀粉，0.2％重量的无水硫酸镁，2.5％重量的蛋白胨，0.2％重量的磷酸氢二钾，余量为水。将培养基在0.15MPa下灭菌115分钟，自然冷却后用于接种。接种后将搅拌器的转速调为180rpm，保持26℃培养30小时后出灌。
将发酵液以3000rpm的转速离心20分钟，去掉上清，取出菌体沉淀物，用无菌水将其配成100亿/毫升的孢子悬浮液，置于冰箱中冷藏，可以保存十个月以上。
实施例3：培养生防菌株Pseudomonas brassicacearum nlsy003(保藏号：CGMCC NO.6774)
培养方式等同于实施例2，不同之处在于所用的液体培养基为：4％重量的可溶性淀粉，0.1％重量的无水硫酸镁，2.0％重量的蛋白胨，0.15％重量的磷酸氢二钾，余量为水。
实施例4：生防菌株Pseudomonas brassicacearum nlsy003(保藏号：CGMCC NO.6774)防治番茄灰霉病的药效试验
在温室盆栽番茄苗，人工接种灰霉病，发病后，将实施例2得到的生防菌产品在室温下用无菌水配置成细菌浓度为2×107个/毫升的悬浮液，对照为清水。每隔7天喷雾一次，共两次，在第二次用药后十天进行调查统计。喷本发明菌剂的处理对番茄灰霉病的抑制率达75％以上。
实施例5：生防菌株Pseudomonas brassicacearum nlsy003(保藏号：CGMCC NO.6774)防治水稻纹枯病的药效试验
在温室盆栽水稻，人工接种纹枯病菌块，发病后，将实施例2得到的生防菌产品在室温下用无菌水配置成细菌浓度为2×107个/毫升的悬浮液，对照为清水。每隔7天喷雾一次，共两次，在第二次用药后十天进行调查统计。喷本发明菌剂的处理对水稻纹枯病的抑制率达70％以上。
实施例6：生防菌株Pseudomonas brassicacearum nlsy003(保藏号：CGMCC NO.6774)防治黄瓜霜霉病的药效试验
在温室盆栽水稻，人工接种纹枯病菌块，发病后，将实施例2得到的生防菌产品在室温下用无菌水配置成细菌浓度为2×107个/毫升的悬浮液，对照为清水。每隔7天喷雾一次，共两次，在第二次用药后十天进行调查统计。喷本发明菌剂的处理对黄瓜霜霉病的抑制率达81％以上。
实施例7：生防菌株Pseudomonas brassicacearum nlsy003(保藏号：CGMCC NO.6774)防治黄瓜白粉病的药效试验
在温室盆栽水稻，人工接种纹枯病菌块，发病后，将实施例2得到的生防菌产品在室温下用无菌水配置成细菌浓度为2×107个/毫升的悬浮液，对照为清水。每隔7天喷雾一次，共两次，在第二次用药后十天进行调查统计。喷本发明菌剂的处理对黄瓜白粉病的抑制率达83％以上。
实施例8：培养生防菌株Pseudomonas brassicacearum nlsy003(保藏号：CGMCC NO.6774)
培养方式等同于实施例2，不同之处在于所用的液体培养基为：5％重量的可溶性淀粉，0.1％重量的无水硫酸镁，1％重量的蛋白胨，0.2％重量的磷酸氢二钾，余量为水。
实施例9：培养生防菌株Pseudomonas brassicacearum nlsy003(保藏号：CGMCC NO.6774)
培养方式等同于实施例2，不同之处在于所用的液体培养基为：3％重量的可溶性淀粉，0.3％重量的无水硫酸镁，3％重量的蛋白胨，0.4％重量的磷酸氢二钾，余量为水。
Claims (3)
1.一种培养油菜假单胞菌的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：将油菜假单胞菌接种到液体培养基中，在24-28℃下培养得到假单胞菌产品；所述液体培养基含有3-5％重量的可溶性淀粉、0.1-0.3％重量的无水硫酸镁，1-3％重量的蛋白胨，0.2-0.4％重量的磷酸氢二钾，余量为水；所述的油菜假单胞菌分类命名为油菜假单胞菌(Pseudomonas brassicacearum)，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO6774。
2.根据权利要求1所述的培养油菜假单胞菌的方法，其特征在于，所述的液体培养基含有3％重量的可溶性淀粉、0.2％重量的无水硫酸镁，2.5％重量的蛋白胨，0.2％重量的磷酸氢二钾，余量为水。
3.根据权利要1或2所述的培养油菜假单胞菌的方法，其特征在于，所述的培养的温度为26℃。
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