WO2012164508A1 - Cepa de cobetia marina y extracto biosurfactante obtenido a partir de ella - Google Patents

Cepa de cobetia marina y extracto biosurfactante obtenido a partir de ella Download PDF

Info

Publication number
WO2012164508A1
WO2012164508A1 PCT/IB2012/052724 IB2012052724W WO2012164508A1 WO 2012164508 A1 WO2012164508 A1 WO 2012164508A1 IB 2012052724 W IB2012052724 W IB 2012052724W WO 2012164508 A1 WO2012164508 A1 WO 2012164508A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
strain
biosurfactant
extract
cobetia
ida2h
Prior art date
Application number
PCT/IB2012/052724
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Miguel Alejandro DINAMARCA TAPIA
Juan Ricardo OJEDA HERRERA
Claudia Jimena IBACACHE QUIROGA
Original Assignee
Universidad De Valparaiso
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universidad De Valparaiso filed Critical Universidad De Valparaiso
Priority to US14/122,529 priority Critical patent/US9629882B2/en
Priority to EP12792549.3A priority patent/EP2716749B1/en
Publication of WO2012164508A1 publication Critical patent/WO2012164508A1/es

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/80—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for aquatic animals, e.g. fish, crustaceans or molluscs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09D—COATING COMPOSITIONS, e.g. PAINTS, VARNISHES OR LACQUERS; FILLING PASTES; CHEMICAL PAINT OR INK REMOVERS; INKS; CORRECTING FLUIDS; WOODSTAINS; PASTES OR SOLIDS FOR COLOURING OR PRINTING; USE OF MATERIALS THEREFOR
    • C09D5/00—Coating compositions, e.g. paints, varnishes or lacquers, characterised by their physical nature or the effects produced; Filling pastes
    • C09D5/16—Antifouling paints; Underwater paints
    • C09D5/1606—Antifouling paints; Underwater paints characterised by the anti-fouling agent
    • C09D5/1612—Non-macromolecular compounds
    • C09D5/1625—Non-macromolecular compounds organic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09D—COATING COMPOSITIONS, e.g. PAINTS, VARNISHES OR LACQUERS; FILLING PASTES; CHEMICAL PAINT OR INK REMOVERS; INKS; CORRECTING FLUIDS; WOODSTAINS; PASTES OR SOLIDS FOR COLOURING OR PRINTING; USE OF MATERIALS THEREFOR
    • C09D5/00—Coating compositions, e.g. paints, varnishes or lacquers, characterised by their physical nature or the effects produced; Filling pastes
    • C09D5/16—Antifouling paints; Underwater paints
    • C09D5/1687—Use of special additives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Definitions

