CN103999877A - 一种海洋细菌活菌粉剂的制备方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明是一种海洋细菌活菌粉剂的制备方法，其步骤是选用海洋细菌L₁-9制备菌株种子液，然后用装有发酵培养基的发酵罐中对L₁-9菌株种子液进行发酵，制备L₁-9菌株发酵液；按饱和吸附量向海洋细菌L₁-9的发酵液中加入载体硅藻土，使载体吸附菌体，菌体形成芽孢后，离心，沉淀烘干，即得LL₁-9菌株菌粉；向菌粉中加入稳定剂和保护剂，气流粉碎机粉碎过300目筛，密封28℃保存，即得成品海洋细菌活菌粉剂。本发明方法采用现有的海洋细菌制成菌粉剂，其可操作性强。制得的菌粉剂的性质和稳定性好，活菌数含量可以达到2.43x10¹⁰cfu/g，细度为300目，活菌粉剂对黄瓜幼苗生长具有明显的促进作用，黄瓜枯萎病有较高的防治效果。

Description

一种海洋细菌活菌粉剂的制备方法与用途

技术领域

本发明涉及一种抗菌剂的制备方法，特别是一种海洋细菌活菌粉剂的制备方法，本发明还涉及该海洋细菌活菌粉剂的用途。

背景技术

黄瓜枯萎病是在黄瓜栽培过程中经常发生的一种土传性病害，一般危及黄瓜近地面茎基处，病原菌感染幼苗后会引起黄瓜植株整株的死亡，一般以温室、大棚黄瓜及陆地的春黄瓜发生较重，而夏、秋黄瓜则发生较轻。其发病率一般为10 %～30 %，严重时高达80 %～90 %。

目前防治黄瓜枯萎病主要依靠嫁接和化学防治，使用化学防治造成的农药残留、环境污染以及因对土壤结构和土壤微生物的影响而受到局限，生物防治不仅具有无毒、无污染及残留等特点，同时还具有提高作物品质、植物抗病性并改善土壤环境等多重作用，弥补了化学防治的不足，利用生物防治防治黄瓜枯萎病日益受到国内外重视。研制微生物活菌制剂将拮抗性微生物引入土壤，防治土传病害是生物防治的重要途径。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种抗菌效果好的、制备方法简单的海洋细菌活菌粉剂的制备方法。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供了前述海洋细菌活菌粉剂的制备方法的用途。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种海洋细菌活菌粉剂的制备方法，其特点是，其步骤如下：

（1）海洋细菌L₁-9菌株种子液的制备：向活化的L₁-9菌株斜面加入9ml无菌水冲洗，用接种环充分涂刮制成菌悬液，吸取3ml接入50ml的PD培养基中在28℃，160rpm条件下摇床培养24h，调整浓度为109个细胞/mL作为种子液；

（2）发酵：用装有发酵培养基的发酵罐对L₁-9菌株种子液进行发酵，制备L₁-9菌株发酵液；发酵条件为：接种量7%(浓度为109个细胞/mL左右)、温度28℃、搅拌速度200rpm、通气量3L/min、发酵时间36h，生物量达2.40×1010cfu/mL；按饱和吸附量向海洋细菌L₁-9的发酵液中加入载体硅藻土，每间隔1h搅拌一次，使载体充分吸附菌体，48h后菌体形成芽孢后，离心，沉淀于60℃电热恒温鼓风干燥箱烘干，即得L₁-9菌株菌粉；种子培养基和发酵培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL，自然pH；

（3）成品制备：按以下重量百分比向菌粉中加入稳定剂和保护剂制成海洋细菌活菌粉剂：硅藻土10%，荧光素钠5%，糊精0.5%；气流粉碎机粉碎过300目筛，密封28℃保存。

