CN108192837A - 一株高效降解纤维素的微生物菌株及其应用 - Google Patents

一株高效降解纤维素的微生物菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物领域，具体公开了一株高效降解纤维素的微生物菌株BW‑1701及其应用。所述微生物菌株BW‑1701为一种巨大芽孢杆菌，保藏编号为：CGMCC No.15079。该菌株产生纤维素酶的能力强，且所产生的纤维素酶能保持很高的活性，能够对农作物秸秆、园林废弃物等富含纤维素的原料进行发酵降解。利用该菌株对农作物秸秆和园林废弃物进行发酵处理，可以加速腐熟速度，强化腐熟程度，生成有机肥时间短，肥效好。可以减少秸秆焚烧、资源浪费、环境污染，并提高了废弃生物资源的利用率，有明显的经济、生态意义。

Description

一株高效降解纤维素的微生物菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体地说，涉及一株高效降解纤维素的微生物菌株及其应用。
背景技术
中国是农业大国，拥有地球上7％的耕地，农作物秸秆产量相当可观，每年可达6亿吨。在过去，农作物秸秆可以用作饲料，喂养牲畜；可以当做燃料，取暖做饭；可以当做修建房屋的材料；可以发酵沤肥，还田。但是随着农业机械化普及程度提高，用于喂养牲畜、取暖做饭和修建房屋的农作物秸秆越来越少，更多地会被就地焚烧。焚烧秸秆不仅会造成资源浪费，损失有机质、N、S，还会形成浓烟雾，影响航空安全，并破坏大气环境。所以寻找一种健康、环保、可持续的农作物秸秆利用方式势在必行。
农作物副产品、园林废弃物等均含有很高的纤维素成分，是一种潜在的自然资源，在全球资源危机的今天，将难以降解的秸秆类、园林废弃物类等资源通过生物发酵的方式转化为可利用资源如饲料、肥料等，不但可避免这些废弃物对环境的污染，还可以通过资源化利用获得经济效益和社会效益。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一株高效降解纤维素的微生物菌株及其应用。
为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一株巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BW-1701，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏日期为2017年12月18日，保藏编号为：CGMCC No.15079。以下将所述菌株简称为菌株BW-1701。
本发明所提供的菌株的形态特征为：白色或乳白色，圆形，边缘整齐，表面有褶皱突起，易挑取，无金属光泽，正反面颜色一致。
本发明所提供的菌株BW-1701产生纤维素酶的能力强，且所产生的纤维素酶能保持很高的活性，可对纤维素实现高效的降解。
本发明所述菌株经由强化饲喂粗饲料的健康竹鼠粪便筛选分离得到，具体过程如下：
取强化饲喂粗饲料7-10天的健康竹鼠粪便5g，放入100mL富集培养基中37℃、180rpm振荡培养72h后，再以5％接种量接种至新鲜培养基继续培养；如此反复富集培养三次。将该富集培养液进行梯度稀释，按照平板涂布法涂布至以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的CMC-刚果红培养基上，37℃培养2-3天。从平板上选择具有透明圈的菌落进行复筛，从中继续选出透明圈显著菌落，在LB平板上划线分离纯化得到单菌落。将得到的单菌落分别测定纤维素酶活，选择纤维素降解效果最好、纤维素酶活最高的菌株，命名为BW-1701。
本发明将分离得到的菌株提取总DNA后进行PCR扩增，扩增后的序列提交GenBank进行比对，发现与Bacillus megaterium strain OSS4有99％的相似性，另外结合生理生化鉴定结果，最后确定菌株BW-1701为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。
本发明对所述菌株BW-1701进行纤维素酶活性测定，发现菌株BW-1701的20h培养液的纤维素酶活为130U/mL，纤维素酶活测定方法参考GB 20287-2006农用微生物菌剂。