  • the present invention is framed in the context of the biotechnology of microorganisms, and deals with a new bacterium Cobetia marina; able to metabolize petroleum hydrocarbons and produce a biosurfactant with emulsifying and biological properties that allows to avoid, specifically, infectious pathologies in fish and that, unlike antibiotics, does not generate resistance.
  • the invention discloses a biosurfactant extract and its use as an additive in the food industry and in the paint and coatings industry.
  • the bacterial strain of this invention is relevant because it produces and releases a biosurfactant supernatant characterized, separately or in a mixture, for its ability to interfere with the cellular communication system known as Quorum Sensing (QS) that affects the formation of microbial biofilms and / or virulent behavior of pathogenic bacteria.
  • QS Quorum Sensing
  • Said supernatant can be extracted by a bioprocess to obtain a concerted extract thereof; which can be used for the control of microbial pathologies.
  • the bioprocess revealed by the present invention consists in cultivating Cobetia marine strain MM1 IDA2H-1 in a bioreactor under preferred physical and chemical cultivation conditions, using dibenzothiophene (DBT) or DBT-rich petroleum industry wastes as the only carbon source for growth, for later; separate, isolate and purify a extracellular surfactant and bioactive extract, characteristics measured by its ability to (i) act as an emulsifier and (ii) interfere with the QS communication system of pathogenic microorganisms, affecting the formation of microbial biofilms and the virulent behavior of pathogenic bacteria, in particular, pathogenic bacteria of fish.
  • DBT dibenzothiophene
  • the extract of the extracellular medium where the strain of Cobetia marina strain MM1 IDA2H-1 has grown under the favorable conditions of the present invention corresponds to a biosurfactant (arbitrarily referred to herein by the reference: biosurfactant AAFOB-1 IDA2H), characterized by presenting a specific biological activity of high interest and applicability, both for the aquaculture industry and in biomedicine; for the control of losses due to infectious microbial pathologies and / or to prevent the formation of microbial biofilms.
  • the AAFOB-1 IA2H biosurfactant has emulsifying properties that allow its incorporation, for example, into food and / or paint coatings.
  • the present invention also relates to the uses of the strain of the present invention in the form of a probiotic in the food intake of preferred acicular species, without causing damage to aquaculture species and benefiting their immunity.
  • antibiotics used in aquaculture are of the bacteriolytic, bacteriostatic or bactericidal type; all of which have the disadvantage that their application implies the positive selection of resistant microorganisms, which harms the therapies and, therefore, persistence of the infectious pathology.
  • antibiotic therapies in open spaces in aquaculture is not specific against pathogenic microorganisms, and may also affect beneficial microorganisms that are part of the marine and / or freshwater microbial communities, altering the stability and functioning of the respective ecosystems Likewise, the use of antibiotics in open spaces can increase the number of genetic determinants associated with resistance to positively selected antibiotics, which may eventually reach species of pathogenic microorganisms for man, constituting a risk to human health.
  • antimicrobial therapies used in aquaculture consider the administration of the active substance in food (medicated food). Doses are delivered based on biomass (kg) for periods of time (days).
  • the treatments are applied via fish feed, by the quantified mixture with the antibiotic. Once the mixture is made, the food is delivered to the crops by dispersion in the water. In this procedure the intake is not controlled and a significant proportion of the food is not ingested, with the consequent release of the antibiotic into the environment. Since aquaculture is an activity directed towards the production of food for human consumption, current antibiotic treatments condition the safety and security of these products, and therefore affect the stability and consolidation of these products in their respective demanding markets.
  • antibiotic replacement includes the search for new microorganisms considered probiotics and / or molecules of natural origin, such as biosurfactants.
  • probiotic microorganisms for the control of infectious pathologies has been defined as a strategy of interest in both human health and aquaculture.
  • the concept of probiotic microorganism in aquaculture includes bacteria, cyanobacteria, microalgae and fungi, among others.
  • probiotic can be extended to "normal microbiota”, “effective microbiota” and / or "beneficial microorganism”.
  • the probiotic concept is extended to microorganisms that, when used during productive tasks, improve water quality and / or inhibit the pathogens that generate diseases in the cultivated species.
  • the mechanisms of competitive exclusion between microorganisms can be varied and range from the production of molecules that kill (antibiotics) to competitors, to complex modulation systems that consider the production of metabolites that alter the genetic program of competitors, altering for example, the virulent behavior of pathogenic microorganisms. These compounds do not have the exclusive function of competition, and can usually be produced by microbial metabolism under various circumstances.
  • the aforementioned probiotic microorganisms such as prebiotic bacteria, can produce natural molecules of microbial origin, surfactants and / or emulsifiers, with hydrophobic and hydrophilic structures; and in this way they are partitioned at the interface between fluid phases with different degrees of polarity, such as the air-water or oil-water interfaces. Said molecules or mixtures thereof are known as biosurfactants.
  • glycolipids The general classification of biosurfactants according to their components, groups them into: glycolipids, lipopeptides, phospholipids, fatty acids and finally polymeric or particulate surfactants.
  • glycopeptide group the best known of them correspond to the ramnolipids, described for the first time in the bacterium Pseudomonas aeruginosa, which are characterized by having one or two molecules of rhamnose associated with one or two molecules of ⁇ -hydroxidecanoic acid.
  • the surfactin produced by B. subtilis ATCC 213322 stands out.
  • biossurfactants correspond to liposan ⁇ Candida lipolytica and emulsify (Acinetobacter calcoaceticus strain, RAG-1), both polymeric surfactants formed by polysaccharide-protein complexes.
  • biosurfactants have important physiological and ecological functions for the microorganism that produces them.
  • the role of surfactants in bacterial motility, cell signaling processes and cell differentiation has been determined.
  • the production of biosurfactants by microorganisms is associated with competition mechanisms with other microorganisms.
  • some of them may be an alternative to the use of synthetic compounds or antimicrobial agents (antibiotics) because of their effectiveness, therapeutic specificity and low toxicity.
  • the biological activities exhibited by biosurfactants are not referred to their detergent properties, but rather to specific molecular and physiological mechanisms. In this context, the antimicrobial and immunomodulatory properties are very attractive today, with a wide variety of applications.
  • AHLs homoserine lactones
  • pathogenicity of microorganisms is related to the expression of virulence factors that allow them to access, colonize, spread and proliferate in the host causing the associated damage.
  • virulence factors occur only under specific conditions, so in different pathogenic microorganisms there are different mechanisms designed to coordinate the expression of these factors with the presence and eco-physiological characteristics of the host organism. Under these conditions, some pathogenic bacteria in addition to trigger pathogenic behavior, form biofilms, and may be resistant to the presence of antibiotics.
  • QS Quorum Sensing
  • the treatments of infectious diseases that affect fish are carried out by the procedures of: (i) immunization via vaccination, (ii) antimicrobial therapy and (iii) prophylactic management and hygiene procedures throughout the production process; all of which do not constitute specific procedures and generate damage to microbial ecosystems, in addition to exhibiting limited effectiveness, quantifiable by economic losses caused due to the mortality of fish for infections; There is currently a growing demand for the search for new products capable of fighting infectious diseases more efficiently.
  • Quorum Quenching the mechanism of inhibition of cellular communication dependent on Quorum Sensing is one of the alternatives to current treatments to avoid and treat infectious diseases, since this control strategy is selective, does not generate resistance and is environmentally compatible because it does not Eliminates microorganisms of environmental importance.
  • the search and development of natural inhibitors of the Quorum Sensing system is based on the competition between microorganisms in their ecosystems, where, in many cases, an interaction based on QS communication systems has evolved.
  • the interference in the QS circuit, with the consequent modification of the genetic program of the opposing microorganism is called Quorum Quenching (QC).
  • Patent application JP2009034094 describes a new microorganism of the Cobetia genus, strain FERM P-21295, and mutant strains thereof.
  • This method reveals a method for the production of polysaccharides, after the isolation and cultivation of the FERM strain P-21295.
  • Said polysaccharides obtained from this strain comprise structural components such as N-acetyl-D-glucosamine, D-galacturonic acid, N-acetyl-D-galactosamine, D-galactose, pyruvic acid and D-alanine.
  • the microorganism of Cobetia marina is useful for producing the mucopolysaccharide that is useful as a dermatological medicine, cosmetics, useful for preventing pigmentation, liver spot, freckles, chloasma, sunburn. It can also be used in prodrugs and pharmaceuticals.
  • JP2009034094 or JP2008194026A documents show similar or close characteristics to those of the extract of the present invention, moreover, the useful products disclosed in said applications correspond to polysaccharides or mucopolysaccharides, and not to fatty acids in an extract with surfactant type characteristics, as is the case of the present invention.
  • Cobetia marina as a producing strain of QS inhibitor compounds, unlike the present invention, where Cobetia marine strain MM1 IDA2H-1 is used as a producing source of tense-active molecules that form capable lipid structures of interacting with the QS signals by inhibiting the behavior of pathogenic microorganisms and / or stimulating the immunity of animals in culture.
  • Figure 1 corresponds to an agar plate Bioassay for the detection of inhibitors of the Quorum Sensing communication system with the Chromobacterium violaceum biosensor.
  • the photograph shows the double-layer nutrient agar culture of the C. violaceum bacteria producing the violacein pigment dependent on the presence of signal molecules from the QS system.
  • the clear zone without blue-violet color indicates a zone of inhibition (+) of the production of the violacein pigment, which is produced by the induction of the QS system by signals of the lactone homoserine type given the activity of the filtered supernatant of the strains of the invention in well 2.
  • Well 4 corresponds to the negative control (-) corresponding to culture medium without bacterial growth.
  • Figure 2 corresponds to a microplate bioassay for the detection of bacteria producing inhibitors of the Quorum Sensing system.
  • the bioassay was performed with liquid cultures of the C. violaceum biosensor grown in the presence of the filtered supernatant of a culture of the MM1 IDA2H-1 strain grown in Bushnell-Hass medium with DBT as the only source of energy and carbon.
  • As a control (c) cultures of C. violaceum exposed to Bushnell-Hass culture medium without inoculating with strain MM1 IDA2H-1 were used.
  • the blue-violet color indicates the presence of the violacein pigment (sign -), which occurs when certain chemical signals activate the QS system.
  • the presence of inhibitors of the QS system is determined by the loss of the blue-violet color (+ sign).
  • Figure 3 corresponds to a microplate bioassay to evaluate the inhibitory effect on the Quorum Sensing communication system of the biosurfactant extracellular extract of the MM1 IDA2H-1 strain.
  • the cultures of C. violaceum were grown in the presence of the biosurfactant extracellular extract (AAFOB) produced by the MM1 IDA2H-1 strain grown in Bushnell-Hass medium with DBT as the only source of energy and carbon (where the inhibitory activity is symbolized with The sign
  • Figure 4 corresponds to Microplate Bioassay to evaluate the inhibitory effect of the AAFOB surfactant extract of Quorum Sensing signals generated by the pathogenic bacterium of fish Aeromonas salmonicida. (where the inhibitory activity is symbolized with the + sign).
  • Figure 5 graphically shows the antivirulence activity of the extract against the pathogenic bacterium Aeromonas salmonicida. Activity measured in relation to the expression of virulence genes: aerolysin (A), serine protease (B) and lipase (C) of said pathogenic strain, under control conditions (without treatment) and when treated with the biosurfactant extract of the present invention.
  • Figure 6 shows an electronic transmission microfotog raffia of the bacterial cells of strain MM1 IDA2H-1 were grown in minimal medium Bushnell-Hass with succinate (30 mM) as the sole source of energy and carbon (A) or in minimal medium Bushnell-Hass with DBT (1% w / v) as the sole source of energy and carbon (B).
  • FIG. 7 shows in a microplate bioassay the inhibition of the Quorum Sensing-dependent phenotype using Cobetia marina MM1 IDA1 H-1.
  • A Shows the response of the purple C. violaceum phenotype at different concentrations ⁇ g ml / L) of the biosurfactant (BS) produced.
  • B Water surface tension (ST) is observed at different concentrations (mg l / L in logarithmic scale) of the biosurfactant ( ⁇ ), and its effect on the biofilm formation of L anguillarum (O).
  • the critical micellar concentration was set at 80 mg l / L.
  • the maximum inhibition values of Quorum Sensing-dependent phenotypes were at micelle formation concentrations.
  • the invention provides a new probiotic bacterium called Cobetia marina strain MM1 IDA2H-1 to prevent or treat infectious pathologies in aquaculture.
  • the bacterial strain of the present invention was isolated and selected among native microorganisms of the marine environment capable of degrading or metabolizing insoluble organic compounds that are part of the oil, which can be harmful to the environment.
  • the substrates useful to be degraded are of the aromatic and / or aliphatic types, which are solubilized in the aquatic environment to be assimilated by the microorganism. These substrates are used by the microorganism to produce its energy, cellular material and secondary metabolites.
  • the bacterium Cobetia marina strain MM1 IDA2H-1 corresponds to a native strain of the marine environment, capable of growing in a wide range of saline concentration (sodium chloride), a wide temperature range of 10 Q to 35 Q C and use aromatic or aliphatic organic compounds that are organic components of oil, as a source of energy and carbon, and therefore survive in the marine environment.
  • the bacterium Cobetia marina strain MM1 IDA2H-1 was grown with dibenzothiophene (DBT) as the only source of carbon and energy, where the range for the use of said carbon source varies between 0.75 and 1.5% p / v; and where preferably the concentration of DBT used is 1% w / v in the culture and selection media.
  • DBT dibenzothiophene
  • the strain of the present invention was identified among bacteria belonging to the Cobetia genus by comparison and determination of the genome identity of the sequence of the region corresponding to the 16S ribosomal DNA, in particular to the polynucleotide of the 16S region of the ribosomal RNA of the sequence of the Cobetia spp.
  • the bacteria Cobetia marina strain MM1 A2DAIH-1 of the present invention is capable of growing in hydrocarbons of the type DBT, generating an extract capable of reducing surface tension, acting as an emulsifier and generating an extract with QS inhibitory capacity when it grows in a culture medium with only DBT as a nutritional source, that is, as a source of energy and carbon.
  • the reference strain Cobetia marina CECT 4278 using methods specific to the technique, its ability to use DBT and produce surfactants was not established.
  • the Cobetia marine strain MM1 IDA2H-1 bacterium has no pathogenicity characteristics, that is, it is harmless; since the bacteria Cobetia marina strain MM1 IDA2H-1 does not show hemolytic activity when grown in a culture medium containing blood.
  • the bacterium Cobetia marina strain MM1 IDA2H-1 of this invention has among its novel features: using petroleum-derived compounds, such as, sulfuric cyclic aromatic hydrocarbons; and generate biosurfactants with specific physical and biological activity. Because of this, it is possible to determine that the bacteria Cobetia marina strain MM1 IDA2H-1 is part of the group of beneficial microorganisms or also called probiotics for aquaculture.
  • the invention provides a method for producing the biosurfactant AAFOB-1 IDA2H using the Cobetia marine strain MM1 IDA2H-1 bacterium of the present invention, which comprises the steps of:
  • strain of the invention can be grown under conditions similar to those already described, replacing 75% of the volume of distilled water with 75% of seawater as a solubilizing agent;
  • centrifugation step is carried out between 4,000 to 8,000 rpm for 15 to 20 minutes; and after discarding the sedimented phase, the supernatant is recovered, which is filtered by cutting filter between 0.22 and 0.45 ⁇ ;
  • step (d) sift the powder obtained in step (c) mechanically, under agitation in a horizontal position, to release impurities and salts; Y (e) drying the sieved powder obtained in step (d) at a temperature between 30 and 50 ° C for 20 to 30 hours, achieving a dry yellow powder consisting of fatty acids having emulsifying and bioactive properties.
  • the most preferred conditions are, dry the powder at 40 Q C for 24 hours.
  • the preferred embodiment of the present invention involves a method where the growth of the bacterial strain is carried out in a commercial medium Bushnell-Hass (Difco) (medium comprising the salts mentioned in step (a)) or a medium formed in 25% by said means and 75% by volume by seawater; where the value of the concentration of the preferred single carbon source (DBT) is 1% w / v.
  • a commercial medium Bushnell-Hass (Difco) (medium comprising the salts mentioned in step (a)) or a medium formed in 25% by said means and 75% by volume by seawater; where the value of the concentration of the preferred single carbon source (DBT) is 1% w / v.
  • the invention provides a biosurfactant and surfactant concentrated extract of emulsifying and bioactive properties.
  • Said biosurfactant extract is characterized by its chemical composition, its ability to emulsify and its biological activity.
  • bioactive properties of the biosurfactant extract of the invention are determined in terms of its activity on the formation of biofilms and bacterial pathogenicity, activities dependent on the QS system.
  • the biological activity of the biosurfactant extract was determined on fish pathogenic bacteria such as Listonella anguillarum that forms biofilms that favor its dissemination.
  • fish pathogenic bacteria such as Listonella anguillarum that forms biofilms that favor its dissemination.
  • the exposure of Listonella anguillarum to the bacteria Cobetia marina strain MM1 IDA2H-1 and / or to the biosurfactant extract of this invention results in the inhibition of biofilm formation of the indicated pathogen.
  • the bacterium Cobetia marina strain MM1 IDA2H-1 can be used as a beneficial bacterium to avoid the pathologies caused by Listonella anguillarum.
