CN108707569A - 屎肠球菌高效发酵培养基及其发酵培养方法 - Google Patents

屎肠球菌高效发酵培养基及其发酵培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出一种屎肠球菌高效发酵培养基及其发酵培养方法，属于乳酸菌的培养技术领域，该发酵培养基能够高效优化发酵工艺、显著提高其发酵活菌量，并且成本极低。该高效发酵培养基的配方包括：玉米粉：30～50g/L，尿素：3～6g/L，结晶乙酸钠：7～10g/L，磷酸氢二钾：2～4g/L，无水硫酸镁：0.05～0.40g/L，硫酸锰：0.04～0.08g/L，柠檬酸氢二铵：1～3g/L，吐温‑80：0.8～1.2g/L。本发明能够应用于屎肠球菌Enterococcus faecium E.F‑2 CCTCC No:M 2018314的高效发酵培养中。

Description

屎肠球菌高效发酵培养基及其发酵培养方法
技术领域
本发明属于乳酸菌培养技术领域，尤其涉及一种屎肠球菌超低成本高效发酵培养基及其发酵培养方法。
背景技术
目前，抗菌药的不合理使用加大畜禽产品中药物残留，耐药菌株也随之增加。抗菌药不仅对有害菌具有灭杀作用，其对肠道内的正常微生物群也有抑制和杀灭作用，长期使用会导致胃肠道正常菌群失调，引起动物的内源性感染或者二重性感染。长此以往，将严重影响养殖业的可持续发展，对人类食品安全和抗菌药资源利用也是一种巨大威胁。因此，微生态制剂应运而生，微生态制剂是用动物体内有益的正常肠道微生物或其分泌的活性物质经特殊工艺制成的活的微生物饲料添加剂，能够调节和维持动物肠道微生态平衡，抑制有害菌的生长、提高机体代谢以及饲料吸收率，有助于畜禽生长，而且无毒、无耐药性，是抗菌药的理想替代品。
乳酸菌是一种应用已久的益生菌，种类有200多种，其中一些乳酸菌也是肠道微生物的固有益生菌群，乳酸菌具有多种生物学作用，包括促进肠道对营养物质的吸收、增强抵抗力，抑制外源有害菌等。屎肠球菌属于乳酸菌，是肠球菌属，革兰阳性菌，需氧或兼性厌氧；是动物肠道正常菌种之一，在肠道微生物群中维持一定比例，与其他肠道益生菌相互协作共同维持宿主的正常生理功能。屎肠球菌是我国农业部公布的饲料添加剂目录中允许使用的微生物菌种。据报道，益生肠球菌在体内发酵可产生大量的乙酸和乳酸，使肠道内容物的pH值下降，从而拮抗病源性细菌的生长繁殖；同时可产生细菌素，对食物中的腐败微生物或有害病原菌起到杀灭作用。因此，屎肠球菌在微生态制剂方面具有广阔的应用前景。目前对乳酸菌属菌种均采用MRS培养基进行发酵培养，然而，MRS培养基价格昂贵，发酵后的活菌数低于1×109CFU/mL，在益生菌有效使用剂量固定的情况下，低发酵水平等于变相的增加了成本。因此，寻求一种低成本的培养基，能够超低成本高效优化发酵工艺、提高其发酵活菌量，这对于推进益生菌发酵的产业化有重大指导及实践意义。
发明内容
本发明提出一种屎肠球菌高效发酵培养基及其发酵培养方法，该发酵培养基成本超低，且能够高效优化发酵工艺、提高其发酵活菌量。
为达到上述目的，本发明提供了一种屎肠球菌高效发酵培养基，所述高效发酵培养基的配方包括：玉米粉：30～50g/L，尿素：3～6g/L，结晶乙酸钠：7～10g/L，磷酸氢二钾：2～4g/L，无水硫酸镁：0.05～0.4g/L，硫酸锰：0.04～0.08g/L，柠檬酸氢二铵：1～3g/L，吐温-80：0.8～1.2g/L。
作为优选，所述高效发酵培养基的配方包括：玉米粉：38.54g/L，尿素：4.57g/L，结晶乙酸钠：8.51g/L，磷酸氢二钾：3.0g/L，无水硫酸镁：0.2g/L，硫酸锰：0.06g/L，柠檬酸氢二铵：2.0g/L，吐温-80：1.0g/L。
作为优选，所述高效发酵培养基适用于保藏编号为CCTCC No:M 2018314的屎肠球菌Enterococcus faecium E.F-2。
本发明还提供了一种利用上述技术方案所述高效发酵培养基的培养方法，包括将屎肠球菌Enterococcus faecium E.F-2CCTCC No:M 2018314在无菌条件下接种到高效发酵培养基中，于33-41℃下发酵培养12-20h。
作为优选，将屎肠球菌Enterococcus faecium E.F-2CCTCC No:M 2018314在无菌条件下接种到所述高效发酵培养基中，于36-38℃，优选37℃条件下，发酵培养12h。