第二方面，本发明提供了所述菌株BW-1701的发酵培养方法，具体为：实验室摇床培养方法：挑取斜面菌种至发酵培养基中，在33～37℃，160～200rpm振荡培养16～24h；发酵罐培养方法：以3-10％(v/v)接种到发酵培养基中，在33～37℃，通气量0.3～1.0(v/v)，压力0.1～0.2MPa，pH 6.7～7.2培养16～24h。
其中，所述发酵培养基的配方为：酵母膏1～3g/L，蛋白胨0.5～2g/L，蔗糖0.5～2g/L，硫酸铵0.5～1g/L，硫酸亚铁0.1～1g/L，pH6.7～7.2。
第三方面，本发明采用本领域常规方法，将本发明所提供的菌株，经活化、一级种子液、二级种子液、固态培养、干燥等工序，得到目的菌种。
进一步地，本发明提供了含有所述菌株BW-1701的发酵液或培养液，或由所述菌株BW-1701制备得到的发酵液或培养液。
本发明在具体实施方式中，对所述发酵液或培养液的应用进行了示例性描述，但在实际应用中，应用方式并不局限于此。
第四方面，本发明提供了所述菌株BW-1701或其发酵液或培养液在纤维素降解方面的应用。本发明所述菌株、所述发酵液或所述培养液可广泛用于含纤维素物质的预处理，为纤维素物质的产业化提供巨大帮助，例如加速农作物秸秆、园林废弃物等有机质的纤维素的降解。
所述应用可表现为在制备秸秆类有机物料腐熟剂中的应用。具体为：利用所述菌株扩繁的菌种或由所述菌株制备的发酵液或培养液，与微生物菌剂载体混合，制备秸秆类有机物料腐熟剂。
所述应用还可表现为制备的秸秆类有机物料腐熟剂，对富含纤维素的物料进行处理。
作为优选，前述制备秸秆类有机物料腐熟剂过程中，所述的微生物菌剂载体的水分≤20％，有机质≥60％，养分2～4％，吸水率50～80g/100g载体，菌体去除率50～80％，载体负载量100～150mg/L。
其中，养分指(氮+五氧化二磷+氧化钾)的质量分数(以烘干基计)。
所述微生物菌剂载体的制备方法为将餐厨废弃物经机械分选和破碎挤压后，调节C/N比为25～30∶1、水分为40～60％、pH值为6.0～7.5并接种高温好氧菌，对餐厨废弃物进行高温好氧发酵处理，将发酵结束的物料进行筛分粉碎后，得到微生物菌剂载体。
更为具体地，所述制备方法包括如下步骤：
(1)对餐厨废弃物进行收集；
(2)对收集的餐厨废弃物进行机械分选，将分选得到的餐厨加工固体废料和食物残渣投入下一步处理；
(3)对步骤(2)获得的物料进行破碎挤压，至粒径≤1cm；
(4)向步骤(3)获得的物料中加入调整材调节C/N比为25～30∶1，调节水分含量为40～60％，调节pH值为6.0～7.5；
其中，所使用的调整材为稻壳粉、花生壳、菇渣、中药渣的一种或多种；
(5)向步骤(4)获得物料中接种高温好氧菌，在温度60～80℃、压力-40～-10Pa、含水量40～60％、物料搅拌设备转速10～30rpm的条件下对餐厨废弃物进行高温好氧发酵处理，发酵时间为8～16h；
搅拌过程中通氧量根据物料发酵过程自动调节；
其中，所使用的高温好氧菌选自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、细黄链霉菌、米曲霉、黑曲霉中的一种或多种，优选为枯草芽孢杆菌、和/或细黄链霉菌、和/或黑曲霉；
(6)将发酵结束的物料进行6mm×6mm的筛网筛分，对筛上物进行粉碎处理，粉碎至5mm后，与前述过筛物料混合，得到微生物菌剂载体。
进一步地，前述应用具体可为，将所述秸秆类有机物料腐熟剂以1：200～1000的质量比添加到富含纤维素的物料中，混合均匀，调节水分至50～60％，腐熟7～10天。在所述秸秆类有机物料腐熟剂中，巨大芽孢杆菌BW-1701的有效活菌数≥1.0亿/g，纤维素酶≥50U/g。
所述富含纤维素的物料例如可以是农作物秸秆或园林废弃物。
可选地，所述农作物秸秆为水稻、小麦、玉米、大豆、花生等秸秆，含水量15～50％，粉碎至3～5cm。所述园林废弃物来自于园林绿化乔木及灌木枝条、树叶，水分约20～60％，粉碎至3～5cm。
本发明的有益效果至少在于：