按照本发明工艺制备的粉剂中含芽孢含量约在2.43x1010 cfu/g。

本发明中所述的海洋细菌L₁-9是中国公开专利文献CN201210463951.3公开的“海洋多粘类芽孢杆菌L₁-9发酵产物提取DEHP的方法与用途”中所公开的海洋多粘类芽孢杆菌L₁-9。该菌株淮海工学院海洋学院实验室可以对外提供。

本发明还公开了一种利用前述的制备方法制得的海洋细菌活菌粉剂对植物病原真菌的毒力测定方法，其特点是，其步骤如下：将制备得到的海洋细菌活菌粉剂加入到装有70mL PDA培养基的250ml的三角瓶中，混合均匀，制成浓度不同的含药平板，每个三角瓶为一个浓度，平均倒入3个培养皿中，为3个重复；打取直径为5mm的供试核盘菌（Sclerotinio sclerotiorum）、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solanii)、黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、菠菜早疫病菌（Alternaria solania）4种植物病原真菌菌苔，放入不同的含药平板中央，28℃下培养5d；以不加海洋细菌活菌粉剂为对照，用十字交叉法测量菌落直径，计算不同浓度的海洋细菌活菌粉剂对不同病原真菌的抑制率，查询抑制率几率值，以粉剂浓度的对数为横坐标，抑制率的机率值为纵坐标，建立L₁-9菌粉对4种植物病原真菌的毒力回归方程，计算的EC50和EC90。

本发明所述的制备方法制得的海洋细菌活菌粉剂在抑制植物病原真菌方面的用途；所述的植物病原真菌为核盘菌（Sclerotinio sclerotiorum），水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solanii)，黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum），菠菜早疫病菌（Alternaria solania）。

本发明所述的制备方法制得的海洋细菌活菌粉剂在防治黄瓜枯萎病中的用途。

与现有技术相比，本发明制备方法采用现有的海洋细菌制成活菌粉剂，其可操作性强。制得的菌粉剂的性质和稳定性好，活菌数粉剂中芽孢含量可以达到2.43x1010 cfu/g，细度为300目，对黄瓜幼苗生长的具有明显的促进作用和对黄瓜枯萎病有较高的防治效果。

具体实施方式

以下进一步对本发明的技术方案进行描述，以使本领域技术人员进一步的理解本发明，而不构成对本发明权利的限制。

实施例1，一种海洋细菌活菌粉剂的制备方法，其步骤如下：

（1）海洋细菌L₁-9菌株种子液的制备：向活化的L₁-9菌株斜面加入9ml无菌水冲洗，用接种环充分涂刮制成菌悬液，吸取3ml接入50ml的PD培养基中在28℃，160rpm条件下摇床培养24h，调整浓度为109个细胞/mL作为种子液；

（2）发酵：用装有发酵培养基的50L发酵罐对L₁-9菌株种子液进行发酵，制备L₁-9菌株发酵液；发酵条件为：接种量7%（浓度为109个细胞/mL）、温度28℃、搅拌速度200rpm、通气量3L/min、发酵时间36h，生物量达2.40×1010cfu/mL；按饱和吸附量向海洋细菌L₁-9的发酵液中加入载体硅藻土，每间隔1h搅拌一次，使载体充分吸附菌体，48h后菌体形成芽孢后，离心，沉淀于60℃电热恒温鼓风干燥箱烘干，即得L₁-9菌株菌粉；种子培养基和发酵培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL，自然pH；

（3）成品制备：按以下重量百分比向菌粉中加入稳定剂和保护剂制成海洋细菌活菌粉剂：硅藻土10%，荧光素钠5%，糊精0.5%；气流粉碎机粉碎过300目筛，密封28℃保存。按照该工艺制备的粉剂中含芽孢含量为2.43x1010 cfu/g。

实施例2，海洋细菌活菌粉剂的制备方法筛选及应用实验：

1材料与方法

1.1 菌种

由本实验室保存的海洋细菌L₁-9菌株。

核盘菌（Sclerotinio sclerotiorum），水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solanii)，黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum），菠菜早疫病菌（Alternaria solania）。

1.2 助剂

载体：膨润土、凹凸棒土、活性白土、皂土、碳酸钙、硅藻土、高岭土；

稳定剂：荧光素钠、海藻酸钠、腐植酸、黄原胶。

保护剂：糊精、羧甲基纤维素钠、十二烷基磺酸钠。

1.3培养基

（1） 海洋细菌L₁-9活化培养基以及L₁-9培养培养基：马铃薯 200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，自然pH。

（2） 种子培养基和发酵培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL，自然pH。

1.3海洋细菌L₁-9菌株种子液的制备

 向活化的L₁-9菌株斜面加入9ml无菌水冲洗，用接种环充分涂刮制成菌悬液，吸取3ml接入50ml的PD培养基中在28℃，160rpm条件下摇床培养24h，调整浓度为109个细胞/mL作为种子液。

1.4不同助剂与海洋细菌L₁-9菌株生物相容性测定

 250ml的三角瓶中加入50ml的含4%助剂的PD培养基，接种海洋细菌L₁-9菌株的种子液2ml， 28℃，160rpm的摇床中培养24h，采用平板菌落计数法测定发酵液中的活菌数，以不添加助剂的为对照，比较不同助剂对L₁-9菌株生长的影响，筛选与海洋细菌L₁-9菌株生物相容性好的助剂。

1.5载体对海洋细菌L₁-9菌株吸附量的测定

选取生物相容性好的载体各2g分别放入到100ml的烧杯中，缓慢向填充剂中滴加海洋细菌L₁-9菌株的发酵液，用玻璃棒搅拌至填充剂粉末开始聚成团状而不分散时停止添加，记录滴加到填充剂中的海洋细菌L₁-9发酵液的量，测定不同载体对海洋细菌L₁-9的饱和吸附量。每种载体做3个重复。

1.6载体配比的筛选

将海洋细菌L₁-9的新鲜干粉与载体分别按1:5,1:20,1:40的比例混合，分别在5d，10d，15d时取每种试样0.1g溶于9ml的无菌水中制成菌悬液，梯度稀释，用平板菌落计数法测定加入不同配比载体的菌悬液中海洋细菌L1-9的菌落数。

1.7稳定剂配比的筛选

将与海洋细菌L₁-9菌株生物相容性好的不同种类稳定剂按5:1,10:1,20:1的比例与L₁-9菌株母粉混匀后室温下保存，分别在5d，10d，15d，20d，取不同配比的样品，用平板菌落计数法测其菌悬液中海洋细菌L₁-9菌株的活菌数，以不加稳定剂为对照，每个配比重复3次。

1.8 保护剂的筛选

   将与海洋细菌L₁-9菌株生物相容性好的保护剂按0.5%的比例与L₁-9菌株菌粉混合均匀，加水梯度稀释，涂布在PDA平板上，放置在距254nm25瓦的紫外灯40cm处照射12h，以不加保护剂为对照，梯度稀释，采用平板菌落计数法，测定菌落数，3次重复。

1.9海洋细菌L₁-9菌株粉剂的制备工艺及其贮藏稳定性测定

用50L发酵罐对L₁-9菌株进行发酵，装液量30L,制备L₁-9菌株发酵液。发酵条件为：接种量7%（菌龄24h、浓度10⁹cfu/ml）、温度28℃、搅拌速度200rpm、通气量3L/min、发酵时间36h，生物量达2.40×10¹⁰cfu/mL。按饱和吸附量向海洋细菌L₁-9的发酵液中加入吸附量最佳及稳定性好的载体，每间隔1h搅拌一次，使载体充分吸附菌体，48h后菌体形成芽孢后，离心，沉淀于60℃电热恒温鼓风干燥箱烘干，即得L₁-9菌株菌粉。

将菌粉与稳定剂和保护剂按筛选出的种类和比例进行混合，气流粉碎机粉碎过300目筛，密封28℃保存，每隔30d取样1次，采用平板菌落计数方法，测定粉剂中的菌落数，连续测定12次。

1.10海洋细菌L₁-9菌株粉剂对几种植物病原真菌的毒力测定 

将制备得到的不同质量的L₁-9菌株菌剂加入到装有70mL PDA培养基的250ml的三角瓶中，混合均匀，制成浓度不同的含药平板，每个三角瓶为一个浓度，平均倒入3个培养皿中，为3个重复。打取直径为5mm的供试黄瓜枯萎病菌、核盘菌、水稻纹枯病菌、菠菜早疫病菌4种植物病原真菌菌苔，放入不同的含药平板中央，28℃下培养5d。以不加粉剂为对照，用十字交叉法测量菌落直径，计算不同浓度的L₁-9菌株粉剂对不同病原真菌的抑制率，查询抑制率几率值，以粉剂浓度的对数为横坐标，抑制率的机率值为纵坐标，建立L₁-9菌粉对4种植物病原真菌的毒力回归方程，计算的EC₅₀和EC₉₀。

1.11海洋细菌L₁-9菌株粉剂对黄瓜枯萎病的防治作用

    盆栽土壤黄瓜枯萎病菌接种物的制备与接种：将保藏的黄瓜枯萎病菌接种到PDA培养基平板上，28℃恒温培养5d，进行活化，取活化5d直径9mm的黄瓜枯萎病菌菌苔5个，接种到灭菌的装有40g麦粒与60ml水的500ml三角瓶中，28℃恒温培养5d。取出扩繁后的黄瓜枯萎病菌培养物，搅拌均匀后按土壤质量的3%添加到土壤中混匀，装入到营养钵中，每个营养钵装土200g。

    设计拌种、灌根、3种施药方法为3个处理，每个方法处理10盆，每盆3株，播种后正常管理，不施用农药和化肥。黄瓜幼苗生长至三叶期时，测定幼苗的株高、茎粗、地上和地下部鲜重以及须根数，调查发病率和病情指数，计算防病效果。

    拌种法：按种子质量比的3% L₁-9菌粉与表面微湿的黄瓜种子拌种后催芽，以不拌种的种子为对照；拌土法：取L₁-9菌株粉剂与土壤进行混合均匀，制成粉剂含量为0.3g/g含药土壤。每个营养钵加先加入2/3体积的接种了黄瓜枯萎病菌的土壤，然后加入含药土壤50g   ，播种已催芽的黄瓜种子，种子上面再覆盖5g含药土壤，再覆盖1/3的接种了黄瓜枯萎病菌的土壤，以不添加L₁-9菌株粉剂的为空白对照（CK）；灌根处理：黄瓜种子消毒催芽后，播种在装有接种黄瓜枯萎病菌土壤的塑料杯中，待黄瓜长到子叶期时用L₁-9菌粉灌根处理，每次每盆取5g粉剂加15ml无菌水灌根，隔1w再灌一次。以无菌水为对照。

2结果与分析

2.1载体的筛选

2.1.1载体与海洋细菌L₁-9菌株生物相容性测定

添加不同的载体与L₁-9菌株的生长有较好的生物相容性。添加硅藻土和膨润土的发酵液中，L₁-9菌株的菌落数较高，分别为达到7.60×10¹⁰cfu/ml和7.40×10¹⁰cfu/ml，其次是碳酸钙和活性白土，结果见表1。

表1  添加不同载体发酵24h菌株L₁-9平板菌落计数结果

 

2.1.2载体吸附量的测定

  供试的载体中硅藻土对海洋细菌L₁-9发酵液吸附量最高，为1.75ml/g；其次是活性白土，为0.758ml/g。

表2 不同载体对海洋细菌L₁-9发酵液的吸附量（ml/g）

 

结合生物相容性测定结果，硅藻土与海洋细菌L₁-9菌株生物相容性最好，且吸附量最高，选取硅藻土作为海洋细菌L₁-9粉剂制备的载体。

2.2稳定剂的筛选 

2.2.1 稳定剂与海洋细菌L₁-9菌株生物相容性测定

不同稳定剂对海洋细菌L₁-9菌株的生长影响不同，含黄原胶和腐植酸的平板菌落数低于空白对照，添加荧光素钠的菌落数与对照基本一致，说明荧光素钠与L₁-9菌株的生物相容性较好，进一步测定其稳定性及其配比。

表3  添加不同稳定剂的海洋细菌L₁-9活菌发酵液中L₁-9活菌含量

  

 2.2.2添加不同比例稳定剂海洋细菌L₁-9活菌粉剂稳定性测定

表4  添加不同比例稳荧光素钠海洋细菌L₁-9保存不同时间的菌落数（cfu/g）

 

加入不同含量荧光素钠的制剂5d时菌落数与对照没有明显差别，10d后，菌落数有所不同，含量为5%时菌落时最高。因此确定荧光素钠在粉剂中的最佳含量为5%

2.3保护剂的筛选

    不同保护剂对海洋细菌L₁-9菌株的生长影响不同，添加十二烷基磺酸钠后L₁-9菌株不能生长，添加羧甲基纤维素钠的菌落数低于对照，添加糊精菌落数与对照基本一致，说明糊精与L₁-9菌株的生物相容性较好，进一步测定其保护作用。

表5  添加不同保护剂的海洋细菌L₁-9活菌发酵液中L₁-9的菌落数

     

    选取与L₁-9菌株的生物相容性较好的糊精和羧甲基纤维素钠进行紫外线保护试验，结果表明，添加糊精的菌落数紫外照射和未照射相比变化较小，说明糊精具有较好的紫外保护作用。

表6  添加不同保护剂的海洋细菌L₁-9活菌发酵液中L₁-9的菌落数

  

添加不同比例糊精的粉剂保存不同时间的菌落数有所不同，糊精含量为0.5%时保存不同时间的菌落数都较高，说明糊精的最佳添加比例为0.5%。

 表7  添加不同比例糊精的粉剂保存不同时间的菌落数（cfu/g）

 

2.4海洋细菌L₁-9菌株粉剂的贮藏稳定性测定

根据助剂筛选结果，制备的L₁-9菌株粉剂的不同成分含量为硅藻土10%，荧光素钠5%，糊精0.5%，按照该工艺制备的粉剂中含芽孢含量为2.43x10¹⁰ cfu/g。

该粉剂室温下保存180d菌落数仍保持8.50x10⁷cfu/g，稳定性较好。

表8  不同配比的海洋细菌L₁-9菌株活菌粉剂保存不同时间的活菌含量

2.4 L₁-9菌粉对4种病原真菌的毒力测定

     表9  L₁-9菌粉对4种病原真菌的毒力测定结果

试验结果表明， L₁-9菌株粉剂对4种病原真菌生长均具有一定的抑制作用，对4种病原真菌的EC₅₀的大小顺序依次为：大豆菌核病菌（53.6895）＞水稻纹枯病菌（50.8113）＞黄瓜枯萎病菌（48.9252）＞菠菜早疫病菌（38.3122）。说明L₁-9菌株粉剂对菠菜早疫病菌和黄瓜枯萎病菌的抑制作用最强。

2.5 L₁-9菌株粉剂对黄瓜生长的促进作用

  表10  L₁-9菌粉拌种处理后黄瓜幼苗的地上、地下鲜重及须根数   

表6的结果表明，采用不同的用药方法L₁-9菌株粉剂对黄瓜均具有明显的促进作用。

3.6       L₁-9菌株粉剂对黄瓜枯萎病的防治作用

    使用3种用药方法防治黄瓜枯萎病实验结果表明，L₁-9菌株粉剂对黄瓜枯萎病的具有较强的防治作用，防治效果均达到了75%以上，其中拌土的防治效果最好，达到81.32%。结果见表11。

表11  L₁-9菌粉拌种处理后黄瓜幼苗的防病效果

本实验通过测定不同助剂与海洋细菌L₁-9菌株的生物相容性、载体的吸附量、分散剂、湿润剂和展着剂的湿润性和分散效果、稳定剂的保护作用和不同助剂对制剂性质的影响，筛选不同助剂及其比例，确定海洋细菌L₁-9菌株可湿性粉剂的助剂种类和配比。结果表明海洋细菌L₁-9菌株可湿性粉剂的最佳载体为硅藻土，稳定剂为硬脂酸钙。制剂的不同成分比例为：硅藻土10%，荧光素钠5%，糊精0.5%，按照该工艺制备的海洋细菌L₁-9活菌粉剂的性质和稳定性最好，芽孢含量为2.43x10¹⁰ cfu/g，细度300目，各项指标均达到国家相关标准。采用盆栽实验法，通过拌种、灌根、拌土3种方法处理黄瓜种子和土壤，L₁-9菌株活菌粉剂对黄瓜幼苗生长的具有明显的促进作用和对黄瓜枯萎病具有良好防治效果。

Claims (5)

1.一种海洋细菌活菌粉剂的制备方法，其特征在于，其步骤如下：

（1）海洋细菌L1-9菌株种子液的制备：向活化的L1-9菌株斜面加入9ml无菌水冲洗，用接种环充分涂刮制成菌悬液，吸取3ml接入50ml的PD培养基中，在28℃，160rpm条件下摇床培养24h，调整浓度为109个细胞/mL作为种子液；

（2）发酵：用装有发酵培养基的发酵罐对L1-9菌株种子液进行发酵，制备L1-9菌株发酵液；发酵条件为：接种量7%、温度28℃、搅拌速度200rpm、通气量3L/min、发酵时间36h，生物量达2.40×1010cfu/mL；按饱和吸附量向海洋细菌L1-9的发酵液中加入载体硅藻土，每间隔1h搅拌一次，使载体充分吸附菌体，48h后菌体形成芽孢后，离心，沉淀于60℃电热恒温鼓风干燥箱烘干，即得L1-9菌株菌粉；种子培养基和发酵培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL，自然pH；

（3）成品制备：按以下重量百分比向菌粉中加入稳定剂和保护剂制成海洋细菌活菌粉剂：硅藻土10%，荧光素钠5%，糊精0.5%；气流粉碎机粉碎过300目筛，密封28℃保存。

2.权利要求1所述的制备方法制得的海洋细菌活菌粉剂对植物病原真菌的毒力测定方法，其特征在于，其步骤如下：将制备得到的海洋细菌活菌粉剂加入到装有70mL PDA培养基的250ml的三角瓶中，混合均匀，制成浓度不同的含药平板，每个三角瓶为一个浓度，平均倒入3个培养皿中，为3个重复；打取直径为5mm的供试核盘菌（Sclerotinio sclerotiorum）、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solanii)、黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、菠菜早疫病菌（Alternaria solania）4种植物病原真菌菌苔，放入不同的含药平板中央，28℃下培养5d；以不加海洋细菌活菌粉剂为对照，用十字交叉法测量菌落直径，计算不同浓度的海洋细菌活菌粉剂对不同病原真菌的抑制率，查询抑制率几率值，以粉剂浓度的对数为横坐标，抑制率的机率值为纵坐标，建立L1-9菌粉对4种植物病原真菌的毒力回归方程，计算的EC50和EC90。

3.权利要求1所述的制备方法制得的海洋细菌活菌粉剂在抑制植物病原真菌中的用途；所述的植物病原真菌为核盘菌（Sclerotinio sclerotiorum），水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solanii)，黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum），菠菜早疫病菌（Alternaria solania）。

4.权利要求1所述的制备方法制得的海洋细菌活菌粉剂在防治黄瓜枯萎病中的用途。

5.权利要求1所述的制备方法制得的海洋细菌活菌粉剂在促进黄瓜生长中的用途。