JP2009247279A

JP2009247279A - 新規水草根圏微生物

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Publication number: JP2009247279A
Application number: JP2008099213A
Authority: JP
Inventors: Masaaki Morikawa; 正章森川; Kenji Washio; 健司鷲尾; Fumiko Yamaga; 文子山賀
Original assignee: Hokkaido University NUC
Current assignee: Hokkaido University NUC
Priority date: 2008-04-07
Filing date: 2008-04-07
Publication date: 2009-10-29
Anticipated expiration: 2028-04-07
Also published as: JP5303176B2

Abstract

【課題】芳香族系の有機汚染物質の浄化能を有する微生物、特にファイトレメディエーションによる環境中の有機汚染物質の浄化に利用可能な微生物を提供することを目的とする。
【解決手段】水酸基を有する単環式芳香族化合物又は芳香族環の開裂反応によって芳香族環上に水酸基が生じる多環式芳香族化合物に対して分解能を有する、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属微生物。本発明は、自然界に全く無害の微生物を用いて、フェノール等の環境汚染物質を浄化することができる。特に本発明の生物製剤は、環境中、特に湖沼や河川に漏出したフェノール等の環境汚染物質を、汚染された水等を回収することなく、自然環境の中で効率的かつ極めて安価に処理することができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、水酸基を有する単環式芳香族化合物又は芳香族環の開裂反応によって芳香族環上に水酸基が生じる多環式芳香族化合物に対して分解能を有し、ウキクサの根に対して付着能を有するアシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属微生物、及び当該微生物を用いて、水酸基を有する単環式芳香族化合物又は芳香族環の開裂反応によって芳香族環上に水酸基が生じる多環式芳香族化合物によって汚染された水又は土壌の浄化方法に関する。

フェノールやナフタレンは、消毒剤、防腐剤、防虫剤、染料中間体として用いられる他、合成樹脂、染料、爆薬、可塑剤、界面活性剤の製造原料として重要な芳香族化合物である。これらはいずれも生物に対する毒性が強く、工場等からの外部への流出は、深刻な環境汚染を引き起こすおそれがある。

そのため、例えばフェノール排出基準は、下水道法や水質汚濁防止法などで５ｍｇ／Ｌと定められており、化学工業等の製造過程において生じるフェノール性化合物を含む廃水を処理する方法として、焼却法、蒸留回収法、活性汚泥法等が実施されている。

上記の処理方法は、主として、工場等の排水が発生する施設の内部で実施されることを目的として開発された方法である。そのため、施設の外部、例えば土壌、河川、湖沼などのオープンな環境に漏出してしまったフェノール等の環境汚染源を、上記の方法で処理することは事実上不可能である。

こうした環境中に漏出してしまった汚染源を物理的又は化学的に回収あるいは分解するのは容易なことではないことから、植物や微生物を用いた生物学的な浄化技術が、環境中の汚染物質の除去方法として利用されている。特に植物の有機化合物の吸収能ならびに代謝能を利用した環境汚染源を浄化する技術は、一般にファイトレメディエーションと呼ばれる。この技術は、植物が自身の栄養源として利用する窒素、リンの除去や、植物体内への吸収、蓄積を利用した重金属の除去に対して、特に優れている。

植物を利用する環境浄化技術の最大のメリットは、太陽エネルギーを利用する経済性及び環境適合性という点であり、受動(パッシブ)システムとしてホテイアオイやヨシなどの植物が広く活用されている。しかし、植物による有機化合物等の環境汚染源の回収、除去反応は一般に長時間を要することから、効率的であるとは言い難い。

この問題を解消する方法として、植物と共存することができ、それ自体が環境浄化作用を有する微生物を組み合わせてファイトレメディエーションの効率を高める方法が提唱されている。その代表例が、植物の根の周囲における微生物と植物の共生関係を利用した、根圏浄化（Ｒｈｉｚｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ）と呼ばれる環境浄化技術である。

例えば、原油汚染砂漠における土着植物と原油分解微生物との組み合わせによって、当該土着植物の根周辺の原油の除去が行われた例がある（非特許文献１）。

また、水生植物の根圏微生物について、植物と根圏微生物の共存下では芳香族化合物の分解能が向上することが報告されている（非特許文献２）
ＳａｍｉｒＲａｄｗａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９５年、第３７６巻、第６５３８号−３０２頁Ｔｏｙａｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．、２００６年、第１０１巻、第４号、３４６−３５３頁

本発明は、芳香族系の有機汚染物質の浄化能を有する微生物、特にファイトレメディエーションによる汚染された環境の浄化に利用可能な微生物を提供することを目的とする。

本発明者らは、ウキクサの根圏から、フェノール及びナフタレンを分解することのできる微生物を単離し、フェノール及びナフタレンの生物学的分解除去、特にファイトレメディエーションによる汚染物質の分解除去又は当該汚染物質によって汚染された環境の浄化に利用し得ることを見いだし、下記の各発明を完成させた。

（１）水酸基を有する単環式芳香族化合物又は芳香族環の開裂反応によって芳香族環上に水酸基が生じる多環式芳香族化合物に対して分解能を有する、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属微生物。

（２）ベンゼンに対する分解能を示さない、（１）に記載のアシネトバクター属微生物。

（３）水生植物の根圏微生物である、（１）又は（２）に記載のアシネトバクター属微生物。

（４）水生植物がウキクサ科（Ｌｅｍｎａｃｅａｅ）植物である、（３）に記載のアシネトバクター属微生物。

（５）ウキクサ科植物がアオウキクサ（Ｌｅｍｎａｐｅｒｐｕｓｉｌｌａ）又はウキクサ（Ｓｐｉｒｏｄｅｌａｐｏｌｙｒｒｈｉｚａ）である、（４）に記載のアシネトバクター属微生物。