  • the surfactant properties of the biosurfactant extract of this invention are measured according to the decrease in surface tension or by its activity as an emulsifier. Said surfactant properties allow the incorporation of these products in the form of cosmetic, food additives and / or any other food or pharmaceutical formula.
  • the bacterium Cobetia marina strain MM1 IDA2H-1 is used in the present invention to produce a biosurfactant extract that has physical properties when acting as an emulsifying agent, with a surface tension value of between 66 to 70 dynes / cm, and with a high emulsion stability
  • the AAFOB-1 IDA2H extract of the present invention corresponds to a mixture of organic molecules composed of at least fatty acids of the palmitic, myristic and linoleic types, specifically consisting of 2.52 to 9.22% of C12 lauric acid: 0 ; 5.97 to 10.13% C14 myristic acid: 0; 2.4 to 2.88% pentadecanoic acid; 19.27 to 24.39% C16: 0 palmitic acid; 7.81 to 9.83% C16: 1 palmitoleic acid; 8.37 to 10.43% C18: 0 stearic acid; and 1,132 to 16.25% C18 oleic acid: 1 cis.
  • This extract is obtained by the biosynthesis carried out by the bacteria Cobetia marina strain MM1 IDA2H-1 grown in a minimal medium supplemented with DBT as the only carbon source.
  • the surfactant properties of products of microbial origin measured by their ability to reduce surface tension or act as emulsifiers are of great technological importance in cosmetic, food and / or pharmaceutical formulations.
  • the emulsifiers provided by the biosurfactant extract of the present invention provide stability to the formulations in which an active ingredient is incorporated that needs to be dosed or delivered for cosmetic, pharmaceutical and food uses, among others.
  • the bacterium Cobetia marina strain MM1 IDA2H-1 produces a surfactant supernatant capable of reducing surface tension, being able to maintain stable emulsions of Organic oils water solutions, used in the food industry and also in hydrocarbon solutions used in the paint and / or coatings industry.
  • the biological activity of the biosurfactant extract was evaluated in fish in culture to determine its toxicity and potential effect on fish immunity.
  • the extract product AAFOB-1 IDA2H was not toxic (with a survival rate of 78%) for fish and according to the immunity analysis with different markers it was observed that it was able to stimulate the activity of the TNF-alpha immunological agent in gills of trout.
  • biosurfactant AAFOB-1 IDA2H extract produced extracellularly by the new marine bacterial strain, with emulsifying physical properties, and biological properties associated with the selective inhibition of virulence mechanisms of pathogenic microorganisms of fish, implies a development line of antimicrobial products for High value aquaculture for being selective, non-toxic, not generating resistance and being environmentally safe.
  • a further aspect of the present invention relates to the use of the bioactive extract with emulsifying surfactant properties as a food additive and / or paint coating.
  • the biosurfactant can be used as a food additive in a food formulation that gives the food functionality; or this food additive is used to prevent and treat infectious pathologies dependent on the QS system.
  • Another alternative embodiment uses the AAFOB-1 IDA2H extract in the formulation of bioactive coatings and / or paints of submerged surfaces, its use being of particular interest for the control of microbial biofilms.
  • Bacteria strains isolated from seawater samples were enriched in Bushnell-Hass liquid medium (Difco, Detroit USA) containing DBT (Merck, Hohenbrunn, Germany) as the only source of energy and carbon.
  • the growth temperature was 20 Q C.
  • the bioassays to determine the presence of inhibitors or stimulators of the QS system were performed using the Chromobacterium violaceum (CECT 494 T; ATCC 12472) and Chromobacterium violaceum CV026 (CECT 5999; NCTC 13278; VTT E-82808) (Chu et ai, 201 1) which were grown to 26 Q C in Luria Bertani medium.
  • the antibiotic Kanamycin 25 ⁇ g ml was added to the culture medium.
  • the bacterium Cobetia marina strain MM1 IDA2H-1 of the present invention was isolated from samples of seawater taken from intertidal coastal pools in the area of Re ⁇ aca, Vi ⁇ a del Mar in the region of Valpara ⁇ so, Chile. Water samples were used to perform selective enrichment by inoculating flasks with culture media and DBT as the sole source of energy and carbon. The flasks were incubated at 20 Q C for 2 weeks. Growing cultures were selected for isolation in Difco TM Marine Agar solid culture medium from ZoBell 2216 (Becton Dickinson and Co. USA). The plates were incubated at 20 C and Q of these isolated colonies for further analysis were selected.
  • the identification and characterization of the bacterium Cobetia marina strain MM1 IDA2H-1 was carried out by means of: 1) molecular studies (amplification, sequencing, sequence analysis of the 16S rDNA region); 2) physiological (growth in different concentrations of sodium chloride); and 3) by biochemical and metabolic tests (with Biomerieux Api 20 NE and BIOLOG Ecoplate systems).
  • the sequencing and analysis of the 16S rDNA region was carried out in the Spanish Type Culture Collection (CECT).
  • CECT Spanish Type Culture Collection
  • the taxonomic location of the bacteria Marine cobetia MM1 IDA2H-1 used in the present invention is based on molecular biology methods and methods that determine the characteristics of microorganisms, such as their metabolism and salt requirements of the NaCI type. All these techniques are reproducible and are part of the state of the art.
  • Table 1 Differences between Cobetia strain MM1 IDA2H-1 bacteria, Cobetia marine bacteria and Halomonas halodurans.
  • the biosurfactant extract produced by Cobetia marina strain MM1 IDA2H-1 was evaluated by means of the evaluation of tensile properties.
  • 12 colonies of isolated strains were evaluated in pure culture, grown independently in Bushnell-Hass (Difco, Detroit USA) culture medium containing DBT as a carbon source at 20 Q C for 72 hours.
  • the cultures obtained were centrifuged at 4,000 rpm for 20 minutes at 4 Q C.
  • the supernatants of the 12 strains obtained were filtered with 0.22 ⁇ cellulose filters and stored at 10 Q C for the analysis of the surfactant properties.
  • the analysis of the surfactant properties were performed using a DuNóy tensiometer for which the supernatants of the isolated microorganisms were used. Table 2. Surface Tension Values.
  • Table 2 above shows the 12 strains of marine-derived bacteria that were isolated from seawater samples using a selective enrichment procedure using a minimum culture medium containing a petroleum-derived hydrocarbon as the sole source of energy and carbon.
  • the compound for the growth of the strain was dibenzothiophene, insoluble in the aqueous phase.
  • the microorganisms were evaluated to determine their ability to produce surfactant compounds, for which they were grown in Bushnell-Hass liquid medium from which samples of 20 ml were obtained, which were filtered and centrifuged at 8,000 g. The final supernatants were used to measure surface tension with a Dunoy tensiometer device. The values represent the drop in the surface tension of the water (TS). Bioactive properties evaluation.
  • the bioassay to determine the existence of inhibitors of the QS system used the strain Chromobacterium violaceum and consisted of exposing this microorganism to the presence of the supernatant of Cobetia marine strain MM1 IDA2H-1.
  • the bacterium Chromobacterium violaceum has a QS circuit that, when activated, induces the expression of the genes that code for the synthesis of violacein, a compound that gives this bacterium a characteristic violet-colored phenotype.
  • Chromobacterium violaceum CV026 was used as a test to determine the existence of a stimulation of the QS system.
  • This microorganism derives from the wild strain Chromobacterium violaceum and unlike has been mutated in its ability to produce self-inducing molecules with the insertion of a mini transposon with resistance to the antibiotic kanamycin (miniTn5 :: Km). In this way, this microorganism requires external chemical signals to activate the QS circuit and generate the violet phenotype.
  • the supernatant of the selected DBT degrading bacteria was used for the bioassays of interference with the QS system.
  • the bacteria Cobetia marina strain MM1 IDA2H-1 is short bacillus, Gram negative, positive oxidase, which grows in a wide range of sodium chloride (Table 1). It has no hemolytic activity and therefore is not considered a pathogenic bacterium. In comparison to that described in the reference strain of the prior art, the bacteria Cobetia marina strain MM1 IDA2H-1 metabolizes as a source of anthracene carbon, naphthalene and phenanthrene.
  • Cobetia marina strain MM1 IDA2H-1 produces AAFOB-1 IDA2H extract with emulsifying properties of interest in food formulation, and in the formulation of bioactive coatings and / or paints of submerged surfaces.
  • the bacteria were inoculated in 1 liter of Bushnell-Hass medium (Difco, Detroit USA) containing DBT as a carbon source.
  • the growth was carried out using a Fermentor Liflus model GX bioreactor with automatic control of pH, oxygen, temperature and agitation.
  • the incubation conditions were: temperature of 30 Q C, 100% aeration and stirring with rotating blades at 200 rpm for 48 hours.
  • the culture obtained was centrifuged at 5,000 rpm for 20 minutes in an Eppendorf model 5810R centrifuge and the supernatant was filtered on sterile 0.22 ⁇ filters.
  • the cell-free supernatant was treated with cold acetone (JT Backer, USA) in a 2: 1 ratio for precipitation.
  • the supernatant / acetone mixture was stored at -10 Q C for 24 hours.
  • the obtained precipitate was separated from the acetone / water solution by centrifugation at 10,000 rpm at 4 Q C in a centrifuge Eppendorf 5810R.
  • the precipitate obtained was dried at room temperature for 48 hours. Emulsification index and emulsion stability tests.
  • the emulsification index of the selected extract with different organic phases was determined.
  • the extract obtained was dissolved in ultra pure water at a concentration of 100 mg / mL.
  • Emulsification tests were carried out with hexadecane (Merck, Germany), commercial diesel, commercial fish oil and commercial cane oil.
  • the proportions of organic: aqueous phases used were 1: 1.
  • the emulsions were formed by vortexing for 2 minutes, leaving the tubes at rest for 24 hours. After the rest time elapsed, the emulsification index was measured at 24 hours (E 24 ), for which the height of the emulsion was measured in centimeters with respect to the total height of the phases, expressing the result in percentage.
  • the stability of the emulsion was determined by measuring the decay constant (K d ).
  • K d The decay constant
  • emulsions were performed as previously described with different organic phases by measuring the turbidity of the aqueous phase at a wavelength of 540 nm. The proportions for the organic and aqueous phases were 4:25, respectively. The measurements were made at times 10, 20, 30, 40, 50 and 60 minutes after the emulsion was formed.
  • the decay constant (K d ) was calculated from the slope of the data obtained in the turbidity readings versus time.
  • the AAFOB-1 IDA2H extract produced by Cobetia marina strain MM1 IDA2H-1 during its growth in DBT as a carbon source, has the property of acting as an emulsifier and is able to maintain stable emulsions of fish oil and cane (Tables 3 and 4).
  • the so-called surfactant compounds can act as emulsifiers which represents various advantages in many production processes of the pharmaceutical and food industrial sectors.
  • the extract called AAFOB produced by strain MM1 IAD2H when grown in dibenzothiophene can be used as an emulsifying agent for oils such as Ca ⁇ óla or fish.
  • the Emulsification Index (IE) measured in percentage indicates the stability of the emulsion formed by the oil and water in the presence of an emulsifying agent, in a given time in this case 24 hours at 20 QC .
  • Table 4 Stability of fish oil-water emulsion in the presence of AAFOB measured by the Decay Constant (K d ).
  • the chemical composition of the biosurfactant extract of this invention was determined, it being found that the profile by gas chromatography (GC-M) shows a high contribution of fatty acids of 12 to 18 carbon atoms (Table 5). Table 5. Percentages of fatty acids present in the extract produced by the bacteria Cobetia marina strain MM1 IA2H-1.
  • Palmitic C16 0 24.39 20.98 19.27 % Ac. Palmitoleic C16: 1 9.83 8.46 7.81
  • Virulence inhibition assays were carried out using the Aeromonas salmonicide strain (CECT 894 T; ATCC 33658) grown at 24 Q C in nutrient broth medium or TSA solid medium. Both A. salmonicida and Listonella anguillarum were manipulated in an ESCO Streamline biosafety cabin model SC2 Class II BS. The bioassays were performed using the Chromobacterium violaceum (CECT 494 T; ATCC 12472) and Chromobacterium violaceum CV026 (CECT 5999; NCTC 13278; VTT E-82808) strains which were grown at 26 Q C in Luria Bertani medium. For the C.
  • vilaceum CV026 strain the antibiotic Kanamycin (25 ⁇ g ml) was added to the culture medium. Both strains were acquired in the Spanish Type Culture Collection (CECT). Marine cobetia strain MM1 IDA2H-1, was grown at 30 Q C in Bushnell-Hass medium (Difco, Detroit USA) containing DBT as a carbon source, for 48 hours with agitation at 200 rpm.
  • CECT Spanish Type Culture Collection
  • Marine cobetia strain MM1 IDA2H-1 was grown at 30 Q C in Bushnell-Hass medium (Difco, Detroit USA) containing DBT as a carbon source, for 48 hours with agitation at 200 rpm.
  • a bioassay was carried out to establish the ability to inhibit or stimulate the cellular communication mechanism known as Quorum Sensing (QS).
  • QS Quorum Sensing
  • the bioassay to determine the existence of inhibitors and / or stimulators of the QS system was carried out with the strain Chromobacterium violaceum and Chromobacterium violaceum CV026 as described previously.
  • the bacterium Chromobacterium violaceum was grown in medium Luria Bertani liquid culture in 96 well microtiter plates at 30 Q C.
  • the biofilm formation or inhibition test was developed with the Listonella anguillarum CECT 522 bacterium acquired in the Spanish Type Culture Collection. This bacterium can form biofilms which is a behavior dependent on Quorum Sensing (QS).
  • QS Quorum Sensing
  • the protocol used was to evaluate the adherence of Listonella anguillarum to 96-well microtiter plates, for which the violet crystal staining method was used. This method allows staining cells that have adhered to a surface when a bio-film is formed. Quantification was performed by diluting the stained wells with ethanol-acetone and reading the optical densities at an absorbance of 575 nm.
  • Aeromonas salmonicida were grown in Erlenmeyer flasks in a Companion orbital incubator model SK-300 at 20 Q C and 200 rpm until reaching an optical density of 0.8 (Abs 6 oonm) - At this time the cultures were centrifuged at 8,000 rpm at 4 Q C and the extraction and purification of RNA with RNeasy ® Mini Kit (Ambion Inc. QuiaGene Texas, USA) system was performed. The cDNA formation and amplification reaction were performed with the Brillan one-step system. III Ultra Fast SYBR ® Green QRT-PCR Master Mix (Agilent Technologies, USA). The total RNA extracted was quantified in NanoDrop DN-1000 model spectrophotometer and subsequently verified in its entirety in an agarose gel electrophoresis (0.8% w / v) stained with ethidium bromide.
  • Amplification was performed using the following primers:
  • the 16S rDNA region was used as the reference sequence using primers 1492-R and 27-F.
  • the reaction was carried out in an Aligent Technologies Stratagene Mx3000P real-time thermal cycler and the relative quantification and statistical analysis was performed with the MxPro software (Aligent Technologies).
  • the results indicate that the extract produced by Cobetia marina strain MM1 IDA2H-1 interferes with QS signals produced by C. violaceum ( Figure 2).
  • This microorganism is exposed to the presence of QS signals and the AAFOB-1 IDA2H extract does not form the violet phenotype in this bacterium. The absence of this extract restores the violet phenotype in cultures exposed to the QS signals ( Figure 2).
  • This bacterium produces, during its growth, QS signals that can be detected by the bacterium Chromobacterium violaceum CV026, igniting its violet phenotype. Exposure of a supernatant with QS signals in the presence of AAFOB-1 IDA2H extract prevents the formation of the violet phenotype in the bacterium Chromobacterium violaceum CV026 ( Figure 4). In this way it is possible to establish that the AAFOB-1 IDA2H extract interferes with the QS signals produced by Aeromonas salmonicida.
  • AAFOB-1 IDA2H a toxicity and immunity test was performed with fish of the Oncorhynchus mykiss species in culture through a food that incorporated as active ingredient the product called AAFOB-1 IDA2H.
  • the field test was carried out with 12 ponds of 0.18 meters / cubic salt water in which 15 fish of approximately 120 grams each of the O. mykiss species were placed, which represented a pond density of 10 kilos per meter cubic.
  • the ponds were separated into three types of diets, of which two were food in the form of pellets made with AAFOB-1 IDA2H in the doses of 4.17 and 8.34 grams of AAFOB-1 IDA2H per kilogram of food delivered.
  • the third diet was a negative control, without AAFOB-1 IDA2H.
  • the elaborated doses were treated with ionizing radiation.
  • the fish were fed for at least 30 days to evaluate the following parameters: 1. Dietary survival based on AAFOB, 2.
  • Antimicrobial activity of blood plasm on the pathogen Aeromonas salmonicida 3. Effect of diets on intestinal microflora at metabolic level, 4. Effect on immune activity at intestinal level. After submitting the fish to the respective diets, the ponds were sampled to obtain samples of blood serum and intestines for their respective analyzes.
  • the product was obtained: 1. In case it only affects the deployment of virulence factors of fish pathogens, 2. It is capable of inducing a specific immune response mediated by Tnf-alpha in kidney and IL-1 B in gills, 3. It does not represent toxicity when incorporated directly into farmed fish, 4. It has physical properties that allow it to form stable emulsions with mixtures of oils and thus be added to fish feed in the form of pellets during the production process of preparation, 5. The food prepared with the active substance AAFOB-1 IDA2H when used in a diet for fish of the O. mykiss species of 120 grams is not toxic and stimulates your immune system, which was measured by a higher antimicrobial activity of blood plasma from dietary fish compared to a control diet without additive AAFOB-1 IDA2H.
  • the extract of the invention does not generate resistance
  • the extract of the invention acts selectively on behaviors that determine virulence in pathogenic microorganisms
  • the extract of the invention shows activity in concentrations similar to antibiotics; iv) unlike antibiotics, the extract of the invention, and since it is a natural product; its use is not subject to the same environmental, sanitary, or other regulations;
  • the extract can be added to food in the extrusion process
  • the extract of the invention is not toxic to different cell lines or fish;
  • the extract of the invention comes from a non-pathogenic marine fish bacterium.
  • the extract of the invention is a mixture of biodegradable compounds and is therefore environmentally safe;
  • the extract of the invention produced by the strain corresponds to a mixture of fatty acids that has an activity that interferes with the QS system; xi) the characteristics and physical properties of the extract of the invention, such as that of emulsifier, allow its addition in dry foods during or after the extrusion process.
  • Table 7 highlights the distinctive properties between the use of the biosurfactant extract of the present invention and two antibiotics widely used in aquaculture.
  • Table 8 shows the main advantages of using the method of the present invention for obtaining a biosurfactant, based on the biosynthesis of an extracellular extract by the strain of the present invention.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)