作为优选，所述高效发酵培养基的初始pH值为5.0-8.0，发酵瓶的装液量为50～80％。
作为优选，所述高效发酵培养基的初始pH值为6.0-7.0，优选pH值为6.5，发酵瓶的装液量为60％。
作为优选，所述屎肠球菌Enterococcus faecium E.F-2CCTCC No:M 2018314接种到高效发酵培养基的接种量为5％-10％。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
本发明利用单因素试验、Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验以及中心复合序贯试验与响应面分析法在MRS培养基的基础上成功优化了屎肠球菌Enterococcus faeciumE.F-2CCTCC No:M 2018314的发酵培养基配方，采用廉价易得的玉米粉作为最适发酵碳源和尿素作为最适发酵氮源，取代了成本较高的酵母粉/浸膏、牛肉粉、蛋白胨等常见的培养基物质，可在节约成本的同时，有效提高其发酵活菌量，实现了屎肠球菌的高效发酵，可达15.33×109cfu/mL，是相同条件下MRS液体培养基发酵菌液活菌数的14.6倍，为实现屎肠球菌的工业化生产奠定了良好基础。
附图说明
图1为本发明实施例提供的屎肠球菌的生长曲线；
图2为本发明实施例提供的活菌数残差图；
图3为本发明实施例提供的玉米粉、尿素、结晶乙酸钠对活菌数的优化图；
图4为本发明实施例提供的活菌数与尿素、玉米粉的等值线图；
图5为本发明实施例提供的活菌数与尿素、玉米粉的曲面图；
图6为本发明实施例提供的活菌数与结晶乙酸钠、玉米粉的等值线图；
图7为本发明实施例提供的活菌数与结晶乙酸钠、玉米粉的曲面图；
图8为本发明实施例提供的活菌数与结晶乙酸钠、尿素的等值线图；
图9为本发明实施例提供的活菌数与结晶乙酸钠、尿素的曲面图；
图10为本发明实施例提供的培养基优化效果验证图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供了屎肠球菌Enterococcus faecium E.F-2CCTCC No:M 2018314菌种(于2018年5月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为中国.武汉.武汉大学)的活化方法，具体如下：
将屎肠球菌保藏菌粉用生理盐水稀释后于MRS平板培养基上三区划线，置于37℃恒温培养箱中培养24h；挑取平板培养基上的单菌落接种于盛有100mL液体MRS液体培养基的250mL锥形瓶中，置于恒温摇床37℃，120r/min培养12h，最后用此菌液在MRS平板培养基三区划线，培养新的单菌落待用。
实施例2
本实施例提供了屎肠球菌Enterococcus faecium E.F-2CCTCC No:M 2018314的生长曲线测定方法，具体如下：
挑取屎肠球菌单菌落接种于盛有100mL液体MRS培养基的250mL锥形瓶中，置于恒温摇床37℃，120r/min培养12h，然后将其以1％(v/v)接种量接种到三瓶盛有150mL MRS液体培养基的250mL锥形瓶中(30％装液量)，于恒温摇床37℃、120r/min培养，每间隔2h用浊度仪测定锥形瓶中菌液浊度，浊度值见表1，绘制屎肠球菌Enterococcus faecium E.F-2CCTCC No:M 2018314的生长曲线，如图1所示。
表1屎肠球菌CCTCC No:M 2018314浊度值
由表1以及附图1可以看出，0-2h为屎肠球菌Enterococcus faecium E.F-2CCTCCNo:M 2018314生长的迟缓期，2-12h为其对数生长期，12-20h为其生长的稳定期，20h以后进入其衰亡期。
实施例3
本实施例提供了屎肠球菌Enterococcus faecium E.F-2CCTCC No:M 2018314的培养基中最适碳源的选择依据，具体如下：
