CN116769683B - 可同时实现水体脱氮和重金属去除的苍白杆菌j-22 - Google Patents
可同时实现水体脱氮和重金属去除的苍白杆菌j-22 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株可同时实现水体脱氮和重金属去除的苍白杆菌J‑22，属于微生物技术领域。该苍白杆菌J‑22已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.27416，保藏日期为2023年5月23日，保藏地址为中国北京。本发明筛选得到的苍白杆菌J‑22能够在多种重金属存在的情况下实现水体脱氮，同时能够将Hg（Ⅱ）转化成汞蒸气实现水体中Hg（Ⅱ）的去除，此外还能够吸附Cd（Ⅱ）和Cr（Ⅵ）实现水体中Cd（Ⅱ）和Cr（Ⅵ）的去除，具有可同时去除多种污染物、操作简单、费用低等优点，在营养盐‑重金属复合污染废水的处理方面具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株可同时实现水体脱氮和重金属去除的苍白杆菌J-22，属于微生物技术领域。
背景技术
复合污染相比单一污染往往具有较高的生物毒性，营养盐-重金属复合污染已经成为河口与近海普遍存在的污染问题。目前，针对复合污染的研究多集中于两种或两种以上污染物对生物的联合毒性方面。
养殖水体中氨氮（NH4 +）、亚硝氮（NO2 -）和硝氮（NO3 -）等氮素含量普遍超标，多年来一直排在众多污染物首位，不但制约了水产养殖业的发展，也是沿海富营养化的重要原因之一。特别是NH4 +和NO2 -，是海水养殖过程中的重点监测指标，0.1mg/L以上的NH4 +和NO2 -便会影响生物的生长发育，引起免疫功能障碍，导致养殖动物脏器损伤甚至死亡。控制水体中的无机氮含量是维持养殖水质的重要手段之一，同时也是保障养殖生物健康与品质的重要手段。
重金属由于易生物富集、具有高毒性、持久性、难降解等特点，已被公认为对环境产生重大危害的污染物。海洋中的部分重金属，即使在较低的浓度也会直接或间接危害海洋生物，进而损害海洋生态系统健康，甚至通过食物链放大还会对人体健康构成极大威胁。汞是在常温、常压下唯一以液态存在的金属，且易蒸发出汞蒸气，从水体中逸散至大气。汞能在微小剂量下对生物和人体健康造成损害，并且会通过影响微生物作用对环境造成损害。
微生物的氮代谢在净化水质、维持水生态健康中起到至关重要的作用，特别是在营养相对丰富的河口和近岸海域，陆源有机质及水生动物排泄物在微生物作用下由有机氮转变为NH4 +，少部分NH4 +在硝化细菌的作用下硝化为NO2 -和NO3 -，再在反硝化细菌作用下由NO2 -和NO3 -转化为N2，实现水体脱氮。反硝化作用被认为是修复自然水体和废水中氮污染的关键步骤。但微生物的硝化反硝化过程受多种因素影响，如碳源、重金属、抗生素等。已有研究表明，汞会影响水体和沉积物的群落组成，包括参与氮代谢的硝化和反硝化细菌的比例，同时，微生物群落的硝化、反硝化作用也会影响SAs的代谢。
硝化、反硝化和厌氧氨氧化是氮循环过程中的三个关键过程，重金属是影响这三个过程的最复杂因素之一。重金属会影响污水体和沉积物中的优势菌群，Hg2+也会抑制微生物的硝化反硝化作用，造成脱氮性能的降低。部分具有氨氧化或反硝化功能的细菌可以吸附去除水体中的重金属，如嗜热反硝化细菌Chelatococcus daeguensis TAD1能将Cr6+还原为Cr3+，同时去除环境中的NO3 --N，但其他重金属的存在（Cu、Zn、Ni）会抑制Cr6+的还原。另外，也有同时去除无机氮和Fe2+、Mn2+等重金属的单菌株，但目前对兼具Hg去除和脱氮能力的菌株研究较少。
发明内容
本发明的目的在于提供一株可同时实现水体脱氮（包括NH4 +和NO3 -）和重金属（包括Hg（Ⅱ）、Cd（Ⅱ）和Cr（Ⅵ））去除的苍白杆菌。
为了实现上述目标，本发明采用如下技术方案：
一株可同时实现水体脱氮和重金属去除的苍白杆菌J-22，所述苍白杆菌J-22筛选自山东烟台夹河入海口，可同时实现水体脱氮和水中Hg（Ⅱ）、Cd（Ⅱ）、Cr（Ⅵ）的去除，该菌株分类命名为小麦苍白杆菌Ochrobactrum tritici，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 27416，保藏日期为2023年 5月 23日，保藏地址为中国北京。
