CN103146602A - 乳酸菌液态混菌发酵方法、所得菌剂及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乳酸菌液态混菌发酵方法，本发明将屎肠球菌、乳酸杆菌、及粪肠球菌接种至同一液态发酵培养基进行发酵培养，得到发酵液，再向发酵液中添加酵母多糖，混合均匀后即得到乳酸菌液态混菌发酵菌剂。本发明还公开了经乳酸菌液态混菌发酵方法获得的乳酸菌液态混菌发酵菌剂以及该菌剂作为鱼用益生素的用途。本发明可节约生产成本，降低发酵能耗，所得产品活性稳定，用于预防鱼类的细菌性疾病有很好的效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种乳酸菌发酵方法，尤其涉及一种乳酸菌液态混菌发酵方法，本发明还涉及用该方法制得的乳酸菌液态混菌发酵菌剂，本发明还进一步涉及了乳酸菌液态混菌发酵菌剂作为鱼用益生素的用途。
背景技术
人工水产养殖中，引起鱼类高死亡率的各种细菌性疾病是影响其生产的棘手问题，目前，生产中多使用各种抗生素来预防和治疗鱼类的细菌性疾病，而抗生素的大量使用带来的药物残留和耐药菌株等负面效应已引起了学术界和消费者的高度关注。为此，国内外科学家都致力于各种抗生素替代品的研究，其中，绿色环保的鱼用益生素的开发正成为国际上的研究热点。
大量的研究表明，乳酸菌能够调节机体肠道正常菌群，保持微生态平衡，提高食物消化率和生物价，增强机体的免疫功能，提高机体的抗病能力，产生抑菌活性代谢产物，如乳酸菌肽、细菌素、乳酸、过氧化氢、乙酸等，对许多革兰氏阳性菌李斯特氏菌、芽孢菌、梭菌等及革兰氏阴性菌大肠杆菌等有强烈的抑制作用，可抑制肠道内腐败菌的生长繁殖和腐败产物的产生。乳酸菌益生素作为鱼、虾饲料添加剂受到广泛的研究，有提高养殖动物的免疫力，抵御病原菌的侵袭，提高养殖成活率的效果。
现有乳酸菌固态发酵多为熟料发酵，能耗大，生产成本高，且多采用单菌种发酵，菌种单一，代谢产物种类及数量均有限，所得到的发酵产品的活菌数量低，保质期短，储存过程中活性不断降低，产品质量难以保障。
乳酸菌液态产品保质期长短及保质期内乳酸菌活菌数、代谢产物与质量息息相关。在储存过程中，乳酸菌液态产品的质量主要受两个因素影响：一、乳酸菌活菌数降低，失去菌落优势，从而使得杂菌滋生，导致产品变质。二、pH降低，乳酸菌代谢产物易失去活性，导致产品效果受损。
酵母多糖是一种绿色饲料添加剂，具有提高水产动物免疫功能，调节动物肠道微生态平衡(促进有益菌增殖、控制致病菌生长)，从而维持动物的生长和健康。因此，酵母多糖与益生菌的联用，即合生素在水产养殖中的应用具有很好的前景。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种生产成本较低、产品活菌数高的乳酸菌液态混菌发酵方法。本发明的另一个目的是公开了使用本发明的乳酸菌液态混菌发酵方法所得菌剂和所述菌剂作为鱼用益生素的用途。
为达到所述目的，本发明的技术方案如下：
一种乳酸菌液态混菌发酵方法，包括如下步骤：
(a)将屎肠球菌（Enterococcus Faecium）、乳酸杆菌（Lacticacid bacteria）、及粪肠球菌（Enterococcus faecalis）接种至同一液态发酵培养基进行发酵培养，得到发酵液。
(b)向发酵液中添加酵母多糖，混合均匀后即得到乳酸菌液态混菌发酵菌剂。
其中，上述步骤(a)中屎肠球菌（Enterococcus Faecium）、乳酸杆菌（Lacticacidbacteria）、及粪肠球菌（Enterococcus faecalis）的接种量相等，均为液态发酵培养基重量的1.8～2.2‰，培养条件为：36～38℃恒温发酵24～30h；所述液态发酵培养基由以下组分组成：按重量百分比记，蔗糖4～6‰，柠檬酸三铵1.5～2.5‰，酵母膏4～6‰，乙酸钠1.5～2.5‰，磷酸氢二钾1.5～2.5‰，硫酸镁0.16～0.24‰，硫酸锰0.03～0.07‰，生石灰0.8～1.2‰，余量为水；按上述配方配制好液态发酵培养基后，调节pH值至7.5～8.0；所述液态发酵培养基可无需灭菌处理，直接接种发酵。