Abstract

La invención divulga una cepa bacteriana de Cobetia marina no patógena de utilidad en acuicultura, que corresponde a una cepa aislada Cobetia marina, gram negativa, oxidasa positiva, depositada bajo el registro de CECT Nº 7764; que crece en dibenzotiofeno (DBT) como única fuente de carbono. Ademas divulga un método para obtener un extracto biosurfactante, tensoactivo que comprende crecer en un biorreactor Cobetia marina cepa (MM1IDA2H-1) CECT Nº 7764 en un medio de cultivo líquido durante 24 a 48 horas a una temperatura entre 10 y 35º C, p H 6 a 8; con agitación constante entre 100 a 400 rpm y saturación de oxígeno entre 10 a 21%; hasta obtener un cultivo con células crecidas y productos extracelulares más sales inorgánicas; separar las celulas, liofilizar el sobrenadante, tamizar el polvo obtenido y secar. Además se divulga un extracto biosurfactante y tensoactivo y usos del mismo para evitar patologías infecciosas en acuicultura, uso como aditivo para formulaciones de pinturas para superficies sumergibles; y uso como aditivo en alimentos para peces donde induce una respuesta inmune.

Description

Cepa de Cobetia marina y extracto biosurfactante obtenido a partir de ella.
La presente invención se enmarca en el contexto de la biotecnología de microorganismos, y trata sobre una nueva bacteria Cobetia marina; capaz de metabolizar hidrocarburos del petróleo y producir un biosurfactante con propiedades emulsificantes y biológicas que permite evitar, de manera específica, patologías infecciosas en peces y que, a diferencia de los antibióticos, no genera resistencia. Ademas la invención divulga un extracto biosurfactante y su uso como aditivo en la industria de los alimentos y en la industria de pinturas y revestimientos.
OBJETO DE LA INVENCIÓN
Es objeto de la presente invención el aislamiento y la obtención de una nueva cepa Cobetia marina con registro de depósito CECT NQ 7764 bajo la Colección Española de Cultivos Tipo (arbitrariamente aquí denominada por la referencia: cepa MM1 IDA2H-1 ). La cepa bacteria de esta invención es relevante por cuanto produce y libera al medio un sobrenadante biosurfactante caracterizado, de forma separada o en una mezcla, por su capacidad de interferir con el sistema de comunicación celular conocido como Quorum Sensing (QS) que afecta la formación de biopelículas microbianas (biofimls) y/o la conducta virulenta de bacterias patógenas. Dicho sobrenadante puede ser extraído mediante un bioproceso para la obtención de un extracto concetrado del mismo; el cual puede ser utilizado para el control de patologías microbianas. El bioproceso revelado por la presente invención consiste en cultivar Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 en un biorreactor bajo condiciones físicas y químicas de cultivo preferidas, utilizando dibenzotiofeno (DBT) o desechos de la industria petrolífera ricos en DBT como única fuente de carbono para el crecimiento, para posteriormente; separar, aislar y purificar un extracto extracelular tensoactivo y bioactivo, características medidas por su capacidad de (i) actuar como emulsificante y de (ii) interferir con el sistema de comunicación QS de microorganismos patógenos, afectando la formación de biopelículas microbianas y la conducta virulenta de bacterias patógenas, en particular, bacterias patógenas de peces.
El extracto del medio extracelular donde ha crecido la cepa de la Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 bajo las condiciones favorables de la presente invención, corresponde a un biosurfactante (arbitrariamente aquí denominado por la referencia: biosurfactante AAFOB-1 IDA2H), caracterizado por presentar una actividad biológica específica de alto interés y aplicabilidad, tanto para la industria acuícola como en biomedicina; para el control de pérdidas por patologías infecciosas microbianas y/o para evitar la formación de biopelículas microbianas. Además, el biosurfactante AAFOB-1 IA2H presenta propiedades emulsificantes que permiten su incorporación, por ejemplo, en alimentos y/o revestimientos de pinturas.
Adicionalmente, la presente invención, se refiere también a los usos de la cepa de presente invención en forma de probiótico en la ingesta alimenticia de especies acuículas preferidas, sin causar daños en especies aquícolas y beneficiando su inmunidad.
ESTADO DE LA TÉCNICA.
Actualmente el uso de antibióticos en la acuicultura es una medida de control de patologías infecciosas, pero que presenta complicaciones y limitantes que amenazan la estabilidad y consolidación de los productos alimenticios de consumo humano generados de esta actividad. La complicación más evidente radica en que el uso de antibióticos no ha evitado las pérdidas económicas y sociales derivadas de los brotes de bacterias y virus patógenos que afectan productivamente a la acuicultura y en especial a la salmonicultura, donde se registran grandes mortalidades. A su vez, entre las principales limitantes está el hecho de que los antibióticos utilizados en acuicultura no varían sustancialmente de los usados en la salud humana. Por esto, y al igual que en salud humana, actualmente el uso de antibióticos en salmonicultura está altamente restringido mediante normas y regulaciones que, por ejemplo, prohiben el uso de estos agentes como estrategia de engorda, o, restringen su uso continuo durante el proceso productivo para el control de patologías infecciosas. Tanto la falta de eficacia de los tratamientos antibióticos como las restricciones a su utilización, se explican por el aumento gradual de brotes epidémicos, tanto en humanos como en animales, generados por microorganismos patógenos que son resistentes a la variedad de antibióticos disponibles. Los antibióticos usados en acuicultura son del tipo bacteriolítico, bacteriostático o bactericida; todos los cuales presentan la desventaja de que su aplicación implica la selección positiva de microorganismos resistentes, lo que perjudica las terapias y, por tanto, persistencia de la patología infecciosa. Por otra parte, la práctica de terapias antibióticas en espacios abiertos en la acuicultura no es específica contra microorganismos patógenos, y puede también afectar a microorganismos beneficiosos que forman parte de las comunidades microbianas marinas y/o dulceacuícolas, alterando la estabilidad y funcionamiento de los respectivos ecosistemas. Así mismo, el uso de antibióticos en espacios abiertos puede incrementar el número de determinantes genéticos asociados a resistencia a los antibióticos seleccionados positivamente, los que eventualmente pueden llegar a especies de microorganismos patógenos para el hombre, constituyendo un riesgo para la salud humana. En la actualidad las terapias antimicrobianas usadas en acuicultura consideran la administración del principio activo en el alimento (alimento medicado). Las dosis son entregadas en función de la biomasa (kg) durante periodos de tiempo (días). Algunas de las terapias usadas se resumen en la tabla siguiente.
Antibiótico Dosis* en alimento Tiempo Recomendación
(mg/kg pez por día) Días
Amoxicilina 160 10 Amplio espectro
Flumequina 16 10 Quinolona para septicemias
Florfenicol 10 10 Amplio espectro
Eritromicina 100 21 Macrolido contra Gram +
(BKD)
Oxitetraciclina 75 21 Amplio espectro Penicilina 80 10 Amplio espectro
*Principio activo
Los tratamientos son aplicados vía alimento para peces, por la mezcla cuantificada con el antibiótico. Una vez hecha la mezcla, el alimento es entregado a los cultivos por dispersión en el agua. En este procedimiento la ingesta no es controlada y una proporción importante del alimento no es ingerido, con la consecuente liberación del antibiótico al medio ambiente. Dado que la acuicultura es una actividad dirigida hacia la producción de alimentos de consumo humano, los actuales tratamientos antibióticos condicionan la inocuidad y seguridad de estos productos, y por tanto afectan la estabilidad y consolidación de dichos productos en sus respectivos mercados demandantes.
En este escenario, la tendencia actual es buscar alternativas al uso de antibióticos, lo que considera soluciones de origen natural que sean específicas, no generen resistencia, no sean tóxicas ni produzcan daños en el medio ambiente. Una de las aproximaciones para el reemplazo de los antibióticos comprende la búsqueda de nuevos microorganismos considerados probióticos y/o moléculas de origen natural, tales como, los biosurfactantes.
El uso de microorganismos probióticos para el control de patologías infecciosas ha sido definido como una estrategia de interés tanto en salud humana como en acuicultura. El concepto de microorganismo probiótico en acuicultura incluye a bacterias, cianobacterias, microalgas y hongos, entre otros. Así mismo, el término probiótico puede ser ampliado a "microbiota normal", "microbiota efectiva" y/o "microorganismo beneficioso". Actualmente, en acuicultura el concepto probiótico se amplia a microorganismos que al ser usados durante las faenas productivas mejoran la calidad de agua y/o inhiben a los patógenos que generan enfermedades en las especies en cultivo. En acuicultura existen prácticas destinadas a la eliminación de los microorganismos presentes en el agua de forma inespecífica mediante el uso de filtros, ozono e irradiación con luz ultravioleta. Estos procedimientos alteran los ecosistemas microbianos acuáticos generando un desequilibrio entre la microbiota beneficiosa y los microorganismos patógenos, lo que favorece la aparición de patologías infecciosas, debido a la pérdida del control biológico entre especies. En este sentido, la búsqueda de nuevos microorganismos beneficiosos antagonistas que controlan las poblaciones de microorganismos patógenos mediante un mecanismo de exclusión competitiva, es una alternativa para el control de pérdidas por patologías infecciosas.
Los mecanismos de exclusión competitiva entre microorganismos pueden ser variados y van desde la producción de moléculas que matan (antibióticos) a los competidores, hasta complejos sistemas de modulación que consideran la producción de metabolitos que alteran el programa genético de los competidores, alterando por ejemplo, la conducta virulenta de microorganismos patógenos. Estos compuestos no tienen como función exclusiva la competencia, y por lo general pueden ser producidos por el metabolismo microbiano bajo variadas circunstancias.
Por otra parte los mencionados microorganismos probióticos, tales como bacterias prebióticas, pueden producir moléculas naturales de origen microbiano, tensoactivas y/o emulsificantes, con estructuras hidrofóbicas e hidrofílicas; y de esta forma se particionan en la interfase entre fases fluidas con diferentes grados de polaridad, tales como, las interfases aire-agua o aceite-agua. Dichas moléculas o mezclas de las mismas son conocidas como biosurfactantes.
A pesar de que los surfactantes de mayor uso son sintetizados químicamente, en las últimas décadas el desarrollo y producción de surfactantes de origen biológico han incrementado. Este alto interés se explica por las potenciales aplicaciones en la protección ambiental, industria del petróleo, salud humana y en la industria de los alimentos. Las aplicaciones se basan principalmente en su comportamiento físico- químico, inocuidad ambiental y baja toxicidad. Los ejemplos de utilidad van desde la depuración de ambientes contaminados hasta la formulación de productos destinados al área de salud. Por ejemplo, en la industria farmacéutica los biosurfactantes son utilizados en cosmética como agentes emulsificantes no tóxicos. Los biosurfactantes se clasifican de acuerdo a su composición química y de acuerdo a su origen microbiano. La clasificación general de los biosurfactantes de acuerdo a sus componentes, les agrupa en: glicolípidos, lipopéptidos, fosfolípidos, ácidos grasos y finalmente surfactantes poliméricos o particulados. Dentro del grupo glipopéptidos, los más conocidos de ellos corresponden a los ramnolípidos, descritos por primera vez en la bacteria Pseudomonas aeruginosa, los cuales se caracterizan por presentar una o dos moléculas de ramnosa asociadas a una o dos moléculas de ácido β-hidroxidecanoico. Entre los lipopéptidos, destaca el surfactin producido por B. subtilis ATCC 213322). Otros biossurfactantes conocidos corresponden al liposan {Candida lipolytica y emulsan (Acinetobacter calcoaceticus cepa, RAG-1 ), ambos surfactantes poliméricos formados por complejos polisacárido-proteína.
El desarrollo de nuevos biosurfactantes y estudios a nivel molecular, indican que estos compuestos tienen importantes funciones fisiológicas y ecológicas para el microorganismo que los produce. Por ejemplo, se ha determinado la función de los surfactantes en la motilidad bacteriana, procesos de señalización celular y diferenciación celular. La producción de biosurfactantes por microorganismos se asocia a mecanismos de competencia con otros microorganismos. Es así que algunos de ellos pueden ser una alternativa al uso de compuestos sintéticos o agentes antimicrobianos (antibióticos) por su efectividad, especificidad terapéutica y baja toxicidad. De acuerdo a las investigaciones realizadas, las actividades biológicas exhibidas por los biosurfactantes no están referidas a sus propiedades detergentes, sino más bien a mecanismos moleculares y fisiológicos específicos. En este contexto, las propiedades antimicrobianas e inmunomoduladoras son muy atractivas en la actualidad, existiendo una gran variedad de aplicaciones. Por ejemplo, se ha establecido que los surfactantes tienen la capacidad de modificar el comportamiento microbiano al relacionarse con la comunicación entre células, en donde ciertos genes relacionados con la síntesis de compuestos de naturaleza surfactante, responden a la presencia de señales químicas específicas. Más específicamente se sostiene que los biosurfactantes pueden interrumpir el sistema de comunicación Quorum Sensing (QS); evitando así la patogenicidad de microorganismos que afectan a otros organismos de interés. En particular, se ha determinado que la formación de biofilms y la virulencia de patógenos microbianos dependen, en muchos casos, del mecanismo molecular denominado Quorum Sensing (QS), caracterizado por corresponder a un mecanismo dependiente de la densidad microbiana y por usar moléculas químicas específicas como señales entre células. Dichas señales químicas son producidas constantemente induciendo una respuesta grupal coordinada cuando la densidad celular es alta. Las moléculas que median la señal de QS, se denominan auto inductores, y son producidas a niveles básales en el microorganismo. Se han identificado una gran variedad de moléculas señal, siendo las más estudiadas la familia de las homoserina lactonas (AHLs).
Dado que la patogenicidad de microorganismos esta relacionada a la expresión de factores de virulencia que les permite acceder, colonizar, diseminarse y proliferar en el hospedero causando el daño asociado. En muchos casos los factores de virulencia se producen sólo bajo condiciones específicas, por lo que en los distintos microorganismos patógenos existen diferentes mecanismos destinados a coordinar la expresión de estos factores con la presencia y características eco-fisiológicas del organismo hospedero. Bajo estas condiciones, algunas bacterias patógenas además de desencadenar la conducta patógena, forman biopelículas, y pueden ser resistentes a la presencia de antibióticos.
En este contexto y dado que el sistema de comunicación denominado Quorum Sensing (QS) está efectivamente presente en bacterias patógenas de peces como Listonella anguillarum y Aeromonas salmonicida; en la actualidad, se propone que una de las alternativas al tratamiento de enfermedades infecciosas en peces debiera enfocarse en la inhibición y/o estimulación del sistema QS de bacterias patógenas.
Los tratamientos de enfermedades infecciosas que afectan a peces son realizados por los procedimientos de: (i) inmunización vía vacunación, (ii) terapia antimicrobiana y (iii) procedimientos de manejo profiláctico e higiene durante todo el proceso productivo; todos los cuales no constituyen procedimientos específicos y generan daños a los ecosistemas microbianos, además de exhibir una limitada eficacia, cuantificable por las perdidas económicas producidas debido a la mortalidad de los peces por infecciones; actualmente existe una demanda creciente para la búsqueda de nuevos productos capaces de combatir las patologías infecciosas con mayor eficiencia.
De esta forma, el mecanismo de inhibición de la comunicación celular dependiente de Quorum Sensing es una de las alternativas a los actuales tratamientos para evitar y tratar patologías infecciosas, puesto que esta estrategia de control es selectiva, no genera resistencia y es ambientalmente compatible pues no elimina microorganismos de importancia ambiental. La búsqueda y desarrollo de inhibidores naturales del sistema Quorum Sensing está basada en la competencia existente entre microorganismos en sus ecosistemas, donde, en muchos casos, se ha evolucionado a una interacción basada en los sistemas de comunicación de QS. Así, la interferencia en el circuito QS, con la consecuente modificación del programa genético del microorganismo contrincante, se denomina Quorum Quenching (QC). Artificialmente, es posible generar QC mediante (i) el uso de moléculas similares a las AHLs que imitan su estructura uniéndose al receptor correspondiente, evitando así la respuesta del circuito, o (ii) mediante la degradación de la señal AHLs respectiva utilizando enzimas lactonasas y/o acilasas que, respectivamente rompen el anillo lactónico o hidrolisan la cadena lateral del mismo anillo.
Existen patentes referidas al mecanismo Quorum Sensing, algunas de ellas tratan sobre métodos para inhibir este sistema y evitar así las patologías microbianas. Entre dichos documentos se encuentra la solicitud de patente WO/2002/00035 A1 , que se refiere a un alimento y el método para producirlo con la finalidad de utilizarlo en la industria acuícola para el control de patologías infecciosas en peces. Dicha solicitud trata del uso de bacterias de los géneros Bacillus, Paenibacillus y Alteromonas como microorganismos probióticos para el control de patógenos por el mecanismo de exclusión competitiva. Así mismo, la patente describe la incorporación en el alimento de furanonas como compuestos destinados a inhibir el sistema de QS. En ambos casos se considera el uso de agentes surfactantes sintéticos como método de formar emulsiones con las bacterias y/o principios activos. En dicha solicitud no se menciona a bacterias del género Cobetia ni tampoco se sugiere el mecanismo por el cual biosurfactantes producidos pudisesen generar un efecto en las señales involucradas en Quorum Sensing. Así mismo no existen documentos de patente que indiquen el uso de biosurfactantes y/o moléculas tensoactivas capaces de realizar un secuestro molecular de las señales involucradas en Quorum Sensing.
Por otra parte, otros documentos del arte previo mencionan o describen el uso de microorganismos similares a la cepa de la presente invención. La solicitud de patente JP2009034094, por ejemplo, describe un nuevo microorganismo del género Cobetia, cepa FERM P-21295, y cepas mutantes de la misma. En esta solicitud se revela un método para la producción de polisacáridos, tras el aislamiento y cultivo de la cepa FERM P-21295. Dichos polisacáridos obtenidos a partir de esta cepa, comprenden componentes estructurales tales como N-acetilo-D-glucosamina, ácido D-galacturónico, N-acetilo-D-galactosamina, D-galactosa, ácido pirúvico y D-alanina. En este documento se revela el uso de los polisacáridos en cosméticos, medicinas, y como aditivo alimenticio; resaltándose el grado de estabilidad de los mismos y un notorio efecto en la supresión de la producción de melanina. La solicitud de patente JP2008194026A, por su parte, describe un nuevo microorganismo Cobetia (FERM P-21 101 ), que cultivado bajo condiciones convenientes produce un ácido mucopolisacárido. Esta solicitud también enseña sobre un método, que consiste en cultivar el microorganismo de Cobetia marina, produciendo el mucopolisacárido en el medio de cultivo, obtener la solución de cultivo, y aislar el mucopolisacárido ácido sin realizar la eliminación selectiva del polisacárido sulfatado de la solución de cultivo.
El microorganismo de Cobetia marina es útil para producir el mucopolisacárido que es útil como medicamento dermatológico, cosméticos, útil para prevenir la pigmentación, punto de hígado, pecas, cloasma, quemadura del sol. Puede también ser utilizado en prodrogas y productos farmacéuticos. Sin embargo, ninguno de los documentos JP2009034094 o JP2008194026A enseña características similares o cercanas a las del extracto de la presente invención, es más, los productos de utilidad divulgados en dichas solicitudes, corresponden a polisacáridos o mucopolisacáridos, y no a ácidos grasos en un extracto con características de tipo surfactante, como es el caso de la presente invención. Además ninguno de ellos hace referencia al uso de Cobetia marina como cepa productora de compuestos inhibidores de QS, a diferencia de la presente invención, donde se utiliza Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 como fuente productora de moléculas tenso-activas que forman estructuras lipídicas capaces de interactuar con las señales de QS inhibiendo las conductas de microorganismos patógenos y/o estimulando la inmunidad de animales en cultivo.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN.
La presente invención se apoya en las siguientes figuras, las cuales a continuación de describen brevemente:
La Figura 1 corresponde a un Bioensayo en placa de agar para la detección de inhibidores del sistema de comunicación Quorum Sensing con el biosensor Chromobacterium violaceum. La fotografía muestra el cultivo en placa de agar nutritivo de doble capa de la bacteria C. violaceum produciendo el pigmento violaceina dependiente de la presencia de moléculas señales del sistema de QS. La zona clara sin color azul-violeta indica una zona de inhibición (+) de la producción del pigmento violaceina, el cual es producido por la inducción del sistema de QS por señales del tipo homoserina lactonas dada la actividad del sobrenadante filtrado de las cepas de la invención en el pocilio 2. El pocilio 4 corresponde al control negativo (-) que corresponde a medio de cultivo sin crecimiento bacteriano.
