CN106434375A - 厚垣普可尼亚菌航天诱变株Pc‑m‑10及由其制备的生防制剂和应用 - Google Patents

厚垣普可尼亚菌航天诱变株Pc‑m‑10及由其制备的生防制剂和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了厚垣普可尼亚菌航天诱变株Pc‑m‑10及其生防制剂和应用。本发明将厚垣普可尼亚菌搭载神舟8号飞船进行航天诱变，以未搭载的原始菌株为对照，将初步筛选得到的厚垣普可尼亚菌航天诱变菌株进行了包括菌落生长速度、菌丝干重、产孢量和致病力等生物学检测并测定了耐盐性以及对苯菌灵的抗性，最终筛选得到一株生长速度快、在高盐环境下能稳定快速生长、对根结线虫卵的致病能力高以及对苯菌灵有较强抗性的突变株Pc‑m‑10。本发明进一步提供了用所述航天诱变菌株Pc‑m‑10制备得到的生防制剂及其在防治根结线虫中的应用。

Description

厚垣普可尼亚菌航天诱变株Pc-m-10及由其制备的生防制剂 和应用
技术领域
本发明涉及厚垣普可尼亚菌(Pochonia chamydosporia＝Verticilliumchlamydosporium)航天诱变突变株，尤其涉及厚垣普可尼亚菌航天诱变突变株Pc-m-10及由其制备的生防制剂，本发明进一步涉及用突变株制备的生防制剂以及在防治根结线虫中的应用，属于厚垣普可尼亚菌突变株的筛选及其应用领域。
背景技术
厚垣普可尼亚菌(Pochonia chamydosporia＝Verticillium chlamydosporium)属半知菌亚门(Deuterom ycotina)丝孢纲(Hyphomycetes)，是一种重要的噬植物线虫真菌(林茂松,沈素文.厚壁轮枝菌防治南方根结线虫研究初报[J].生物防治通报,1994,10(1):7-10)能够有效防治南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、花生根结线虫(Meloidogynearenaria)、大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)等植物寄生线虫(汪来发,杨宝君,关文刚等.淡紫拟青霉和厚壁轮枝霉防治南方根结线虫[J],四川农业大学学报,1998,16(2):231-233；刘畅.厚垣轮枝菌V10菌株对南方根结线虫的寄生和防治作用.广西农业科学,2004,35(2)：135-137.)。厚垣普可尼亚菌主要通过内寄生的方式寄生于卵及雌虫体内，通过大量繁殖使线虫死亡，其对植物寄生线虫卵和雌虫的寄生，在自然条件下对植物寄生线虫的控制起着重要的作用，是最具潜在开发价值的生防真菌之一(裘维蕃,高仁恒,刘杏忠.根结线虫的生物防治简介[J].贵州农学院学报,1996,15(2):51-55.)，厚垣普可尼亚菌具有较广的适应能力，易于培养，且可以寄生多种植物线虫，因而有利于田间防治的应用。同时，其作为线虫生防菌替代化学农药在一些国家已经开始推广应用，并取得了一些成绩。但由于土壤生态系统的复杂性，特别是土壤抑菌作用，导致生防菌的应用受到限制。
航天诱变育种技术作为一种有效的诱变育种新技术，已经在创造特异突变基因资源和培育作物新品种方面显示出重要的作用。已有报道，中国神舟八号飞船搭载松褐天牛幼虫上分离的球孢白僵菌，筛选出了杀虫速度较快，致病力高的诱变菌株，在林间防治松褐天牛具有很大的应用潜力(王曦茁,汪来发,马建伟,郭民伟,刘洪剑,董广平.松褐天牛球孢白僵菌高毒力航天诱变菌株的筛选[J].昆虫学报,2014,(11):1299-1305.)；同时，神舟八号飞船搭载植物线虫生防菌淡紫拟青霉山东菌株后，也使诱变菌株生物学特性与原始菌株存在不同程度的分化，筛选出了在生长特性和致病力方面发生较大幅度正向变异的优良菌株(王源,汪来发,王曦茁,朱天辉,.航天搭载淡紫拟青霉的生物学效应[J].核农学报,2014,(11):1933-1940.)。由此说明，航天诱变的变异率高，变异类型丰富，有益变异增多，为选育优良菌株提供更多的机会，为选育符合生产需求且抗逆性强的优良菌株提供了新的途径。航天诱变育种技术作为一种有效的诱变育种新技术，同其它诱变育种一样，航天诱变处理后必需通过各种性状的检测，以判断航天诱变的效应和筛选得到特定变异的目标品种(农向群,张泽华,胡攀,高松,张礼生.航天诱变对昆虫病原真菌的生物学效应[J].菌物学报,2006,25(4):674-681.)。
