WO2007043657A1 - 重金属存在下で有機物質を分解する方法 - Google Patents

重金属存在下で有機物質を分解する方法 Download PDF

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organic substances
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plant
serratia
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Fumihisa Kobayashi
Yoshitoshi Nakamura
Nobuo Suzuki
Rumiko Kofuji
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Definitions

  • the present invention relates to a method for decomposing organic substances in the presence of heavy metals, and a method for purifying soil or water containing heavy metals and organic substances.
  • phosphorus and nitrogen are treated at high speed using a number of treatment methods: biological treatment, ozone treatment, thermal decomposition treatment, gasification treatment, and precipitation treatment. It provides a method for treating organic sewage that has been removed to reduce excess sludge generation and has lost the elution of heavy metals from incineration ash power. Although we have succeeded in reducing excess sludge, it is difficult to say that no waste is generated because the excess sludge is finally incinerated with raw garbage. In addition, this treatment system requires a lot of energy for ozone treatment, pyrolysis treatment, and gasification treatment. There is. Also, in the “Waste Stabilization Method” (Japanese Patent Laid-Open No.
  • surplus sludge generated by the wastewater treatment by the activated sludge method is carbonized by dry distillation treatment and landfilled as a waste stabilization material. It is mixed with the cover material at the disposal site.
  • this method there is a risk of secondary contamination due to heavy metals contained in excess sludge.
  • the surplus sludge is reused only as a covering material and the reuse is limited.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 9-150193
  • Patent Document 2 JP-A-2004-216266
  • Patent Document 3 JP 2005-199209
  • An object of the present invention is to provide a technique for biologically decomposing organic substances in contaminated water or contaminated soil containing both heavy metals and organic substances.
  • the present invention includes the following inventions.
  • the microorganism is a bacterium belonging to Serratia 'Marcescens or Kovetia' Marina
  • a method for purifying soil or water containing heavy metals and organic substances which belongs to the genus Serratia or Covetia and has the ability to decompose organic substances in the presence of heavy metals. Decomposing organic matter in the soil or water using a product to obtain a first treated product, treating the first treated product using a plant that absorbs heavy metals to obtain a second treated product, And the method comprising the steps of separating the plant from the second treated product, steam-explosing the separated plant, and making the explosion product a useful resource.
  • step of converting the explosion product into a useful resource is a step of converting the cellulose or hemicellulose in the explosion product into a useful resource by sugarcane or fermentation. .
  • step of converting the explosion product into a useful resource is a step of converting the lignin component in the explosion product into a useful resource.
  • a method for purifying soil or water containing heavy metals and organic substances comprising a microorganism belonging to the genus Serratia or Covetia and capable of decomposing organic substances in the presence of heavy metals.
  • a microorganism belonging to the genus Serratia or Covetia capable of decomposing organic substances in the presence of heavy metals.
  • treating the first treated product using a plant that absorbs heavy metals to obtain a second treated product and The method comprising the steps of separating the plant from the second treated product, steam-explosing the separated plant, and recovering heavy metal from the explosion product.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing a method for purifying soil or water containing heavy metals and organic substances according to the present invention.
  • FIG. 2 A graph showing changes in optical density and phenol concentration over time in treatment of a heavy metal-containing phenol aqueous solution using a novel marine bacterium.
  • FIG. 3 is a graph showing changes over time in plant dry weight and copper concentration in the treatment of a heavy metal-containing aqueous solution using honmonjigoke.
  • the present invention relates to a method for decomposing an organic substance in the presence of heavy metal using a microorganism belonging to the genus Serratia or Covetia and having the ability to decompose the organic substance in the presence of heavy metal.
  • organic substances can be biologically decomposed in contaminated water and contaminated soil containing both heavy metals and organic substances.
  • Examples of the heavy metal include those selected from the group force consisting of Fe, Cr, Co, Cu, Au, Sn, Pb, Bi, Zn, Cd, and Hg. These heavy metals are typically present in contaminated water or soil in the form of hydrochloride, sulfate, nitrate, sulfite, acetate, phosphate, carbonate, etc. or in ionized form.
  • the organic substance typically includes a hardly decomposable aromatic compound.
  • the persistent organic compound is not particularly limited, but examples thereof include phenols (including bisphenols, halogenated phenols, alkylphenols, etc.), dioxins, polychlorinated biphenyls (PCBs), phthalates. Acid esters, estradiol, benzophenone, trichlorethylene and the like.
  • phenols are particularly preferably decomposed.
  • the phenol means a compound having at least one hydroxyphenol group in which a hydrogen atom of the phenol group is substituted with a hydroxy group or a derivative thereof.
  • the hydrogen atom of the benzene ring is 1 to 5 selected from an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an ether group having 1 to 5 carbon atoms and a halogen.
  • Compounds having a hydroxyphenol group substituted with a substituent, compounds having an alkyl ether moiety of phenol for example, a methoxyphenyl group, an ethoxyphenyl group, a propoxyphenyl group, etc.
  • Specific examples of phenols include phenol, bisphenol, halogenated phenol, alkylphenol, and the above derivatives.
  • the above bisphenol means a compound bonded via a divalent group at the hydroxyphenyl group power, preferably each in the para position.
  • the divalent group include a sulfol group, a sulfiel group, a divalent organic group, for example, a linear or branched alkylene group having 1 to 6 carbon atoms, and 2 having 3 to 6 carbon atoms.
  • These divalent organic groups may be substituted with a halogen group, a functional group or the like.
  • bisphenol examples include bisphenol A (2, 2-bis (4-hydroxyphenol) propane), bisphenol F (bis (4-hydroxyphenol) methane), and bisphenol AF. (2,2,1bis (4-hydroxyphenol) hexafluoropropane), bisphenol S (4,4'-dihydroxydiphenylsulfone), bisphenol M (4,4,1 (1 , 3—Phenolenedipropylidene) bisphenol), Bisphenol E (4,4, ethylidenebisphenol), Bisphenol P (4,4,1 (1,4-phenolic isopropylidene) bis (Phenol), Bisphenol AP (4, 4, 1- (1-Luylylidene) Bisphenol), Bisphenol Z (4, 4, Monocyclohexylidene Bisphenol).
  • the halogenated phenol means a phenol in which the hydrogen atom of the phenol is substituted with one or more halogens (eg, fluorine, chlorine and bromine, preferably chlorine).
  • halogens eg, fluorine, chlorine and bromine, preferably chlorine.
  • PCP pentachlorophenol
  • halogenated phenol derivatives include bromophenol blue, bromophenol red, and the like.
  • the above alkylphenol means a compound in which a hydrogen atom bonded to a benzene ring of phenol is substituted with 1 to 5 alkyl groups.
  • the alkyl group include linear or branched alkyl groups having 1 to 9 carbon atoms, preferably 4 to 9 carbon atoms.
  • the alkylphenol is an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms or an ether having 1 to 5 carbon atoms. It may be a derivative further substituted with 1 to 4 substituents selected from a group and a halogen group.
  • Suitable alkylphenols include butylphenol, pentylphenol, octylphenol, norphenol, isopentylphenol, hexylphenol, 2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT), and the like.
  • Examples of the alkylphenol derivatives include 3-tbutyl-4-hydroxylsol (BHA).
  • BHA 3-tbutyl-4-hydroxylsol
  • dioxins examples include 2, 3, 7, 8-tetrachlorodibenzo-p dioxin, 1, 2, 3, 7, 8 pentachlorodibenzo-p dioxin, 1, 2, 3, 4, 7, 8— Hexachlorodibenzo-p dioxin, 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8 Heptachlorodibenzo p dixin, 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9 Polychlorinated products of dibenzo p dioxins such as otatachlorodibenzo-p dioxin; 2, 3, 7, 8—tetrachlorodibenzofuran, 1, 2, 3, 7, 8 pentachlorodibenzofuran, 2, 3, 4, 7, 8 Pentachlorodibenzofuran, 1, 2, 3, 4, 7, 8 Hexachlorodibenzofuran, 1, 2, 3, 6, 7, 8 Hexachlorodibenzofuran, 1, 2, 3, 7, 8, 9 Xachlorodibenzofuran, 2, 3, 4, 6, 7, 8 monohexachlorodibenzo
  • PCBs examples include 3, 3, 4, 4, monotetrachlorobiphenol, 3, 3, 4, 4, 4
  • Coplanar PCBs such as ,, 5-pentachlorobiphenol, 3, 3 ', 4, 4, 5, 5, 5, monohexachlorobiphenol.