La Figura 2 corresponde a un Bioensayo en microplaca para la detección de bacterias productoras de inhibidores del sistema Quorum Sensing. El bioensayo fue realizado con cultivos líquidos del biosensor C. violaceum crecidos en la presencia del sobrenadante filtrado de un cultivo de la cepa MM1 IDA2H-1 crecida en medio Bushnell-Hass con DBT como única fuente de energía y carbono. Como control (c) se utilizaron cultivos de C. violaceum expuestos a medio de cultivo Bushnell-Hass sin inocular con la cepa MM1 IDA2H-1 . El color azul-violeta indica la presencia del pigmento violaceina (signo -), el cual se produce cuando determinadas señales químicas activan el sistema de QS. La presencia de inhibidores del sistema QS se determina por la pérdida del color azul-violeta (signo +).
La Figura 3 corresponde a un Bioensayo en microplaca para evaluar el efecto inhibidor sobre el sistema de comunicación Quorum Sensing del extracto extracelular biosurfactante de la cepa MM1 IDA2H-1 . Los cultivos de C. violaceum fueron crecidos en la presencia del extracto extracelular biosurfactante (AAFOB) producido por la cepa MM1 IDA2H-1 crecida en medio Bushnell-Hass con DBT como única fuente de energía y carbono (donde la actividad inhibitoria, se simboliza con el signo
+)■
La Figura 4 corresponde a Bioensayo en microplaca para evaluar el efecto inhibidor del extracto surfactante AAFOB de señales de Quorum Sensing generadas por la bacteria patógena de peces Aeromonas salmonicida. (donde la actividad inhibitoria, se simboliza con el signo +).
La Figura 5 muestra gráficamente la actividad antivirulencia del extracto contra la bacteria patógena Aeromonas salmonicida. Actividad medida en relación a la expresión de genes de virulencia: aerolisina (A), serina proteasa (B) y lipasa (C) de dicha cepa patógena, en condiciones control (sin tratamiento) y al ser tratada con el extracto biosurfactante de la presente invención. La Figura 6 muestra una microfotog rafia electrónica de transmisión de las células bacterianas de la cepa MM1 IDA2H-1 fueron crecidas en medio mínimo Bushnell-Hass con succinato (30 mM) como única fuente de energía y de carbono (A) o en medio mínimo Bushnell-Hass con DBT (1 % p/v) como única fuente de energía y de carbono (B). (C) y (D) corresponden a microfotog rafias de epifluorescencia, equivalentes a (A) y (B), usando la tinción con BODIPY para visualizar ácidos grasos. La Figura 7 muestra en un bioensayo de microplaca la inhibición del fenotipo dependiente de Quorum Sensing usando Cobetia marina MM1 IDA1 H-1 . (A) Muestra la respuesta del fenotipo púrpura de C. violaceum a diferentes concentraciones ^g ml/L) del biosurfactante (BS) producido. (B) Se observa tensión superficial de agua (ST) a diferentes concentraciones (mg l/L en escala logarítmica) del biosurfactante (□), y su efecto sobre la formación de biopelícula de L anguillarum (O). La concentración micelar crítica fue establecida en 80 mg l/L. Los valores máximos de inhibición de fenotipos dependientes de Quorum Sensing fueron a concentraciones de formación de micelas.
En un primer aspecto, la invención provee una nueva bacteria probiótica denominada Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 para evitar o tratar patologías infecciosas en acuicultura. La cepa bacteriana de la presente invención fue aislada y seleccionada entre microorganismos autóctonos del ambiente marino capaces degradar o metabolizar compuestos orgánicos insolubles y que forman parte del petróleo, que pueden ser dañinos para el ambiente. Los compuestos sustratos útiles para ser degradados son de los tipos aromáticos y/o alifáticos, los que son solubilizados en el medio acuático para ser asimilados por el microorganismo. Dichos sustratos son utilizados por el microorganismo para producir su energía, material celular y metabolitos secundarios. La bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 , de esta invención corresponde a una cepa autóctona del ambiente marino, capaz de crecer en un amplio rango de concentración salina (cloruro de sodio), un amplio rango de temperatura de 10Q a 35QC y utilizar compuestos orgánicos aromáticos o alifáticos que son componentes orgánicos del petróleo, como fuente de energía y de carbono, y por tanto sobrevive en el ambiente marino. En una realización preferida la bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 fue crecida con dibenzotiofeno (DBT) como única fuente de carbono y energía, donde el rango para la utilización de dicha fuente de carbono varía entre 0,75 y 1 ,5 % p/v; y donde preferentemente la concentración de DBT utilizada es de 1 % p/v en los medios de cultivo y selección. La cepa de la presente invención fue identificada entre bacterias pertenecientes al género Cobetia por comparación y determinación de la identidad del genoma de la secuencia de la región correspondiente al ADN ribosomal 16S, en particular al polinucleótido de la región 16S del ARN ribosomal de la secuencia del microorganismo Cobetia spp. De esta forma se aisló un nuevo microrganismo, el cual fue depositado en el Centro Español de Cultivos Tipo (CECT) con número de registro 7764 con fecha 5 de Julio del año 2010 {Cobetia marina cepa MM1 IDA2H- 1 ). Dadas dos secuencias muy similares o idénticas, la discriminación se realizó con la técnica de evaluación de paramámetros fisiológicos/bioquímicos, tales como; capacidad de utilizar diferentes hidrocarburos, la sensibilidad a antibióticos y actividades enzimáticas. Como patrón para comparación se utilizó en los ensayos de caracterización la bacteria de referencia denominada Cobetia marina CECT 4278.
A diferencia de la especie de referencia Cobetia marina CECT 4278, la bacteria Cobetia marina cepa MM1 A2DAIH-1 de la presente invención es capaz de crecer en hidrocarburos del tipo DBT, generar un extracto capaz de disminuir la tensión superficial, actuar como emulsificante y generar un extracto con capacidad inhibidora de QS cuando crece en un medio de cultivo sólo con DBT como fuente nutricional, esto es, como fuente de energía y carbono. En los ensayos realizados con la cepa de referencia Cobetia marina CECT 4278 utilizando métodos propios de la técnica, no se estableció su capacidad de utilizar DBT y producir tensoactivos. A su vez, a partir de ensayos bioquímicos para determinar la existencia de enzimas y/o metabolismos caracterizadores se establece que existen características diferenciadoras entre Cobetia marina cepa de referencia y Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 de esta invención. En particular es posible diferenciar, de forma simple y efectiva ambas bacterias, debido a que Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 tiene una reacción positiva a la reacción de oxidasa, mientras que Cobetia marina CECT 4278 arroja resultados negativos para dicha prueba. Por otra parte, es de especial interés el hecho de que la bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 no presenta características de patogenicidad, es decir, es inocua; ya que la bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 no presenta actividad hemolítica cuando se crece en un medio de cultivo conteniendo sangre. En este sentido, la bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 de esta invención presenta entre sus características novedodas: usar compuestos derivados del petróleo, tales como, hidrocarburos aromáticos cíclicos sulfurados; y generar biosurfactantes con actividad física y biológica específica. En razón de esto es posible determinar que la bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 es parte del grupo de microorganismos beneficiosos o también denominado probiótico para la acuicultura.
En un segundo aspecto, la invención provee un método para producir el biosurfactante AAFOB-1 IDA2H utilizando la bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 de la presente invención, el cual comprende las etapas de:
(a) crecer Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 en un medio de cutivo conteniendo entre 0,75 a 1 ,5% p/v de DBT u otro hidrocarburo aromático cíclico azufrado como único sustrato de carbono disponible para la bacteria, el medio además comprende al menos: 0,2 g/L de sulfato de magnesio; 0,02 g/L de cloruro de calcio; 1 g/L de fosfato de monopotasio; 1 g/L de fosfato de diamonio hidrógeno; 1 g/L de nitrato de potasio y 0,05 g/L de cloruro férrico, todo ellos disueltos en agua destilada;
donde, alternativamente, se puede crecer la cepa de la invención en condiciones similares a las ya descritas, reemplazando un 75% del volumen de agua destilada por un 75% de agua de mar como agente solubilizante;
agitar entre 100 a 400 rpm, durante 24 a 48 horas bajo condiciones de pH entre 6 y 8; temperatura entre 10Q y 35Q C; saturación de oxígeno entre 10-21 %;
(b) separar las células de la cepa crecida mediante centrifugación y posterior filtración;
donde la etapa de centrifugación se lleva a cabo entre 4.000 a 8.000 rpm durante 15 a 20 minutos; y tras descartar la fase sedimentada, se recupera el sobrenadante, el cual es filtrado por filtro de corte entre 0,22 y 0,45 μηι;
(c) liofilizar el sobrenadante filtrado a -80QC y 10 militorr (1 ,33 Pa);
(d) tamizar el polvo obtenido den la etapa (c) mecánicamente, bajo agitación en posición horizontal, para desprender impurezas y sales; y (e) secar el polvo tamizado obtenido en la etapa (d) a una temperatura entre 30 y 50 °C durante 20 a 30 horas, logrando un polvo seco de color amarillo tenue constituido de ácidos grasos que tiene propiedades emulsificantes y bioactivas. La condiciones mas preferentes son, secar el polvo a 40Q C por 24 horas.
La realización preferida de la presente invención involucra un método donde se lleva a cabo el crecimiento de la cepa bacteriana en un medio comercial Bushnell-Hass (Difco) (medio que comprende las sales mencionadas en el paso (a)) ó un medio formado en un 25% por dicho medio y un 75 % en volumen por agua de mar; donde el valor de la concentración de la fuente única de carbono (DBT) preferido es de 1 % p/v.
En un tercer aspecto, la invención provee un extracto concentrado biosurfactante y tensioactivo de propiedades emulsificantes y bioactivas. Dicho extracto biosurfactante es caracterizado por su composición química, su capacidad de emulsificar y su actividad biológica.
Las propiedades bioactivas del extracto biosurfactante de la invención (AAFOB- 1 1DA2H) son determinadas en cuanto a su actividad sobre la formación de biofilms y la patogenicidad bacteriana, actividades dependientes del sistema QS.
La actividad biológica del extracto biosurfactante se determinó sobre bacterias patógenas de peces tales como Listonella anguillarum que forma biopelículas que favorecen su diseminación. En particular, la exposición de Listonella anguillarum a la bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 y/o al extracto biosurfactante de esta invención, resulta en la inhibición de la formación de biopelículas del patógeno señalado.
Asi mismo, se puede utilizar la bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 como bacteria beneficiosa para evitar las patologías causadas por Listonella anguillarum. Además, se determinó el efecto del extracto biosurfactante de la presente invención sobre las bacterias del género Aeromonas que producen y secretan proteínas extracelulares líticas que son factores de virulencia, controlados por QS, tales como proteasas y lipasas, especialmente se logra inhibir la virulencia que depende del mecanismo de QS de bacterias y hongos patógenos, preferentemente la inhibición de la virulencia de la bacteria patógena Aeromonas salmonicida.
Por otra parte, las propiedades tensoactivas del extracto biosurfactante de esta invención son medidas de acuerdo a la disminución de la tensión superficial o por su actividad como emulsificante. Dichas propiedades tensoactivas permiten la incorporación de estos productos en la forma de aditivos cosméticos, alimentarios y/o cualquier otra fórmula alimentaria o farmacéutica.
La bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 es utilizada en la presente invención para producir un extracto biosurfactante que tiene propiedades físicas al actuar como un agente emulsificante, con un valor de tensión superficial de entre 66 a 70 dinas/cm, y con una alta estabilidad de emulsión.
El extracto AAFOB-1 IDA2H de la presente invención corresponde a una mezcla de moléculas orgánicas compuesta de al menos ácidos grasos de los tipos palmítico, miristico y linoléico, específicamente está constituido por 2,52 a 9,22 % de ácido láurico C12:0; 5,97 a 10,13 % de ácido miristico C14:0; 2,4 a 2,88 % de ácido pentadecanoico; 19,27 a 24,39 % de ácido palmítico C16:0; 7,81 a 9,83 % de ácido palmitoleico C16:1 ; 8,37 a 10,43 % de ácido esteárico C18:0; y 1 1 ,32 a 16,25 % de ácido oleico C18:1 cis. Este extracto es obtenido por la biosíntesis llevada a cabo por la bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 crecida en un medio mínimo sumplementado con DBT como única fuente de carbono.
Las propiedades tensoactivas de productos de origen microbiano medidas por su capacidad de disminuir la tensión superficial o actuar como emulsificantes son de gran importancia tecnológica en formulaciones cosméticas, alimentarias y/o farmacéuticas. En particular las emulsionantes provistas por el extracto biosurfactante de la presente invención entregan estabilidad a las formulaciones en las que se incorpora un principio activo que requiere ser dosificado o entregado para usos cosméticos, farmacéuticos y alimentarios, entre otros. La bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 produce un sobrenadante tensoactivo capaz de disminuir la tensión superficial, siendo capaz de de mantener emulsiones estables de soluciones agua aceites orgánicos, utilizados en la industria de los alimentos y también en soluciones con hidrocarburos usados en la industria de pinturas y/o revestimientos. Por otra parte la actividad biológica del extracto biosurfactante se evaluó en peces en cultivo para determinar su toxicidad y potencial efecto sobre la inmunidad de peces. En este sentido el producto extracto AAFOB-1 IDA2H no resultó ser tóxico (con una sobreviciencia del 78 %) para peces y de acuerdo al análisis de inmunidad con diferentes marcadores se observó que fue capaz de estimular la actividad del agente inmunológico TNF-alfa en branquias de truchas.
La utilización del extracto AAFOB-1 IDA2H biosurfactante producido extracelularmente por la nueva cepa bacteriana marina, con propiedades físicas emulsificantes, y propiedades biológicas asociadas a la inhibición selectiva de mecanismos de virulencia de microorganismos patógenos de peces, implica una línea de desarrollo de productos antimicrobianos para la acuicultura de alto valor por ser selectivo, no tóxicos, no generar resistencia y ser ambientalmente inocuos.
Así un aspecto adicional de la presente invención se refiere al uso del extracto bioactivo con propiedades tensoactivas emulsificantes como un aditivo alimentario y/o revestimiento de pintura. En particular, el biosurfactante puede ser utilizado como un aditivo alimentario en una formulación alimentaria que otorga funcionalidad al alimento; o este aditivo alimentario se usa para evitar y tratar patologías infecciosas dependientes del sistema QS. Otra realización alternativa utiliza el extracto AAFOB- 1 IDA2H en la formulación de revestimientos y/o pinturas bioactivas de superficies sumergidas, siendo de especial interés su utilización para el control de biopelículas microbianas.
EJEMPLOS DE APLICACION
Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento.
Las cepas de bacterias aisladas desde muestras de aguas de mar fueron enriquecidas en medio líquido Bushnell-Hass (Difco, Detroit USA) conteniendo DBT (Merck, Hohenbrunn, Germany) como única fuente de energía y de carbono. La temperatura de crecimiento fue de 20 QC. Los bioensayos para determinar la presencia de inhibidores o estimuladores del sistema QS fueron realizados utilizando a las cepas Chromobacterium violaceum (CECT 494 T; ATCC 12472) y Chromobacterium violaceum CV026 (CECT 5999; NCTC 13278; VTT E-82808)(Chu et ai, 201 1 ) las que fueron crecidas a 26 QC en medio Luria Bertani. Para la cepa C. vilaceum CV026 se adicionó al medio de cultivo el antibiótico Kanamicina (25 μg ml).
Aislamiento de Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 .
La bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 de la presente invención fue aislada desde muestras de agua de mar tomadas de pozas litorales intermareales en la zona de Reñaca, Viña del Mar en la región de Valparaíso, Chile. Las muestras de agua fueron utilizadas para realizar un enriquecimiento selectivo inoculando matraces con medios de cultivos y DBT como única fuente de energía y de carbono. Los matraces fueron incubados a 20 QC durante 2 semanas. Los cultivos con crecimiento fueron seleccionados para realizar el aislamiento en medio de cultivo sólido Difco™ Agar Marino de ZoBell 2216 (Becton Dickinson and Co. USA). Las placas fueron incubadas a 20 Q C y de ellas se seleccionaron colonias aisladas para los posteriores análisis.
Caracterización microbiológica.
La identificación y caracterización de la bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 se realizó mediante estudios: 1 ) moleculares (amplificación, secuenciación, análisis de la secuencia de la región ADNr 16S); 2) fisiológicos (crecimiento en diferentes concentraciones de cloruro de sodio); y 3) por ensayos bioquímicos y metabólicos (con los sistemas Api 20 NE de Biomerieux y Ecoplate de BIOLOG). La secuenciación y análisis de la región del ADNr 16S se realizó en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT). Para todos los estudios comparativos se utilizó la cepa de referencia Cobetia marina (CECT 4278; ATCC 25374).
Dada la necesidad de clasificar adecuadamente a los nuevos microorganismos presentes en la familia Halomonadaceae, la ubicación taxonómica de la bacteria Cobetia marina MM1 IDA2H-1 utilizada en la presente invención se basa en métodos de biología molecular y en métodos que determinan características propias de los microorganismos, tales como su metabolismo y requerimientos de sales del tipo NaCI. Todas estas técnicas son reproducibles y forman parte del estado de la técnica.
Tabla 1 . Diferencias entre bacteria Cobetia cepa MM1 IDA2H-1 , bacteria Cobetia marina y Halomonas halodurans.
Halomonas
Cobetia marina halodurans MM1 IDA2H-1
Crecimiento en:
Lactulosa - - +
Xylitol - - +
Acido Fórmico - - -
Acido D-Glucosaminico - + +
Dibenzotiofeno ND* ND* +
Antraceno ND* ND* +
Fenantreno ND* ND* +
Naftaleno ND* ND* +
Hexadecano ND* ND* -
Rango de crecimiento en NaCI
0,5-20 3-20 1 -18
(%)
Reacción de:
Oxidasa - + +
Reducción de nitrato - - -
ONPG + - +
Lisina decarboxilasa + + -
Sensibilidad a:
Nitrofurantoina + - - Rifampicina - + -
Trimetroprima-sulfametoxazol + + -
16S rADN similitud a Cobetia
100 100 100 marina
16S rADN similitud a Halomonas
100 100 100 halodurans
Producción de extracto
tensoactivo biosurfactante (BS) ND* ND* + utilizando DBT.
Producción de extracto BS con
propiedades contra A. - ND* + salmonicida
Producción de extracto BS
inhibidor de sistema de QS de C. - ND* + violaceum.
ND* No descrito en la literatura
La evaluación del extracto biosurfacante producido por Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 se realizó mediante la evaluación de propiedades tensoactivas. En particular se evaluaron 12 colonias de cepas aisladas en cultivo puro, crecidas independientemente en medio de cultivo Bushnell-Hass (Difco, Detroit USA) conteniendo DBT como fuente de carbono a 20 QC durante 72 horas. Los cultivos obtenidos fueron centrifugados a 4.000 rpm durante 20 minutos a 4 QC. Los sobrenadantes de las 12 cepas obtenidas fueron filtrados con filtros de celulosa de 0,22 μηι y almacenados a 10 QC para el análisis de las propiedades tensoactivas. El análisis de la propiedades tensoactivas fueron realizadas utilizando un tensiómetro de DuNóy para lo cual se utilizó los sobrenadantes de los microorganismos aislados. Tabla 2. Valores de Tensión Superficial.
Figure imgf000023_0001
La Tabla 2 de arriba muestra las 12 cepas de bacterias de origen marino que fueron aisladas desde muestras de agua de mar mediante un procedimiento de enriquecimiento selectivo utilizando un medio mínimo de cultivo conteniendo un hidrocarburo derivado del petróleo como única fuente de energía y carbono. El compuesto para el crecimiento de la cepa fue dibenzotiofeno, insoluble en la fase acuosa. Una vez aislados, los microorganismos fueron evaluados para determinar su capacidad de producir compuestos tensoactivos, para lo cual fueron crecidos en medio líquido Bushnell-Hass desde donde se obtuvieron muestras de 20 ml_ que fueron filtradas y centrifugadas a 8.000 g. Los sobrenadantes finales fueron utilizados para medir la tensión superficial con un equipo tensiómetro de Dunoy. Los valores representan la caída en la tensión superficial del agua (TS). Evaluación propiedades bioactivas.
Una vez determinada la propiedad tensoactiva de los sobrenadantes se procedió a realizar un bioensayo destinado a establecer la capacidad de inhibir o estimular el mecanismo de comunicación celular conocido como Quorum Sensing (QS). El bioensayo para determinar la existencia de inhibidores del sistema QS utilizó a la cepa Chromobacterium violaceum y consistió en exponer a este microorganismo a la presencia del sobrenadante de Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1. La bacteria Chromobacterium violaceum tiene un circuito de QS que al estar activado induce la expresión de los genes que codifican para la síntesis de violaceína, un compuesto que otorga a esta bacteria un fenotipo de color violáceo característico. Por otra parte, como ensayo para determinar la existencia de una estimulación del sistema QS se utilizó a Chromobacterium violaceum CV026. Este microorganismo deriva de la cepa silvestre Chromobacterium violaceum y a diferencia ha sido mutada en su capacidad de producir moléculas autoinductoras con la inserción de un mini transposón con resistencia al antibiótico kanamicina (miniTn5::Km). De esta forma este microorganismo requiere de señales químicas externas para poder activar el circuito de QS y generar el fenotipo de color violeta. Para los bioensayos de interferencia con el sistema QS se utilizó el sobrenadante de las bacterias degradadotas de DBT seleccionadas.