本发明的有益之处在于：
（1）本发明筛选得到的苍白杆菌J-22能够在多种重金属存在的情况下实现水体脱氮，同时能够将Hg（Ⅱ）转化成汞蒸气实现水体中Hg（Ⅱ）的去除，此外还能够吸附Cd（Ⅱ）和Cr（Ⅵ）实现水体中Cd（Ⅱ）和Cr（Ⅵ）的去除，具有可同时去除多种污染物、操作简单、费用低等优点，在营养盐-重金属复合污染废水的处理方面具有很好的应用前景；
（2）本发明筛选得到的苍白杆菌J-22在海水、淡水中均能实现水体脱氮和重金属的去除。
附图说明
图1是本发明筛选得到的苍白杆菌J-22的电镜扫描图；
图2是以NH4 +-N为唯一氮源时，本发明筛选得到的苍白杆菌J-22的脱氮效果图；
图3是以NH4 +-N为唯一氮源时，本发明筛选得到的苍白杆菌J-22的重金属去除效果图；
图4是以NO3 --N为唯一氮源时，本发明筛选得到的苍白杆菌J-22的脱氮效果图；
图5是以NO3 --N为唯一氮源时，本发明筛选得到的苍白杆菌J-22的重金属去除效果图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一、菌株的富集与筛选
兼具重金属抗性和脱氮能力的菌株的富集
从山东烟台夹河入海口处采集沉积物，取2g采集的沉积物，加入到含有10μM Hg（Ⅱ）、100μM Cd（Ⅱ）和100μM Cr（Ⅵ）的硝酸盐培养基中，于30℃、140rpm培养箱中培养5d，然后吸取5mL浑浊培养液，转移至新的含有10μM Hg（Ⅱ）、100μM Cd（Ⅱ）和100μM Cr（Ⅵ）的硝酸盐培养基中，同样条件培养5d，重复5次，富集兼具重金属抗性和脱氮能力的菌株。
硝酸盐培养基的配制方法如下：硝酸钠 0.607g，柠檬酸钠 3.58g，磷酸二氢钠0.25g，磷酸氢二钾 0.75g，七水硫酸镁 0.05g，一水硫酸锰 0.01g，七水硫酸亚铁 0.01g，蒸馏水 1L，用2M氢氧化钠调节pH值至7.0，120℃高压灭菌15min。
兼具重金属抗性和脱氮能力的菌株的筛选
将富集到的兼具重金属抗性和脱氮能力的菌株用0.9%的无菌NaCl溶液稀释至不同梯度，均匀涂布于LB固体培养基上和2216E固体培养基上，30℃恒温培养48h，挑选平板上的单菌落，进行扩增和保藏。
LB固体培养基的配制方法如下：胰蛋白胨 10g，酵母浸膏 5g，氯化钠 10g，琼脂10g，蒸馏水 1L，120℃高压灭菌15min。
2216E固体培养基的配制方法如下：蛋白胨 5g，酵母膏 1g，磷酸高铁 0.1g，琼脂10g，陈海水 1L，120℃高压灭菌15min。
兼具脱氮和重金属去除能力的菌株的筛选
将上一步筛选得到的单菌落分别接种于LB液体培养基中和2216E液体培养基中，于30℃、140rpm培养箱中培养12h，再分别接种至含有10μM Hg（Ⅱ）、100μM Cd（Ⅱ）和100μMCr（Ⅵ）的硝酸盐培养基和氨氮培养基中，30℃、140rpm培养3d，静置10min，取上清液离心，分别检测离心后所得上清液中的氨氮、硝态氮和Hg（Ⅱ）、Cd（Ⅱ）、Cr（Ⅵ）3种重金属浓度，以氨氮、硝态氮、Hg（Ⅱ）、Cd（Ⅱ）和Cr（Ⅵ）的浓度均最低为筛选目标，最终筛选出兼具脱氮和重金属去除能力的菌株J-22。
LB液体培养基的配制方法如下：胰蛋白胨 10g，酵母浸膏 5g，氯化钠 10g，蒸馏水1L，120℃高压灭菌15min。
2216E液体培养基的配制方法如下：蛋白胨 5g，酵母膏 1g，磷酸高铁 0.1g，陈海水 1L，120℃高压灭菌15min。
硝酸盐培养基的配制方法如下：硝酸钠 0.607g，柠檬酸钠 3.58g，磷酸二氢钠0.25g，磷酸氢二钾 0.75g，七水硫酸镁 0.05g，一水硫酸锰 0.01g，七水硫酸亚铁 0.01g，蒸馏水 1L，用2M氢氧化钠调节pH值至7.0，120℃高压灭菌15min。
氨氮培养基的配制方法如下：硫酸铵 0.471g，柠檬酸钠 3.58g，磷酸二氢钠0.25g，磷酸氢二钾 0.75g，七水硫酸镁 0.05g，一水硫酸锰 0.01g，七水硫酸亚铁 0.01g，蒸馏水 1L，用2M氢氧化钠调节pH值至7.0，120℃高压灭菌15min。