（６）受託番号ＮＩＴＥＰ−５２３として受託された、アシネトバクター属微生物。

（７）（１）〜（６）の何れかに記載のアシネトバクター属微生物を含む、水酸基を有する単環式芳香族化合物又は芳香族環の開裂反応によって芳香族環上に水酸基が生じる多環式芳香族化合物を分解するための生物製剤。

（８）（１）〜（６）の何れかに記載のアシネトバクター属微生物とウキクサ科（Ｌｅｍｎａｃｅａｅ）植物とからなる、水酸基を有する単環式芳香族化合物又は芳香族環の開裂反応によって芳香族環上に水酸基が生じる多環式芳香族化合物を分解するための生物製剤。

（９）ウキクサ科植物がアオウキクサ（Ｌｅｍｎａｐｅｒｐｕｓｉｌｌａ）又はウキクサ（Ｓｐｉｒｏｄｅｌａｐｏｌｙｒｒｈｉｚａ）である、（８）に記載のフェノール及び／又はナフタレン分解用生物製剤。

（１０）（１）〜（６）のいずれかに記載のアシネトバクター属微生物と水酸基を有する単環式芳香族化合物若しくは芳香族環の開裂反応によって芳香族環上に水酸基が生じる多環式芳香族化合物によって汚染された水若しくは土壌とを接触させる工程ａ）を含む、前記汚染された水若しくは土壌に含まれる水酸基を有する単環式芳香族化合物若しくは芳香族環の開裂反応によって芳香族環上に水酸基が生じる多環式芳香族化合物を分解除去する方法。

（１１）工程ａ）が、前記汚染された水若しくは土壌に（７）〜（９）の何れかに記載の生物製剤を投与することで、アシネトバクター属微生物と水酸基を有する単環式芳香族化合物若しくは芳香族環の開裂反応によって芳香族環上に水酸基が生じる多環式芳香族化合物によって汚染された水若しくは土壌とを接触させる工程である、（１０）に記載の方法。

（１２）（１）〜（６）のいずれかに記載のアシネトバクター属微生物と水酸基を有する単環式芳香族化合物若しくは芳香族環の開裂反応によって芳香族環上に水酸基が生じる多環式芳香族化合物によって汚染された水若しくは土壌とを接触させる工程ａ）、及び前記汚染された水若しくは土壌に含まれる水酸基を有する単環式芳香族化合物若しくは芳香族環の開裂反応によって芳香族環上に水酸基が生じる多環式芳香族化合物を分解除去する工程ｂ）を含む、前記汚染された水若しくは土壌の浄化方法。

（１３）工程ａ）が、前記汚染された水若しくは土壌に請求項７〜９の何れかに記載の生物製剤を投与することで、アシネトバクター属微生物と水酸基を有する単環式芳香族化合物若しくは芳香族環の開裂反応によって芳香族環上に水酸基が生じる多環式芳香族化合物によって汚染された水若しくは土壌とを接触させる工程である、（１２）に記載の浄化方法。

本発明は、自然界に全く無害の微生物を用いて、フェノール等の環境汚染物質を分解除去して、環境を浄化することができる。特に本発明の生物製剤は、環境中、特に湖沼や河川に漏出したフェノール等の環境汚染物質を自然環境の中で効率的かつ極めて安価に分解処理して、環境を浄化することができる。

本発明は、水酸基を有する単環式芳香族化合物又は芳香族環の開裂反応によって芳香族環上に水酸基が生じる多環式芳香族化合物に対して分解能を有する、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属微生物を提供する。

本発明のアシネトバクター属微生物は、下記表１に示す微生物学的性質を有する。その好ましい例は、産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、受託番号ＮＩＴＥＰ−５２３として寄託されているアシネトバクターエスピーＰ２３株である。

上記の微生物学的特徴を備えたアシネトバクター属微生物であって、水酸基を有する単環式芳香族化合物又は芳香族環の開裂反応によって芳香族環上に水酸基が生じる多環式芳香族化合物に対して分解能を有するアシネトバクター属微生物、特にウキクサ科植物の根圏微生物であるアシネトバクター属微生物であれば、何れのアシネトバクター属微生物も本発明に含まれ、前記受託番号ＮＩＴＥＰ−５２３として寄託されている特定のアシネトバクター属微生物株には限定はされないが、本発明で好ましいアシネトバクター属微生物は、受託番号ＮＩＴＥＰ−５２３として寄託されているアシネトバクターエスピーＰ２３株である。以下、アシネトバクターエスピーＰ２３株をＡ−Ｐ２３株と表すこととする。

本発明のアシネトバクター属微生物を培養するために用いられる培地の栄養源としては、通常の微生物の生育に必要であって本菌が資化可能な栄養源であれば、いかなる炭素源、窒素源及び無機塩類等でもよい。

炭素源としては、グルコースやデンプンその他の糖類、酵母エキス等の天然物等が利用できるが、水酸基を有する単環式芳香族化合物又は芳香族環の開裂反応によって芳香族環上に水酸基が生じる多環式芳香族化合物も炭素源として利用することができる。

また窒素源としては、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム等の硝酸塩、各種アミノ酸、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、ペプトン等の天然物が利用できる。また、カリウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、マンガン塩、リン酸塩等を無機成分として用いることができる。

上記の窒素源ならびに炭素源を含む、本発明のアシネトバクター属微生物の培養に好適な培地の例としては、Ｌ培地、Ｈｏａｇｌａｎｄ培地（Ｈｏａｇｌａｎｄら、ＳｏｉｌＳｃｉ．，１９４０年、第５０巻、第４６３−４８５頁）、ＢＭ（ＢａｓａｌｓａｌｔＭｅｄｉｕｍ）培地などを挙げることができるが、これらには限定されない。