  • phthalic acid esters examples include dibutyl phthalate, butyl benzyl phthalate, and di-2-ethylhexyl phthalate.
  • the microorganism that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it belongs to the genus Serratia or Covetia and has the ability to decompose organic substances in the presence of heavy metals.
  • the microorganism is preferably an aerobic microorganism. Aerobic microorganisms consume oxygen when decomposing organic substances and release carbon dioxide, which is later released. In the fight mediation method described below, it is a power that can be assimilated by plants and turned into useful resources.
  • the above microorganism is added at an initial cell optical density (wavelength 610 nm) of 0.01 in an aqueous solution containing 5 g ZL yeast extract, lOgZL polypeptone, lOOmgZ L phenol, and 50 mg ZL copper chloride at a temperature of 30 ° C.
  • the microorganism is capable of degrading the entire amount of phenol within 55 hours, preferably within 20 hours.
  • microorganism examples include, but are not limited to, bacteria belonging to Serratia marcescens or Kovetia marina.
  • Serratia marcesences the initial cell optical density (wavelength 610 nm) at a temperature of 30 ° C in an aqueous solution containing 5 g ZL fermentation mother extract, 10 g / L polypeptone, lOOmg / L phenol, and 50 mg / L copper chloride 0 Bacteria that can degrade the total amount of phenol within 20 hours when supplemented with 01 are preferred.
  • the initial cell optical density (wavelength 610nm) added at 0.01 at a temperature of 30 ° C in an aqueous solution containing 5gZL yeast extract, lOgZL polypeptone, lOOm gZL phenol, and 50mgZL copper chloride.
  • bacteria that can degrade the entire amount of phenol within 55 hours.
  • the most preferable microorganism is Serratia sp. EBR03 (reception number FERM ABP-10695) or Kobettia sp. EBR04 (reception number FERM ABP-10696). These bacteria are capable of decomposing organic substances in organic substance-contaminated wastewater or soil containing heavy metals at high concentrations (eg 50 ⁇ : LOOmg copper chloride) without being inhibited by heavy metals.
  • Serratia sp. EBR03 is a novel microorganism isolated by the present inventors from the intestinal contents of marine organism Streptomyces, and was granted a patent biological deposit center (Ibaraki, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) on August 19, 2005. It was deposited under the receipt number FERM ABP 10695 in the prefecture Tsukuba Toto 1-6 (central 6th) (transferred from the domestically deposited FERM P-20628 to the international deposit under the Budapest Treaty).
  • Kobezia sp. EBR04 is a novel microorganism isolated by the present inventors from the intestinal contents of the marine fish Megochi. On August 19, 2005, the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary (Ibaraki Tsukuba Sakai Higashi 1-1-1 Central No. 6) Receipt No. FERM ABP— 10 Deposited as 696 (transferred from domestically deposited FERM P-20629 to international deposit under the Budapest Treaty).
  • Serratia sp. EBR03 and Kobettia sp. EBR04 show the results of the following morphological and physiological / biochemical property tests.
  • the belonging taxon of Serratia sp. EBR03 and Kobecia sp. EBR04 was estimated using a partial base sequence of about 500 bp of 16S rDNA (16 S rRNA gene). Genomic DNA was extracted according to a conventional method, and the extracted genomic DNA was used as a saddle type to amplify a region of about 500 bp at the 5 ′ end of 16S rDNA (16S rRNA gene) by PCR. Thereafter, the amplified base sequence was sequenced to obtain a 16S rDNA partial base sequence. The determined 16S rDNA partial nucleotide sequences of Serratia sp. EBR03 and Kobecia sp.
  • EBR04 are shown in the sequence listing as SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively.
  • a homology search was performed, and using the 16S rDNA partial base sequences of the top 10 strains and specimens, a molecular phylogenetic strain was prepared by the neighbor binding method. The attribution taxon was examined. Use Micro 3 ⁇ 4eq Micro Dial Identification system Software V. 1. 4. 1 for homology search and phylogenetic tree construction. MicroSeq Bacterial 500 Library v. 00 23 (Applied Biosystems, CA, USA) was used. Furthermore, homology search was performed on DNA base sequence database (GenBankZDDBjZEMBL) using BLAST.
  • the 16S rDNA partial nucleotide sequence of Serratia sp. EBR03 showed 99.24% homology to Seratia marcescens 16S rDNA. It was shown to be closely related to Serratia marcescens 16S rDNA on the molecular lineage.
  • the homology search for GenBankZDDBJ / EMBL using BLAST showed 99.4% homology to 16S rDNA of S. marcescens subsp. Sakuensis KR ED strain (reference strain). Since it was unrecognizable that the nucleotide sequences were completely identical, it was judged that this microorganism, which also isolated the intestinal contents of marine organism Streptomyces, was a novel microorganism belonging to the genus Serratia.
  • the 16S rDNA partial nucleotide sequence of Covetia sp. EBR04 showed 99.81% homology to 16S rDNA of Cobeetia marina. In the molecular phylogenetic tree, it was located on the same branch as the 16S rDNA of Kobezia 'Marina.
  • the homology search for GenBankZDDBjZEMBL using BLAST showed 99.6% homology to the 16S rDNA of C. marina DSM 4741 (reference strain). Since it was unrecognizable that the nucleotide sequence was completely identical, it was determined that this microorganism isolated from the intestinal contents of the marine fish Megochi was a novel microorganism belonging to the genus Covetia.
  • a mutant strain of Serratia sp. EBR03 or Kobettia sp. EBR04 is also preferably used.
  • the mutagenesis treatment can be performed using any suitable mutagen.
  • the term “mutagen” should be understood in the broad sense to include not only a drug having a mutagenic effect but also a treatment having a mutagenic effect such as UV irradiation.
  • mutagens include ethyl methanesulfonate, UV irradiation, N-methyl-N '-tro N--trosoguanidine, nucleotide base analogs such as bromouracil, and ataridins, but any other Effective mutagens can also be used.
  • Serratia sp. EBR03 its 16S rDNA has 95% or more, more preferably 97% or more, more preferably 99% or more, and most preferably 100% homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. It preferably has a partial base sequence.
  • Covetia sp As a variant strain of Covetia sp.
  • EBR04 its 16S rDNA has a homology of 95% or more, more preferably 97% or more, more preferably 99% or more, most preferably 100% with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2. It is preferable to have a partial base sequence having sex.
  • any of the above microorganisms can be used in an immobilized form supported on an appropriate carrier as much as possible as a suspension of the microorganism itself.
  • the dose of the above microorganisms to the system containing heavy metals and organic substances is not particularly limited, and preferably about 0.01 force 0.1 is sufficient as the cell optical density at a wavelength of 610 nm.
  • the culture conditions for decomposing the organic substance using the above microorganisms are not particularly limited.
  • the temperature is 5 ° C and the force is 40 ° C. It can be grown and decomposed, and the pH is preferably neutral, but it can be grown and decomposed even under acidic conditions.
  • the treatment target is water containing heavy metals and organic substances, it can be grown and decomposed at a temperature of 5 ° C and 40 ° C.
  • the pH is preferably neutral, but it can be grown and decomposed even under acidic conditions. is there.
  • the present invention is also a method for purifying soil or water containing heavy metals and organic substances, which belongs to the genus Serratia or Covetia and decomposes organic substances in the presence of heavy metals.
  • the present invention provides a soil containing heavy metals and organic substances, including a step of recovering heavy metals from the blasting products in place of or in addition to the step of making the above blasting products useful resources. Or it is related with the method of purifying water. An example of this embodiment is shown as a flow chart in FIG.