氨氮、硝态氮的检测参照《海洋监测规范》第四部分：海水分析（GB17378.4-1998）。
Hg（Ⅱ）、Cd（Ⅱ）、Cr（Ⅵ）3种重金属检测采用Thermo Scientific iCAP Qc ICP-MS检测，RF功率1550W，QCell 4.2L/min，冷却气14L/min，KED电压3V，驻留时间100ms，雾化气1.02L/min，中心管2.5mm。
二、菌株的形态特征、生长特性和种属鉴定
菌株的形态特征
经观察，在LB固体培养基上，菌株J-22为乳白色饱满圆形菌落，边缘光滑明显；在扫描电镜下，菌株J-22聚集行为明显，呈现长1.5-2.0μm、宽0.4-0.5μm的椭圆形或短杆状，见图1。
菌株的生长特性
经试验，菌株J-22既可在淡水中生长，也可在海水中生长，最适生长温度为32℃，最适生长pH值为7.0-8.0。
菌株的种属鉴定
经16S rRNA序列分析比对，菌株J-22与小麦苍白杆菌Ochrobactrum tritici相似度最高，高达100%。
综合菌株形态、生长特性和16S rRNA基因序列，菌株J-22被鉴定为小麦苍白杆菌Ochrobactrum triticiO，已于2023年 5月 23日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 27416，保藏地址为中国北京。
三、检测苍白杆菌J-22净化污水的效果
菌体收集和清洗
将苍白杆菌J-22接种至LB液体培养基中，30℃、140rpm培养12h，6000rpm离心3min获得大量菌体，用0.9%无菌氯化钠溶液清洗菌体3遍，获得干净的苍白杆菌J-22菌体。
苍白杆菌J-22净化污水试验
分别在含有10μM Hg（Ⅱ）、100μM Cd（Ⅱ）和100μM Cr（Ⅵ）的硝酸盐培养基和氨氮培养基中加入干净的苍白杆菌J-22菌体，并使菌体浓度达到108CFU/mL。30℃、140rpm培养，每12h取样，分别检测菌株浓度、氨氮浓度和硝态氮浓度，培养48h后，取上清液，10000rpm离心1min，收集上清，0.44μm滤膜过滤，检测上清中Hg（Ⅱ）、Cd（Ⅱ）和Cr（Ⅵ）的浓度。
检测结果
菌株浓度、氨氮浓度和硝态氮浓度的检测结果分别见表1、表2和表3。
Hg（Ⅱ）、Cd（Ⅱ）和Cr（Ⅵ）浓度的检测结果见表4。
表1 菌株浓度（OD600）的检测结果
| 0h | 12h | 24h | 36h | 48h | 60h | 72h | 84h | |
| 硝酸盐培养基 | 0.20 | 0.24 | 0.25 | 0.98 | 0.96 | 0.90 | 0.77 | 0.81 |
| 氨氮培养基 | 0.20 | 0.48 | 1.72 | 1.35 | 1.60 | 1.30 | 1.21 | 1.31 |
表2 氨氮浓度的检测结果（mg/L）
| 0h | 12h | 24h | 36h | 48h | 60h | 72h | 84h | |
| 氨氮培养基 | 280.18 | 239.05 | 40.82 | 16.64 | 28.75 | 13.06 | 50.46 | 50.01 |
表3硝态氮浓度的检测结果（mg/L）
| 0h | 12h | 24h | 36h | 48h | 60h | 72h | 84h | |
| 硝酸盐培养基 | 147.89 | 139.40 | 112.16 | 71.14 | 77.72 | 67.96 | 70.62 | 64.64 |
表4 Hg（Ⅱ）、Cd（Ⅱ）和Cr（Ⅵ）浓度的检测结果（μM）
| Hg（Ⅱ）的浓度 | Cd（Ⅱ）的浓度 | Cr（Ⅵ）的浓度 | |
| 硝酸盐培养基 | 0.875 | 29.67 | 49.03 |
| 氨氮培养基 | 0.277 | 27.70 | 38.80 |
由表1可知：苍白杆菌J-22能够利用氨氮和硝态氮作为唯一氮源生长，对氨氮的利用效率较高，24h内可以达到最大浓度，对硝态氮的利用效率相对较低，36h内达到最大浓度。
由表2可知：苍白杆菌J-22能够快速去除水体中的高浓度氨氮。