其中，上述步骤(a)中屎肠球菌（Enterococcus Faecium）、乳酸杆菌（Lacticacidbacteria）、及粪肠球菌（Enterococcus faecalis）的接种量优选为2‰，培养条件优选为：37℃恒温发酵24h；所述液态发酵培养基各组分含量优选为：按重量百分比记，蔗糖5‰，柠檬酸三铵2‰，酵母膏5‰，乙酸钠2‰，磷酸氢二钾2‰，硫酸镁0.2‰，硫酸锰0.05‰，生石灰1‰，余量为水；按上述配方配制好液态发酵培养基后，调节pH值至8.0；所述液态发酵培养基可无需灭菌处理，直接接种发酵。
其中，上述步骤(b)中向发酵液中添加的酵母多糖重量为发酵液重量的1.5～2.5‰，优选的，添加的酵母多糖重量为发酵液重量的2‰。
用上述方法获得的乳酸菌液态混菌发酵菌剂和所述乳酸菌液态混菌发酵菌剂作为鱼用益生素的用途也属于本发明的保护范围。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
（1）本发明所用的采用生料发酵（培养基不需灭菌），发酵能耗大大降低，节约生产成本；
（2）本发明采用三种乳酸菌混合发酵，无论是活菌或是代谢产物都更加丰富，对致病菌的抑制效果更佳；
（3）本发明的乳酸菌液态混菌发酵菌剂在储存过程中活性稳定，抗杂菌能力强，提高了产品质量。
本发明的详细内容可通过后述的说明及所附图而得到。
附图说明
图1为本发明乳酸菌液态混菌发酵方法的工艺路线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步描述，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实验材料
本发明所涉及的部分菌种购于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心，屎肠球菌（Enterococcus Faecium）产品编号为：ACCC00658，乳酸杆菌（Lacticacid bacteria）产品编号为：ACCC11026，粪肠球菌（Enterococcusfaecalis）产品编号为：ACCC10180；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）产品编号为：ACCC02973；
本发明所涉及的地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis）和侧孢芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus）为华中农业大学农业微生物学国家重点实验室赠送提供。
预备试验例1乳酸菌的筛选
1实验材料与方法
1.1实验菌株
指示菌：肠型点状产气单胞菌T1是从患肠炎病草鱼中分离，并经回归感染确认有致病性的菌株。鱼害粘球菌T2是从患烂鳃病草鱼中分离，并经回归感染确认有致病性的菌株。
1.2培养基
试验菌培养基、指示菌培养基及检测培养基均为牛肉膏蛋白胨培养基。
1.3测定方法
抑菌活性检测采用平板打孔抑菌圈测定法。
平板打孔抑菌圈测定法：制作牛肉膏蛋白胨培养基，无菌操作倒平板，每个平板的培养基厚度为6mm，取指示菌菌悬液0.1mL，涂布于牛肉膏蛋白胨培养基表面，选择一定的位置，在无菌条件下，用无菌打孔器打孔，孔径为10mm，将试验菌培养液注入孔内（不能溢出），于37℃培养24h，检测抑菌圈直径的大小。
2实验结果
2.1菌株筛选
表1为不同菌株采用牛肉膏蛋白胨培养基37℃培养24h后调pH至4.65的培养液，采用平板打孔发测定抑菌圈的大小。
表1不同菌株对指示菌的抑菌活性