  • the step of decomposing an organic substance using the above microorganisms resistant to heavy metals to obtain a first treated product is nothing but the method of treating an organic substance detailed in the present specification. Since this step is usually performed in a suspension or aqueous solution containing a lot of water, the obtained first processed product is often in the form of a suspension or aqueous solution. This step is preferably performed in a treatment tank equipped with stirring means.
  • the microorganism can also be used in an immobilized form supported on a suitable carrier as much as possible as a suspension of the microorganism itself. When microorganisms are in a fixed form, it is preferable because the ability of the first processed product after the organic substance decomposition treatment is easy to separate the microorganisms.
  • the microorganisms When microorganisms are immobilized and used in a suspension state, the microorganisms can be separated from the first treated product after the organic substance decomposition treatment by conventional methods such as filtration and dialysis. In addition, it can be directly applied to the next heavy metal treatment step without separating the microorganism from the first treated product.
  • the “first treated product” in the following heavy metal treatment process includes both those from which microorganisms have been separated and those from which microorganisms have not been separated.
  • a plant having the ability to absorb and accumulate heavy metals If it is not particularly limited, for example, hornfish, phyo cca americana, nasuna (Thlaspi calammare, etc.), ragweed (Alpine pennycress, Ambrosia artemisiaeiona var.elatior, etc.), Tagetes patula, etc.), Bifidal beetle (Gibasis geni culata), Hebinonegoza (Athrium yokoscense) and the like.
  • the processing conditions are as follows: the temperature is within the range of general outside air temperature (5 ° C force 40 ° C) and the time is about one week.
  • the treatment of the first processed product by A. pokeweed, etc. is to absorb heavy metals contained in the first processed product by cultivating the pokeweed etc. using the first processed product as the medium. This can be done.
  • heavy metals can be absorbed by hydroponics using water to be treated.
  • diacid-carbon that exists in the air but also aerobic microorganisms were discharged in the organic substance treatment process as the diacid-carbon required for plant growth.
  • Dioxide carbon can also be used.
  • the method for separating the plant from the second treated product is not particularly limited, but when using the primordial mycelium cell of the pearl moss as the plant, it can be separated by precipitating the protoplast cell. Since the second treated product after plant separation does not substantially contain heavy metals and organic substances, it can be released into the environment as treated water.
  • Steam explosion equipment usually includes a steam generator, a high pressure reactor, a product receiver, and a condenser.
  • Various conditions such as steam explosion temperature and pressure are not particularly limited, and can be appropriately determined according to the material to be exploded.
  • Residues such as microbial cells used in the decomposition of organic substances or dead bodies and fragments thereof may be mixed in the plant body. Similarly, it undergoes water vapor explosion and is used in the following useful resource recycling process.
  • the plant body mainly contains a cellulose component, a hemicellulose component, and a lignin component, and these components can be used by steam explosion.
  • useful resources of the cellulose component and the hemicellulose component are not particularly limited, but examples include methane fermentation, saccharification, use as a food additive raw material, ethanol resource, and pulpy koji.
  • the lignin component can be made into various useful resources depending on the molecular weight. For example, low molecular weight lignin can be used after being converted into an adhesive or resin material, and high molecular weight lignin can be used after being converted into activated carbon or a soil conditioner.
  • the method for recovering heavy metal is not particularly limited, but it can be recovered as a component remaining after burning the organic material contained in the component remaining after the above-mentioned useful resource generation step. Alternatively, it can be recovered by a neutralization precipitation method, a sulfide precipitation method, a copper cyanide recovery method, a metal substitution method, a bacterial leaching method, an electrolytic recovery method, a solvent extraction method, a chloride volatilization method, or the like.
  • Serratia sp. EBR03 or Kobettia sp. EBR04 was added to each of the aqueous solutions so that the bacterial optical density (wavelength: 610 nm) was 0.01.
  • the optical density (wavelength: 610 nm) of fungus butter 'Calcoaceticus AH (obtained from Osaka University), known as a phenol-degrading bacterium was 0. 0 1 It added to the said aqueous solution so that it might become. After adding the cells, the cells were cultured for 60 hours with stirring at 30 ° C.
  • the optical density of the bacterial cells during the culture was measured over time with a spectrophotometer (UV-mini240 manufactured by Shimadzu Corporation).
  • the phenol concentration was measured over time using a liquid chromatograph (LC-10A manufactured by Shimadzu Corporation) equipped with a Wakosil Agri-9 column.
  • Organic substance-containing wastewater containing high concentrations of heavy metals is decomposed by conventional bacteria. However, it can be decomposed by using novel marine bacteria isolated by the inventors.
  • Copper ion decreased with the growth of pearl moss, reaching about 2 mgZL below the drainage standard of 3 mgZL in about 7 days from the initial concentration of lOOmgZL, and decreased to an undetectable level after 9 days. In this way, wastewater containing high-concentration heavy metals could be absorbed and treated with high efficiency by using honmonjigoke.
  • Marine bacteria (Kobetia sp. EBR04) and hornbill were crushed and decomposed by the steam explosion method, which has a physical crushing effect and a chemical hydrolysis effect. Absorbing organic substances and heavy metals, etc. 'A dry weight of 10 g was used for the mixture of marine bacteria (Kobecia sp. EBR04) and honmonjigoke. This mixture was prepared by the following procedure. Cell cultures were collected by centrifuging the culture solution lL (100 mL ⁇ 10 tubes) of Kobettia sp. EBR04 after the organic substance was decomposed by the above procedure 1. Centrifugation by Shimadzu CST-151MT at 15000 rpm for 5 minutes I went for a while.
  • the rainbow trout culture solution lL (100 mL ⁇ 10 pieces) after heavy metal was absorbed by the above procedure 2 was centrifuged to collect moss. Centrifugation was carried out for 10 minutes at 15000 rpm from Shimadzu CST-151MT. The collected marine bacterial cells and moss were mixed and dried in an 80 ° C oven (YAMATO DX-58) for 24 hours for steam explosion. The reason why bacterium and moss were mixed in this experiment is that it is assumed that both of them are treated in a mixed state when the method of the present invention is industrially used.
  • the steam explosion equipment consists of a steam generator, a high-pressure reactor, a product receiver and a condenser, with a maximum operating temperature of 275 ° C and a maximum operating pressure of 6. OMPa. As an example, the temperature was 225 ° C. and the pressure was 2.555 MPa.
  • the residue after methanolization was extracted with methanol to produce lignin resin with methanol-soluble components. Furthermore, the residual metal after methanol extraction was recovered.
  • the residue extracted with water was quickly dried, and the dry residue lg was extracted with a Soxhlet extractor using lOOmL of methanol for 12 hours.
  • the dry weight of the component extracted with methanol was measured and used as the amount of methanol-soluble lignin.
  • the residue after methanol extraction contains methanol insoluble lignin (Klason lignin) and holocellulose (polysaccharide component).
  • the amount of lignite in the residue was determined by the Klason method using sulfuric acid, and the amount of holocellulose was determined by subtracting the amount of Klason lignin from the amount of residue.
  • the residue after methane fermentation was lyophilized.
  • the dry residue was extracted for 12 hours with a Sotshlet extractor using lOOmL methanol.
  • a dried product of components extracted with methanol was used as a raw material for epoxy resination.
  • 2 g of the sample was dissolved in lOOmL of epochlorohydrin, 10 mL of 10N NaOH aqueous solution was slowly added dropwise at 110 ° C, and the reaction was allowed to proceed for 3 hours while removing water. After completion of the reaction, the resulting NaCl was washed with distilled water to remove NaCl, and the solvent was evaporated to obtain an epoxidized lignin.
  • Diethylenetriamine was used as a curing agent in the gelling reaction to produce an epoxidized lignin resin. As a result, about 5 g of epoxidized lignite resin was obtained.
  • the valuable residue (Klason lignin) force used in the above-mentioned methanol-soluble lignin oil also recovered valuable metals.
  • About 600 mg of the residue was placed in a crucible and dried at 90 ° C for 12 hours. Further, heating was performed at 500 ° C. for 6 hours, and carbon was converted to carbon dioxide and removed.
  • the treated sample was dissolved in 10 mL of nitric acid aqueous solution 10 mL in a crucible to obtain a metal recovery solution.