作为生物农药，厚垣普可尼亚菌同其它植物线虫生防菌一样尽管具有化学农药不可比拟的诸多优点，但同时也存在生长缓慢、且受环境影响较大，防治效果不稳定以及自身抗逆性较差等缺点，因此有必要对线虫生防真菌厚垣普可尼亚菌进行航天诱变，筛选出产孢子量高、杀线虫能力强、对农药有很好抗性的的诱变菌株，使其更好地发挥防治植物线虫的作用。
发明内容
本发明的主要目的是将厚垣普可尼亚菌(Pochonia chamydosporia) 进行航天诱变以期筛选获得一株生长速度快、在高盐环境下能稳定快速生长、对根结线虫卵的致病能力高以及对苯菌灵有较强抗性的突变株；
本发明的另一目的是将所获得的性能优异的突变株应用于根结线虫的生物防治。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明将培养活化的厚垣普可尼亚菌菌进行航天搭载(神舟八号)诱变，航天诱变完成后，以未搭载的厚垣普可尼亚菌原始菌株作为对照，比较航天诱变菌株在菌落形态、色素变化、孢子形态、生长速度、产孢量、致病力、耐盐性和苯菌灵抗性等方面的变异性。本发明发现将厚垣普可尼亚菌经航天诱变后，产生了丰富的性状变异。从总体上看，航天诱变对生长速度、产孢量、致病力、耐盐性和苯菌灵抗性等很多性状表现出了不同的的变异趋向和幅度。
菌落的生长速度、产孢量和致病力等是筛选生物防治菌株的最重要指标，航天诱变使这些特性表现出不同变异趋向和幅度，证明了航天诱变是非定点的、广泛性的、正负双向性的，且诱变位点多、诱变率高，所导致的生物体变异有生理性变异也可能有遗传性变异(农向群，张泽华，胡攀，高松，张礼生.航天诱变对昆虫病原真菌的生物学效应[J].菌物学报，2006，25(4)：674～681)。
为筛选得到产孢子量高、对根结线虫卵的致病能力有显著提高以及对苯菌灵有很好抗性的适合于生物防控的突变株，本发明对初步筛选得到的厚垣普可尼亚菌航天诱变菌株进行了形态、色素、菌丝及孢子形态、菌落生长速度、菌丝干重、产孢量和致病力等生物学检测并测定了各航天诱变菌株的耐盐性以及对苯菌灵的抗性：
厚垣普可尼亚菌航天诱变菌株对南方根结线虫的致病力产生了明显的变异。试验结果发现，突变体Pc-m-10的菌落生长速度明显超过了原始菌株的生长速度。
厚垣普可尼亚菌航天诱变菌株对南方根结线虫的致病力产生了明显的变异，其中。突变菌株Pc-m-10对南方根结线虫卵的寄生率为93.78％，其较高的寄生率对于田间生防实践具有重要意义。方差分析显示，Pc-m-10对根结线虫卵的寄生率与原始菌株之间差异显著(P<0.05)。
经航天诱变后的菌株对耐盐性出现了不同类型的变异。第一种类型为随着盐浓度的升高生长速率加快，到达一定值后随着盐浓度的升高生长速率减慢，其最适生长的盐浓度为0.10-0.15mol/L。第二种类型为随着盐浓度的升高生长速率减慢。从试验结果可见，Pc-m-10在高盐环境下能够保持稳定、快速的生长。方差分析显示，Pc-m-10对高盐环境(0.50mol/L)的耐受性与原始菌株Pc之间差异显著(P<0.05)。