由表1结果可以看出，三株乳酸菌（屎肠球菌、乳酸杆菌、粪肠球菌）的抑菌效果明显优于芽孢杆菌；而且相同pH值的HCl水没有抑菌活性，说明三株乳酸菌的抑菌效果并不是pH值低造成的。
2.2菌株组合筛选
将筛选得到的三个菌株两两混合培养及三株菌混合培养的产物进行抑菌效果比较，即将牛肉膏蛋白胨培养基接种后37℃混合培养24h，调培养液pH至4.65，最后采用平板打孔发测定抑菌圈的大小，结果如表2所示。
表2三株乳酸菌的组合对指示菌的抑菌活性
由表2结果可以看出，三株乳酸菌混合培养液的抑菌效果明显优于两两组合的混合培养液，同时高于单株菌培养液（表1）。可见，三株乳酸菌对致病菌的抑制作用有协同效应，混菌培养液能达到最佳抑菌效果。
预备实施例1液态发酵培养基的制备
配制液态发酵培养基，其组成为：按重量百分比记，蔗糖5‰，柠檬酸三铵2‰，酵母膏5‰，乙酸钠2‰，磷酸氢二钾2‰，硫酸镁0.2‰，硫酸锰0.05‰，生石灰1‰，余量为水；按重量百分比称取各组分加入水中，搅拌至溶解，调pH值至8.0。
预备实施例2固态发酵培养基的制备
配制固态发酵培养基，其组成为：按重量百分比记，蔗糖5‰，柠檬酸三铵2‰，酵母膏5‰，乙酸钠2‰，磷酸氢二钾2‰，硫酸镁0.2‰，硫酸锰0.05‰，生石灰3％，余量为麸皮；以麸皮为基质，按重量百分比称取各组分加入麸皮，搅拌混匀。
实施例1乳酸菌液态混菌发酵菌剂的制备
1.将购买来的屎肠球菌（Enterococcus Faecium）、乳酸杆菌（Lacticacidbacteria）和粪肠球菌（Enterococcus faecalis）菌株分别接种于装有液态发酵培养基的小三角瓶中恒温振荡培养，培养温度为37℃，培养时间为24h，得到这三个菌种的菌液。
2.将步骤1所得的三种菌液再接种至同一液态发酵培养基进行扩大培养，每种菌液的接种量相等，均为液态发酵培养基重量的2‰，培养温度为37℃，培养时间为24h，得到发酵液。
3.在发酵液中加入2‰的酵母多糖，混合均匀后即得到乳酸菌液态混菌发酵菌剂。
对照例1屎肠球菌液态发酵菌剂
1.将购买来的屎肠球菌（Enterococcus Faecium）、乳酸杆菌（Lacticacidbacteria）和粪肠球菌（Enterococcus faecalis）菌株分别接种于装有灭过菌的液态发酵培养基的小三角瓶中恒温振荡培养，培养温度为37℃，培养时间为24h，得到这三个菌种的菌液。
2.将步骤1所得的三种菌液接种于装有灭过菌的固态发酵培养基的发酵袋中恒温发酵，发酵温度为37℃，发酵时间为48h，发酵结束后将发酵物料在50℃烘干至水分含量为10%，得到这三个菌种的菌粉。
3.将步骤2所得的三种菌粉再接种至同一液态发酵培养基进行扩大培养，每种菌液的接种量相等，均为液态发酵培养基重量的2‰，培养温度为37℃，培养时间为24h，得到发酵液。
4.在发酵液中加入2‰的酵母多糖，混合均匀后即得到乳酸菌液态混菌发酵菌剂。
对照例2乳酸杆菌液态发酵菌剂
1.将购买来的乳酸杆菌（Lacticacid bacteria）接种于装有灭过菌的液态发酵培养基的小三角瓶中恒温振荡培养，培养温度为37℃，培养时间为24h，得到屎肠球菌菌液。
2.将步骤1所得的乳酸杆菌菌液接种于装有灭过菌的固态发酵培养基的发酵袋中恒温发酵，发酵温度为37℃，发酵时间为48h，发酵结束后将发酵物料在50℃烘干至水分含量为10%，得到乳酸杆菌菌粉。
3.将步骤2所得的乳酸杆菌菌粉再接种至液态发酵培养基进行扩大培养，接种量为液态发酵培养基重量的2‰，培养温度为37℃，培养时间为24h，得到乳酸杆菌的发酵液。
4.在发酵液中加入2‰的酵母多糖，混合均匀后即得到乳酸杆菌液态发酵菌剂。
对照例3粪肠球菌液态发酵菌剂
1.将购买来的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）接种于装有灭过菌的液态发酵培养基的小三角瓶中恒温振荡培养，培养温度为37℃，培养时间为24h，得到屎肠球菌菌液。