本発明のアシネトバクター属微生物は、２０〜４０℃の温度範囲、好ましくは２５〜３５℃の温度範囲、５〜９のｐＨ範囲、好ましくは６〜８のｐＨ範囲で、好気的に培養することができる。

本発明において、水酸基を有する単環式芳香族化合物とは、芳香族化合物の環に水酸基が直接結合した化合物で、フェノール類として表される化合物を意味する。代表的な例としては、フェノール、ｍ−クレゾール、ビスフェノールＦ、サリチル酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸等が挙げられる。また、本発明において、芳香族環の開裂反応によって芳香族環上に水酸基が生じる多環式芳香族化合物とは、多環式芳香族化合物の一部を構成する芳香族環における原子間の共有結合が切断されることにより、芳香族環上に新たに水酸基が形成される多環式芳香族化合物をいう。例えば、ナフタレン、ビフェニル、アントラセン、ピレンである。本発明の微生物は、この様な化合物を分解することで、当該化合物を培地乃至環境から除去することができる。以下、本発明では、水酸基を有する単環式芳香族化合物と多環式芳香族化合物の一部を構成する芳香族環における原子間の共有結合が切断されることにより芳香族環上に新たに水酸基が形成される多環式芳香族化合物とをまとめて、「汚染化合物」と、それぞれ表すこととする。

本発明のアシネトバクター属微生物は、工場、営業所あるいは家庭等からの排水、汚染された河川や湖沼、海水その他の水であって、「汚染化合物」が含まれることが予想され又は確認されている水（以下、「被汚染水」と表す）、あるいは「汚染化合物」が含まれることが予想され又は確認されている土壌（以下、「被汚染土壌」と表す）と接触させることで、「汚染化合物」を分解資化、すなわち分解処理して、「被汚染水」及び／「被汚染土壌」を浄化することができる。「汚染化合物」の分解処理ならびに「被汚染水」及び／又は「被汚染土壌」の浄化は、好ましくは、「被汚染水」又は「被汚染土壌」において本発明のアシネトバクター属微生物を培養し、増殖させることで行われる。

本発明のアシネトバクター属微生物は、これを「被汚染水」の中でそのまま培養することで、「汚染化合物」を分解処理させることができる。また、公知の方法で適当な担体に本発明のアシネトバクター属微生物を固定化させた固定化微生物を用意し、これを用いてバッチ式に、あるいは連続的に「被汚染水」を固定化微生物に接触させることで、「汚染化合物」を分解処理してもよい。「被汚染水」が本発明のアシネトバクター属微生物の培養、増殖に好適な栄養源に乏しい場合には、好適な栄養源を「被汚染水」に適宜添加してもよい。

また本発明のアシネトバクター属微生物は、これを「被汚染土壌」にそのまま散布することにより「汚染化合物」を分解処理させることができる。また、公知の方法で適当な担体に本発明のアシネトバクター属微生物を固定化させた固定化微生物を用意し、これを「被汚染土壌」に散布して「汚染化合物」を分解処理してもよい。「被汚染土壌」が本発明のアシネトバクター属微生物の培養、増殖に好適な栄養源に乏しい場合には、好適な栄養源を「被汚染土壌」に散布する、あるいは本発明のアシネトバクター属微生物と共に散布してもよい。

本発明のアシネトバクター属微生物、特に好ましいアシネトバクター属微生物であるＡ−Ｐ２３株は、ウキクサ科植物、例えばアオウキクサ（Ｌｅｍｎａｐｅｒｐｕｓｉｌｌａ）と共に培養すると、アオウキクサの根に付着して根圏を形成する性質を有している。特に、Ａ−Ｐ２３株の「汚染化合物」の分解処理能力は当該根圏が形成されることによって上昇し、また、「汚染化合物」が含まれる環境下でのアオウキクサの株数の増加率も、Ａ−Ｐ２３株による根圏が形成されることによって上昇することが確認された。このことから、本発明のアシネトバクター属微生物は、ウキクサ科植物に対して根圏を形成して共生関係を成立させることによって成長を促進する性質を有する、ＰＧＰＲ（ＰｌａｎｔＧｒｏｗｔｈＰｒｏｍｏｔｉｎｇｒｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉａ）の一種であると考えられる。

この様に、本発明のアシネトバクター属微生物は、そのままあるいはウキクサ科植物と組み合わせることで、「汚染化合物」の分解処理を目的とした生物製剤として利用することができる。すなわち本発明は、アシネトバクター属微生物又は本発明のアシネトバクター属微生物とウキクサ科植物を含む、「汚染化合物」を分解処理するため、又は汚染化合物を分解処理して「被汚染水」及び／又は「被汚染土壌」を浄化するための生物製剤を提供するものである。

本発明の生物製剤は、本発明のアシネトバクター属微生物、アシネトバクター属微生物とウキクサ科植物の他に、適当な賦形剤、及び／又はアシネトバクター属微生物の培養に好適な培地その他の任意成分を含んでいてもよい。また、アシネトバクター属微生物とウキクサ科植物はそれぞれ分離されて製剤に含まれていてもよく、あるいはウキクサ科植物の根の表面にアシネトバクター属微生物が根圏を形成している形態にあってもよい。アシネトバクター属微生物が根圏を形成しているウキクサ科植物を生物製剤として用いて湖沼や河川における「汚染化合物」の分解処理を行う場合、処理が終了したあとはウキクサを回収することで、湖沼や河川から不要となった微生物を簡便に回収することができる。

本発明は、本発明に係るアシネトバクター属微生物と「被汚染水」又は「被汚染土壌」とを接触させる工程ａ）を含む、前記「被汚染水」又は「被汚染土壌」に含まれる「汚染化合物」を分解除去する方法を提供する。また、前記工程ａ）が、前記「被汚染水」又は「被汚染土壌」に本発明に係る生物製剤を投与することで、アシネトバクター属微生物と「被汚染水」又は「被汚染土壌」とを接触させる工程である、前記「被汚染水」又は「被汚染土壌」に含まれる「汚染化合物」を分解除去する方法を提供する。