使用不同碳源代替MRS液体培养基中的碳源进行单因素试验，以筛选最适合该屎肠球菌生长的碳源。可选碳源包括：葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、玉米粉、低聚异麦芽糖、麦芽糖糊精。不同碳源的添加量均是按照与MRS液体培养基中葡萄糖含碳量一致的原则换算添加的，另设MRS液体培养基为对照组。培养基调节MRS液体培养基相同pH值，于37℃下120r/min培养12h，然后测定在不同碳源培养基中屎肠球菌的菌液浊度及活菌数，以10-5，10-6，10-7这三个稀释度来测定活菌数(涂布平板100uL)，所得结果如表2-4。
表2屎肠球菌Enterococcus faecium E.F-2CCTCC No:M 2018314不同碳源下的浊度值
表3屎肠球菌Enterococcus faecium E.F-2CCTCC No:M 2018314不同碳源下的浊度值
表4屎肠球菌Enterococcus faecium E.F-2CCTCC No:M 2018314不同碳源下的浊度值
由表2-4我们可知，屎肠球菌Enterococcus faecium E.F-2CCTCC No:M 2018314的培养基中最适碳源为玉米淀粉，其次为可溶性淀粉，二者均显著地优于其他碳源。
实施例4
本实施例提供了屎肠球菌Enterococcus faecium E.F-2CCTCC No:M 2018314的培养基中最适氮源的选择依据，具体如下：
将MRS液体培养基中的碳源换为最适碳源，使用不同氮源代替MRS中的复合氮源(蛋白胨10g/L，牛肉浸粉8g/L，酵母粉4g/L)进行单因素试验，以筛选最适合该屎肠球菌生长的氮源。可选氮源包括：胰蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉、鱼蛋白胨、玉米浆干粉、尿素、硝酸钠、硫酸铵。各种氮源添加量均是按照MRS液体培养基中复合氮源的含碳量添加的，另设复合氮源作为对照组。培养基调节相同pH，于37℃下120r/min培养14h，然后测定不同的氮源培养基对屎肠球菌菌液浊度和活菌数的影响，以10-7，10-8这两个稀释度测定活菌数(涂布平板100uL)所得结果与成本分析如表5。
表5屎肠球菌Enterococcus faecium E.F-2CCTCC No:M 2018314不同氮源下浊度值及成本分析
由表5得出，屎肠球菌Enterococcus faecium E.F-2CCTCC No:M 2018314的培养基中最适氮源为牛肉浸粉，其次为尿素；然而二者的成本相差悬殊，从经济生产的角度出发，我们选择尿素为其培养基中的最适氮源。
实施例5
本实施例提供了屎肠球菌Enterococcus faecium E.F-2CCTCC No:M 2018314的最适生长pH的测定方式，具体如下：
挑取屎肠球菌的单菌落，接种于盛有100mL液体MRS培养基的250mL锥形瓶中，置于恒温摇床37℃，120r/min培养14h，然后将其以1％(v/v)接种量接种到30％装液量的不同pH值(pH＝5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5)的以玉米粉为碳源，尿素为氮源的新型MRS液体培养基，于37℃，120r/min培养，14h后测定不同pH值培养基条件下菌液浊度以及活菌数，所得结果如表6。
表6屎肠球菌Enterococcus faecium E.F-2 CCTCC No:M 2018314最适pH优化
根据表6可知，在pH5.0-8.0屎肠球菌Enterococcus faecium E.F-2CCTCC No:M2018314均可生长良好，其最适生长pH为6.0-7.0，优选pH值为6.5。
实施例6
本实施例提供了屎肠球菌Enterococcus faecium E.F-2CCTCC No:M 2018314的Plackett-Burman试验设计，具体如下：
根据单因素试验筛选出屎肠球菌的最适碳源及氮源后，选取最佳碳源、最佳氮源、磷酸氢二钾、结晶乙酸钠、无水硫酸镁、硫酸锰、柠檬酸氢二钾以及吐温-80共8个因子进行Plackett-Burman试验，以各试验因子原始浓度为低水平，原始浓度的1.5倍浓度为高水平，设计试验如表7，调节pH为6.5，接菌14h后，测定活菌数所得的结果如下表8，分析筛选影响屎肠球菌发酵活菌数的显著影响因子见表9。
表7 Plackett－Burman实验各因素水平
表8 Plackett－Burman实验活菌数
表9 Plackett－Burman实验显著性排序