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Abstract

　本発明は重金属と有機物質とを共に含む汚染水又は汚染土壌中の有機物質を生物的に分解する技術を提供することを目的とする。 　本発明は、セラチア属又はコベチア属に属し、重金属存在下で有機物質を分解する能力を有する微生物を用いて、重金属存在下で有機物質を分解する方法に関する。

Description

明 細 書
重金属存在下で有機物質を分解する方法
技術分野
[0001] 本発明は重金属存在下で有機物質を分解する方法、並びに重金属及び有機物質 を含有する土壌又は水を浄化する方法に関する。
背景技術
[0002] フエノールなどを含む有機性廃水は、製鉄工業、石炭石油工業、プラスチック工業 、製薬工業など多くの分野の工場力 排出され、し力もその多くに銅や鉄などの重金 属が含まれている。また、汚染された地下水などは重金属や有機物質を多く含む。 重金属と有機物質とで汚染された土壌等の処理法の開発が急がれている。
[0003] 廃水や汚染土壌中の有機物質を微生物を用いて分解する方法は数多く研究され ているが、従来の方法で用いられる微生物は重金属により活性阻害を受けるため、 重金属と有機物質とで汚染された土壌等の処理には用いることができな 、と 、う問題 かあつた。
[0004] 現在、重金属を多く含む有機性廃水の処理のほとんどは、活性炭などの物理的処 理ゃィ匕学的処理によって重金属を除去した後に、残った有機物質を活性汚泥法な どで分解処理している。この方法では重金属を処理した際に生じる廃棄物に有機物 質を多く含むため、さらなる二次処理の問題が生じている。また、活性汚泥法は余剰 汚泥などの廃棄物が生じ、その処理が問題となっている。重金属を含む有機性廃水 処理に関する技術を開示した特許文献のうち、生物のみを用いた環境負荷低減型- 廃棄物抑制型のものはほとんどない。例えば、「有機性汚水の処理方法」（特開平 9 150193号公報）では、生物処理 ·オゾン処理 ·熱分解処理 ·ガス化処理 ·沈殿処 理のいくつもの処理法を用いてリン、窒素を高速に除去し、余剰汚泥の発生を少なく し、焼却灰力 の重金属の溶出を失くした有機性汚水の処理方法を提供して 、る。 余剰汚泥の減量ィ匕には成功しているものの、最終的に余剰汚泥は生ゴミといつしょに 焼却していることから、廃棄物が発生しないとは言いがたい。また、この処理システム はオゾン処理、熱分解処理、ガス化処理に多くのエネルギーを必要とするという問題 がある。また、「廃棄物の安定化処理方法」（特開 2004— 216266号公報)では、活 性汚泥法による排水処理で生じた余剰汚泥を乾留処理により炭化し、廃棄物の安定 化材として埋め立処分場における覆土材に混合して施用している。し力しながら、こ の方法では余剰汚泥に含まれる重金属などによる二次汚染のおそれもある。また、 余剰汚泥を覆土材としてのみ再利用するのであって再利用の用途が限定的であると いう問題もある。
[0005] 一方、本発明者らはこれまでに重金属を吸収する性質を有する植物を用いて、重 金属汚染された土壌等を浄ィ匕するファイトメディエーシヨン技術を開発して 、る (特開 2005 - 199209号公報)。し力しながら植物による重金属の吸収作用は多くの場合 、有機物質により阻害を受けるから、重金属と有機物質とを共に含む汚染水又は汚 染土壌の浄ィ匕のために上記ファイトメディエーシヨン技術を適用することは難しい。 特許文献 1：特開平 9 - 150193号公報
特許文献 2 :特開 2004— 216266号公報
特許文献 3 :特開 2005— 199209号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明は重金属と有機物質とを共に含む汚染水又は汚染土壌中の有機物質を生 物的に分解する技術を提供することを目的とする。
[0007] 本発明が目的とする、重金属と有機物質とを共に含む汚染水又は汚染土壌中の有 機物質を生物的に分解する技術が提供されれば、重金属と有機物質とを共に含む 汚染水又は汚染土壌中の有機物質を生物的に分解し、続いて上記の特開 2005— 199209号公報に開示されたファイトメディエーシヨン技術を用いて重金属を植物体 に吸収させるとともに吸収後の植物体を有用資源化することが可能になる。すなわち 、重金属と有機物質とを共に含む汚染水又は汚染土壌の、生物的処理方法のみを 用いた環境負荷低減型，廃棄物抑制型の浄化方法が実現される。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明は以下の発明を包含する。
[0009] (1)セラチア属又はコべチア属に属し、重金属存在下で有機物質を分解する能力を 有する微生物を用いて、重金属存在下で有機物質を分解する方法。
[0010] (2)前記微生物が、セラチア 'マルセセンス又はコべチア 'マリナに属する細菌である
(1)記載の方法。
[0011] (3)前記微生物力 セラチア sp. EBR03 (受領番号 FERM ABP— 10695)又は コべチア sp. EBR04 (受領番号 FERM ABP— 10696)である（1)記載の方法。
[0012] (4)重金属が Fe、 Cr、 Co、 Cu、 Au、 Sn、 Pb、 Bi、 Zn、 Cd及び Hgからなる群から選 択されるものである（1)〜（3)の何れかに記載の方法。
[0013] (5)有機物質が難分解性芳香族化合物である（1)〜 (4)の何れかに記載の方法。
[0014] (6)セラチア sp. EBR03 (受領番号 FERM ABP— 10695)。
[0015] (7)コべチア sp. EBR04 (受領番号 FERM ABP— 10696)。
[0016] (8)重金属及び有機物質を含有する土壌又は水を浄ィ匕する方法であって、セラチア 属又はコべチア属に属し、重金属存在下で有機物質を分解する能力を有する微生 物を用いて、前記土壌又は水中の有機物質を分解して第 1処理物を得る工程、重金 属を吸収する植物を用いて前記第 1処理物を処理して第 2処理物を得る工程、及び 前記第 2処理物から前記植物を分離し、分離された前記植物を水蒸気爆砕し、爆砕 生成物を有用資源化する工程を含む前記方法。
[0017] (9)前記爆砕生成物を有用資源化する工程が、前記爆砕生成物中のセルロース又 はへミセルロースを糖ィ匕又は発酵により有用資源化する工程である（8)記載の方法。
[0018] (10)前記爆砕生成物を有用資源化する工程が、爆砕生成物中のリグニン成分を榭 脂化することにより有用資源化する工程である（8)記載の方法。
[0019] (11)重金属及び有機物質を含有する土壌又は水を浄化する方法であって、セラチ ァ属又はコべチア属に属し、重金属存在下で有機物質を分解する能力を有する微 生物を用いて、前記土壌又は水中の有機物質を分解して第 1処理物を得る工程、重 金属を吸収する植物を用いて前記第 1処理物を処理して第 2処理物を得る工程、及 び前記第 2処理物から前記植物を分離し、分離された前記植物を水蒸気爆砕し、爆 砕生成物から重金属を回収する工程を含む前記方法。
発明の効果
[0020] 本発明によれば、重金属と有機物質とを共に含む汚染水又は汚染土壌中の有機 物質を生物的に分解する技術が提供される。
[0021] 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2005-300682号の明細書 および Zまたは図面に記載される内容を包含する。
図面の簡単な説明
[0022] [図 1]本発明に係る、重金属及び有機物質を含有する土壌又は水を浄化する方法の 概略を示す図である。
[図 2]新規海洋細菌を用いた重金属含有フ ノール水溶液の処理における菌体光学 密度及びフエノール濃度の経時的変化を示す図である。
[図 3]ホンモンジゴケを用いた重金属含有水溶液の処理における植物体乾燥重量及 び銅濃度の経時的変化を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0023] 本発明は、セラチア属又はコべチア属に属し、重金属存在下で有機物質を分解す る能力を有する微生物を用いて、重金属存在下で有機物質を分解する方法に関す る。本方法によれば重金属と有機物質とを共に含む汚染水、汚染土壌等において有 機物質を生物的に分解することができる。