2.将步骤1所得的粪肠球菌菌液接种于装有灭过菌的固态发酵培养基的发酵袋中恒温发酵，发酵温度为37℃，发酵时间为48h，发酵结束后将发酵物料在50℃烘干至水分含量为10%，得到粪肠球菌菌粉。
3.将步骤2所得的粪肠球菌菌粉再接种至液态发酵培养基进行扩大培养，接种量为液态发酵培养基重量的2‰，培养温度为37℃，培养时间为24h，得到粪肠球菌的发酵液。
4.在发酵液中加入2‰的酵母多糖，混合均匀后即得到粪肠球菌液态发酵菌剂。
试验例1本发明产品对致病菌的抑制作用检测
1.试验材料与方法
1.1实验菌株
指示菌：肠型点状产气单胞菌T1是从患肠炎病草鱼中分离，并经回归感染确认有致病性的菌株。鱼害粘球菌T2是从患烂鳃病草鱼中分离，并经回归感染确认有致病性的菌株。
1.2培养基
指示菌培养基及检测培养基均为牛肉膏蛋白胨培养基。
1.3检测方法
抑菌活性检测采用平板打孔抑菌圈测定法。
平板打孔抑菌圈测定法：制作牛肉膏蛋白胨培养基，无菌操作倒平板，每个平板的培养基厚度为6mm，取指示菌菌悬液0.1mL，涂布于牛肉膏蛋白胨培养基表面，选择一定的位置，在无菌条件下，用无菌打孔器打孔，孔径为10mm，将乳酸菌液态混菌发酵菌剂注入孔内（不能溢出），于37℃培养24h，检测抑菌圈直径的大小。
2实验结果
2.1乳酸菌及其代谢产物对指示菌的抑制作用
表3为本发明实施例1的乳酸菌液态混菌发酵菌剂以及该菌剂经5000rpm，15min离心后取得的上清液，采用平板打孔测定抑菌圈的大小。表4为实施例1乳酸菌液态混菌发酵菌剂及三个对照例的乳酸菌单菌发酵后调pH至4.65的发酵液，采用平板打孔测定抑菌圈的大小。
表3本发明产品及上清液对指示菌的抑菌活性
表4本发明产品及单菌发酵液对指示菌的抑菌活性
从表3试验可看出本发明产品与其上清液对致病菌T1、T2都有抑菌圈，而相同pH值的HCl水却没有，可见发酵液与上清液的抑菌效果并不是pH值低造成的。试验结果表明本发明产品比上清液对指示菌的抑菌圈大，说明本发明产品的抑菌活性强于上清液，乳酸菌及其代谢产物对致病菌有协同抑制作用。本发明产品对致病菌T1、T2的抑菌圈大小不同，上清液也是如此，表明本发明产品对不同种类致病菌的抑菌活性不同。
由表4结果可看出本发明产品对致病菌T1、T2的抑菌效果明显强于对照例的三株乳酸菌单菌发酵液，且不同乳酸菌对不同种类致病菌的抑菌活性不同。
本发明实施例1产品用无菌生理盐水稀释1、2、3倍，其稀释液对指示菌的抑菌能力见表5。
表5不同稀释倍数的本发明产品对指示菌的抑菌活性
从表5中可看出本发明产品经3倍稀释后对致病菌T1、T2仍有抑制作用。
2.2本发明产品中抑菌活性物质的耐热性实验
将本发明实施例1产品于60、80℃恒温水浴中保温15min，及沸水浴中保温5、10、15min，与未处理的本发明实施例1产品一起做抑菌活性实验，实验结果见表6。
表6不同温度及时间处理的本发明产品对指示菌的抑菌活性
从表6的实验结果可知，本发明产品经60、80℃恒温水浴中保温15min，及沸水浴中保温5、10、15min后，对致病菌T1、T2仍有很好的抑制作用。由此可见，本发明产品中抑菌活性物质具有很好的耐热性，可避免在饲料制作过程瞬间高温的破坏，而保持其活性。
试验例2本发明产品储存过程中活性变化规律
1实验材料与方法
1.1培养基
指示菌培养基及检测培养基均为牛肉膏蛋白胨培养基。
1.2活菌数测定方法
将待测样品按10倍稀释法制成不同浓度稀释液，从稀释液中分别吸取100μl菌液涂平板，每一稀释度做3次重复。将无菌培养基熔化后倒平板，待凝固后编号，然后量取吸取100μl菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上（每个编号设三个重复）。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度共用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板于37℃倒置培养24h，进行菌落计数。选择适宜的稀释度Z，采用菌落数在30-300个之间的平板进行计数。