更に本発明は、本発明に係るアシネトバクター属微生物と「被汚染水」又は「被汚染土壌」とを接触させる工程ａ）、及び前記「被汚染水」又は「被汚染土壌」に含まれる「汚染化合物」を分解除去する工程ｂ）を含む、前記「被汚染水」又は「被汚染土壌」の浄化方法を提供する。また、前記工程ａ）が、前記「被汚染水」又は「被汚染土壌」に本発明に係る生物製剤を投与することで、アシネトバクター属微生物と「被汚染水」又は「被汚染土壌」とを接触させる工程である、「被汚染水」又は「被汚染土壌」の浄化方法を提供する。

本発明のアシネトバクター属微生物を用いた「被汚染水」中の「汚染化合物」の分解処理又は「被汚染水」の浄化は、例えば活性汚泥方式、バイオリアクター方式により、また「被汚染物土壌」においては、本発明のアシネトバクター属微生物を土壌に散布するあるいは注入することにより行われてもよく、目的に適した方式を適宜に選択することができる。

活性汚泥法では、本発明のアシネトバクター属微生物又は生物製剤と「被汚染水」とを接触させることで、「汚染化合物」を分解処理することができる。例えば、活性汚泥法による分解処理の場合には、本発明のアシネトバクター属微生物の菌体を１０^３ｃｆｕ／ｍＬ以上、好ましくは１０^６ｃｆｕ／ｍＬ以上の濃度でばっ気槽に添加し、前記の好適な培養条件下で培養して分解処理を行えばよい。また、散水濾床法、浸漬濾床法、菌体固定法においては、本発明のアシネトバクター属微生物を固定化した担体と、「被汚染水」と接触させることにより、「汚染化合物」を分解処理することができる。

本発明の分解処理方法によれば、２０ｍｇ／Ｌという高濃度の汚染化合物（フェノール）を、２５℃４時間の培養で０．０１ｍｇ／Ｌ以下まで分解することができる。

土壌浄化においては、「被汚染土壌」と本発明のアシネトバクター属微生物とを、好ましくは本発明のアシネトバクター属微生物が増殖可能な条件下で接触させることにより、「被汚染土壌」中の「汚染化合物」を分解処理し、「被汚染土壌」を浄化することができる。

本発明にかかる方法の好ましい態様は、本発明に係るアシネトバクター属微生物を、「被汚染水」中で培養し、増殖させて、「被汚染水」に含まれる「汚染化合物」を分解除去する、あるいは「被汚染水」を浄化する方法である。本発明に係るアシネトバクター属微生物の培養条件は、先に述べたとおりである。
以下、実施例を示して本発明を更に詳しく説明するが、本発明はその実施例に限定されるものではない。

＜実施例１＞
１−１）微生物の単離
３種類の炭化水素 (フェノール、ナフタレン、マレーシア原油)を終濃度２０または２００ｍｇ／Ｌとなるように添加したＨｏａｇｌａｎｄ培地（表２）１００ｍＬ／３００ｍＬ容三角フラスコへ、北海道大学付属植物園幽庭湖から採取し、蒸留水で洗浄したアオウキクサ（Ｌｅｍｎａｐｅｒｐｕｓｉｌｌａ）を加え、温度：２５℃の恒温室内、照度：４５００−６０００ルクス、明暗条件：１６時間明８時間暗で培養した。

３週間後、アオウキクサを取り出して蒸留水１０ｍＬで２回洗浄した後、１０株分の葉状態と根をそれぞれエッペンドルフチューブへ取り出した。ここへ５ｍｇ／Ｌトリポリリン酸ナトリウム水溶液１ｍＬを添加し、超音波発振操作（操作１：５秒×６回、操作２：２０秒×５回）を行い、１〜１×１０⁵に段階希釈した溶液を調製した。これを５０μＬのＢＭ（表３、ＢａｓａｌｓａｌｔＭｅｄｉｕｍ）培地又はＬＢ固形培地へ塗布し、２５℃で平板培養を行った。このときＢＭ培地には単一炭素源として集積培養の際添加した炭化水素を１００μＬ添加した。平板上に表れたコロニーをそれぞれＬ培地、または各炭化水素を加えたＢＭ培地へ植え継いだ。

固形培地上でコロニー形態の異なる細菌として、フェノール含有培地から１０９菌株、ナフタレン含有培地から７９菌株、マレーシア原油含有培地から４１菌株がそれぞれ取得された。単一菌株と確認されたコロニーを、それぞれで使用された炭化水素を１０ｍｇ／Ｌ含む液体Ｌ培地５ｍＬに植菌し、濁度が十分上昇したと確認されるまで２５℃、１５０ｒｐｍで振とう培養した。菌体を遠心分離（１９００×ｇ、５分、２０℃ )で集菌し、１５％グリセロール溶液として−８０℃のディープフリーザーで保存した。グリセロール溶液作製後、Ｌ固形培地に塗布し、単一種が保存されていることを確認した。

１−２）単離細菌の炭化水素分解活性の評価

１−２）−１．フェノール分解活性評価
終濃度２ｍｇ／Ｌのフェノールを添加したＬ液体培地５ｍＬ／試験管に各微生物を植菌後、濁度が十分上昇したと確認されるまで振とう培養（２５℃、１５０ｒｐｍ）を行い、遠心分離（１９００×ｇ、５分、２０℃）により集菌し、１ｍＬのＢＭ培地で洗浄後、同量のＢＭ培地に懸濁した。終濃度１０ｍｇ／Ｌのフェノールを添加した４ｍＬのＢＭ培地へ１ｍＬの細菌懸濁液を加え、振とう培養（２５℃、１５０ｒｐｍ）を行い、７日後の培養液１ｍＬをポリプロピレンチューブに入れて遠心分離（１３０００×ｇ、１５分、４℃）して上清を回収し、その中のフェノール残存量を、ＨＰＬＣ（ＨＰ１１００Ｓｅｒｉｅｓ、ＨＥＷＬＥＴＴＰＡＣＫＡＲＤ社）により測定した。ＨＰＬＣの測定条件を表４に示す。