从表8-9可得出，影响屎肠球菌发酵活菌数的因子依次为玉米粉、尿素、结晶乙酸钠、吐温-80、硫酸锰、无水硫酸镁、柠檬酸氢二铵、磷酸氢二钾，前三者为显著影响因子。
实施例7
本实施例提供了屎肠球菌Enterococcus faecium E.F-2CCTCC No:M 2018314的最陡爬坡试验，具体如下：
根据Plackett-Burman试验的结果，以PB实验中活菌数最高的第4组为基础，按照效应增减添加量，调节pH值为6.5，接菌14h后，测定其活菌数(涂布平板100uL)，实验设计以及结果如下表10。
表10最陡爬坡实验确定响应曲面实验中心点
依据表10得出：以PB实验中活菌数最高的第4组为基础，按照效应，依次等量增加玉米粉和结晶乙酸钠的量，同时等量减少尿素的量，最终筛选出第5组的活菌数最高。
实施例8
本实施例提供了屎肠球菌Enterococcus faecium E.F-2CCTCC No:M 2018314的响应曲面实验(Box-Behnken实验)，具体分析如下：
以最陡爬坡实验中活菌数最高的第5组为中心点，Minitab 17设计Box-Behnken实验，调节pH为6.5，接菌14h后，测定活菌数(涂布平板100uL)，运用响应面分析法得到各显著影响因子的最佳浓度，试验因素见表11，测得的活菌数如表12，回归分析见表13，方差分析如表14、15，删除不显著项再进行回归分析结果如表16，方差分析见表17、18，活菌数残差图见附图2，活菌数的响应优化见表19-21，优化图见附图3，活菌数与尿素、玉米粉的等值线图见附图4，活菌数与尿素、玉米粉曲面图见附图5，活菌数与结晶乙酸钠、玉米粉的等值线图见附图6，活菌数与结晶乙酸钠、玉米粉的曲面图见附图7，活菌数与结晶乙酸钠、尿素等值线图见附图8，活菌数与结晶乙酸钠、尿素的曲面图见附图9。
表11响应曲面实验(Box-Behnken实验)各因素水平
表12响应曲面实验(Box-Behnken实验)活菌数
表13回归分析表
项 效应 系数 系统标准误 T值 P值
常量 - 15.287 0.159 95.96 0.000***
A -1.9400 -0.9700 0.0976 -9.94 0.000***
B 0.4575 0.2287 0.0976 2.34 0.066
C 0.0175 0.0088 0.0976 0.09 0.932
A2 -3.322 -1.661 0.144 -11.57 0.000***
B2 -1.817 -0.908 0.144 -6.33 0.001**
C2 -1.207 -0.603 0.144 -4.20 0.008**
AB -0.295 -0.147 0.138 -1.07 0.334
AC 0.015 0.008 0.138 0.05 0.959
BC 0.320 0.160 0.138 1.16 0.299
回归方程：活菌数＝-318.5+5.361A+30.08B+38.0C-0.06643A2-3.633B2-2.413C2-0.0590AB+0.0030AC+0.640BC
表14方差分析
表15方差分析S、R2
S R2 R2(调整) R2(预测)
0.275614 98.24％ 95.07％ 77.64％
删除不显著项“AB、AC、BC”后再进行回归分析，结果如下：
表16回归分析表
回归方程：活菌数＝-333.4+5.121A+33.16B+41.04C-0.06643A2-3.633B2-2.413C2
表17方差分析
来源 自由度 Adj SS Adj MS F值 P值
模型 6 21.0523 3.5087 49.22 0.000***
线性 3 7.9464 2.6488 37.16 0.000***
A 1 7.5272 7.5272 105.59 0.000***
B 1 0.4186 0.4186 5.87 0.042
C 1 0.0006 0.0006 0.01 0.928
平方 3 13.1059 4.3686 61.28 0.000***
A2 1 10.1847 10.1847 142.87 0.000***
B2 1 3.0464 3.0464 42.73 0.000***
C2 1 1.3440 1.3440 18.85 0.002
误差 8 0.5703 0.0713 - -
失拟 6 0.4790 0.0798 1.75 0.407
纯误差 2 0.0913 0.0456 - -