本发明提供了一株巨大芽孢杆菌菌株BW-1701，该菌株产生纤维素酶的能力强，且所产生的纤维素酶能保持很高的活性，能够对农作物秸秆、园林废弃物等富含纤维素的原料进行发酵降解。利用该菌株对农作物秸秆和园林废弃物进行发酵处理，可以加速腐熟速度，强化腐熟程度，生成有机肥时间短，肥效好。可以减少秸秆焚烧、资源浪费、环境污染，并提高了废弃生物资源的利用率，有明显的经济、生态意义。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例用于说明利用本发明所提供的巨大芽孢杆菌菌株如何制备发酵液培养液。
1、原料
斜面培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂15～20g/L，pH 7.2～7.4。
发酵培养基：酵母膏1～3g/L，蛋白胨0.5～2g/L，蔗糖0.5～2g/L，硫酸铵0.5～1g/L，硫酸亚铁0.1～1g/L，pH 6.7～7.2。
2、制备方法：
挑取斜面菌种至发酵培养基中，装液量100mL/500mL三角瓶，在37℃，180rpm振荡培养20h。
3、发酵液中纤维素酶活的检测
(1)纤维素酶活检测方法(参考NY 609-2002有机物料腐熟剂)
a、试剂和溶液
底物溶液：准确称取0.625g羧甲基纤维素钠盐，溶于100.0mL磷酸钠缓冲液(0.2mol/L，pH 6.0)，加热搅拌使之溶解。
DNS显色剂：称取10.0g 3,5-二硝基水杨酸溶于蒸馏水中，加入20.0g氢氧化钠、200.0g酒石酸钾钠和500.0mL水，加热溶解后再加入重蒸酚2.0g、无水亚硫酸钠0.5g待全部溶解后冷却，定容至1000.0mL。
b、仪器设备：分光光度计、电子天平、振荡器、培养箱。
c、标准曲线绘制：
标准葡萄糖溶液：用蒸馏水溶解25.0mg葡萄糖定容至25.0mL。
标准曲线绘制：取5支带有20.0mL刻度的试管，按照下表取试剂。
每管中各加1.0mL 2.0mol/L氢氧化钠溶液和2.0mL DNS显色液，摇匀后置于沸水浴中准确加热5.0min后，流水冷却，蒸馏水定容至20.0mL，摇匀后于490nm处测定各管的吸光度(OD)值，以葡萄糖的微克(μg)数为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。
原样酶液：称取5.0g样品用蒸馏水稀释10倍，充分振荡，静置30min，过滤，其滤液即为原样酶液。
d、测定步骤：取3至带有20.0mL刻度的试管，1支作为空白对照，其余2支作为平行样品管。样品管中加1.0mL原样酶液，然后3支试管中分别加入4.0mL已预热至60℃的底物溶液，在60℃的水浴锅中反应20min取出，每管立即加入1.0mL 2.0mol/L氢氧化钠溶液和2.0mL DNS显色液，摇匀后在对照管中再加入1.0mL原样酶液。将3支试管放入沸水浴中，显色5min后立即取出，流水冷却，定容至20.0mL，用分光光度计于490nm处测其OD值。
e、纤维素酶活计算：根据标准曲线换算成葡萄糖微克(μg)数，并按照以下公式计算：
式中：U——样品的酶活力，单位为微克每分钟(μg/min)；
M0——对照葡萄糖量，单位为微克(μg)；
M1——分解后样品质量，单位为微克(μg)；
20——酶与底物反应时间，单位为分钟(min)。
1mL原样酶液，每分钟产生1μg葡萄糖定义为1个酶活力单位。
(2)纤维素酶活检测结果
菌株BW-1701振荡培养20h发酵液纤维素酶活为178.24U。
实施例2
本实施例用于说明实施例1所制备的发酵液或培养液在农作物秸秆腐熟中的应用，
1、腐熟目标：
玉米秸秆，被粉碎至3～5cm，水分约35％。
2、方法
2.1制备微生物菌剂载体
餐厨垃圾收运车收集得到的餐厨废弃物，依次采用以下步骤进行处理：
(1)使用收料机对餐厨废弃物进行收集；
(2)使用振动格栅分选机(专利号：ZL200910085142.1)进行机械分选：将分选得到的餐厨废液投入综合污水处理，将分选得到的纸制品、木制品等投入焚烧，将分选得到的餐厨加工固体废料和食物残渣投入下一步处理；
(3)使用破袋布料机对步骤(2)获得的物料进行破碎挤压，至粒径≤1cm；
(4)向步骤(3)获得的物料中加入调整材调节C/N比为25～30∶1、调节水分含量为55％，调节pH值为6.0～7.5；
其中，所使用的调整材为稻壳粉和中药渣，二者质量比为4:1；
调节pH值采用乙酸或氨水；