上記の測定から、培地に添加したフェノールの８０％以上を分解した細菌を選択した。この選択された細菌の前培養液１ｍＬ（ＯＤ₆₀₀＝１．０）を、１００ｍＬ容フラスコに終濃度２０ｍｇ／Ｌのフェノールを添加した５０ｍＬのＨｏａｇｌａｎｄ培地に添加して振とう培養（２５℃、１５０ｒｐｍ）を行い、培養開始から１．５、３、４．５、６、９、１２、２４各時間後に培地を５００μＬ回収し、菌体を遠心分離（１３０００ｒｐｍ、１５分、４℃）で除去した上清を上記と同じ条件でＨＰＬＣにかけ、培地中のフェノール残存量の経時変化を測定した。

この実験を通じて、培地に添加したフェノールの８０％以上を分解することのできる細菌として５菌株が得られた。これらはいずれも、２０ｍｇ／Ｌのフェノールを数時間で分解するような高い分解活性を有した。

１−２）−２．ナフタレン分解活性評価
終濃度３０ｍｇ／Ｌのナフタレンを添加したＢＭ液体培地１０ｍＬ／遠心管に各微生物を植菌後、振とう培養（２５℃、１５０ｒｐｍ、７日間）を行った後、培地に１０ｍＬの抽出溶媒（ヘキサン：アセトン＝１：１）を添加して撹拌し、遠心分離（２８１０×ｇ、３０分、４℃）した。１ｍＬのヘキサン層をＧＣ用ガラスバイアルチューブに移し、ナフタレン残存量を表５に示す条件でガスクロマトグラフィー(以下、ＧＣ−ＦＩＤ) を用いて測定した。ナフタレンと内部標準物質であるビフェニルのクロマトグラムピーク面積の値から、残存率、および分解率を算出した。

上記実験でナフタレン分解能が高いと判断された細菌について、上記実験と同様の条件で再度培養し、培地中のナフタレン残存量の経時変化を測定した。

この実験を通じて、ナフタレン分解能が高いと判断された細菌として、６菌株が得られた。

１−２）−３．スタンダードガスオイル分解活性評価
スタンダードガスオイル５０００ｍｇ／Ｌを添加した１０ｍＬのＢＭ培地／５０ｍＬ容遠沈管に各微生物を植菌後、振とう培養（２５℃、１５０ｒｐｍ、７日間）を行った後、上記２）と同様にして、培地からの残存原油又は残存スタンダードガスオイルの抽出操作及びＧＣ−ＦＩＤを用いた測定、さらに栽培用による培地中の残存原油量等の経時変化を測定した。

この実験を通じて、スタンダードガスオイル分解能が高いと判断された細菌として、５菌株が得られた。

１−３）分離菌株の同定
１−２）で得られたフェノール分解能を有する５菌株、ナフタレン分解能を有する６菌株、スタンダードガスオイル分解能を有する５菌株について、１６ＳｒＲＮＡ後半部分約６００塩基を解析することで各菌株の属同定を行った。

Ｌ固形培地に生育させた各菌株のコロニーを１０μＬの蒸留水を加えたポリプロピレンチューブに移して懸濁した後、９９℃で１５分間加熱して溶菌させた。この溶液を鋳型とし、表５に示す反応液組成において、９４℃で１分の後、［９４℃、３０秒−５２℃、２分−７４℃、３０秒］×３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。

アガロースゲル電気泳動法によって回収した増幅されたＤＮＡをＱｉａｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。この生成されたＤＮＡを鋳型とし、表６に示すような反応駅組成において、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、９６℃で１０分の後、［５０℃、５分−６０℃、４分］×２５サイクルのシーケンスＰＣＲ反応を行った。

エタノール沈殿法で回収、精製したシーケンスＰＣＲ反応産物を、Ｈｉ−Ｄｉ−Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）１２μＬに溶解し、ＡＢＩ３１００（ＡＢＩＰＲＩＳＭ（登録商標）３１００−ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてシーケンスを決定し、ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ（ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を用いて相同性の高い遺伝子の検索を行った。遺伝子解析は、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮＶｅｒ．５．１（ソフトウエア開発株式会社）およびＭＥＧＡ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙＧｅｎｅｔｉｃｓＡｎａｌｙｓｉｓ社）を用いて行った。この実験の結果を表７に示す。

＜実施例２＞単離細菌のバイオフィルム形成能の測定
５ｍＬの液体Ｌ培地に表７に示した各菌株を植菌し、濁度ＯＤ₆₀₀＝０．３になるまで前培養した。フェノール分解性５菌株は、終濃度１０ｍｇ／Ｌのフェノールを含むＬ培地、Ｈｏａｇｌａｎｄ培地、ＢＭ培地を、ナフタレン分解性６菌株は終濃度３０ｍｇ／Ｌのナフタレンを含むＬ培地、Ｈｏａｇｌａｎｄ培地、ＢＭ培地それぞれ３００μＬを遠心チューブに用意して、前培養液を植菌し、２５℃の温室内で静置培養した。培養開始から２４時間後及び４８時間後に遠心チューブ内の培養液を取り除き、３５０μＬ蒸留水１回洗浄した後、０．１％クリスタルバイオレット溶液４００μＬをチューブに加えて２０分間染色した。染色液を取り除き、４５０μＬの蒸留水で１回洗浄した後、自然乾燥させた。さらに５００μＬの９５%エタノールを添加し、６０分間抽出をおこなった。抽出溶液を９５%エタノール溶液で適度に希釈し、５９０ｎｍにおける吸光度の測定値をバイオフィルム活性とした。