Como resultado de Crecimiento de la a Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 en un medio de Bushnell-Hass (Difco, Detroit USA) conteniendo DBT (Merck, Hohenbrunn, Germany) se produce un sobrenadante que reduce la tensión superficial del agua ultrapura (agua de alta pureza completamente libre de sólidos disueltos y suspendidos) a 68 Dinas/cm (Tabla 2). Esta reducción es comparativamente menor al obtenido por las cepas que fueron asiladas por su característica de crecer en la presencia de DBT como fuente de carbono. Durante su crecimiento en estas condiciones es posible apreciar mediante el uso de microscopía electrónica de transmisión, la formación de estructuras lipídicas que son secretadas al exterior de la célula (Figura 6).
El sobrendante producido por Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 en un medio de cultivo Bushnell-Hass (Difco, Detroit USA) conteniendo DBT inhibe el fenotipo de color violeta que depende de QS en la bacteria Chromobacterium violaceum (ver 2 en Figura 1 y Figura 7). Por otra parte no se observó un efecto inductor del sistema de QS de la bacteria Chromobacterium violaceum CV026. El medio de cultivo sin inocular no produjo efecto inductor o inhibidor en los respectivos bioensayos (ver 1 en Figuras 1 y 7).
La bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 es de forma bacilo corto, Gram negativa, oxidasa positiva, que crece en un amplio rango de cloruro de sodio (Tabla 1 ). No posee actividad hemolítica y por tanto no es considerada una bacteria patógena. En comparación a lo descrito en la cepa de referencia del arte previo, la bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 metaboliza como fuente de carbono antraceno, naftaleno y fenantreno.
Durante el crecimiento en un medio de cultivo Bushnell-Hass (Difco, Detroit USA) conteniendo DBT como fuente de carbono, la bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 produce un sobrenadante de características de biosurfactante y que es bioactivo al ser capaz de inhibir el mecanismo de comunicación intercelular de QS de la bacteria Chromobacterium violaceum. No existen reportes de bacterias de este género que sean capaces de utilizar DBT como fuente de carbono y sintetizar biosurfactantes que tengan actividad biológica. Tanto la degradación de este tipo de compuestos como la producción de surfactantes bioactivos son consideradas características positivas en bacterias de origen marino y por tanto explican su beneficio en el uso en acuicultura.
Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 produce el extracto AAFOB-1 IDA2H con propiedades emulsionantes de interés en la formulación de alimentos, y en la formulación de revestimientos y/o pinturas bioactivas de superficies sumergidas.
Obtención de extracto AAFOB-1 IDA2H.
Para obtener un extracto tensoactivo desde el sobrenadante producido por la bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 , se procedió a inocular la bacteria en 1 litro de medio Bushnell-Hass (Difco, Detroit USA) conteniendo DBT como fuente de carbono. El crecimiento fue llevado a cabo utilizando un biorreactor Fermentor Liflus modelo GX con control automático de pH, oxígeno, temperatura y agitación. Las condiciones de incubación fueron: temperatura de 30 QC, aireación 100 % y agitación con aspas giratorias a 200 rpm durante 48 horas. El cultivo obtenido fue centrifugado a 5.000 rpm durante 20 minutos en una centrifuga Eppendorf modelo 5810R y el sobrenadante fue filtrado en filtros estériles de 0,22 μηι. El sobrenadante libre de células fue tratado con acetona (JT Backer, USA) fría en una proporción de 2:1 para la precipitación. La mezcla sobrenadante/acetona se almacenó a -10 QC durante 24 horas. El precipitado obtenido fue separado de la solución acetona/agua por centrifugación a 10.000 rpm a 4 QC en una centrifuga Eppendorf modelo 5810R. El precipitado obtenido se secó a temperatura ambiente durante 48 horas. Ensayos de índice de emulsificación y estabilidad de emulsión.
Se determinó el índice de emulsificación del extracto seleccionado con diferentes fases orgánicas. El extracto obtenido se disolvió en agua ultra pura a una concentración de 100 mg/mL. Los ensayos de emulsificación fueron llevados a cabo con hexadecano (Merck, Germany), gasoil comercial, aceite de pescado comercial y aceite de cañóla comercial. Las proporciones de fases orgánica:acuosa utilizadas fueron de 1 :1 . Las emulsiones fueron formadas mediante la agitación en vortex durante 2 minutos dejando los tubos en reposo durante 24 horas. Una vez transcurrido el tiempo de reposo se procedió a medir el índice de emulsificación a las 24 horas (E24) para lo cual se midió la altura de la emulsión en centímetros respecto a la altura total de las fases, expresando el resultado en porcentaje. La estabilidad de la emulsión fue determinada mediante la medición de la constante de decaimiento (Kd). Para esto se realizaron emulsiones como se describió previamente con diferentes fases orgánicas midiendo la turbidez de la fase acuosa a una longitud de onda de 540 nm. Las proporciones para las fases orgánicas y acuosas fueron de 4:25, respectivamente. Las mediciones fueron realizadas a los tiempos 10, 20, 30 40, 50 y 60 minutos después de haber formado la emulsión. La constante de decaimiento (Kd) fue calculada a partir de la pendiente de los datos obtenidos en las lecturas de turbidez versus tiempo.
El extracto AAFOB-1 IDA2H producido por Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 durante su crecimiento en DBT como fuente de carbono, posee la propiedad de actuar como un emulsificante y es capaz de mantener estables emulsiones de aceite de pescado y cañóla (Tablas 3 y 4).
Tabla 3. Actividad emulsificante del extracto denominado AAFOB con aceites de pescado y de cañóla.
Extracto AAFOB IE24 (%)
(mg/mL) Aceite de pescado
200 71 ,4
400 69,6
Control 0 Los compuestos denominados tensoactivos pueden actuar como emulsionantes lo que representa variadas ventajas en muchos procesos productivos de los sectores industriales farmacéutico y de los alimentos. En este caso se muestra que el extracto denominado AAFOB producido por la cepa MM1 IAD2H cuando crece en dibenzotiofeno puede ser utilizado como un agente emulsionante de aceites tales como el de Cañóla o el de pescado. El índice de Emulsificación (IE) medido en porcentaje indica la estabilidad de la emulsión formada por el aceite y el agua en presencia de un agente emulsionante, en un tiempo determinado en este caso 24 horas a 20Q C.
Tabla 4: Estabilidad de emulsión aceite de pescado-agua en la presencia de AAFOB medida por la Constante de Decaimiento (Kd).
Figure imgf000027_0001
La composición química del extracto biosurfactante de esta invención fue determinada, encontrándose que el perfil por cromatografía de gas- masa (GC-M) muestra una alta contribución de ácidos grasos de 12 a 18 átomos de carbono (Tabla 5). Tabla 5. Porcentajes de ácidos grasos presentes en el extracto producido por la bacteria Cobetia marina cepa MM1 IA2H-1 .
Perfil Acidos Grasos Muestra Muestra Muestra
AAFOB-A AAFOB AAFOB-MM
% Ac. Láurico C12:0 9,22 2,52 3,87
% Ac. Mirístico C14:0 10,13 5,97 6,83
% Ac Pentadecanóico C15:0 2,88 2,54 2,40
% Ac. Palmítico C16:0 24,39 20,98 19,27 % Ac. Palmitoleico C16:1 9,83 8,46 7,81
% Ac. Esteárico C18:0 10,43 9,65 8,37
% Ac. Oléico C18:1 cis 13,29 16,25 1 1 ,32
Actividad del extracto biosurfactante AAFOB-1 IDA2H producido por Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 sobre la virulencia de Aeromonas salmonicida y la formación de biofilms de Listonella anguillarum. Para los ensayos de formación de biofilms se utilizó la bacteria Listonella anguillarum (CECT 522; ATCC 19264) crecida a 20Q C en DifcoTM Agar Marino de ZoBell 2216 (Becton Dickinson and Co. USA). La cepa Listonella anguillarum fue crecida a 20Q C en medio líquido marino conteniendo: Extracto de levadura 10 g; Peptona 10 g; agua de mar filtrada 750 mi; agua destilada 250 mi. Los ensayos de inhibición de virulencia fueron llevados a cabo utilizando la cepa Aeromonas salmonicida (CECT 894 T; ATCC 33658) crecida a 24 QC en medio caldo nutritivo o medio sólido TSA. Tanto A. salmonicida como Listonella anguillarum fueron manipuladas en una cabina de bioseguridad ESCO Streamline modelo SC2 Class II BS. Los bioensayos fueron realizados utilizando a las cepas Chromobacterium violaceum (CECT 494 T; ATCC 12472) y Chromobacterium violaceum CV026 (CECT 5999; NCTC 13278; VTT E- 82808) las que fueron crecidas a 26 QC en medio Luria Bertani. Para la cepa C. vilaceum CV026 se adicionó al medio de cultivo el antibiótico Kanamicina (25 μg ml). Ambas cepas fueron adquiridas en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT). Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 , fue crecida a 30 QC en medio Bushnell-Hass (Difco, Detroit USA) conteniendo DBT como fuente de carbono, durante 48 horas con agitación a 200 rpm.
Bioensayo de inhibición del sistema de QS con extracto AAFOB-1 IDA2H.
Con el extracto obtenido se procedió a realizar un bioensayo destinado a establecer la capacidad de inhibir o estimular el mecanismo de comunicación celular conocido como Quorum Sensing (QS). El bioensayo para determinar la existencia de inhibidores y/o estimuladores del sistema de QS fue llevado a cabo con la cepa Chromobacterium violaceum y Chromobacterium violaceum CV026 al igual que lo descrito previamente. La bacteria Chromobacterium violaceum fue crecida en medio de cultivo liquido Luria Bertani en placas de microtitulación de 96 pocilios a 30 QC. Para determinar si el extracto obtenido interfiere con la presencia de señales de QS, una vez alcanzada una densidad óptica de 0,3 (600 nm) a los pocilios se les adicionó 50 μΙ de sobrendantes provenientes de cultivos líquidos de la misma bacteria Chromobacterium violaceum y el extracto obtenido de Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 (Figura 2). El extracto fue utilizado en concentraciones de 300 mg/ml disuelto en el medio de cultivo LB.
Para determinar si el extracto producido por Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 produce efectos en el sistema de QS durante el crecimiento, Chromobacterium violaceum y Chromobacterium violaceum CV026 fueron crecidas en la presencia del extracto de la presente invención (Figura 3).
Ensayo de inhibición del biofilms de Listonella anguillarum con el extracto AAFOB- 1 IDA2H.
El ensayo de formación o inhibición de biofilms fue desarrollado con la bacteria Listonella anguillarum CECT 522 adquirida en la Colección Española de Cultivos Tipo. Esta bacteria puede formar biofilms lo cual es una conducta dependiente de Quorum Sensing (QS). El protocolo utilizado fue evaluar la adherencia de Listonella anguillarum a placas de microtitulación de 96 pocilios, para lo cual se utilizó el método de tinción con cristal violeta. Este método permite teñir las células que se han adherido a una superficie cuando se forma una biopelicula. La cuantificación se realizó diluyendo con etanol-acetona los pocilios teñidos y leyendo las densidades ópticas a una absorbancia de 575 nm.
Ensayo de inhibición de factores de virulencia en Aeromonas salmonicida.
Para determinar el efecto de la bacteria Cobetia marina de esta invención sobre los factores de virulencia dependientes de QS en Aeromonas salmonicida se realizó un ensayo para cuantificar la expresión de genes de virulencia expuestos al extracto biosrufactante. Los genes evaluados fueron: 1 ) aerolisina, 2) proteasa de serina, y 3) lipasa. Dichos genes dependen del mecanismo QS en Aeromonas salmonicida. El ensayo fue llevado a cabo creciendo a Aeromonas salmonicida en un medio de cultivo líquido Caldo Nutritivo (Oxoid, UK) en presencia o ausencia del estímulo. Para los efectos y condiciones favorables de este estudio el estímulo corresponde al resultado de la exposición a compuestos producidos por la bacteria Cobetia marina. Los cultivos de Aeromonas salmonicida fueron crecidos en matraces Erlenmeyer en un incubador orbital Companion modelo SK-300 a 20 Q C y 200 rpm hasta llegar a una densidad óptica de 0,8 (Abs6oonm)- A este tiempo los cultivos fueron centrifugados a 8.000 rpm a 4 QC y se realizó la extracción y purificación de ARN con el sistema RNeasy® Mini Kit (Quiagene Ambion Inc. Texas, USA). La reacción de formación de cADN y amplificación fueron realizadas con el sistema de un solo paso Brillan. III Ultra Fast SYBR® Green QRT-PCR Master Mix (Agilent Technologies, USA). El RNA total extraído fue cuantificado en espectrofotómetro NanoDrop modelo DN-1000 y posteriormente se verificó en su integridad en una electroforesis en gel de agarosa (0,8 % p/v) teñido con bromuro de etidio.
La amplificación se realizó utilizando los siguientes cebadores:
Aero-F 5'-GAGCGAGAAGGTGACCACCAAGAACC, y
Aero-R 5X- TTCCAGTCCCACCACTTCACTTCAC para Aerolisina;
Lip-F 5'-GACCCCCTACCTGAACCTGAGCTAC, y
Lip-R 5'-AGTGACCCAGGAAGTGCACCTTGAG para Lipasa; y
Ser-F 5'- ACGGAGTGCGTTCTTCCTACTCCAG, y
Ser-R 5'- CCGTTCATCACACCGTTGTAGTCG para proteasa de serina.
Para la cuantificación relativa se utilizó como secuencia de referencia la región de ADNr 16S utilizando los cebadores 1492-R y 27-F. La reacción se llevó a cabo en un termociclador de tiempo real Aligent Technologies Stratagene modelo Mx3000P y la cuantificación relativa y análisis estadístico se realizó con el software MxPro (Aligent Technologies). Los resultados indican que el extracto producido por Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 interfiere con señales de QS producidas por C. violaceum (Figura 2). Cuando este microorganismo se expone a la presencia de señales de QS y al extracto AAFOB-1 IDA2H no se forma el fenotipo de color violeta en esta bacteria. La ausencia de este extracto restituye el fenotipo violeta en los cultivos expuestos a las señales de QS (Figura 2). Para determinar si el extracto AAFOB-1 IDA2H actúa durante el desarrollo de C. violaceum, se expuso a este microorganismo diferentes concentraciones de extracto. En este caso, tampoco fue posible apreciar la formación del fenotipo violeta en las diferentes concentraciones evaluadas (Figura 3). Así, es posible establecer que el extracto AAFOB- 1 IDA2H posee la capacidad biológica de interferir con el sistema de QS existente en Chromobacterium violaceum.
Para determinar si la interferencia con el sistema de QS afecta la conducta patógena de microorganismos, se evaluó el efecto del extracto sobre la expresión de virulencia de la bacteria Aeromonas salmonicida (Figura 4), y en la inhibición de la formación de biofilm de la Listonella anguillarum (Tabla 6). Tabla 6. Actividad inhibitoria de la formación de biofilms de Listonella anguillarum.
Figure imgf000031_0001
Los resultados indican que el extracto AAFOB-1 IDA2H interfiere con las señales de QS producidas por el patógenos Aeromonas salmonicida. Esta bacteria produce, durante su crecimiento, señales de QS que pueden ser detectadas por la bacteria Chromobacterium violaceum CV026, encendiendo su fenotipo de color violeta. La exposición de un sobrenadante con señales de QS en la presencia del extracto AAFOB-1 IDA2H evita la formación del fenotipo de color violeta en la bacteria Chromobacterium violaceum CV026 (Figura 4). De esta forma es posible establecer que el extracto AAFOB-1 IDA2H interfiere con las señales de QS producidas por Aeromonas salmonicida. Para determinar si el extracto AAFOB-1 IDA2H interfiere con el sistema de QS de Aeromonas salmonicida, y afecta el despliegue de factores de virulencia asociados, se realizaron ensayos de cuantificación de transcritos provenientes de Aeromonas salmonicida expuesta a los productos de la bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 (Figura 5). Los resultados indican que los genes asociados a virulencia de Aerolisina (Figura 5A) y proteasa de serina (Figura 5B), son reprimidos significativamente cuando Aeromonas salmonicida crece en presencia de los productos generados por la bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 .
Por otra parte, se estudió la formación de biofilm de Listonella anguillarum en la presencia del extracto AAFOB-1 IDA2H. En esta bacteria patógena de peces, la conducta de formación de biopelículas es dependiente del sistema de QS y se considera que es de importancia para el desarrollo de patologías causadas por este microorganismo. Los resultados obtenidos indican que la presencia del extracto AAFOB-1 IDA2H, a una concentración de 75 mg/ml, inhibe la formación de biofilm hasta en un 86,5% (Tabla 6).
Los resultados indican que el extracto AAFOB-1 IDA2H producido por la bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 interfiere con el sistema de QS, y puede ser utilizado para evitar el despliegue de mecanismos de virulencia en bacterias patógenas de peces.
Ensayo de toxicidad y de inmunidad con peces.
Adicionalmente se ejecutó un ensayo de toxicidad y de inmunidad con peces de la especie Oncorhynchus mykiss en cultivo a través de un alimento que incorporó como principio activo al producto denominado AAFOB-1 IDA2H.
El ensayo de campo se realizó con 12 estanques de 0,18 metros/cúbicos agua salada en los cuales se colocaron 15 peces de aproximadamente 120 gramos cada uno de la especie O. mykiss, lo cual respresentó una densidad por estanque de 10 kilos por metro cúbico. Los estanques fueron separados en tres tipos de dietas, de los cuales dos fueron alimento en la forma de pellets elaborado con AAFOB-1 IDA2H en las dosis de 4,17 y 8,34 gramos de AAFOB-1 IDA2H por kilogramo de alimento entregado. La tercera dieta fue un control negativo, sin AAFOB-1 IDA2H. Para su mantenimiento en condiciones axénicas, las dosis elaboradas fueron tratadas con radiaciones ionizantes. Los peces fueron alimentados por al menos 30 días para evaluar los siguientes parámetros: 1 . Sobrevida a la dieta basada en AAFOB, 2. Actividad antimicrobiana de plásma sanguíneo sobre el patógeno Aeromonas salmonicida, 3. Efecto de las dietas sobre la microflora intestinal a nivel metabólico, 4. Efecto sobre la actividad inmunológica a nivel intestinal. Luego de someter a los peces a las respectivas dietas, los estanques fueron muestreados para obtener muestras de suero sanguíneo e intestinos para sus respectivos análisis.
Como resultados de este ensayo se obtuvo que el producto: 1. Por si sólo afecta el despliegue de factores de virulencia de patógenos de peces, 2. Es capaz de inducir una respuesta inmune específica mediada por Tnf-alfa en riñon e IL-1 B en branquias, 3. No representa toxicidad al ser incorporado directamente en peces en cultivo, 4. Presenta propiedades físicas que le permiten formar emulsiones estables con mezclas de aceites y así, ser adicionado a alimento de peces en la forma de pellets durante el proceso productivo de elaboración, 5. El alimento elaborado con el principio activo AAFOB-1 IDA2H al ser utilizado en una dieta para peces de la especie de O. mykiss de 120 gramos no resulta tóxico y estimula su sistema inmunológico, lo cual fue medido por una mayor actividad antimicrobiana de plasma sanguíneo de peces sometidos a la dieta comparados a una dieta control sin aditivo AAFOB-1 IDA2H.
Esto representa que la dieta formulada en base al producto AAFOB-1 IDA2H presenta un efecto a nivel de microflora y por tanto a niveles fisiológico e inmunológico. De esta forma, entre las ventajas de la presente invención se pueden destacar:
i) a diferencia de los antibióticos, el extracto de la invención no se genera resistencia;
ii) a diferencia de los antibióticos, el extracto de la invención actúa de forma selectiva sobre conductas que determinan virulencia en los microorganismos patógenos;
iii) el extracto de la invención muestra actividad en concentraciones similares a los antibióticos; iv) a diferencia de los antibióticos, el extracto de la invención, y dado que es producto natural; su utilización no esta sujeta a las mismas regulaciones ambientales, sanitarias, o de otra índole;
v) al igual que los antibióticos usados en acuicultura, el extracto puede ser añadido a los alimentos en el proceso de extrusión;
vi) a diferencia de los antibióticos, otros antimicrobianos e incluso otros inhibidores del Quorum Sensing no se requiere de pasos de síntesis o hemisíntesis química;
vii) el extracto de la invención no es tóxico para diferentes líneas celulares ni peces;
viii) el extracto de la invención proviene de una bacteria marina no patógena para peces.
ix) el extracto de la invención es una mezcla de compuestos biodegradables y por tanto es ambientalmente seguro;
x) el extracto de la invención producido por la cepa corresponde a una mezcla de ácidos grasos que presenta una actividad que interfieren con el sistema de QS; xi) las características y propiedades físicas del extracto de la invención, tales como la de emulsificante, permiten su adición en alimentos secos durante o después del proceso de extrusión.
La tabla 7 resalta las propiedades distintivas entre el uso del extracto biosurfactante de la presente invención y dos antibióticos ampliamente usados en acuicultura.
Tabla 7. Propiedades del biosurfactatnte producido por la bacteria Cobetia marina cepa MM1 IDA2H-1 y de algunos antibióticos seleccionados.
Extracto
Ampicilina Tetraciclina
Biosurfactante
SI NO SI NO SI NO
Actividad
bactericida,
bacteriostática, • O • O O • bacteriolítica.1 Inhibición de
O o
sistema de QS.2 • • • o
Inhibición selectiva
de virulencia O • o • • o bacteriana.3
Generación de
resistencia • o • o o •
Origen natural O • o • • o
Origen sintético • o • o o •
1 Medida sobre la bacteria Chromobacterium violaceum
2 Medida sobre la bacteria Chromobacterium violaceum y Chromobacterium violaceum CV026.
3 Medida sobre la bacteria patógena Aeromonas salmonicida.
La tabla 8 muestra las principales ventajas del uso del método de la presente invención para la obtención de un biosurfactante, basado en la biosíntesis de un extracto extracelular por parte de la cepa de la presente invención.
Tabla 8. Ventajas del proceso de producción del extracto BS usando la bacteria Cobetia cepa MM1 IDA2H-1 .
SI NO
Reducción de consumo de agua. • O
Proceso inducible o controlable. • O
Independiente de síntesis química. • o
Producción selectiva • o
Problemas de contaminación O o