(5)向步骤(4)获得物料中接种高温好氧菌，在温度65℃、压力-15Pa、含水量40～50％、物料搅拌设备转速10～15rpm、搅拌过程中通氧量根据物料发酵过程自动调节，对餐厨废弃物进行高温好氧发酵处理，发酵时间为8～10h；
其中，所使用的高温好氧菌选自地衣芽孢杆菌和米曲霉。
(6)将发酵结束的物料进行6mm×6mm的筛网筛分，对筛上物进行粉碎处理，粉碎至5mm后，与前述过筛物料混合，得到微生物菌剂载体。
2.2制备秸秆类有机物料腐熟剂
将100L实施例1所得菌株BW-1701的发酵液与900kg前述步骤制备的微生物菌剂载体混合均匀，得到秸秆类有机物料腐熟剂。其中所述秸秆类有机物料腐熟剂中，有益活菌数≥0.5亿/克，纤维素酶活≥30U/g，水分≤35％，pH为5.5～8.5。
2.3堆肥腐熟
将秸秆类有机物料腐熟剂，以1:500的比例添加至腐熟目标中，混合均匀，调节水分至50～60％，开始堆肥。
按照上述方法操作，在7天完成腐熟，小麦发芽率为95.32％。秸秆腐解度测定方法参考NY/T 2722-2015秸秆腐熟菌剂腐解效果评价技术规程。添加秸秆类有机物料腐熟剂的7天秸秆失重率为39.84％，空白对照的7天秸秆失重率为6.45％。添加秸秆类有机物料腐熟剂的7天秸秆断裂拉力下降比率为55.42％，空白对照的7天秸秆失重率为8.19％。
实施例3
本实施例与实施例2的区别在于，腐熟目标不同，本实施例的腐熟目标为园林废弃物：来自于园林绿化乔木及灌木枝条、树叶，被粉碎至3～5cm，水分约35％。
按照相同方法操作，在10天完成腐熟，白菜种子发芽率指数91.45％。白菜种子发芽率指数测定方法参考DB11/T 840-2011园林绿化废弃物堆肥技术规程。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一株巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株BW-1701，保藏编号为：CGMCCNo.15079。
2.权利要求1所述菌株BW-1701的发酵培养方法，其特征在于，实验室摇床培养方法：以3～10％(v/v)接种到发酵培养基中，在33～37℃，160～200rpm振荡培养16～24h；发酵罐培养方法：以3～10％(v/v)接种到发酵培养基中，在33～37℃，通气量0.5(v/v)，压力0.1～0.2MPa，pH 6.7～7.2培养16～24h。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：酵母膏1～3g/L，蛋白胨0.5～2g/L，蔗糖0.5～2g/L，硫酸铵0.5～1g/L，硫酸亚铁0.1～1g/，pH 6.7～7.2。
4.含有权利要求1所述菌株BW-1701的发酵液或培养液。
5.由权利要求1所述菌株BW-1701制备或由权利要求2或3所述方法制备得到的发酵液或培养液。
6.权利要求1所述的菌株或权利要求4或5所述的发酵液或培养液在纤维素降解方面的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，利用权利要求1所述菌株扩繁的菌种或权利要求4或5所述的发酵液或培养液，与微生物菌剂载体混合，制备秸秆类有机物料腐熟剂，对富含纤维素的物料进行处理。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述微生物菌剂载体的水分≤20％，有机质≥60％，养分2～4％，吸水率50～80g/100g载体，菌体去除率50～80％，载体负载量100～150mg/L。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述微生物菌剂载体的制备方法为将餐厨废弃物经机械分选和破碎挤压后，调节C/N比为25～30∶1、水分为40～60％、pH值为6.0～7.5并接种高温好氧菌，对餐厨废弃物进行高温好氧发酵处理，将发酵结束的物料进行筛分粉碎后，得到微生物菌剂载体。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将所述秸秆类有机物料腐熟剂以1：200～1000的比例添加到富含纤维素的物料中，混合均匀，调节水分至50～60％，腐熟7～10天。
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