在实际应用中根结线虫的防治历来以化学药剂防治为主，而施用化学药剂严重影响土壤微生物生长和繁殖，甚至危及有益微生物(孔凡玉,王静.烟其中草根结线虫病研究进展[J].沈阳农业大学学报,2001,32(3):232-235.)。因此，在提高生防菌防效的同时提高生防菌的耐药性，可以有效用于病害防治(祝明亮，张克勤，李飞天等.烟草根结线虫生物防治研究进展[J].微生物学通报，2004，31(6)：95-99.)。将航天诱变后的突变菌株进行苯菌灵抗性筛选，筛选结果发现突变体菌株出现了对苯菌灵抗性的不同变异，其中，突变体Pc-m-10对苯菌灵有较好的抗性，其对苯菌灵(30μg/mL)的抗性与原始菌株Pc之间差异显著(P<0.05)，并且突变体Pc-m-10能在该苯菌灵浓度条件下稳定生长，说明该菌株与苯菌灵等常用杀菌剂具有良好的兼容性，这非常有利于厚垣普可尼亚菌在生产上的推广应用。
最终本发明从众多的航天诱变突变菌株中筛选得到一株性能优异的突变株Pc-m-10，该突变株能在高盐环境下保持快速、稳定生长，对根结线虫卵的致病能力高，对农药苯菌灵有较强的抗性，可作为生防菌剂在根结线虫的防治上具有重要的应用前景。
本发明将厚垣普可尼亚菌(Pochonia chamydosporia)航体诱变突变株Pc-m-10提交保藏，其微生物保藏号是：CGMCC No.12511；分类命名：厚垣普可尼亚菌Pochoniachamydosporia；保藏时间：2016年6月14日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明进一步提供了一种防治根结线虫的生防制剂，包括：防治上有效量的厚垣普可尼亚菌(Pochonia chamydosporia)突变株Pc-m-10的孢子粉或发酵液和载体。
作为参考，本领域技术人员可参考下述方法制备得到厚垣普可尼亚菌(Pochoniachamydosporia)突变株Pc-m-10孢子粉：
(1)制备厚垣普可尼亚菌突变株Pc-m-10发酵液；(2)从厚垣普可尼亚菌突变株Pc-m-10发酵液中回收孢子产物；(3)干燥所回收的厚垣普可尼亚菌突变株Pc-m-10发酵产物，即得孢子粉。
本领域所属技术人员可按照文献中所公开的各种方法制备得到厚垣普可尼亚菌发酵液；例如，采用三级培养方法，即：种子培养、二级液体扩大培养和液体发酵培养，制备得到厚垣普可尼亚菌航天突变株Pc-m-10发酵液；其中，在液体发酵培养时,可以采用发酵罐发酵或采用摇瓶培养的方式进行发酵培养；三级培养所用到的培养基及其培养条件均已在文献中公开，作为参考，其中，所述的液体发酵培养基的组成成分包括碳源和氮源；所述的碳源包括但不限于葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉或玉米粉中的任一种或多种。所述的氮源包括但不限于硝酸钠、硫酸铵、蛋白胨或黄豆粉中的任一种或多种。
本发明进一步提供一种制备防治根结线虫的厚垣普可尼亚菌生防制剂的方法，该方法包括以下步骤：将厚垣普可尼亚菌航天诱变突变株的Pc-m-10孢子粉或发酵液和载体混合在一起，搅拌均匀，粉碎过筛，制备得到相应的微生物制剂，例如，可以是颗粒制剂、粉剂、可湿性粉剂或微胶囊菌剂等。
其中，所述的载体可以是硅藻土、高岭土、木屑、活性炭、草炭、农作物秸秆、干燥的农家肥等；此外，本发明的厚垣普可尼亚菌微生物制剂中还可加入辅料或/和助剂；所述的辅料可以是蟹壳粉或几丁质等；所述的助剂可以是润湿剂、分散剂或稳定剂等。
附图说明
图1是航天诱变厚垣普可尼亚菌的菌落正面、背面和侧面形态类型；
图2是航天诱变厚垣普可尼亚菌的孢子形态；
图3是航天诱变厚垣普可尼亚菌的菌落生长速度的柱状图；
图4是航天诱变厚垣普可尼亚菌菌株菌丝干重的柱状图；
图5是航天诱变厚垣普可尼亚菌的产孢量的柱状图。
具体实施方式
通过下列实施例将更具体说明本发明的实施方式，但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例 厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂的制备
一、厚垣普可尼亚菌孢子粉的制备
(一)、发酵液的制备