[0024] 上記重金属としては例えば Fe、 Cr、 Co、 Cu、 Au、 Sn、 Pb、 Bi、 Zn、 Cd及び Hgか らなる群力 選択されるものが挙げられる。これらの重金属は典型的には塩酸塩、硫 酸塩、硝酸塩、亜硫酸塩、酢酸塩、リン酸塩、炭酸塩等あるいはイオン化した形態で 汚染水又は汚染土壌中に存在する。
[0025] 上記有機物質としては典型的には難分解性芳香族化合物が挙げられる。難分解 性芳香族化合物としては、特に限定されないが、例えば、フエノール類 (ビスフエノー ル類、ハロゲン化フエノール類、アルキルフエノール類等を含む）、ダイォキシン類、 ポリ塩化ビフヱ-ル（PCB)類、フタル酸エステル類、エストラジオール、ベンゾフエノ ン、トリクロロエチレン等が挙げられる。
[0026] 本発明ではフエノール類が特に好適に分解される。フエノール類とは、フエ-ル基 の水素原子をヒドロキシ基で置換したヒドロキシフエ-ル基を少なくとも 1個有する化 合物又はその誘導体を意味する。誘導体としては、ベンゼン環の水素原子が炭素数 1〜5のアルキル基、炭素数 1〜5のエーテル基及びハロゲンから選ばれる 1〜5個の 置換基で置換されたヒドロキシフヱ-ル基を有する化合物、フヱノールのアルキルェ 一テル部分（例えば、メトキシフエ-ル基、エトキシフエ-ル基、プロポキシフエ-ル基 など）を有する化合物などが含まれる。フエノール類としては、具体的には、フエノー ル、ビスフエノール、ハロゲン化フエノール、アルキルフエノール及びこれらの上記誘 導体が挙げられる。
[0027] 上記ビスフエノールとは、ヒドロキシフエニル基力 好ましくはそれぞれパラ位で、 2 価の基を介して結合した化合物を意味する。ここで 2価の基としては、スルホ-ル基、 スルフィエル基、 2価の有機基、例えば、炭素数 1〜6の直鎖状又は分枝状のアルキ レン基、炭素数 3〜6の 2価の脂環式炭化水素基、フエ-レン基、フエ-レンジアルキ リデン (オルト、メタ、パラ)等が挙げられる。これらの 2価の有機基は、ハロゲン基、フ 工-ル基等で置換されていてもよい。ビスフエノールとしては、具体的には、ビスフエノ ール A (2, 2—ビス（4 -ヒドロキシフエ-ル）プロパン）、ビスフエノール F (ビス（4—ヒ ドロキシフエ-ル）メタン）、ビスフエノール AF (2, 2，一ビス（4—ヒドロキシフエ-ル） へキサフルォロプロパン）、ビスフエノール S (4, 4'—ジヒドロキシジフエ-ルスルホン )、ビスフエノール M (4, 4，一（1, 3—フエ-レンジイソプロピリデン）ビスフエノール）、 ビスフエノール E (4, 4，一ェチリデンビスフエノール）、ビスフエノール P (4, 4，一（1, 4—フエ-レンジイソプロピリデン）ビスフエノール）、ビスフエノール AP (4, 4，一（1— フエ-ルェチリデン）ビスフエノール）、ビスフエノール Z (4, 4， 一シクロへキシリデンビ スフヱノール)等が挙げられる。
[0028] 上記ハロゲン化フエノールとは、フエノールの水素原子が 1個以上のハロゲン（例え ば、フッ素、塩素及び臭素、好ましくは塩素）で置換されたフ ノールを意味する。例 えばペンタクロロフエノール（PCP)、クロ口フエノール、ジクロロフエノール等が挙げら れ、ハロゲン化フエノール誘導体としては、ブロモフエノールブルー、ブロモフエノー ルレッド等が挙げられる。
[0029] 上記アルキルフエノールとは、フエノールのベンゼン環に結合した水素原子が 1〜5 個のアルキル基で置換されたィ匕合物を意味する。前記アルキル基としては例えば炭 素数 1〜9、好ましくは炭素数 4〜9の直鎖状又は分枝状のアルキル基が挙げられる 。上記アルキルフエノールは、炭素数 1〜5のアルキル基、炭素数 1〜5のエーテル 基及びハロゲンカゝら選ばれる 1〜4個の置換基で更に置換された誘導体であってもよ い。好適なアルキルフエノールとしては、ブチルフエノール、ペンチルフエノール、オタ チルフエノール、ノ-ルフエノール、イソペンチルフエノール、へキシルフェノール、 2, 6—ジ— t ブチル— 4—メチルフエノール（BHT)等が挙げられ、アルキルフエノー ル誘導体としては、 3— t ブチル— 4—ヒドロキシァ-ソール（BHA)等が挙げられる 。これらアルキルフエノールは、アルキル基がヒドロキシ基に対してオルト、メタ又はパ ラ位にある 、ずれの異性体であってもよ!/、。
[0030] 上記ダイォキシン類としては、例えば、 2, 3, 7, 8—テトラクロロジベンゾー p ジォ キシン、 1, 2, 3, 7, 8 ペンタクロロジベンゾ一 p ジォキシン、 1, 2, 3, 4, 7, 8— へキサクロロジベンゾー p ジォキシン、 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8 ヘプタクロロジベンゾ p ジ才キシン、 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9 オタタクロロジベンゾー p ジォキシン等 のジベンゾ p ジォキシンの多塩素化物； 2, 3, 7, 8—テトラクロロジベンゾフラン、 1, 2, 3, 7, 8 ペンタクロロジベンゾフラン、 2, 3, 4, 7, 8 ペンタクロロジベンゾフ ラン、 1, 2, 3, 4, 7, 8 へキサクロロジベンゾフラン、 1, 2, 3, 6, 7, 8 へキサクロ ロジベンゾフラン、 1, 2, 3, 7, 8, 9 へキサクロロジベンゾフラン、 2, 3, 4, 6, 7, 8 一へキサクロロジベンゾフラン、 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8 ヘプタクロロジベンゾフラン、 1 , 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9—オタタクロロジベンゾフラン等のジベンゾフランの多塩素化物 等が挙げられる。
[0031] 上記 PCB類としては、例えば 3, 3，， 4, 4，一テトラクロロビフエノール、 3, 3，， 4, 4
，， 5—ペンタクロロビフエノール、 3, 3' , 4, 4，， 5, 5，一へキサクロロビフエノール等 のコブラナー（Coplanar) PCBが挙げられる。
[0032] 上記フタル酸エステル類としては、ジブチルフタレート、ブチルベンジルフタレート、 ジー 2—ェチルへキシルフタレート等が挙げられる。
[0033] 本発明に用いることができる微生物としては、セラチア属又はコべチア属に属し、重 金属存在下で有機物質を分解する能力を有する微生物であれば特に限定されない
[0034] 上記微生物は好気性微生物であることが好ま ヽ。好気性微生物は有機物質を分 解する際に酸素を消費して二酸ィ匕炭素を放出するが、放出された二酸ィ匕炭素は、後 述するファイトメディエーシヨン法において植物により資化され、有用資源化され得る 力 である。
[0035] 上記微生物はより好ましくは、 5gZL酵母エキス、 lOgZLポリペプトン、 lOOmgZ Lフエノール、及び 50mgZL塩化銅を含む水溶液中に 30°Cの温度において初期菌 体光学密度 (波長 610nm) 0. 01で添加されたときに、 55時間以内、好ましくは 20時 間以内でフエノールの全量を分解することができる微生物である。
[0036] 上記微生物としてはセラチア ·マルセセンス又はコべチア ·マリナに属する細菌が挙 げられるがこれらには限定されない。セラチア'マルセセンスのなかでも特に 5gZL酵 母エキス、 10g/Lポリペプトン、 lOOmg/Lフエノール、及び 50mg/L塩化銅を含 む水溶液中に 30°Cの温度において初期菌体光学密度 (波長 610nm)0. 01で添カロ されたときに、 20時間以内でフエノールの全量を分解することができる細菌が好まし い。コべチア'マリナのなかでも特に 5gZL酵母エキス、 lOgZLポリペプトン、 lOOm gZLフエノール、及び 50mgZL塩化銅を含む水溶液中に 30°Cの温度において初 期菌体光学密度（波長 610nm) 0. 01で添加されたときに、 55時間以内でフエノー ルの全量を分解することができる細菌が好まし 、。