その結果、図１に示されるように、フェノール分解能を有するＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．Ｐ２２株（以下、Ｒ−Ｐ２２株と表す）及びＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｓｐ．Ｐ２３株（Ａ−Ｐ２３株と表す）が、特にＬ培地において２４時間培養で高いバイオフィルム形成量を示した。また４８時間後のバイオフィルム形成量は減少した（図２）。

また、ナフタレン分解能を有する菌株についてもフィルム形成は確認されたが、フェノール分解能を有する菌株と比較すると、フィルム形成量は少なかった。ナフタレン分解能を有する菌株のフィルム形成能（２４時間培養後）を図３に示す。

＜実施例３＞単離細菌のアオウキクサへの付着評価
１）アオウキクサ付着細菌数の計測
北海道大学付属植物園幽庭湖から採取し、蒸留水で洗浄したアオウキクサ（Ｌｅｍｎａｐｅｒｐｕｓｉｌｌａ）数十株を、０．５％ＮａＣｌＯ及び０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００を含む水溶液に入れて１０分間緩やかに撹拌した後、同溶液を捨て、さらに滅菌済みの蒸留水を用いて１分間の撹拌を２回行い、アオウキクサを滅菌した。

表７に示した菌株からＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ．ｓｐ．Ｐ２株（以下、Ｐ−Ｐ２株と表す）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．Ｐ１１ｃ株（以下、Ｒ−Ｐ１１ｃ株と表す）及びＡ−Ｐ２３株を選択し、それぞれＬ固形培地に生育させて形成させたコロニーを５ｍＬの液体Ｌ培地に植菌し、振とう培養（２５℃、１７０ｒｐｍ、２４時間）を行い、前培養液を調製した。１００ｍＬ容のフラスコへ滅菌した５０ｍＬのＨｏａｇｌａｎｄ培地、ＢＭ培地、Ｌ培地をそれぞれ用意し、滅菌済みのアオウキクサを入れ、さらにＯＤ_６００＝０．３に調製した前培養液を１％植菌し、２５℃で４８時間静置培養を行った。

培養後、アオウキクサを回収して５００μＬの５ｍｇ／Ｌトリポリリン酸ナトリウム溶液を加えたチューブへ入れた後、同溶液を捨て、再び５００μＬの同溶液を新たに加えてアオウキクサの表面を洗浄した。さらに５００μＬの同溶液を加え、超音波処理及び攪拌処理を行って、アオウキクサへ付着した細菌を溶液中に遊離させた。この溶液をL培地で希釈し、５０μＬをＬ固形培地へ塗布し、形成されたコロニー数を計測した。また、培養後の培養液の浮遊細胞濁度（ＯＤ_６００）を測定した。

その結果、培養開始から４８時間後に、Ｐ−Ｐ２株とＡ−Ｐ２３株において、アオウキクサと共に培養することで培養液の浮遊細胞濁度が１％ほどに減少した（Ａ−Ｐ２３株について、図４）。

一方、Ｒ−Ｐ１１ｃ株では、浮遊細胞濁度の変化は確認されなかった。また、アオウキクサへの付着菌数は、３種類の微生物の何れもアオウキクサ1株あたり１×１０⁹〜１×１０¹⁰ＣＦＵｓの付着細菌数が確認された。またアオウキクサへの付着菌数は、２４時間後に比べて４８時間後にはおよそ２倍に増えていた。

また、培養終了後に回収したアオウキクサの水分をふき取った後に、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅ（Ｐｉ、緑）又はＳｙｔｏ９（Ｓ９、赤）各２５０μＬを含む蛍光色素混合液０．５ｍＬに入れて、５分間、蛍光染色した。Ｐｉ及びＳ９を用いた蛍光染色により、植物体表面はＰｉ及びＳ９を共に取り込むことでオレンジに染色され、生菌は緑に染色され、死菌は赤に染色される。５分後、アオウキクサのみを取り出し、蛍光顕微鏡（ＢＺ９０００ＫＥＹＥＮＣＥ）を用いて観察（対物レンズ×２０）した。その結果（写真）を図５に示す。

滅菌したアオウキクサの表面はオレンジに染色される（図５のパネルＥ）が、Ｐ−Ｐ２株（図５のパネルＡとＣ）、及びＡ−Ｐ２３株（図５のパネルＢとＤ）では、緑に染色された生菌がアオウキクサの表面に観察された。特に、Ｐ−Ｐ２株では、培養２４時間後に比較して培養４８時間後に明らかに多くの生菌がアオウキクサに付着していることが確認された。

＜実施例４＞Ａ−Ｐ２３株の特性解析
１）菌種同定のための生理学試験
ＢａｃｔｏＴｒｙｐｔｉｃＳｏｙＢｒｏｔｈ（ＴＳＢ）を含む固形寒天培地にＡ−Ｐ２３株を接種し、２５℃で２４時間培養して形成させた数十個のコロニーをまとめて、滅菌した０．８５％ＮａＣｌ水溶液へ懸濁した。この溶液をマクファーランド濁度０．５（ＯＤ５５０＝０．１２５）に希釈して、ＩＤ３２ＥＡＰＩシステム（日本ＢＩＯＭＥＲＩＥＵＸ社）用のキットプレートに５５μＬずつ注入した。さらにＯＤＣ、ＡＤＨ、ＬＤＣ、ＵＲＥ、ＬＡＲＬ、ＧＡＴ及び５ＫＧのカップにミネラルオイルを２滴ずつ滴下して、３７℃、２４時間インキュベーター内で静置した。２４時間後、ＩＮＤのカップへＪａｍｅｓ試薬を加えた。成績の読み取りは判定表に従って目視でおこなった。