1.3活菌数计算方法
W=X×Z×10
式中W-------样品中乳酸菌活菌数，CFU/ml；
X-------平板上乳酸菌菌落平均数；
Z-------样品稀释倍数。
2.实验结果
表7为本发明实施例1产品及三个对照例的乳酸菌单菌液态发酵菌剂储存一月内，每周取样后采用稀释涂平板法测定活菌数。表8为添加酵母多糖及未添加酵母多糖的本发明实施例1发酵液储存半年时间内，每月取样后采用稀释涂平板法测定活菌数。
表7本发明产品及乳酸菌单菌发酵液储存一月内活菌数变化
表8本发明产品及未添加酵母多糖的发酵液储存半年内活菌数变化
由表7结果可以看出，本发明产品相比于三个对照例的单菌液态发酵菌剂不仅生物量高，而且保质期长，在储存过程中活性稳定，产品质量有保障。从表8结果可看出，本发明产品添加酵母多糖后，生物量变化幅度小，活性稳定。
Claims (9)
1.一种乳酸菌液态混菌发酵方法，包括如下步骤：
(a)将屎肠球菌（Enterococcus Faecium）、乳酸杆菌（Lacticacid bacteria）、及粪肠球菌（Enterococcus faecalis）的菌液接种至同一液态发酵培养基进行发酵培养，得到发酵液；
(b)向发酵液中添加酵母多糖，混合均匀后即得到乳酸菌液态混菌发酵菌剂。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述步骤(a)中屎肠球菌（Enterococcus Faecium）、乳酸杆菌（Lacticacidbacteria）、及粪肠球菌（Enterococcus faecalis）菌液的接种量相等，均为液态发酵培养基重量的1.8～2.2‰，培养条件为：36～38℃恒温发酵24～30h。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述步骤(a)中液态发酵培养基由以下组分组成：按重量百分比记，蔗糖4～6‰，柠檬酸三铵1.5～2.5‰，酵母膏4～6‰，乙酸钠1.5～2.5‰，磷酸氢二钾1.5～2.5‰，硫酸镁0.16～0.24‰，硫酸锰0.03～0.07‰，生石灰0.8～1.2‰，余量为水；按上述配方配制好液态发酵培养基后，调节pH值至7.5～8.0。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述步骤(b)中向发酵液中添加的酵母多糖重量为发酵液重量的1.5～2.5‰。
5.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：
所述步骤(a)中屎肠球菌（Enterococcus Faecium）、乳酸杆菌（Lacticacidbacteria）、及粪肠球菌（Enterococcus faecalis）的接种量均为液态发酵培养基重量的2‰，培养条件为：37℃恒温发酵24h。
6.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述步骤(a)中液态发酵培养基由以下组分组成：按重量百分比记，蔗糖5‰，柠檬酸三铵2‰，酵母膏5‰，乙酸钠2‰，磷酸氢二钾2‰，硫酸镁0.2‰，硫酸锰0.05‰，生石灰1‰，余量为水；按上述配方配制好液态发酵培养基后，调节pH值至8.0。
7.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤(b)中向发酵液中添加的酵母多糖重量为发酵液重量的2‰。
8.按照权利要求1～7任何一项所述方法获得的乳酸菌液态混菌发酵菌剂。
9.按照权利要求8所述的乳酸菌液态混菌发酵菌剂作为鱼用益生素的用途。
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