[0037] 上記微生物として最も好ましいものは、セラチア sp. EBR03 (受領番号 FERM ABP— 10695)又はコべチア sp. EBR04 (受領番号 FERM ABP— 10696)で ある。これらの菌は重金属が高濃度 (例えば 50〜： LOOmg塩化銅)で含有された有機 物質汚染廃水又は土壌中で、重金属による阻害を受けることなく有機物質を分解す ることがでさる。
[0038] セラチア sp. EBR03は本発明者らが海洋生物ァメフラシの腸内容物から単離した 新規微生物であり、 2005年 8月 19日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許 生物寄託センター (茨城県つくば巿東 1 - 1 - 1中央第 6)に受領番号 FERM ABP 10695として寄託された（国内寄託された FERM P— 20628よりブタペスト条約 に基づく国際寄託へ移管された)。
[0039] コべチア sp. EBR04は本発明者らが海洋魚類メゴチの腸内容物から単離した新規 微生物であり、 2005年 8月 19日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物 寄託センター (茨城県つくば巿東 1 - 1 - 1中央第 6)に受領番号 FERM ABP— 10 696として寄託された（国内寄託された FERM P— 20629よりブタペスト条約に基 づく国際寄託へ移管された)。
[0040] セラチア sp. EBR03及びコべチア sp. EBR04は次の形態及び生理 ·生化学性状 試験の結果を示す。
[表 1]
Figure imgf000010_0001
+：腸性、 一：陰性
[0041] セラチア sp. EBR03及びコべチア sp. EBR04の帰属分類群は、 16S rDNA (16 S rRNA遺伝子）の部分塩基配列約 500bpを用いて推定した。常法に従ってゲノム DNAの抽出を行ない、抽出されたゲノム DNAを铸型として PCRにより 16S rDNA (16S rRNA遺伝子）のうち 5'末端側約 500bpの領域を増幅した。その後、増幅さ れた塩基配列をシーケンシングし、 16S rDNA部分塩基配列を得た。決定されたセ ラチア sp. EBR03及びコべチア sp. EBR04の 16S rDNA部分塩基配列をそれぞ れ配列番号 1及び配列番号 2として配列表に示す。 [0042] 16S rDNA部分塩基配列を用いて相同性検索を行なうとともに、検索された上位 10株と検体の 16S rDNA部分塩基配列を用いて近隣結合法により分子系統榭を 作製し、近縁種及び帰属分類群を検討した。相同性検索及び系統樹の作製には Mi cro¾eq Micro Dial Identincation system Software V. 1. 4. 1を、相 | 性 検索を行なう際のデータベースとして MicroSeq Bacterial 500 Library v. 00 23 (Applied Biosystems, CA, USA)を使用した。更にまた、 BLASTを用い て DNA塩基配列データベース（GenBankZDDBjZEMBL)に対して相同性検索 を行なった。
[0043] セラチア sp. EBR03の 16S rDNA部分塩基配列は、 MicroSeqを用いた解析の 結果、セラチア'マルセセンス（Seratia marcescens)の 16S rDNAに対して 99. 24%の相同性を示した。分子系統榭上でもセラチア'マルセセンスの 16S rDNAと クラスターを形成し近縁であることが示された。 BLASTを用いた GenBankZDDBJ /EMBLに対する相同性検索では、 S. marcescens subsp. sakuensis KR ED株（基準株）の 16S rDNAに対し 99. 4%の相同性を示した。塩基配列が完全 に一致するものは認められな力つたことから、海洋生物ァメフラシの腸内容物力も単 離した本微生物はセラチア属に属する新規微生物であると判断した。
[0044] コべチア sp. EBR04の 16S rDNA部分塩基配列は MicroSeqを用いた解析の 結果、コべチア.マリナ（Cobetia marina)の 16S rDNAに対して 99. 81%の相 同性を示した。分子系統樹上でもコべチア'マリナの 16S rDNAとほぼ同じ枝に位 置した。 BLASTを用いた GenBankZDDBjZEMBLに対する相同性検索では、 C . marina DSM 4741株（基準株）の 16S rDNAに対し 99. 6%の相同性を示 した。塩基配列が完全に一致するものは認められな力つたことから、海洋魚類メゴチ の腸内容物からから単離した本微生物はコべチア属に属する新規微生物であると判 断した。
[0045] 本発明には、セラチア sp. EBR03又はコべチア sp. EBR04の変異株もまた好適 に使用される。変異誘発処理は任意の適当な変異原を用いて行われ得る。ここで、「 変異原」なる語は、その広義において、例えば変異原効果を有する薬剤のみならず UV照射のごとき変異原効果を有する処理をも含むものと理解すべきである。適当な 変異原の例としてェチルメタンスルホネート、 UV照射、 N—メチルー N' —-トロー N— -トロソグァ-ジン、ブロモウラシルのようなヌクレオチド塩基類似体及びアタリジ ン類が挙げられるが、他の任意の効果的な変異原もまた使用され得る。セラチア sp. EBR03の変異株としては、その 16S rDNAが、配列番号 1の塩基配列と 95%以上 、より好ましくは 97%以上、より好ましくは 99%以上、最も好ましくは 100%の相同性 を有する部分塩基配列を有するものであることが好ましい。コべチア sp. EBR04の変 異株としては、その 16S rDNAが、配列番号 2の塩基配列と 95%以上、より好ましく は 97%以上、より好ましくは 99%以上、最も好ましくは 100%の相同性を有する部分 塩基配列を有するものであることが好まし 、。
[0046] 本発明において上記微生物はいずれも、微生物自体の懸濁液として使用すること ができるだけでなぐ適当な担体に担持させた、固定化された形態で使用することも できる。
[0047] 上記微生物の重金属及び有機物質を含有する系への投与量は特に限定されな!、 力 好ましくは 610nm波長の菌体光学密度として 0. 01力 0. 1程度で十分である。
[0048] 上記微生物を用いて有機物質を分解する際の培養条件は特に限定されないが、 例えば、処理対象が重金属及び有機物質を含有する土壌である場合、温度は 5°C 力も 40°Cにおいて生育及び分解処理可能であり、 pHは中性が好ましいが酸性条件 下でも生育及び分解処理可能である。処理対象が重金属及び有機物質を含有する 水である場合、温度は 5°C力 40°Cにおいて生育及び分解処理可能であり、 pHは 中性が好ましいが酸性条件下でも生育及び分解処理可能である。
[0049] 上記で説明した方法を用いれば重金属及び有機物質を含有する土壌又は水にお いて有機物質を分解することが可能になる。また本発明者らはこれまでに重金属を 吸収する性質を有する植物を用いて、重金属汚染された土壌等を浄ィ匕するファイトメ ディエーシヨン技術 (特開 2005— 199209号公報）を開発していることは先に述べた 通りである。そこで本発明者らは両技術を組合せ、本発明の次の形態を完成するに 至った。