合计 14 21.6226 - - -
表18方差分析S、R2
S R2 R2(调整) R2(预测)
0.266995 97.36％ 95.38％ 90.19％
删除不显著项“AB、AC、BC”的回归分析显示R2(调整)由95.07％升至95.38％，R2(预测)由77.64％升至90.19％，表明回归分析可信。
表19响应优化-活菌数上下限
响应 目标 下限 目标 上限 权重
活菌数 最大值 11.50 15.53 - 1
表20响应优化
解 玉米粉 尿素 结晶乙酸钠 活菌数拟合值 复合合意性
1 38.5354 4.5657 8.5051 15.4427 0.9783
表21响应优化-置信/预测区间
响应 拟合值 标准误 95％置信区间 95％预测区间
活菌数 15.443 0.15 (15.098,15.788) (14.737,16.148)
由表16-21以及附图2-9可以得出：预测玉米粉38.5354g/L、尿素4.5657g/L、结晶乙酸钠8.5051g/L时，活菌数最高。
实施例9
本实施例提供了屎肠球菌Enterococcus faecium E.F-2 CCTCC No:M 2018314的高效发酵培养基配方的检验方法，具体如下：
为了检验优化培养基的实际效果，将优化后培养基与MRS液体培养基在相同条件下进行摇瓶发酵实验，统计试验结果，以验证回归模型是否可靠，屎肠球菌发酵培养基优化是否成功，优化培养基的配方如下(g/L)：玉米粉：38.54，尿素：4.57，结晶乙酸钠：8.51，磷酸氢二钾：3.0，无水硫酸镁：0.2，硫酸锰：0.06，柠檬酸氢二铵：2.0，吐温-80：1.0。测定活菌数结果见表22和附图10。培养基优化后屎肠球菌发酵活菌量稳定，高达15.33×109cfu/mL，是相同条件下MRS液体培养基发酵菌液活菌数的14.6倍。
表22优化后活菌数
由表22及图10可知：当玉米粉38.54g/L、尿素4.57g/L、结晶乙酸钠8.51g/L时，活菌数高达15.33×109cfu/mL，优化培养基的实际效果与预测的相符，是相同条件下MRS液体培养基发酵菌液活菌数的14.6倍。

Claims (8)

1.一种屎肠球菌高效发酵培养基，其特征在于，所述高效发酵培养基的配方包括：玉米粉：30～50g/L，尿素：3～6g/L，结晶乙酸钠：7～10g/L，磷酸氢二钾：2～4g/L，无水硫酸镁：0.05～0.4g/L，硫酸锰：0.04～0.08g/L，柠檬酸氢二铵：1～3g/L，吐温-80：0.8～1.2g/L。
2.根据权利要求1所述的高效发酵培养基，其特征在于，所述高效发酵培养基的配方包括：玉米粉：38.54g/L，尿素：4.57g/L，结晶乙酸钠：8.51g/L，磷酸氢二钾：3.0g/L，无水硫酸镁：0.2g/L，硫酸锰：0.06g/L，柠檬酸氢二铵：2.0g/L，吐温-80：1.0g/L。
3.根据权利要求1或2所述的高效发酵培养基，其特征在于，所述高效发酵培养基适用于保藏编号为CCTCC No:M 2018314的屎肠球菌Enterococcus faecium E.F-2。
4.利用权利要求3所述的高效发酵培养基的发酵培养方法，其特征在于，包括将屎肠球菌Enterococcus faecium E.F-2 CCTCC No:M 2018314在无菌条件下接种到高效发酵培养基中，于33-41℃下发酵培养12-20h。
5.根据权利要求4所述的发酵培养方法，其特征在于，将屎肠球菌Enterococcusfaecium E.F-2 CCTCC No:M 2018314在无菌条件下接种到所述高效发酵培养基中，于36-38℃，优选37℃下发酵培养12h。
6.根据权利要求4所述的发酵培养方法，其特征在于，所述高效发酵培养基的初始pH值为5.0-8.0，发酵瓶的装液量为50～80％。
7.根据权利要求6所述的发酵培养方法，其特征在于，所述高效发酵培养基的初始pH值为6.0-7.0，优选pH值为6.5，发酵瓶的装液量为60％。
8.根据权利要求4所述的发酵培养方法，其特征在于，所述屎肠球菌Enterococcusfaecium E.F-2 CCTCC No:M 2018314接种到高效发酵培养基的接种量为5％-10％。
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