1、将厚垣普可尼亚菌航天诱变突变株菌种活化后，进行摇瓶种子培养；
摇瓶种子培养培养基的组成(按质量百分比计)：
葡萄糖 1.5-2％
硝酸钠 0.4-0.6％
硫酸铵 0.2-0.3％
黄豆粉 0.2-0.3％
磷酸氢二钾 0.1-0.2％
硫酸镁 0.1-0.2％
水 余量
液体发酵条件：500ml三角瓶中装入种子培养基200ml,高压灭菌后接种厚垣普可尼亚菌孢子悬浮液，接种量为1.5-3％，置于24-28℃，摇床150-200r/min，培养18-36h。
2、二级液体扩大培养(按质量百分比计):
二级液体扩大培养的培养基组成：
葡萄糖 3-5％
硝酸钠 0.4-0.6％
硫酸铵 0.2-0.3％
黄豆粉 0.2-0.3％
磷酸氢二钾 0.1-0.2％
硫酸镁 0.1-0.2％
水 余量
将上述二级液体扩大培养基在发酵罐中在位灭菌；
液体发酵条件：发酵温度25-28℃，罐压0.6-0.8bar，其通氧量可以是100-300L/h，转速150-250rpm，起始pH值5.5-6.0。
3、液体发酵培养：
液体发酵培养的培养基组成：
葡萄糖 10-18％
硝酸钠 0.2-0.3％
硫酸铵 0.1-0.15％
黄豆粉 0.1-0.15％
磷酸氢二钾 0.1-0.2％
硫酸镁 0.1-0.2％
土豆浸出液(20％) 10-30％
水 余量
将上述液体培养基在发酵罐中在位灭菌；
液体发酵条件：发酵温度为28-30℃，其通氧量可以是100-300L/h，前24h，通气量控制在100-150L/h，后期控制在250-300L/h；起始pH：5.0-6.0；转速：150-200r/min；罐压：0.6-0.8Mpa，发酵周期控制在6d，一般镜检孢子浓度达到109个/ml以上即可。
(二)、从发酵液中回收并干燥孢子产物
将发酵液离心，离心条件为：相对离心力为4000g，离心时间为40min，每100毫升发酵液中加入絮凝剂2.0g；弃上清，将沉淀菌浆用硅藻土载体吸附后阴干至产品中的含水量低于10％，即得厚垣普可尼亚菌孢子粉。
二、可湿性粉剂的制备
按下述质量百分配比称取各组分：将上述制备的孢子粉85％，硅藻土11％，润湿剂PEG 2％、分散剂木钠2％；将孢子粉和硅藻土混合均匀后粉碎过325目筛；将粉碎后的产物与润湿剂和分散剂混合均匀后用气流磨磨细，混合均匀，即得。
试验例1厚垣普可尼亚菌航体诱变突变株Pc-m-10的筛选及诱变效应的测定试验
1材料和方法
1.1生物材料
供试菌株厚垣普可尼亚菌(P.chamydosporia)源自美国，是用于防治根结线虫的生产菌株，菌种保藏于中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所。航天诱变返地后，于本发明人实验室4℃保存，备用。供试的南方根结线虫(M.incognita)由中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所提供。
1.2航天搭载
将用PDA培养活化7d的菌丝块转移至无菌的EP管(1.5mL)2管，封口。其中一管进行航天搭载(神舟八号)，另一管作为对照材料保存在4℃冰箱中。
1.3突变体筛选
将经航天诱变处理后的厚垣普可尼亚菌和原始菌株分别制成孢子悬浮液，稀释孢子浓度到1.0×103cfu/mL，均匀涂布到直径为9cm的PDA平板上(每皿加0.1mL孢子悬浮液)，25℃恒温培养6d-9d后，观察单菌落大小、形态和正反面颜色，挑选出与原始菌株差别较明显的单菌落菌株；原始编号为“Pc”，其余菌株编号为“Pc-m-No.”。
1.4航天诱变效应的检测
以未搭载的厚垣普可尼亚菌原始菌株作为对照，比较航天诱变菌株在菌落形态、色素变化、孢子形态、生长速度、产孢量、致病力、耐盐性和苯菌灵抗性等方面的变异性。
1.4.1菌落的形态和色素变化观察