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Cepa bacteriana de Cobetia marina no patógena de utilidad en acuicultura, CARACTERIZADA porque corresponde a una cepa aislada Cobetia marina, gram negativa, oxidasa positiva, depositada bajo el registro de CECT NQ 7764; que crece un hidrocarburos aromáticos cíclico sulfurado como una única fuente de carbono.
2. Método para obtener un extracto biosurfactante, tensoactivo CARACTERIZADO porque comprende las etapas de:
(a) crecer en un biorreactor Cobetia marina cepa (MM1 IDA2H-1 ) CECT NQ 7764 en un medio de cultivo líquido durante 24 a 48 horas a una temperatura entre 10 y 35QC, pH 6 a 8; con agitación constante entre 100 a 400 rpm y saturación de oxígeno entre 10 a 21 %; hasta obtener un cultivo con células crecidas y productos extracelulares más sales inorgánicas;
(b) separar las células crecidas mediante centrifugación y filtración; obteniéndose un sobrenadante líquido libre de células bacterianas que contiene exclusivamente productos extracelulares más sales inorgánicas;
(c) liofilizar el sobrenadante filtrado en la etapa (ii) a -80 QC y 10 militorr (1 ,33 Pa), hasta obtener un polvo que corresponde a producto extracelular más sales inorgánicas;
(d) tamizar, mecánicamente el polvo resultante en la etapa (iii), colocándose dicho polvo en un tamiz en agitación horizontal para desprender sales e impurezas, obteniéndose un polvo constituido de material extracelular generado durante el crecimiento microbiano; y
(e) secar el polvo tamizado obtenido en la etapa (iv) a una temperatura entre 30 y 50°C durante 20 a 30 horas, logrando un polvo seco de color amarillo tenue constituido de ácidos grasos que tiene propiedades emulsificantes y bioactivas.
3. Método de acuerdo con la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque el medio de cultivo líquido de la etapa (i) comprende al menos: 0,2 g/L de sulfato de magnesio; 0,02 g/L de cloruro de calcio; 1 g/L de fosfato de monopotasio; 1 g/L de fosfato de diamonio hidrógeno; 1 g/L de nitrato de potasio y 0,05 g/L de cloruro férrico, y entre 0,75 a 1 ,5% p/v de un hidrocarburo aromático cíclico sulfurado como una única fuente de carbono; todos ellos disueltos en agua destilada.
4. Método de acuerdo con la reivindicación 2, CARACTERIZADO porque el medio de cultivo de etapa (i) es el mismo medio conteniendo al menos un 75 % de agua de mar en volumen como agente solubilizante.
5. Método de acuerdo con la reivindicación 2, CARACTERIZADO porque el medio de cultivo de etapa (i) contiene como una única fuente de carbono, dibenzotiofeno (DBT).
6. Método de acuerdo con la reivindicación 5, CARACTERIZADO porque la concentración de DBT es 1 % p/v.
7. Método de acuerdo con la reivindicación 2, CARACTERIZADO porque la separación de las células del cultivo de etapa (ii) se realiza por centrifugación entre 2.000 a 4.000 rpm durante 15 a 20 minutos, y la filtración se realiza en filtro de corte entre 0,22 y 0,45 μιτι.
8. Extracto biosurfactante y tensoactivo obtenido por el método de la reivindicaciones 2 a 7, CARACTERIZADO porque comprende 2,52 a 9,22 % de ácido láurico C12:0; 5,97 a 10,13 % de ácido mirístico C14:0; 2,4 a 2,88 % de ácido pentadecanoico; 19,27 a 24,39 % de ácido palmítico C16:0; 7,81 a 9,83 % de ácido palmitoleico C16:1 ; 8,37 a 10,43 % de ácido esteárico C18:0; y 1 1 ,32 a 16,25 % de ácido oleico C18:1 cis; y presenta una tensión superficial de entre 66 a 70 dinas/cm, con una alta estabilidad de emulsión.
9. Uso del extracto biosurfactante y tensoactivo de acuerdo con la reivindicación 8, CARACTERIZADO porque sirve para evitar patologías infecciosas en acuicultura.
10. Uso del extracto biosurfactante de acuerdo con la reivindicación 9, CARACTERIZADO porque las patologías infecciosas son causadas por bacterias de los géneros Aeromonas, Listonella y por hongos patógenos.
1 1 . Uso del extracto biosurfactante y tensoactivo de acuerdo con la reivindicación 10, CARACTERIZADO porque las patologías infecciosas son causadas por bacterias Aeromonas salmonicida o Listonella anguillarum.
12. Uso del extracto biosurfactante y tensoactivo de acuerdo con la reivindicación 8, CARACTERIZADO porque es útil como un aditivo alimentario en una formulación alimentaria que otorga funcionalidad al alimento.
13. Uso del extracto biosurfactante y tensoactivo de acuerdo con la reivindicación 8, CARACTERIZADO porque es útil como aditivo alimentario para evitar y tratar patologías infecciosas dependientes del sistema Quorum Sensing.
14. Uso del extracto biosurfactante y tensoactivo de acuerdo con la reivindicación 8, CARACTERIZADO porque es útil en la formulación de revestimientos y/o pinturas bioactivas de superficies sumergidas.
15. Uso del extracto biosurfactante y tensoactivo de acuerdo con la reivindicación 8, CARACTERIZADO porque es útil en la formulación de revestimientos y/o pinturas para control de biopelículas microbianas.
16. Uso de la cepa bacteriana de Cobetia marina de acuerdo con la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque sirve como probiótico útil para inhibir y/o controlar el crecimiento de bacterias patógenas de peces y hongos patógenos
17. El uso de acuerdo con la reivindicación 16, CARACTERIZADO porque las bacterias patógenas corresponden a Aeromonas salmonicida o Listonella anguillarum.
PCT/IB2012/052724 2011-05-31 2012-05-30 Cepa de cobetia marina y extracto biosurfactante obtenido a partir de ella WO2012164508A1 (es)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/122,529 US9629882B2 (en) 2011-05-31 2012-05-30 Strain of Cobetia marina and biosurfactant extract obtained from same
EP12792549.3A EP2716749B1 (en) 2011-05-31 2012-05-30 Strain of cobetia marina and biosurfactant extract obtained from same