由表3可知：苍白杆菌J-22能够去除水体中的硝态氮。
由表4可知：苍白杆菌J-22在氨氮培养基和硝态氮培养基中均能够有效降低水体中Hg（Ⅱ）、Cd（Ⅱ）和Cr（Ⅵ）的浓度。
4、计算氮去除率和重金属去除率
氮去除率和重金属去除率均按以下公式进行计算：
R=（C 0-C t ）÷C 0×100%
式中：R为去除率，C 0为初始浓度，C t 为t小时的浓度。
氨氮去除率和硝态氮去除率的计算结果见表5和表6。
重金属去除率的计算结果见表7。
表5 氨氮去除率的计算结果（%）
| 0h | 12h | 24h | 36h | 48h | 60h | 72h | 84h | |
| 氨氮培养基 | 0 | 14.68 | 85.43 | 94.06 | 89.74 | 95.34 | 81.99 | 82.15 |
表6硝态氮去除率的计算结果（%）
| 0h | 12h | 24h | 36h | 48h | 60h | 72h | 84h | |
| 硝酸盐培养基 | 0 | 5.74 | 24.16 | 51.90 | 47.45 | 54.05 | 52.25 | 56.29 |
表7 Hg（Ⅱ）、Cd（Ⅱ）和Cr（Ⅵ）去除率的计算结果
| Hg（Ⅱ）去除率 | Cd（Ⅱ）去除率 | Cr（Ⅵ）去除率 | |
| 硝酸盐培养基 | 91.25% | 70.33% | 50.97% |
| 氨氮培养基 | 97.23% | 72.30% | 61.20% |
分别对氨氮去除率、硝态氮去除率、重金属去除率以及细菌生长OD值作图。
以NH4 +-N为唯一氮源时（氨氮培养基）得到的苍白杆菌J-22的生长情况以及脱氮效果见图2，得到的苍白杆菌J-22的重金属去除效果见图3。
以NO3 --N为唯一氮源时（硝酸盐培养基）得到的苍白杆菌J-22的生长情况以及脱氮效果见图4，得到的苍白杆菌J-22的重金属去除效果见图5。
由图2和图4可知：本发明筛选得到的苍白杆菌J-22对氨氮的去除率最高可达95.34%，对硝态氮的去除率最高可达56.29%。
由图3可知：以氨氮为唯一氮源时，本发明筛选得到的苍白杆菌J-22对Hg（Ⅱ）、Cd（Ⅱ）、Cr（Ⅵ）的去除率分别为97.23%、72.30%、61.20%。
由图5可知：以硝态氮为唯一氮源时，本发明筛选得到的苍白杆菌J-22对Hg（Ⅱ）、Cd（Ⅱ）、Cr（Ⅵ）的去除率分别为91.25%、70.33%、50.97%。
综上，本发明筛选得到的苍白杆菌J-22能够在多种重金属存在的情况下实现水体脱氮，同时还能够去除Hg（Ⅱ）、Cd（Ⅱ）和Cr（Ⅵ）等重金属，具有可同时去除多种污染物、操作简单、费用低等优点，在营养盐-重金属复合污染废水的处理方面具有很好的应用前景。
需要说明的是，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明技术方案所引申出的显而易见变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (1)
1.一株可同时实现水体脱氮和重金属去除的苍白杆菌J-22，所述苍白杆菌J-22的分类命名为小麦苍白杆菌（Ochrobactrum tritici），筛选自山东烟台夹河入海口，可同时实现水体脱氮和水中Hg（Ⅱ）、Cd（Ⅱ）、Cr（Ⅵ）的去除，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 27416，保藏日期为2023年 5月 23日，保藏地址为中国北京。
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| WO2009145074A1 (ja) * | 2008-05-29 | 2009-12-03 | 日本たばこ産業株式会社 | 植物体中の重金属含量を低減する細菌 |
| CN109082387A (zh) * | 2018-03-14 | 2018-12-25 | 重庆理工大学 | 一种可低温去除高氨氮的异养硝化-好氧反硝化复合菌剂及其应用 |
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