从已生长好的PDA平板上，用直径为5mm的打孔器切菌落3块于5 mL含0.5‰吐温的溶液中，充分振荡，制成孢子悬浮液。在9cm培养皿(15mL培养基)中央接入2.5μL孢子悬浮液(孢子浓度为1×106cfu/mL)，置于25℃温箱中培养，每个菌株重复3次。
1.4.2孢子形态的观察
将孢子悬浮液(孢子浓度为1×106cfu/mL)滴在载玻片上制成临时玻片，并在显微镜下观察孢子形态。
1.4.3菌落生长速度测定
用灭好菌的直径为5mm的滤纸片蘸满孢子悬浮液(孢子浓度为1×106cfu/mL)放在PDA培养基平板中央，置于25℃温箱中培养，以十字交叉法每3d测菌落直径，直至菌株长满整皿时停止测定。原始菌株为对照，重复3次。
1.4.4菌丝干重测定
150mL锥形瓶装50mL PD培养基，吸取200μL(孢子浓度为1×106cfu/mL)孢子悬浮液于每瓶培养基中，恒温摇床温度为25℃，转速为120r/min。培养96h后，将三角瓶中所有的菌液倒入50mL的离心管中，5000r/min离心3min，倒出上清，将沉淀倒在滤纸上，烘箱50℃烘干至恒重，称重。
1.4.5产孢量测定
用打孔器在菌落中央到边缘的中点打取直径为5mm的菌块3块，放入5mL含0.5‰吐温的溶液中，充分振荡，用血球计数板(25×16格)测定孢子含量，设3次重复。
1.4.6致病力测定
大棚采集病根，将病根洗净，剪成0.5cm的小段，装入500mL三角瓶中，倒入200mL1％次氯酸钠溶液，封口后猛摇3min，迅速过200目筛子，再迅速过500目筛子，用蒸馏水反复冲洗留在500目筛子上的卵，最后用无菌水冲洗收集于无菌的小烧杯中，显微镜下观察，调节虫卵浓度到1000个/mL。在直径6cm的培养皿中加入100μL卵悬浮液，并加入2mL的1.0×106个/mL的突变体孢子悬浮液，野生型Pc做对照。每个突变菌株各重复3次，25℃培养5d，统计卵的寄生数和未寄生数，并计算菌株孢子对南方根结线虫虫卵的寄生率。
1.4.7耐盐性测定
配制含NaCl分别为0.05mol/L，0.10mol/L，0.15mol/L，0.20mol/L，0.25mol/L和0.50mol/L的PDA培养基。用灭好菌直径为5mm的滤纸片蘸满航天诱变菌菌株孢子悬浮液(孢子浓度为1×106cfu/mL)放在以上不同浓度的含NaCl的PDA培养基中央，置于25℃温箱中培养，于9d后测量菌落直径，并计算生长速度。
1.4.8苯菌灵抗性筛选
配制终浓度为30μg/mL苯菌灵的PDA培养基(苯菌灵规格为50％的可湿性粉剂，江苏蓝丰生物化工股份有限公司产品)。用灭好菌直径为5mm的滤纸片蘸满航天诱变菌菌株孢子悬浮液(孢子浓度为1×106cfu/mL)放在终浓度为30μg/mL苯菌灵的PDA培养基中央，置于25℃温箱中培养，于9d后测量菌落直径，并计算生长速度。
1.4.9数据处理与分析
采用Microsoft Excel软件对数据进行处理。采用SPSS 19.0进行单因素方差分析(One-way ANOPC-M-A)，运用Duncan法对不同菌株多重比较(P＝0.05)，试验数据采用平均值加减标准差(mean±SD，n＝3)的形式表示。
2结果与分析
2.1航天诱变对菌落形态和色素变化的影响
航天诱变厚垣普可尼亚菌通过3-4代继代培养获得稳定性状后，观察发现菌落有明显的形态分化(图1)，可根据菌落的正面、背面及侧面形态和颜色变化将分化菌株分为I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型4种类型：I型菌落形态与原始菌株Pc相似，菌落正面呈白色羽绒状，菌落背部为淡黄色，菌落侧面呈平滑圆拱形，I型菌落共11株，占航天诱变菌株的37.9％；Ⅱ型菌株菌落正面为白色羽绒状，菌落中心凹陷且有褶皱，背面颜色为淡黄色较I型深，Ⅱ型菌落共14株，占航天诱变菌株的48.3％；Ⅲ型菌落正面为白色羽绒状，菌落中心凹陷无褶皱，背面颜色为淡黄色，Ⅲ型菌落共3株，分别是Pc-m-13、Pc-m-26和Pc-m-54，占航天诱变菌株的10.3％；Ⅳ型菌落正面为白色羽绒状，菌落中心呈白色凸起且有褶皱，背部颜色为黄色，Ⅳ型菌落只有一个菌株Pc-m-9，占航天诱变菌株的3.4％。