その結果、Ｐ−ＡＰ２３株は、インドール生産、Ｌ−Ａｓｐａｒｔｉｃ−ａｌｌｙｌａｍｉｄａｓｅ、Ｇｌｕｃｏｓｅの酸性化について疑陽性であった。また、この表現型を元にＡＰＩシステムデーターベース検索を行った結果、Ａ−Ｐ２３株はＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｂａｕｍａｎｎｉｉと近種（９９．９％の相同性）の微生物であると推察された。しかし、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｂａｕｍａｎｎｉｉではフェノールの分解活性や植物根への付着活性に関する報告はなく、Ａ−Ｐ２３株はＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属細菌の新種であると判断された。

２）分解汚染物質の特異性
固形Ｌ寒天培地上のＡ−Ｐ２３株コロニーを５ｍＬの液体Ｌ培地へ植菌し、振とう培養（２５℃、１５０ｒｐｍ、２４時間）して、前培養液を調製した。各炭化水素（フェノール、ベンゼン、トルエン、ナフタレン、エタノール、グルコース）５００ｍｇ／Ｌを含む５ｍＬのＢＭ液体培地（ナフタレンのみ、別途５０ｍｇ／ＬのＢＭ液体培地を追加して）用意し、前培養液を１％植菌し、振とう培養（２５℃、１５０ｒｐｍ）して、濁度上昇の有無を目視により確認した。培養開始から１日目、および５日目の濁度変化の有無を表８に示す。

表８に示される様に、Ａ−Ｐ２３株は、フェノールとナフタレンを炭素源とする培地において濁度上昇が観察されたが、グルコース、トルエン又はベンゼンを炭素源とする培地では濁度上昇は観察されなかった。

３）アオウキクサとの共培養によるフェノール分解活性
固形Ｌ寒天培地上のＡ−Ｐ２３株コロニーを５ｍＬの液体Ｌ培地へ植菌し、振とう培養（２５℃、１５０ｒｐｍ、２４時間）して、前培養液を調製した。この前培養液から遠心操作（１９００×ｇ、５分、２０℃) により集菌し、１ｍＬのＨｏａｇｌａｎｄ培地で菌体を洗浄後、ＯＤ６００＝１５の懸濁液／Ｈｏａｇｌａｎｄ培地を調製した。１００ｍＬ容の三角フラスコに、２０ｍｇ／Ｌのフェノールを含む５０ｍＬのＨｏａｇｌａｎｄ培地を用意し、実施例３の１）と同様にして用意した滅菌したアオウキクサを３０株ずつ加えた。ここへ前記懸濁液１ｍＬを添加し、人工気象器内（２５℃、８５００ルクス、１６時間：明−８時間暗）で４８時間静置培養した。４８時間後、４０ｍｇ／Ｌのフェノールを添加した新たな５０ｍＬのＨｏａｇｌａｎｄ培地へアオウキクサ２０株のみを移した。

アオウキクサを新たな培地に移した時点を０時間とし、４時間又は８時間毎にゆるく攪拌しながら培養液を２５０μＬ採取し、遠心分離（１３０００×ｇ、１０分、２０℃）して回収した上清中のフェノール残存量を、実施例１−２）−１．と同様にしてＨＰＬＣを用いて測定した。４０時間を経過したときに、採取された培地と等量の新鮮なＨｏａｇｌａｎｄ培地を加え、さらに終濃度４０ｍｇ／Ｌとなるように新たにフェノールを加えた。この時点を新たに０時間とし、上記と同様のサンプリング、フェノール残存量の測定、培地及びフェノールの補充を、２回繰り返した。コントロールは、滅菌処理していないアオウキクサ、及び滅菌処理をしたアオウキクサを用意した。この実験によるフェノール残存量の変化を図６に示す。

滅菌処理したアオウキクサのみの培養では、残存フェノール量は殆ど変化しなかった。一方、Ａ−Ｐ２３株の接種の有無について比較すると、１サイクル目では、Ａ−Ｐ２３株を接種した系（図６の○）と滅菌処理をしていないアオウキクサ、すなわち常在菌を含むアオウキクサ（図６の●）ではその除去率に差は見られなかったが、２サイクル目ではフェノール除去率に差が生じ、さらに３サイクル目に入ると滅菌処理をしていないアオウキクサではフェノールの減少は殆ど認められなかった。

４）アオアウキクサの生育への影響
１００ｍL容の三角フラスコに２０ｍｇ・Lのフェノールを含むＨｏａｇｌａｎｄ培地５０ｍLを用意し、アオウキクサを３０株ずつ加え、さらに前記３）で調製したＯＤ６００＝１５の懸濁液／Ｈｏａｇｌａｎｄ培地を添加して、人工気象器内（２５℃、８５００ルクス、１６時間：明−８時間暗）で静置培養し、一定時間後、アオウキクサの増加数及び根の長さを測定した。

Ａ−Ｐ２３株を接種した培地における１６０時間培養後のアオウキクサの増殖は、Ａ−Ｐ２３株を摂取しなかった培地におけるアオウキクサの増殖のそれの１．７倍に達した（図７）。

また、１６０時間培養後のアオウキクサの根の伸長の様子を図８に示した。滅菌処理をしないアオウキクサ、Ａ−Ｐ２３株を接種した株、及びＡ−Ｐ２３株を接種しなかった株の根の成長は、培養開始後約１００時間を過ぎた頃より根の長さに変化が現れ、１６０時間培養後の上記３株のそれぞれの根の長さの平均値は、４．２ｃｍ、３．７５ｃｍ及び６．５ｃｍと、Ａ−Ｐ２３株の接種によって根の伸長が抑制されることが確認された。