[0050] すなわち本発明はまた、重金属及び有機物質を含有する土壌又は水を浄化する 方法であって、セラチア属又はコべチア属に属し、重金属存在下で有機物質を分解 する能力を有する微生物を用いて、前記土壌又は水中の有機物質を分解して第 1処 理物を得る工程、重金属を吸収する植物を用いて前記第 1処理物を処理して第 2処 理物を得る工程、及び、前記第 2処理物から前記植物を分離し、分離された前記植 物を水蒸気爆砕し、爆砕生成物を有用資源化する工程を含む前記方法に関する。 本発明は更にまた、上記の爆砕生成物を有用資源化する工程に換えて、又は同ェ 程に加えて、前記爆砕生成物から重金属を回収する工程を含む、重金属及び有機 物質を含有する土壌又は水を浄化する方法に関する。本実施形態の一例をフロー チャートとして図 1に示す。
[0051] 重金属耐性のある上記微生物を用いて有機物質を分解して第 1処理物を得る工程 は本明細書でこれまでに詳述した有機物質の処理方法にほかならな 、。本工程は 通常、水分を多く含んだ懸濁液又は水溶液中で行なわれるから、得られる第 1処理 物もまた懸濁液又は水溶液の形態であることが多 、。本工程は攪拌手段を備えた処 理槽中で行われることが好ましい。微生物は、微生物自体の懸濁液として使用するこ とができるだけでなぐ適当な担体に担持させた、固定化された形態で使用することも できる。微生物が固定化された形態である場合、有機物質分解処理後の第 1処理物 力も微生物を分離することが容易であるため好まし 、。微生物が固定化されて 、な 、 懸濁液の状態で用いられる場合、ろ過、透析等の常法により有機物質分解処理後の 第 1処理物から微生物を分離することができる。また、第 1処理物から微生物を分離 せずに直接次の重金属処理工程に供することもできる。すなわち以下の重金属処理 工程における「第 1処理物」とは微生物が分離されたものと分離されていないものの 両方を包含する。
[0052] 重金属を吸収する植物を用いて前記第 1処理物を処理して第 2処理物を得る工程 で用いることができる植物としては、重金属を吸収 ·蓄積する能力を有する植物 (Hyp eraccumulator)であれば特に限定されないが、例えばホンモンジゴケ、ヨウシュャ マコボウ (phyo cca americana)、ナスナ (Thlaspi calammare等)、ブタクサ ( Alpine pennycressや Ambrosia artemisiaeiona var. elatior等)、マリ ~~ゴ ~~ルド (Tagetes erecta、 Tagetes patula等)、ブフィダルべ ~~ノレ (Gibasis geni culata)、へビノネゴザ (Athrium yokoscense)等が挙げられる。特にホンモンジゴ ケは原糸体細胞として第 1処理物中に懸濁するなどして分散させて重金属吸収処理 を行なうことができるため好ましい。ホンモンジゴケによる処理条件としては、例えば 温度は、一般的な外気温の範囲内（5°C力 40°C)、時間は約 1週間程度で処理す ることができる。ヨウシュャマゴボウ等による第 1処理物の処理は、第 1処理物を培地と してヨウシュャマゴボウ等を裁培することにより第 1処理物中に含まれる重金属を吸収 させること〖こよって行なうことができる。あるいは、処理対象水を用いた水耕栽培によ つて重金属を吸収処理することができる。
[0053] 重金属を吸収する本工程では植物の生育に必要な二酸ィ匕炭素として空気中に存 在する二酸ィ匕炭素だけでなく有機物質処理工程で好気性微生物カゝら排出された二 酸ィ匕炭素を利用することもできる。
[0054] 第 2処理物から植物を分離する方法としては特に限定されないが、植物としてホン モンジゴケの原糸体細胞を用いる場合、原糸体細胞を沈殿させることにより分離する ことができる。植物分離後の第 2処理物は重金属及び有機物質を実質的に含まない から、処理水として環境中に放出することができる。
[0055] 分離された重金属吸収後の植物から有用物質の再資源化と重金属の回収を行なう ために、前記植物の水蒸気爆砕を行なう。水蒸気爆砕装置は通常、水蒸気発生器、 高圧反応器、生成物受器、凝縮器を備えている。水蒸気爆砕の温度、圧力等の諸条 件は特に限定されず、被爆砕物に合わせて適宜決定できる。なお有機物質の分解 に用いられた微生物菌体又はその死骸、破片等の残存物が植物体中に混入してい ることがあるが、その場合は、混入した微生物菌体又はその上記残存物も同様に水 蒸気爆砕を受け、下記の有用資源化工程で利用される。
[0056] 植物体には主としてセルロース成分、へミセルロース成分、及びリグニン成分が含 まれ、水蒸気爆砕によりこれらの成分が利用可能となる。セルロース成分及びへミセ ルロース成分の有用資源化の例としては特に限定されないが、メタン発酵、糖化、食 品添加剤原料としての利用、エタノール資源化、パルプィ匕等が挙げられる。リグニン 成分は分子量に応じて種々の有用資源化が可能である。例えば、低分子リグニンは 接着剤ゃ榭脂材料に変換して使用することができ、高分子リグニンは活性炭や、土 壌改良剤等に変換して使用することができる。 [0057] 重金属の回収方法は特に限定されないが爆砕生成物又は爆砕生成物力 上記有 用資源化工程を経て残存した成分に含まれる有機物を燃焼させた後に残存した成 分として回収することができる。あるいは、中和沈殿法、硫化物沈殿法、シアン化銅 回収法、金属置換法、バクテリアリーチング法、電解回収法、溶媒抽出法、塩化揮発 法等でち回収することがでさる。
[0058] 以下に実施例に基づき本発明を具体的に説明するが本発明は実施例の内容には 限定されない。
実施例
[0059] 下記実験で用いた試薬はすべて和光純薬工業株式会社製のものを用いた。
[0060] 1. 重余通耐件細菌によるフ ノールの分解
5gZL酵母エキス、 lOgZLポリペプトン、 lOOmgZLフエノール、 50mgZL塩ィ匕 銅を含む水溶液を調製した。
[0061] 上記水溶液にそれぞれセラチア sp. EBR03又はコべチア sp. EBR04を菌体光学 密度（波長 610nm) 0. 01となるように添カ卩した。比較実験として、セラチア sp. EBR 03又はコべチア sp. EBR04に代えて、フエノール分解菌として知られるァシネトバタ ター'カルコァセチカス AH (大阪大学より入手)を菌体光学密度 (波長 610nm) 0. 0 1となるように上記水溶液に添加した。菌体添加後、 30°Cにて攪拌しながら 60時間、 培養を行なった。
[0062] 培養中の菌体光学密度を分光光度計 (島津製作所製 UV— minil240)で経時的 に測定した。フエノール濃度は Wakosil Agri— 9カラムを装着した液体クロマトダラ フィー（島津製作所製 LC— 10A)を用いて経時的に測定した。
[0063] 結果を図 2に示す。新規海洋細菌であるセラチア sp. EBR03及びコべチア sp. EB R04が添加された水溶液中では、菌体の増殖とともにフエノールが分解された。セラ チア sp. EBR03は約 20時間で、コべチア sp. EBR04は約 55時間でほぼ完全にフ ェノールを分解することができた。一方、従来のフエノール分解菌であるァシネトバタ ター.カルコァセチカス AHが添加された水溶液中では菌体増殖もフエノール分解も 見られな力つた。これは重金属である銅による阻害作用が原因であると考えられる。
[0064] 重金属を高濃度含有している有機物質含有廃水は、従来の細菌では分解処理で きないが、発明者らが単離した新規海洋細菌を用いることによって、分解処理可能で ある。
[0065] 2.植物による重金属の吸収
0. OOlmM MgSO ·4Η 0、 0. 0184mM ΚΗ ΡΟ、 10mM ΚΝΟ、及び 0
4 2 2 4 3
. 045mM FeSO · 7Η Oを含む基本培地に重金属として塩化銅を銅イオン濃度と
4 2
して lOOmgZLで添加した溶液を調製した。
[0066] 上記溶液を lOOmL容量植物培養試験管 (相互理化学硝子製作所製培養 5号)に 入れ、ホンモンジゴケを乾燥重量約 5g/Lの量添カ卩した。
[0067] 上記溶液を、ノ ィオシエーカー（タイテック製 BR— 30L)に蛍光灯を 4本取り付けて 改造した装置に設置し、 4590ルクスの連続照射のもと、温度 25°C、回転数 50rpm で培養を行なった。