2.2航天诱变对孢子形态的影响
通过显微镜(100μm)观察，航天诱变厚垣普可尼亚菌的分生孢子形态为球形或近球形，透明光滑，四个类型(I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)均与原始菌株Pc无明显差异。
2.3航天诱变对菌落生长速度的影响
据观察，航天诱变厚垣普可尼亚菌的生长速度约为1cm/3d，但15d后生长速度变慢，菌落需约20d才能长满整皿。培养15d的菌落直径大于或等于原始菌株Pc的菌株(包括Pc-m-10在内)有10株，占突变菌株的34.5％；小于原始菌株Pc的菌株有19株，占突变菌株的65.5％。
表1航天诱变厚垣普可尼亚菌的菌落生长速度
Table 1 Varieties of colony growth rate of aerospace mutant strainsof Pochonia chamydosporia/cm
注：表中数据为平均值±标准差，数据后*表示与原始菌株Pc相比有显著性差异(P<0.05)。
Note:Data in the table is mean±SD,data marked*represents significantdifference(P<0.05).
2.4航天诱变对菌丝干重的影响
航天诱变菌株培养过程中菌丝干重出现了正负双向变异(图4)。与原始菌株Pc相比，菌丝干重提高的有13株，占突变菌株的44.8％；菌丝干重降低的有16株，占突变菌株的55.2％。其中，Pc-m-26的菌丝干重最重，为0.2776g；干重最小的诱变菌株为Pc-m-27，其干重为0.1559g。
2.5航天诱变对产孢量的影响
试验结果见表2和图5。经航天诱变后的菌株出现了不同趋向和幅度的变异(表2)。与原始菌株Pc相较，产孢量提高的有24株，占突变菌株的82.8％；产孢量降低的有5株，占突变菌株的17.2％。其中Pc-m-51的产孢量最多，为2.43×106cfu·mL-1；产孢量最少的是Pc-m-130，为0.20×106cfu·mL-1。
表2航天诱变厚垣普可尼亚菌的产孢量
Table 2 Sporulation of aerospace mutant strains of Pochoniachamydosporia/(×106cfu·mL-1)
注：表中数据为平均值±标准差，数据后*表示与原始菌株Pc相比有显著性差异(P<0.05)。Note:Data in the table is mean±SD,data marked*represents significantdifference(P<0.05).
2.6航天诱变对致病力的影响
试验结果见表3，厚垣普可尼亚菌航天诱变菌株对南方根结线虫的致病力产生了明显的变异。相较于原始菌株Pc，对南方根结线虫卵的寄生率提高的菌株有20株，占突变菌株的69.0％；寄生率降低的菌株有9株，占突变菌株的31.0％。其中，突变菌株Pc-m-10对南方根结线虫卵的寄生率93.78％。方差分析显示，Pc-m-10对根结线虫卵的寄生率与原始菌株之间差异显著(P<0.05)。
表3航天诱变厚垣普可尼亚菌对南方根结线虫卵的寄生率
Table 3 Parasitic rate of aerospace mutant strains of Pochoniachamydosporia against Meloidogyne incognitaeggs/％
注：表中数据为平均值±标准差，数据后*表示与原始菌株Pc相比有显著性差异(P<0.05)。Note:Data in the table is mean±SD,data marked*represents significantdifference(P<0.05).