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CL2011001286A CL2011001286A1 (es) 2011-05-31 2011-05-31 Cepa bacteriana de cobetia marina, no patogena, de utilidad en acuicultura que crece en hidrocarburos aromaticos ciclicos sulfurados como unica fuente de carbono; metodo para obtener un extracto biosurfactante; extracto biosurfactante; uso del biosurfactante para evitar patologias infecciosas en acuicultura.
CL1286-2011 2011-05-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012164508A1 true WO2012164508A1 (es) 2012-12-06

Family

ID=51017462

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/IB2012/052724 WO2012164508A1 (es) 2011-05-31 2012-05-30 Cepa de cobetia marina y extracto biosurfactante obtenido a partir de ella

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9629882B2 (es)
EP (1) EP2716749B1 (es)
CL (1) CL2011001286A1 (es)
WO (1) WO2012164508A1 (es)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2624050C2 (ru) * 2015-12-07 2017-06-30 Общество С Ограниченной Ответственностью "Арктический Научно-Проектный Центр Шельфовых Разработок" Штамм Cobetia marina ARC 10 ВКПМ В-12349 - деструктор нефти и нефтепродуктов
RU2624059C2 (ru) * 2015-12-07 2017-06-30 Общество С Ограниченной Ответственностью "Арктический Научно-Проектный Центр Шельфовых Разработок" Штамм Cobetia marina ARC 11 ВКПМ В-12350 - деструктор нефти и нефтепродуктов
EA039857B1 (ru) * 2020-11-09 2022-03-21 Ракишев, Куаныш Боранкулович Способ безотходной утилизации навоза крупного рогатого скота

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CL2017003446A1 (es) * 2017-12-28 2018-06-15 Univ De Valparaiso Extracto de origen bacteriano producido por la bacteria marina kocuria sp y su uso para generar estructuras poliméricas con superficies bioactivas capaces de inhibir la formación de biopelículas microbianas

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002000035A1 (en) 2000-06-23 2002-01-03 Acuabiotec Llc Bioactive food complex, method for making bioactive food complex product and method for controlling disease
WO2007043657A1 (ja) * 2005-10-14 2007-04-19 National University Corporation Kanazawa University 重金属存在下で有機物質を分解する方法
JP2008194026A (ja) 2007-01-16 2008-08-28 Shiibaion:Kk 酸性ムコ多糖産生微生物、酸性ムコ多糖の製造法、ならびに酸性ムコ多糖を有効成分として配合した美白剤
JP2009034094A (ja) 2007-07-09 2009-02-19 Shiibaion:Kk 新規微生物およびその変異株並びにそれを用いた多糖類の製造方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT1811848E (pt) * 2004-10-15 2011-03-15 Univ Antofagasta Produto bacteriano de origem marinha, útil para a prevenção de macro e micro biofouling provocado por macroalgas e invertebrados marinhos

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002000035A1 (en) 2000-06-23 2002-01-03 Acuabiotec Llc Bioactive food complex, method for making bioactive food complex product and method for controlling disease
WO2007043657A1 (ja) * 2005-10-14 2007-04-19 National University Corporation Kanazawa University 重金属存在下で有機物質を分解する方法
JP2008194026A (ja) 2007-01-16 2008-08-28 Shiibaion:Kk 酸性ムコ多糖産生微生物、酸性ムコ多糖の製造法、ならびに酸性ムコ多糖を有効成分として配合した美白剤
JP2009034094A (ja) 2007-07-09 2009-02-19 Shiibaion:Kk 新規微生物およびその変異株並びにそれを用いた多糖類の製造方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MAKI J.S. ET AL.: "Substratum/bacterial interactions and larval attachment: films and exopolysaccharides of Halomonas marina (ATCC 25374) and their effect on barnacle cyprid larvae, Balanus amphitrite Darwin.", BIOFOULING: THE JOURNAL OF BIOADHESION AND BIOFILM RESEARCH, vol. 16, no. 2-4, 2000, pages 159 - 170, XP008169323 *
OLIVERA N.L. ET AL.: "Isolation and characterization of biosurfactant- producing Alcanivorax strains: hydrocarbon accession strategies and alkane hydroxylase gene analysis", RESEARCH IN MICROBIOLOGY, vol. 19-26, 2009, XP025771442 *
SATPUTE, S. ET AL.: "Biosurfactants, bioemulsifiers and exopolysaccharides from marine microorganisms", BIOTECHNOLOGY ADVANCES, vol. 28, 2010, pages 436 - 450, XP027048557 *
See also references of EP2716749A4

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2624050C2 (ru) * 2015-12-07 2017-06-30 Общество С Ограниченной Ответственностью "Арктический Научно-Проектный Центр Шельфовых Разработок" Штамм Cobetia marina ARC 10 ВКПМ В-12349 - деструктор нефти и нефтепродуктов
RU2624059C2 (ru) * 2015-12-07 2017-06-30 Общество С Ограниченной Ответственностью "Арктический Научно-Проектный Центр Шельфовых Разработок" Штамм Cobetia marina ARC 11 ВКПМ В-12350 - деструктор нефти и нефтепродуктов
EA039857B1 (ru) * 2020-11-09 2022-03-21 Ракишев, Куаныш Боранкулович Способ безотходной утилизации навоза крупного рогатого скота

Also Published As

Publication number Publication date
EP2716749A1 (en) 2014-04-09
US20140186475A1 (en) 2014-07-03
CL2011001286A1 (es) 2011-09-30
EP2716749A4 (en) 2014-06-18
EP2716749B1 (en) 2018-12-26
US9629882B2 (en) 2017-04-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Nimrat et al. Potential Bacillus probiotics enhance bacterial numbers, water quality and growth during early development of white shrimp (Litopenaeus vannamei)
Montánchez et al. Vibrio harveyi: A brief survey of general characteristics and recent epidemiological traits associated with climate change
Chumpol et al. The roles of probiotic purple nonsulfur bacteria to control water quality and prevent acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) for enhancement growth with higher survival in white shrimp (Litopenaeus vannamei) during cultivation
Karim et al. Probiotic strains for shellfish aquaculture: protection of eastern oyster, Crassostrea virginica, larvae and juveniles againsl bacterial challenge
Nimrat et al. Effects of probiotic forms, compositions of and mode of probiotic administration on rearing of Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) larvae and postlarvae
Zheng et al. Selection, identification and application of antagonistic bacteria associated with skin ulceration and peristome tumescence of cultured sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka)
WO2016070174A1 (en) Method for reducing cyanuric acid in recreational water systems
Helmy et al. Identification and characterization of novel small molecule inhibitors to control Mycoplasma gallisepticum infection in chickens
Mahdhi et al. Survival and retention of the probiotic properties of Bacillus sp. strains under marine stress starvation conditions and their potential use as a probiotic in Artemia culture
Torkildsen et al. Minimum inhibitory concentrations of chloramphenicol, florfenicol, trimethoprim/sulfadiazine and flumequine in seawater of bacteria associated with scallops (Pecten maximus) larvae
WO2012164508A1 (es) Cepa de cobetia marina y extracto biosurfactante obtenido a partir de ella
Sakami et al. Effects of epiphytic bacteria on the growth of the toxic dinoflagellate Gambierdiscus toxicus (Dinophyceae)
Li et al. Virulence properties of Vibrio vulnificus isolated from diseased zoea of freshness shrimp Macrobrachium rosenbergii
Mahmoud et al. Hydrolytic bacteria associated with natural helminth infection in the midgut of Red Sea marbled spinefoot rabbit fish Siganus rivulatus
Hamza et al. Efficacy of cell free supernatant from Bacillus licheniformis in protecting Artemia salina against Vibrio alginolyticus and Pseudomonas gessardii
Castex et al. Probiotic applications in crustaceans
Kannan et al. Effect of biosurfactant derived from Vibrio natriegens MK3 against Vibrio harveyi biofilm and virulence
Chang et al. Biocontrol of acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) in shrimp using a microalgal-bacterial consortium
Soundararajan et al. Isolation of exopolysaccharide, galactan from marine Vibrio sp. BPM 19 to template the synthesis of antimicrobial platinum nanocomposite
US20220322707A1 (en) Drinkable Supplement Composition for Improved Health and Hydration
KR20120088436A (ko) 사프로레그니아 속 미생물에 대한 생물학적 방제용 프로바이오틱스
JP6506259B2 (ja) シュードアルテロモナス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ）属由来の単離された細菌の使用、シクロリポペプチド、及びその使用
Beleneva et al. Biochemical and pathogenic properties of the natural isolate of Shewanella algae from Peter the Great Bay, Sea of Japan
WO2005117923A1 (de) Bioprotektivum
Rajan et al. Screening, Production and Characterization of extracellular glutaminase free L-Asparaginase producing endo-symbiontic bacteria from the gut of Mugil cephalus (Mullet fish)

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12792549

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012792549

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14122529

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE