CN103215312A

CN103215312A - 真菌固体发酵培养基

Info

Publication number: CN103215312A
Application number: CN2013101109736A
Authority: CN
Inventors: 冯晓晓; 刘诚; 章初龙; 林福呈
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2013-03-31
Filing date: 2013-03-31
Publication date: 2013-07-24
Anticipated expiration: 2033-03-31
Also published as: CN103215312B

Abstract

本发明属于微生物发酵领域，提供了一种用于真菌发酵培养，尤其是固体发酵培养的培养基。具体而言，本发明公开了一种真菌固体发酵培养基，其由以下成分组成：熟小米100g、珍珠岩19~21g和营养液24~26ml；熟小米的制备方法为：在100g生小米中加入55~65ml土豆汁，用灭菌锅于120~122℃加热14~16分钟，得熟小米；营养液的制备方法为：将葡萄糖0.5~3g、脱脂大豆粉5~7g，蛋白胨1~5g，磷酸二氢钾0.3~0.55g，硫酸镁0.15g，用25~50ml的土豆汁溶解后调节pH至6，得营养液。采用该培养基能够快速有效地得到产气霉属真菌固体发酵的产物。

Description

真菌固体发酵培养基

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，提供了一种用于真菌发酵培养，尤其是固体发酵培养的培养基。

背景技术

固体发酵（solid-state fermentation，SSF）是在指没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度固态基质中，用一种或多种微生物进行的一个生物反应过程(Singhania et al., 2009)。从生物反应过程的角度考虑，固态发酵是以气相为连续相的生物反应过程，更为具体的，我们可以认为固体发酵是一种在培养基为固体微粒的情况下进行利用的一种发酵手段(Mitchell et al., 2000b)。固体发酵与液体发酵相比有许多显著的优点：培养基更为便宜、低能耗、投入成本低、更容易控制发酵体积、产生的废水较少(Pandey A et al.,2000; Pandey A et al., 2008)。以培养基的用料为例，用于固体发酵的培养基比较单纯，一般来说，例如谷物类、小麦麸、小麦草、大宗谷物或农产品等均可被使用，所以发酵原料成本较经济。

对于大多数的微生物而言，其生长的环境并没有大量的自由水存在。即便是海洋中的微生物，其中有超过98%的种类是生长于水下表层的固体介质中的，对于真菌而言，所有已知的真菌中只有不到1%的种类是在海洋中发现的(Carlile & Watkinson, 1994; Kelecom, 2002)。也正是因为如此，固体发酵能够较好地模拟真菌的生长环境，从而适用于真菌的生物发酵。

到目前为止，有许多人研究了影响固体发酵进程的生物化学和工程学的因素(Mitchell et al., 2000a, 2000b; Pandey, 2003)，但是SSF中的许多技术问题仍然没有得到解决(H?lker et al., 2004)。即便如此，SSF在生物技术中的运用已经很广泛了(Raimbault,1998; Pandey et al., 2000, 2001)。在许多综述中可以查到运用SSF技术生产的一些生物产品或代谢物，如次级代谢产物(Balakrishnan & Pandey, 1996; Robinson et al., 2001)、黄曲霉素(Barrios-Gonzalez & Tomasini, 1996)、工程酶(Pandey et al., 1999)、细菌酶(Babu & Satyanarayana, 1996)、淀粉糖化酶(Selvakumar et al., 1998)、纤维素酶(Cen & Xia, 1999)、中国食品(Han et al., 2001)、木质素的生物转化(Tengerdy &Szakacs, 2003)、食用菌种植和天然香料的生产(Wang, 1999)、富蛋白食物(Nigam & Singh, 1996)等。

关于固体发酵工艺的优化，一般情况下，都会从温度、培养基、初始pH、含水量、接种量、种龄、发酵时间等角度考虑，而关于培养基，更是涉及了碳源、氮源和无机盐的选择(Davood Mazaheri et al., 2012; Tamires Carvalho dos Santos et al., 2012; Madhuri Narra et al., 2012; FatmaChaari et al., 2012)。以含水量为例，在蛋白酶和脂肪酶的生产中，高含水量会降低培养基质的多孔性，从而妨碍气体的交换，而低含水量则会减少微生物的生长，从而使酶的产量下降(Mahanta etal., 2008)。再以发酵时间（发酵进程）对固体发酵的影响为例，Biazus等人在采用玉米麦芽糖进行研究的时候发现，发酵开始时，产物的量很低，而随后产物的量就迅速上升直到达到最大值，在达到最大产物量后，产物的生成就受到了抑制，并且产物的活性也会下降(Biazus et al., 2006)。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种真菌固体发酵培养基，采用该培养基能够快速有效地得到产气霉属真菌固体发酵的产物。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种真菌固体发酵培养基，其由以下成分组成：熟小米100g、珍珠岩19~21g和营养液24~26ml；

熟小米的制备方法为：在100g生小米中加入55~65ml土豆汁，用灭菌锅于120~122℃加热14~16分钟，得熟小米；

营养液的制备方法为：将葡萄糖0.5~3g、脱脂大豆粉5~7g，蛋白胨（peptone）1~5g，磷酸二氢钾0.3~0.55g，硫酸镁0.15g，用25~50ml的土豆汁溶解后调节pH至6，得营养液（呈糊状）。

作为本发明的真菌固体发酵培养基的改进：其由以下成分组成：熟小米100g、珍珠岩20g和营养液25ml；

熟小米的制备方法为：在100g生小米中加入60ml土豆汁，用灭菌锅，于121℃加热15分钟，得熟小米；

营养液的制备方法为：将葡萄糖0.5g，脱脂大豆粉7g，蛋白胨（peptone）1.0g，磷酸二氢钾0.55g，硫酸镁0.15g，用25ml的土豆汁溶解后调节pH至6，得营养液（呈糊状）。

作为本发明的真菌固体发酵培养基的进一步改进：营养液的制备方法中用浓度为4.8~5.2mol/L（最佳为5mol/L）的NaOH溶液调节pH。

在本发明中，土豆汁采用常规方法制备而得，即，土豆汁的制备方法为：将200g新鲜去皮土豆切块，用900~990 ml的水煮沸30min后用4层纱布过滤，滤液自然冷却至室温后用蒸馏水定容至1L备用，pH为自然pH。

本发明的真菌固体发酵培养基的制备方法为：将营养液、熟小米和珍珠岩均匀搅拌后，于121℃高压（1.05×10⁵Pa）灭菌锅灭菌20分钟后备用。

在本发明中：

用于制备真菌固体发酵培养基的各项成分可通过市购的方式获得，例如，脱脂大豆粉可购自河北省秦皇岛金海食品工业有限公司生产的食品级的低温脱脂大豆粉；蛋白胨可购自生工公司生产的PN5247型号的peptone。

此外，本发明采用DNS法、钼酸铵比色法、中性甲醛法、质量差法测定了固体发酵过程中相关生物量参数（浸出液中的还原糖、总糖、溶磷和氨基氮及氨氮，质量损失率，含水量）在不同发酵时间的水平，最终得到了这些相关生物量参数随发酵进程进行改变的发酵曲线。通过对发酵曲线的综合分析推测在摇瓶小量固体发酵时，菌株的对数生长期开始于发酵起始后的第5-6天，结束于发酵起始后的第8天。

本发明中涉及的真菌，尤其是植物内生真菌，是定殖于健康植物组织中并不表现出病害症状的一类真菌，这些内生真菌从分类上来讲，主要是一些子囊菌，也有一些是担子菌和卵菌。它们能与植物建立起互利共生的互作关系。这种共生互作为寄主植物带来的好处是使植物增加了对病原微生物的抵抗能力，促进了植物的生长和对逆境的忍受能力。

本发明中涉及的产气霉属Muscodor内生真菌，已知分布于中美洲、南美洲、东亚、东南亚和澳大利亚的热带、亚热带植物中。它们的一个重要特征就是能够产生易挥发的有机化合物（volatile organic compounds, VOCs），这些VOCs能够抑制甚至杀死许多的植物病原菌、线虫甚至昆虫和一些与人类疾病有关的病原菌。

真菌例如选用保藏号为CGMCC 2864的内生真菌Muscodor sp. ZJLQ070。备注说明：ZJLQ070在专利200910153511.6有告知，保藏号为CGMCC2864。

本发明具有如下优点：

1、首次尝试产气霉属真菌的固体发酵，开创先例；

2、能够快速有效地得到产气霉属真菌固体发酵的产物。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1：不同生小米与土豆汁比例下的固体发酵情况。

A：生小米：土豆汁=1：0.75、营养液土豆汁用量为50%，培养基有明显的结块；B：生小米:土豆汁=1：0.50、营养液土豆汁用量为25%，无法观测到菌体的生长；C：生小米:土豆汁=1：0.60、营养液土豆汁用量为25%，菌体生长且体系松散不结块；D：生小米:土豆汁=1：0.60、营养液土豆汁用量为25%，可见到分布均匀的白色菌丝（即，D是C的放大图）。

图2：发酵10天时发酵体系的质量损失率（%）与营养液初始pH的关系。

图3：发酵10天时发酵体系的质量损失率（%）与种龄的关系。

图4 ：25℃下ZJLQ070菌株在PDA平皿上的生长速率。

图5：发酵10天时发酵体系的质量损失率（%）与接种量的关系。

图6：发酵10天时发酵体系的质量损失率（%）与发酵温度的关系。

图7：发酵产物浸出液中还原糖的含量与发酵时间的关系。

图8：发酵产物浸出液中总糖的含量与发酵时间的关系。

图9：发酵产物浸出液中溶磷的含量与发酵时间的关系。

图10：发酵产物浸出液中氨氮的含量与发酵时间的关系。

图11：发酵体系中的含水量与发酵时间的关系。

图12：发酵体系的质量损失率与发酵时间的关系。

图13 ：ZJLQ070菌株固体发酵曲线。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1：固体发酵培养基含水量的确定

在固体发酵中，培养基的含水量将影响微生物的生长，含水量过高，将在培养过程中形成结块，从而影响发酵的进行。本实施例中，通过改变熟小米的制备中，生小米与土豆汁之间的料水比以及营养液中土豆汁的用量来改变培养基的含水量。

按照上述设计理论，在进行了大量初步选择培养基的基础上，选用了以下三个培养基配方进行试验，从而确定培养基中较优含水量。

配方一的固体发酵培养基由以下成分组成：熟小米100g，珍珠岩20g，营养液25ml。

制备过程如下：

1）、熟小米制备：100g生小米中加入75ml土豆汁，用灭菌锅于121℃加热15分钟，得熟小米。

2）、营养液制备：

将葡萄糖3.0g，低温脱脂大豆粉5.0g，蛋白胨（peptone）5.0g，磷酸二氢钾0.3g，硫酸镁0.15g，用50ml的土豆汁溶解后再用浓度为5mol/L的NaOH溶液调节pH至6，得营养液（糊状）。

3）、将25ml营养液与100g熟小米和20g珍珠岩混拌在一起，121℃高压（1.05*10⁵Pa）灭菌锅灭菌20分钟后备用。

备注说明：按照上述配方一所得的培养基，灭菌前（即，步骤3）中营养液、熟小米和珍珠岩混拌后）的理论含水量约为54.62% 。

配方二的固体发酵培养基由以下成分组成：熟小米100g，珍珠岩20g，营养液25ml。

制备过程如下：

1）、熟小米制备：100g生小米中加入50ml土豆汁，用灭菌锅于121℃加热15分钟，得熟小米。

2）、营养液制备：

将葡萄糖3.0g，低温脱脂大豆粉5.0g，蛋白胨（peptone）5.0g，磷酸二氢钾0.3g，硫酸镁0.15g，用25ml土豆汁溶解后再用浓度为5mol/L的NaOH溶液调节pH至6，得营养液（糊状）。

备注说明：按照上述配方二所得的培养基，灭菌前（即，步骤3）中营养液、熟小米和珍珠岩混拌后）的理论含水量约为28.35%。

配方三的固体发酵培养基由以下成分组成：熟小米100g，珍珠岩20g，营养液25ml。

制备过程如下：

1）、熟小米制备：100g生小米中加入60ml土豆汁，用灭菌锅于121℃加热15分钟，得熟小米。

2）、营养液制备：

备注说明：按照上述配方三所得的培养基，灭菌前（即，步骤3）中营养液、熟小米和珍珠岩混拌后）的理论含水量约为40.64%。

分别用配方一、配方二和配方三所得的培养基进行固体发酵，即将内生真菌Muscodor sp. ZJLQ070以接种量0.2%（质量%）于25℃下黑暗培养发酵，发酵时间10天，定期（每隔24小时）观察固体发酵体系中真菌的生长状况：

实验结果如图1所示：

当用配方一所得的培养基时，即当生小米与土豆汁的料水比为1：0.75、营养液土豆汁用量为50%（灭菌前理论含水量为54.62%）时，发酵7天时，ZJLQ070生长旺盛，且培养基有明显的结块，并且结块不易消除（图1A）；

当用配方二所得的培养基时，即料水比仅为1：0.5、营养液土豆汁用量为25%（灭菌前理论含水量为28.35%）时，ZJLQ070将难以生长，在发酵体系中无法观测到菌体的生长（图1B）；

当用配方三所得的培养基时，即在料水比为1：0.6、营养液土豆汁用量为25%（灭菌前理论含水量为40.64%）时，有较好的发酵结果，在发酵7天时，能够见到明显的菌体生长，且培养体系松散不结块（图1C），仔细观看，可见到培养基中分布均匀的白色菌丝（图1D）。

因此，适用于ZJLQ070菌株固体发酵的料水比为生小米：土豆汁=1：0.60，即配方三，此时的灭菌前理论含水量为40.64%。

实施例2：固体发酵培养基配方的优化

采用的培养基为确定了含水量的固体发酵培养基，其配方如实施例1中配方三。

培养基的优化采用正交设计，如表1所示，以葡萄糖的用量为因素一，蛋白胨的用量为因素二，低温脱脂大豆粉的用量为因素三，磷酸二氢钾的用量为因素四，进行4因素3水平的正交设计。因素与水平、以及正交设计表如下表2：

表1：4因素3水平的正交设计表（单位：克）：

水平\因素	葡萄糖	蛋白胨	低温脱脂大豆粉	磷酸二氢钾
					水平1	0.50	1.00	1.00	0.05
水平2	3.00	4.00	4.00	0.30
					水平3	5.50	7.00	7.00	0.55

表2：不同因素的正交设计表（单位：克）：

试验\因素	葡萄糖	蛋白胨	低温脱脂大豆粉	磷酸二氢钾
					1	0.50	1.00	1.00	0.05
2	0.50	4.00	4.00	0.30
					3	0.50	7.00	7.00	0.55
4	3.00	1.00	4.00	0.55
					5	3.00	4.00	7.00	0.05
6	3.00	7.00	1.00	0.30
					7	5.50	1.00	7.00	0.30
8	5.50	4.00	1.00	0.55
					9	5.50	7.00	4.00	0.05

本实施例共9组处理，每组处理进行3次平行进行，并且每组各自以不接种ZJLQ070菌株的空白培养基为对照。实验条件：装料量100g每1L容量锥形瓶，接种量0.2%（质量%，即相对于装料量的质量比），于25℃下黑暗培养发酵，发酵时间10天。发酵结束后计算每组的质量损失率，用DPS统计软件对数据做方差分析。

所得数据首先用DPS统计软件对数据进行极差分析，结果如表3。由极差分析可知，4个因素都对固体发酵的结果有着影响，其中葡萄糖和蛋白胨的用量对实验结果的影响较大，而相对的，低温脱脂大豆粉和磷酸二氢钾的用量对实验结果的影响则较小。由于因素三（低温脱脂大豆粉的用量）的极差值最小，因此就以因素三为空白列进行方差分析，结果如表4。由方差分析表可知，和极差分析相吻合的是因素一（葡萄糖的用量）和因素二（蛋白胨的用量）对固体发酵的结果影响较大，且两个因素均达到了极显著的水平（p﹤0.01）。同样的，和极差分析相吻合的是因素四（磷酸二氢钾的用量）对固体发酵结果的影响相对较少，不过也接近了显著水平（p=0.0517127＞0.05）。此外，虽然因素三（低温脱脂大豆粉的用量）对实验结果的影响是最小的，但是在极差分析中，这一因素也的确是在水平三（用量为7%）的时候能够产生实验中最好的发酵结果。

固体发酵培养基优化正交设计的极差分析、正交设计的方差分析，如下表3和表4所示。

表3 、“固体发酵培养基优化”正交设计的极差分析

表4、“固体发酵培养基优化”正交设计的方差分析

综合以上的分析，可以得到优化的ZJLQ070固体发酵培养基的配方具体如下：

配方四的真菌固体发酵培养基：由以下成分组成：熟小米100g，珍珠岩20g，营养液25ml。

制备过程如下：

2）、营养液制备：

将葡萄糖0.5g，低温脱脂大豆粉7.0g，蛋白胨（peptone）1.0g，磷酸二氢钾0.55g，硫酸镁0.15g，用25ml土豆汁溶解后再用浓度为5mol/L的NaOH溶液调节pH至6，制备成营养液（糊状）。

备注说明：按照上述配方所得的培养基，灭菌前（即，步骤3）中营养液、熟小米和珍珠岩混拌后）的理论含水量约为40.64%。

实施例3、固体发酵培养基中营养液最适pH

在固体发酵培养基中，葡萄糖、低温脱脂大豆粉、蛋白胨、磷酸二氢钾和硫酸镁用土豆汁溶解后就配制成了培养基的营养液部分，营养液会拌入到熟小米和珍珠岩组成的颗粒体系中，成为培养基的重要组成部分。针对营养液的初始pH进行单因素试验。

本实施例中用NaOH溶液（5mol/L）和盐酸溶液（分析级盐酸与纯水按照1:1体积比）调节营养液pH。设置7组不同的pH处理，分别为4、5、5.5、6、6.5、7、8。每组处理进行3次平行实验，并且每组各自以不接种ZJLQ070菌株的空白培养基为对照。实验条件：装料量100g（即固体发酵培养基的用量为100g）每1L容量的锥形瓶，接种量0.2%（质量%），于25℃下黑暗培养发酵，发酵时间10天。发酵结束后计算每组的质量损失率。用DPS统计软件做方差分析。

实验结果如图2所示，在营养液pH为6.00的时候，固体发酵有最好的效果，发酵10天后体系的质量损失率达到了2.27%。比较高pH值和低pH值的数据可以发现，ZJLQ070菌株的固体发酵对酸性体系更为敏感，营养液pH下降所带来的影响要大于其pH上升所带来的影响，这可能与该菌本身生长所需的最适pH有关。

备注说明：质量损失率（%）采用常规的质量损失法进行检测。

实验数据用DPS统计软件得到的单因素试验的方差分析结果见表5。在样本方差齐性检验中，由Bartlett卡方检验的p=0.66644（p＞0.05），说明实验数据可以采用方差分析的方法进行统计分析。而由方差分析中的p=0.3409＞0.05，可以得知营养液的pH与固体发酵结果之间的关系是不显著的。虽然方差分析的结果显示是不显著的，但是根据数据结果，pH=6.00时，可以得到最好的发酵结果，推测营养液的最适pH在6.00左右。

综上，可以得到如下结论：ZJLQ070的固体发酵培养基中营养液的最适pH在6.00左右，进行固体发酵时，宜将营养液的pH值调节至6.00附近，以获得较好的发酵效果。营养液的pH对固体发酵的影响并不显著，但是过高和过低的pH还是会降低发酵的效果，且过低的pH对发酵结果的影响更大。

营养液初始pH优化实验数据的方差分析如下表5所示。

表5、 “营养液初始pH优化实验”数据的方差分析

实施例4：固体发酵条件优化菌种种龄影响

在生物发酵的工艺中，菌种的种龄是一个重要的参数，固体发酵也不例外。在ZJLQ070菌株的固体发酵中，种子是PDA平皿培养物，因此平皿生长的时间决定了种龄。本实施例使用的培养基为经过配方优化和最适pH实验所得出的优化培养基，即，其配方为上述配方四。

本实施例设置5个不同种龄的处理，分别为3、6、9、12、15天。每组处理进行3次试平行实验，并且每组各自以不接种ZJLQ070菌株的空白培养基为对照。实验条件：装料量100g（即，真菌固体发酵培养基的量为100g）每1L容量的锥形瓶，接种量0.2%（质量%，相对于真菌固体发酵培养基而言），于25℃下黑暗培养发酵，发酵时间10天。发酵结束后计算每组的质量损失率。用DPS统计软件做单因素试验的方差分析。

实验结果如图3所示，种龄的不同对固体发酵的效果有着一定的影响的，不过影响并不大，从图上看，在种龄为6天的时候有着最好的发酵效果。

实验数据用DPS统计软件进行方差分析，结果如表6。在样本方差齐性检验中，由Bartlett卡方检验的p=0.17811（p＞0.05），说明实验数据可以采用方差分析的方法进行统计分析。而由方差分析中的p=0.1819＞0.05，可以得知种龄与固体发酵结果之间的关系是不显著的。在确定最适合的种龄时，还要考虑到菌株的生长速率。在制备固体发酵的种子时，培养温度为25℃，此时，ZJLQ070菌株的生长速率见图4。由图4可知，培养6天时的菌落直径为31.40mm。此时若作为发酵种子，考虑接种量的情况下，就需要准备较多的PDA平皿以供使用。由于方差分析显示，种龄与固体发酵结果之间的关系是不显著的，且如果同一批次需要进行较多的发酵，可以考虑延长种龄，以获得更多的种子进行试验。

综上，虽然固体发酵中所用种子的种龄与发酵效果之间的关系在统计上不显著，但是在种龄为6天的时候有着最好的发酵效果。具体在实验和生产中选择种龄时要考虑具体的情况（例如实验的设计和要求），选择合适的种龄，一般情况下，种龄的选择范围在6-10天内最为合适。

实施例5：固体发酵优化中接种量的影响

在微生物发酵中，控制合适的接种量十分重要。接种量少，微生物生长缓慢，延长了发酵周期；接种量适当增大可以缩短微生物的繁殖期，节约时间成本，也可以有效地防止杂菌污染；过大的接种量会使得微生物繁殖过快不易控制，且容易增加发酵体系中杂质的成份。本实施例中设置了5个不同的接种量的处理，分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，以上%均为%；每组处理进行3次平行实验，以不接种ZJLQ070菌株的空白培养基为对照。本实施例采用的培养基为经过实验所确定的优化培养基，即配方四。实验条件：装料量100g每1L容量的锥形瓶，于25℃下黑暗培养发酵，发酵时间为10天。发酵结束后计算每组的质量损失率。用DPS统计软件做单因素试验的方差分析。

实验结果如图5所示，随着接种量的上升，发酵10天后发酵体系的质量损失率也会上升，两者之间存在着良好的线性关系（R²=0.9712）。这一结果说明和大多数的微生物发酵一样，在ZJLQ070的固体发酵中加大接种量会加快菌株的生长和繁殖，增加了对培养基的消耗，从而使得培养体系的质量损失率增加。

实验数据用DPS统计软件进行方差分析，结果如表6。在样本方差齐性检验中，由Bartlett卡方检验的p=0.31720（p＞0.05），说明实验数据可以采用方差分析的方法进行统计分析。而由方差分析中的p=0.2258＞0.05，可以得知种龄与固体发酵结果之间的关系是不显著的。同样的，确定在发酵中的接种量也要考虑其他的因素，而不单单只根据接种量与发酵效果之间的关系。接种量大的确可以提高发酵的效率和效果，可是相对的，种子的准备就会耗费更多的人力和物力，这就需要根据实际情况来选择了。就实验阶段而言，摇瓶阶段的实验培养基较少，为了使发酵进行到能够制剂的阶段时有足够的菌量和成熟度，一般控制发酵周期在7-10天之内，在此基础上，再综合考虑种子的制备这一因素，采用0.2%-0.3%的接种量较为合适。

综上，ZJLQ070菌株的固体发酵的效果与接种量的大小存在着线性关系，试验阶段小量的固体发酵宜采用的接种量为0.2%-0.3%。

表6 、“接种量优化实验”数据的方差分析

实施例6：固体发酵优化时的发酵温度选择

发酵的温度会直接影响微生物细胞内酶的活性，进而影响微生物的生长、繁殖和代谢，因此，发酵温度是发酵工艺探索中一个必须考虑的参数。因此，在大量基础实验的前提下，预测ZJLQ070菌株在发酵温度为25℃时有最好的发酵效果。具体的实验设置7个不同的温度处理，分别为15℃、20℃、23℃、25℃、28℃、30℃、35℃。每组处理进行3次平行实验，每组各自以不接种ZJLQ070菌株的空白培养基为对照。实验采用的培养基为经过实验所确定的优化培养基。实验条件：装料量100g（即，真菌固体发酵培养基的量为100g）每1L容量的锥形瓶，接种量0.2%（质量%，相对于真菌固体发酵培养基而言），于25℃下黑暗培养发酵，发酵时间为10天。发酵结束后计算每组的质量损失率。

实验结果如图6所示，在发酵温度为23-28℃的范围内，有较好的发酵效果，并且25℃是最适合发酵的温度。而当温度低于20℃或高于30℃时，发酵效果明显下降，其原因就是在不适宜ZJLQ070生长的温度下，菌株的生长繁殖受到阻碍，甚至不能生长，因此就不能消耗掉培养基，从而导致发酵10天后的发酵体系质量损失率较低。

实施例7：ZJLQ070菌株固体发酵发酵曲线绘制

在完成了培养基的优化和发酵工艺的探索后，需要在改良培养基和发酵工艺的基础上对ZJLQ070的固体发酵的发酵进程绘制发酵曲线。曲线涉及的参数包括浸出液还原糖、浸出液总糖、浸出液溶磷、浸出液氨基氮和氨氮、含水量和质量损失率。发酵曲线的绘制进行一批次的固体发酵，采用的培养基为上述最佳培养基—配方四。

选取的发酵进程的时间点包括0天、2天、4天、6天、8天、10天、12天。以不接种ZJLQ070的空白培养基为对照。实验条件：装料量100g（即，真菌固体发酵培养基的量为100g）每1L容量的锥形瓶，接种量0.2%（质量%，相对于真菌固体发酵培养基而言），于25℃下黑暗培养发酵，发酵时间依据相应的处理。在发酵结束时，计算质量损失率，获得的发酵产物用于测定发酵体系的含水量和制备浸出液，浸出液用于测定还原糖、总糖、溶磷、氨基氮和氨氮。

1、固体发酵产物浸出液的制备：

称取发酵产物1g（记录下质量），加入纯水25-28ml，沸水浴30分钟，于12000rpm离心5分钟，取上清液。尽量挤尽沉淀中的液体，回收后并入上清液中。用双蒸水将上清液定容至30ml（记录下体积），制备成发酵产物的浸出液。

2、浸出液中还原糖和总糖含量的测定方法：

还原糖在碱性条件下加热会被氧化成糖酸，3，5-二硝基水杨酸与糖酸共热能生成棕红色氨基化合物，在一定浓度范围内，还原糖含量与颜色强度呈比例关系，符合“朗勃-比尔”定律。利用比色法在550nm处测定吸光值，依据标准曲线就可以得出还原糖的含量。

总糖的测定需要在酸性加热条件下将非还原性糖水解为还原糖，然后依据测定还原糖的方法测定总的还原糖量（原有还原糖和非还原性糖水解得到的还原糖），以此来确定总糖的含量。

DNS试剂的配制：

甲液：苯酚0.69g，NaHSO₃0.69g，溶于1.52ml的10%NaOH溶液中，稀释至6.9ml；

乙液：酒石酸钾钠25.5g，溶于30ml的10%NaOH溶液中，加入1%的3，5-二硝基水杨酸88ml，混匀；

将甲、乙两种溶液混合，装入棕色瓶中，4℃保存。

标准曲线的制作：

葡萄糖标准液（20mg/ml）的配制：

称取一水合葡萄糖（≧99.0%）2.22g，用纯水溶解并定容至100ml，4℃保存。使用前用稀释10倍，即成2mg/ml的标准液。

吸取葡萄糖标准液0ml，0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml，1.0ml，分别加入到25ml容量瓶中，补水至2ml，加入2mlDNS试剂，沸水浴5分钟，立即冷却，定容混匀，于550nm处测定吸光值，绘制标准曲线。

还原糖的测定：

吸取样品（即，步骤1所得的发酵产物的浸出液）0.1ml，加入到25ml容量瓶中，补水至2ml，加入2mlDNS试剂，沸水浴5分钟，立即冷却，定容混匀，测定OD₅₅₀，根据标准曲线计算还原糖的含量。

总糖的测定：

吸取样品5ml，加入到25ml容量瓶中，加入0.5ml的HCl（1：1），沸水浴45分钟，立即冷却，用5mol/L的NaOH调节pH至中性，定容混匀，得到处理后的样品溶液。

处理后的样品溶液用还原糖测定方法测定还原糖的含量，即为总糖的含量。

计算公式

标准曲线：Y=AX-B

还原糖含量（g/L）：Z=20*（Y+B）/A

上述公式中，Y、A 、X 、B分别代表A是曲线的斜率、B是曲线的截距、X标准曲线中的自变量即糖含量、Y是标准曲线中的因变量即OD₅₅₀。

在微生物发酵中，发酵体系里还原糖和总糖的含量是重要的发酵参数，可以直观地反映微生物的生长状况，从而便于人们判断发酵的进展。在ZJLQ070菌株的固体发酵中，菌株会利用培养基中的成份为自己提供生长和繁殖的能量，糖类物质作为主要的能源物质，在其代谢中就起到了重要的作用。绘制还原糖和总糖的发酵曲线的目的就是为了找到ZJLQ070菌株在固体发酵过程中，发酵产物的浸出液中还原糖和总糖的含量的变化规律。实验结果如下：

还原糖的发酵曲线见图7，总糖的发酵曲线见图8。由图中可以发现，总糖的含量随着发酵的进行呈下降趋势，而还原糖的含量则是先上升达到峰值后再下降，到发酵结束时，回复到了和初始时相近的水平。从两张图上分析，有两点值得注意：

第一点，还原糖的量在发酵第6天的时候达到最大值（2.88%），而在紧接着的第8天时，总糖的含量开始急剧下降。菌ZJLQ070固体发酵的对数生长期可能开始于发酵的第5或第6天，结束于发酵的第8天。

第二点值得注意的是还原糖的初始值和总糖的含量。还原糖的初始值为1.57%，而培养基配置中加入的还原糖（葡萄糖）只有0.5%。

3、浸出液中溶磷含量的测定方法：

在酸性条件下，PO₄ ^3-与钼酸铵发生反应，生成磷钼酸盐，在加入还原剂米吐尔后，高价钼还原成低价钼（蓝色）。在一定浓度内，颜色的深浅与磷的含量成比例关系，符合“朗勃-比尔”定律，因此可以采用分光光度法测定浸出液中磷的含量。

试剂：

1、钼酸铵溶液（试剂A）

称取钼酸铵20g溶解于200ml纯水中，浑浊过滤，倒入300ml浓硫酸与200ml的纯水，边加边搅拌。混匀后转移至棕色玻璃瓶中，4℃保存。

2、米吐尔溶液（试剂B）

称取米吐尔0.7g、无水硫酸钠3.5g，分别置于两个烧杯中，加少量纯水使两者溶解后混匀。加入153.5gNaHSO₃后加水溶解，稀释至700ml，摇匀过滤，转移至棕色玻璃瓶中，4℃保存。

3、10%三氯乙酸

称取500g三氯乙酸，加水至5000ml，摇匀，转移至玻璃瓶中，常温保存。

磷标准曲线的制作：

磷标准溶液的配制：

称取于105℃干燥4小时至恒重的磷酸二氢钾0.4384g，置于1000ml容量瓶中，加入20ml的0.05mol/L的H₂SO₄，溶解后定容，此时含磷量为100μg/ml。

吸取上述溶液5ml，转移至100ml容量瓶中，加入2ml的0.05mol/L的H₂SO₄，定容，此时磷含量5μg/ml。

吸取5μg/ml磷标准溶液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5ml，分别加入到10ml容量瓶中，补纯水至5ml，加入A、B试剂各1ml，沸水浴20分钟，立即冷却后加纯水定容，测定OD₆₅₀。根据吸光值和磷含量绘制标准曲线。

浸出液中磷含量的测定：

吸取浸出液5ml至100ml容量瓶中，加入10ml的10%三氯乙酸，立即轻轻振荡，使反应充分，加纯水定容，过滤。

吸取滤液2ml至10ml容量瓶中，补纯水至5ml，再加入A、B试剂各1ml，摇匀，沸水浴20分钟，立即冷却后加纯水定容，测定OD₆₅₀。

用纯水做空白对照。

计算公式

标准曲线：y=ax+b

磷含量（μg/ml）：p=（y-b）/2*25

备注说明：y=ax+b是Excel软件制作的标准曲线，x是自变量即磷含量，y是因变量OD₆₅₀，a是斜率，b是截距，通过公式可以算出相应OD值对应的磷含量。将制备样品（浸出液）的过程中的稀释倍数考虑进去进行换算，可以得到最终测得的浸出液中的磷含量p。

浸出液中溶磷含量随发酵时间的变化曲线如图9所示。随着发酵时间的进行，浸出液中所能测得的溶磷的含量是逐渐上升的，在达到一定数值后保持稳定，曲线为“S”型。在溶磷的发酵曲线制作中，所测定的是浸出液中以PO₄ ^3-形式存在磷含量。最初在培养基中加入的无机磷只有磷酸二氢钾（0.55%，即0.55g/100g），而在测定中会发现实际测得的含磷量远远低于这一数值。随着发酵的进行，浸出液中磷的含量一直上升，直到达到一定的值以后趋于稳定。

4、浸出液中氨氮含量的测定方法：

浸出液中氨氮的测定采用中性甲醛法，其原理如下：

试剂：

1、0.25mol/L的H₂SO₄；

2、18%中性甲醛：量取36-38%的甲醛溶液，与纯水按1：1配制即成；

3、酚酞指示剂：称取酚酞0.1g，加入无水乙醇溶解后稀释至100ml；

4、甲基红指示剂：称取甲基红0.1g，加入0.05mol/L的NaOH溶液7.4ml，溶解；

5、0.05mol/L的NaOH滴定液；

测定方法：

浸出液2ml（V₂）于锥形瓶中，加入纯水15ml，滴加甲基红指示剂2滴，用0.25mol/L的H₂SO₄将溶液调成红色，用0.05mol/L的NaOH溶液中和至红色消失，加入18%的中性甲醛2ml，摇匀后静置5分钟，加入酚酞指示剂5滴，用0.05mol/L的NaOH溶液滴定至为红色，记下消耗的NaOH溶液的体积V₁。

计算公式：

氨氮（mg/100ml）=V₁*0.05*14/V₂*100。

备注说明：V1代表浸出液体积，V2代表消耗的NaOH溶液的体积。

浸出液中氨氮的变化曲线如图10。由图中可知，随着发酵时间的进行，浸出液中所能测得的氨氮含量是逐渐下降。对于这张图的分析主要包括三个方面：

第一个方面，在培养基的配制中没有加入过任何的无机氮源，而加入的有机氮源的种类却很复杂（小米、低温脱脂大豆粉和蛋白胨），这些氮源中，以氨基和氨（或NH₄ ⁺）存在的氮元素在溶于浸出液中后被检测到，随着发酵进行和营养物质的消耗，氨氮的含量也就逐渐下降了。因此，曲线中氨氮的含量能间接地反映出营养物质的消耗情况。

第二个方面，在发酵进行至4-6天的时候，氨氮的含量下降明显。在同一时间段内，还原糖、总糖和溶磷的含量也有相应的变化。这里再一次地说明了固体发酵时，菌株进入对数生长期的时间在第5-6天时。

第三个方面，在发酵进行至10-12天的时候，氨氮的含量又一次地明显下降。同一时期还原糖、总糖和溶磷都没有这样的变化。

5、发酵体系含水量的测定方法：

于玻璃培养皿（质量为M₁）中称取固体发酵产物10g左右（质量为M₂），将培养皿放置于80℃鼓风干燥箱中干燥至恒重，称取培养皿和烘干后产物的总质量M₃，依据公式（M₂-（M₃-M₁））/M₂*100计算固体发酵产物的含水量。

含水量反映了发酵体系中水分的散失情况，而发酵体系的质量损失率直接反映了营养物质经过呼吸和代谢消耗的情况，从而进一步反映了微生物的生长状况。含水量的发酵曲线见图11，发酵体系质量损失率的发酵曲线见图12。

从图11可以看出，随着发酵的进行，发酵体系的含水量逐渐下降，并且含水量与发酵时间呈现出良好的线性关系（R²=0.9806）。这表明在整个发酵过程中，尽管有菌生长繁殖的影响，水分的散失还是稳定变化的，不会由于后期菌量的上升而有大幅度的变化。

分析图12，可以发现，随着发酵的进行，发酵体系的质量损失率是不断上升的。一般在发酵不进行补料的情况下，培养基中营养物质通过细胞呼吸和代谢被消耗，整个体系的质量会减轻，是正常现象。

不过从图12上还可以看出另外两个方面的问题。第一，曲线的线性呈“J”型，即指数型的曲线，这类似于微生物在理想条件下的生长曲线。由于质量损失率反映了营养物质的消耗情况，进而间接地反映了菌的数量和菌的代谢强度，所以，这条曲线表现出的“J”型线形较好地模拟了菌在固体发酵中的生长状况，因此，本实施例也能由这一参数来判断固体发酵在微生物生长这一方面的效果。第二，“J”型曲线的拐点出现在发酵进行至第8天的时候。之前在分析浸出液中还原糖和总糖的变化曲线时曾告知：菌ZJLQ070固体发酵的对数生长期可能开始于发酵的第5或第6天，结束于发酵的第8天。换言之，在第8天的时候，固体发酵中的产气霉菌的菌量已经较之前有了明显的上升。这也就解释了为什么在第8-12天这四天内质量损失率的增幅要高于前面8天的增幅。

实施例8、将配方四所述的真菌固体发酵培养基按照如下最佳发酵工艺参数进行发酵：

ZJLQ070菌株的种龄6天，接种量0.2%~0.3%（质量）%，发酵温度25℃，黑暗培养发酵；发酵时间为5-8天，从图13中给出了除含水量以外的发酵产物浸出液中还原糖、总糖、溶磷和氨氮含量的发酵曲线，以及整个发酵体系质量损失率的发酵曲线。从图上可以清楚地了解发酵过程中各个参数的变化趋势，每条曲线都会在发酵4-8天内发生明显的变化：还原糖含量在发酵6天时达到最高值；总糖含量在第8天过后急剧下降，与之相反的是发酵体系的质量损失率在发酵第8天后迅速上升；而溶磷和氨氮则分别在发酵进行的第4-6天中有加速上升和加速下降的趋势。所以，最佳的培养条件是：在摇瓶小量固体发酵时，菌株的对数生长期开始于发酵起始后的第5-6天，结束于发酵起始后的第8天。

对比例1、将实施例8配方四的熟小米制备过程中的“100g生小米中加入60ml土豆汁”改成“100g生小米中加入75ml土豆汁”，其余完全同实施例8。发酵工艺参数也同实施例8。

发酵时间为5-8天后，发酵产物浸出液中的还原糖、总糖、溶磷和氨氮含量发生变化，总糖在7天以后发生明显变化，溶磷和氨氮则在第3天就发生明显变化，故最佳的培养时间不一致，对整体发酵不利。

对比例2、将实施例8配方四的熟小米制备过程中“100g生小米中加入60ml土豆汁”改成“100g生小米中加入50ml土豆汁”，其余完全同实施例8。发酵工艺参数也同实施例8。

发酵时间为5-8天后，发酵产物浸出液中中还原糖、总糖、溶磷和氨氮含量发生变化，还原糖和总糖在6天以后发生明显变化，溶磷和氨氮则在第2天就发生明显变化，故最佳的培养时间不一致，对整体发酵不利。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.真菌固体发酵培养基，其特征是由以下成分组成：熟小米100g、珍珠岩19~21g和营养液24~26ml；

所述熟小米的制备方法为：在100g生小米中加入55~65ml土豆汁，用灭菌锅于120~122℃加热14~16分钟，得熟小米；

所述营养液的制备方法为：将葡萄糖0.5~3g、脱脂大豆粉5~7g，蛋白胨1~5g，磷酸二氢钾0.3~0.55g，硫酸镁0.15g，用25~50ml的土豆汁溶解后调节pH至6，得营养液。

2.根据权利要求1所述的真菌固体发酵培养基，其特征是由以下成分组成：熟小米100g、珍珠岩20g和营养液25ml；

所述熟小米的制备方法为：在100g生小米中加入60ml土豆汁，用灭菌锅于121℃加热15分钟，得熟小米；

所述营养液的制备方法为：将葡萄糖0.5g，脱脂大豆粉7g，蛋白胨1.0g，磷酸二氢钾0.55g，硫酸镁0.15g，用25ml的土豆汁溶解后调节pH至6，得营养液。

3.根据权利要求1或2所述的真菌固体发酵培养基，其特征是：所述营养液的制备方法中用浓度为4.8~5.2mol/L的NaOH溶液调节pH。