[0068] 経時的にサンプルを採取し、溶液中の銅イオン濃度 (mgZL)及び 1リットル当たり の植物体 (ホンモンジゴケ)の乾燥重量 (gZL)を測定した。銅イオン濃度は TSK— GEL ODS— 80TSカラムを装着した液体クロマトグラフィー（島津製作所製 LC— 1 OA)を用いて経時的に測定した。植物体 (ホンモンジゴケ)の乾燥重量は培養液 lm Lを適宜サンプリングし、 80°Cのオーブン (YAMATO製 DX— 58)で 24時間乾燥さ せた後電子天秤 (メトラートレド製 AB104— S)にて測定した。結果を図 3に示す。ホ ンモンジゴケの増殖とともに銅イオンは減少し、初期濃度 lOOmgZLから約 7日で排 水基準の 3mgZL以下の約 2mgZLに達し、 9日後には検出できない程度まで減少 した。このように、高濃度の重金属を含む廃水は、ホンモンジゴケを用いることによつ て、高効率で吸収処理することが可能であった。
[0069] 3.海洋細菌 ホンモンジゴケの有用詧源化
海洋細菌（コべチア sp. EBR04)とホンモンジゴケを物理的破砕効果と化学的加水 分解効果のある水蒸気爆砕法によって粉砕 '分解した。有機物質及び重金属等を吸 収 '蓄積した海洋細菌（コべチア sp. EBR04)とホンモンジゴケの混合物は乾燥重量 10gを使用した。この混合物は次の手順で調製した。上記 1の手順で有機物質を分 解処理した後のコべチア sp. EBR04の培養液 lL (100mL X 10本）を遠心分離して 菌体を回収した。遠心分離は島津製作所製 CST— 151MTにより 15000rpmで 5分 間行った。一方、上記 2の手順で重金属を吸収処理した後のホンモンジゴケの培養 液 lL (100mL X 10本)を遠心分離してコケを回収した。遠心分離は島津製作所製 CST— 151MT〖こより 15000rpmで 10分間行った。回収された海洋細菌菌体とコケ とを混合し、 80°Cのオーブン（YAMATO製 DX— 58)で 24時間乾燥させたものを 水蒸気爆砕処理に用いた。なお、本実験において敢えて細菌とコケとを混合した理 由は、本発明の方法を工業ィ匕する際には両者を混合状態で処理することが想定され るカゝらである。水蒸気爆砕装置は水蒸気発生器、高圧反応器、生成物受器、凝縮器 からなり、最高使用温度 275°C、最高使用圧力 6. OMPaである。実施例として、温度 225°C、圧力 2. 55MPaの水蒸気を用いて行った。また、爆砕生成物中のセルロー ス ·へミセルロース成分の資源化例としてメタン発酵によってメタンに資源化した。次 に、メタンィ匕された後の残渣をメタノール抽出し、メタノール可溶性成分力もリグニン 榭脂を製造した。さらに、メタノール抽出後の残渣物力 金属を回収した。
[0070] 以下、その結果を順次説明する。
[0071] 3-1. 成分柚出比
有機物質及び重金属等を吸収 ·蓄積した海洋細菌とホンモンジゴケの水可溶性へ ミセルロース、ホロセルロース、メタノール可溶性リグ-ン（低分子リグ-ン）と Klasonリ ザ二、ノ (高分子リグニン)の各成分抽出比を検討した。凍結乾燥後の爆砕生成物 5g に蒸留水 300mLを加え、室温で 12時間浸透しながら抽出した。ろ液は乾燥後その 残渣の重量を測定して水可溶性成分 (水可溶性へミセルロース）とした。水で抽出し た残渣はすばやく乾燥し、乾燥残渣 lgは lOOmLのメタノールを用いたソックスレー 抽出器で 12時間抽出した。メタノールで抽出された成分の乾燥重量を測定し、メタノ ール可溶性リグニン量とした。メタノール抽出後の残渣中にはメタノール不溶性リグ- ン (Klasonリグニン）とホロセルロース（多糖成分）が含まれる。残渣中のリグ-ン量は 硫酸を用いた Klason法によって定量し、ホロセルロース量は残渣量から Klasonリグ ニン量を差し引くことによって求めた。
[0072] 3— 2.セルロース'へミセルロースのメタン化
凍結乾燥後の海洋細菌とホンモンジゴケ爆砕生成物 5gを 500mL容量三角フラス コに入れ、下水処理汚泥 500mLを加え、 pH7、温度 37°Cで培養した。フラスコ内の 気相は予めアルゴンガスで置換した。発生したガスは塩ィ匕ビニル管によりアクリル榭 脂製のガス収集管に導き、飽和食塩水中で水上置換により捕集した。なお、水蒸気 爆砕処理しな力つた海洋細菌とホンモンジゴケから同様の実験を行った力 メタンは ほとんど生成されなかった。
[0073] 3— 3.メタノール可溶性リグニンの榭脂ィ
メタン発酵後の残渣物を凍結乾燥した。乾燥残渣は lOOmLメタノールを用いたソッ タスレー抽出器で 12時間抽出した。メタノールで抽出された成分の乾燥物をェポキ シ榭脂化の原料として用いた。エポキシ反応は試料 2gをェポクロルヒドリン lOOmL に溶解させ、 10Nの NaOH水溶液 10mLを 110°Cでゆっくり滴下し、水を除去しなが ら 3時間反応させた。反応終了後、生成した NaClを取り除くために蒸留水で洗浄し た後、溶媒をエバポレートしてエポキシ化リグニンを得た。エポキシ化リグニンカもェ ポキシ化リグ-ン榭脂を作成するためのゲルィ匕反応には硬化剤としてジエチレントリ アミンを用いた。その結果、約 5gのエポキシ化リグ-ン榭脂が得られた。
[0074] 3— 4.残液物からの重余属回収
前記、メタノール可溶性リグニンの榭脂ィ匕において用いな力つた残渣物 (Klasonリ グニン)力も有価金属を回収した。残渣物約 600mgをるつぼにとり、 90°C、 12時間 乾固させた。さらに、 500°C、 6時間加熱し、炭素を二酸ィ匕炭素にして取り除いた。処 理した試料をるつぼ内で 10%硝酸水溶液 lOmLに溶解させ、金属回収溶液とした。
[0075] 本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
[I] セラチア属又はコべチア属に属し、重金属存在下で有機物質を分解する能力を有 する微生物を用いて、重金属存在下で有機物質を分解する方法。
[2] 前記微生物が、セラチア'マルセセンス又はコべチア'マリナに属する細菌である請 求項 1記載の方法。
[3] 前記微生物力 セラチア sp. EBR03 (受領番号 FERM ABP— 10695)又はコ ベチア sp. EBR04 (受領番号 FERM ABP— 10696)である請求項 1記載の方法
[4] 重金属力 SFe、 Cr、 Co、 Cu、 Au、 Sn、 Pb、 Bi、 Zn、 Cd及び Hgからなる群から選択 されるものである請求項 1〜3の何れか 1項に記載の方法。
[5] 有機物質が難分解性芳香族化合物である請求項 1〜4の何れか 1項に記載の方法
[6] セラチア sp. EBR03 (受領番号 FERM ABP— 10695)。
[7] コべチア sp. EBR04 (受領番号 FERM ABP— 10696)。
[8] 重金属及び有機物質を含有する土壌又は水を浄ィ匕する方法であって、
セラチア属又はコべチア属に属し、重金属存在下で有機物質を分解する能力を有 する微生物を用いて、前記土壌又は水中の有機物質を分解して第 1処理物を得るェ 程、
重金属を吸収する植物を用いて前記第 1処理物を処理して第 2処理物を得る工程 、及び
前記第 2処理物から前記植物を分離し、分離された前記植物を水蒸気爆砕し、爆 砕生成物を有用資源化する工程を含む前記方法。
[9] 前記爆砕生成物を有用資源化する工程力 前記爆砕生成物中のセルロース又は へミセルロースを糖ィヒ又は発酵により有用資源化する工程である請求項 8記載の方 法。
[10] 前記爆砕生成物を有用資源化する工程が、爆砕生成物中のリグニン成分を榭脂 化することにより有用資源化する工程である請求項 8記載の方法。
[II] 重金属及び有機物質を含有する土壌又は水を浄化する方法であって、 セラチア属又はコべチア属に属し、重金属存在下で有機物質を分解する能力を有 する微生物を用いて、前記土壌又は水中の有機物質を分解して第 1処理物を得るェ 程、
重金属を吸収する植物を用いて前記第 1処理物を処理して第 2処理物を得る工程 、及び
前記第 2処理物から前記植物を分離し、分離された前記植物を水蒸気爆砕し、爆 砕生成物から重金属を回収する工程を含む前記方法。
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