アオウキクサから分離されたフェノール分解能を有する微生物株のバイオフィルム形成能（培養２４時間）の測定結果を示すグラフである。図中、Ｐ２〜Ｐ２４ａはそれぞれ表７に示された微生物株を表す。アオウキクサから分離された細菌のフェノールを含む培地におけるバイオフィルム形成能（培養４８時間）の測定結果を示すグラフである。図中、Ｐ２〜Ｐ２４ａはそれぞれ表７に示された微生物株を表す。アオウキクサから分離されたナフタレン分解能を有する微生物株のバイオフィルム形成能（培養２４時間）の測定結果を示すグラフである。図中、Ｎ１−ｂ〜Ｎ１２−ｂはそれぞれ表７に示された微生物株を表す。Ａ−Ｐ２３株をアオウキクサと共に培養したときの培養液における浮遊細胞濁度の現象を示す図（写真）である。蛍光色素を用いてアオウキクサと共にＡ−Ｐ２３株を培養したときの、アオウキクサの根圏に付着したＡ−Ｐ２３株を示す蛍光顕微鏡観察結果（写真）である。Ａ−Ｐ２３株をアオウキクサと共培養したときのフェノール分解活性の経時的変化を示すグラフである。図中、▲が滅菌したアオウキクサのみを、●が常在菌を有するアオウキクサを、○がＡ−Ｐ２３株を接種したアオウキクサを、それぞれ示す。フェノールを含む培地におけるアオウキクサの生育に対するＡ−Ｐ２３株の影響を示す図（写真）である。図中、左がＡ−Ｐ２３株を接種したアオウキクサを、右が滅菌したアオウキクサのみを示す。フェノールを含む培地におけるアオウキクサの生育（根の伸展）に対するＡ−Ｐ２３株の影響を示す図（写真）である。図中、ａが常在菌を有するアオウキクサを、ｂがＡ−Ｐ２３株を接種したアオウキクサを、ｃが滅菌したアオウキクサのみを示す。

Claims

水酸基を有する単環式芳香族化合物又は芳香族環の開裂反応によって芳香族環上に水酸基が生じる多環式芳香族化合物に対して分解能を有する、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属微生物。
ベンゼンに対する分解能を示さない、請求項１に記載のアシネトバクター属微生物。
水生植物の根圏微生物である、請求項１又は２に記載のアシネトバクター属微生物。
水生植物がウキクサ科（Ｌｅｍｎａｃｅａｅ）植物である、請求項３に記載のアシネトバクター属微生物。
ウキクサ科植物がアオウキクサ（Ｌｅｍｎａｐｅｒｐｕｓｉｌｌａ）又はウキクサ（Ｓｐｉｒｏｄｅｌａｐｏｌｙｒｒｈｉｚａ）である、請求項４に記載のアシネトバクター属微生物。
受託番号ＮＩＴＥＰ−５２３として受託された、アシネトバクター属微生物。
請求項１〜６の何れかに記載のアシネトバクター属微生物を含む、水酸基を有する単環式芳香族化合物又は芳香族環の開裂反応によって芳香族環上に水酸基が生じる多環式芳香族化合物を分解処理するための生物製剤。
請求項１〜６の何れかに記載のアシネトバクター属微生物とウキクサ科（Ｌｅｍｎａｃｅａｅ）植物とからなる、水酸基を有する単環式芳香族化合物又は芳香族環の開裂反応によって芳香族環上に水酸基が生じる多環式芳香族化合物を分解処理するための生物製剤。
ウキクサ科植物がアオウキクサ（Ｌｅｍｎａｐｅｒｐｕｓｉｌｌａ）又はウキクサ（Ｓｐｉｒｏｄｅｌａｐｏｌｙｒｒｈｉｚａ）である、請求項８に記載のフェノール及び／又はナフタレン分解処理用生物製剤。
請求項１〜６のいずれかに記載のアシネトバクター属微生物と水酸基を有する単環式芳香族化合物若しくは芳香族環の開裂反応によって芳香族環上に水酸基が生じる多環式芳香族化合物によって汚染された水若しくは土壌とを接触させる工程ａ）を含む、前記汚染された水若しくは土壌に含まれる水酸基を有する単環式芳香族化合物若しくは芳香族環の開裂反応によって芳香族環上に水酸基が生じる多環式芳香族化合物を分解除去する方法。
工程ａ）が、前記汚染された水若しくは土壌に請求項７〜９の何れかに記載の生物製剤を投与することで、アシネトバクター属微生物と水酸基を有する単環式芳香族化合物若しくは芳香族環の開裂反応によって芳香族環上に水酸基が生じる多環式芳香族化合物によって汚染された水若しくは土壌とを接触させる工程である、請求項１０に記載の方法。
請求項１〜６のいずれかに記載のアシネトバクター属微生物と水酸基を有する単環式芳香族化合物若しくは芳香族環の開裂反応によって芳香族環上に水酸基が生じる多環式芳香族化合物によって汚染された水若しくは土壌とを接触させる工程ａ）、及び前記汚染された水若しくは土壌に含まれる水酸基を有する単環式芳香族化合物若しくは芳香族環の開裂反応によって芳香族環上に水酸基が生じる多環式芳香族化合物を分解除去する工程ｂ）を含む、前記汚染された水若しくは土壌の浄化方法。
工程ａ）が、前記汚染された水若しくは土壌に請求項７〜９の何れかに記載の生物製剤を投与することで、アシネトバクター属微生物と水酸基を有する単環式芳香族化合物若しくは芳香族環の開裂反応によって芳香族環上に水酸基が生じる多環式芳香族化合物によって汚染された水若しくは土壌とを接触させる工程である、請求項１２に記載の浄化方法。