2.7航天诱变对耐盐性的影响
试验结果见表4。经航天诱变后的菌株对耐盐性出现了不同类型的变异。第一种类型为随着盐浓度的升高生长速率加快，到达一定值后随着盐浓度的升高生长速率减慢，其最适生长的盐浓度为0.10-0.15mol/L，该类突变菌株共17株，占突变菌株的58.6％，Pc-m-10以及原始菌株Pc也属于该种类型。第二种类型为随着盐浓度的升高生长速率减慢；该类突变菌株共9株，占突变菌株的31.0％。另外有3株突变菌株均不属于以上两种类型，分别是Pc-m-30、Pc-m-39和Pc-m-51，占突变菌株的10.3％。方差分析显示，Pc-m-10对高盐环境(0.50mol/L)的耐受性与原始菌株Pc之间差异显著(P<0.05)，且Pc-m-10能在高盐环境下稳定生长。
表4航天诱变厚垣普可尼亚菌的耐盐性测定
Table 4 Salt tolerance of aerospace mutant strains of Pochoniachamydosporia/cm
注：表中数据为平均值±标准差，数据后*表示与原始菌株Pc相比有显著性差异(P<0.05)。Note:Data in the table is mean±SD,data marked*represents significantdifference(P<0.05).
2.8航天诱变对苯菌灵抗性的影响
试验结果见表5，经航天诱变后，菌株出现了对苯菌灵抗性的不同变异(表5)。调节培养基苯菌灵的终浓度为30μg/mL，25℃培养9d后观察结果，发现突变体Pc-m-10对苯菌灵有很好的抗性。方差分析显示，Pc-m-10对苯菌灵(30μg/mL)的抗性与原始菌株Pc之间差异显著(P<0.05)，Pc-m-10能在该浓度苯菌灵条件下稳定生长。
表5航天诱变厚垣普可尼亚菌的苯菌灵抗性筛选
Table 5 Benomyl resistance of aerospace mutant strains of Pochoniachamydosporia/cm
注：表中数据为平均值±标准差，数据后*表示与原始菌株Pc相比有显著性差异(P<0.05)。Note:Data in the table is mean±SD,data marked*represents significantdifference(P<0.05).
实验例1由厚垣普可尼亚菌航天诱变突变株Pc-m-10制备的可湿性粉剂防治花椒根结线虫的田间试验
1试验材料及方法
1.1供试菌剂
试验菌剂：用厚垣普可尼亚菌航天诱变突变株Pc-m-10制备的可湿性粉剂(实施例1制备)；
对照菌剂：用厚垣普可尼亚菌原始菌株(未进行航天诱变)制备的可湿性粉剂(按照实施例1的方法进行制备)。
1.2实验作物
花椒种植区种植的花椒树。
1.3实验设计
实验地点设在线虫虫量大且均匀的花椒种植区，药前调查根结线虫二龄幼虫虫口在每100g土壤20-30头。
实验分为3组，试验1组，试验2组和清水对照组，具体实验设计如下：
试验1组采用实施例1制备的可湿性粉剂进行处理；
对照2组采用对照菌剂进行处理。
清水对照组：采用清水进行处理(不施加任何防治线虫的药剂)，不作防线虫处理；
每个处理30个重复(分三列，每列10株花椒树)，各处理随机排列。
4月15日至5月10日进行菌剂小区试验，在花椒树四周扒开根表面10cm厚、半径为50cm的土层，将1毫升的原菌剂(试验菌剂以及对照菌剂的用量均相同，均为1毫升原菌剂/株)用水稀释后采用喷雾方式将稀释后的菌剂均匀喷洒在挖好的坑中，使菌剂分布在根围，再使扒开土壤复位。施药90d后调查花椒树根结指数(病情指数)和土壤中二龄幼虫数，评价防治效果。
根结指数(病情指数)计算方法：挖出每处理花椒根，按照根结线虫分级调查指标进行调查，根结严重度分0-4级，分级标准参照Benjamin等(Benjamin D，Grover C BJ.Comparison of compatible and incompatible response of potato to Meloidogyneincognita.Journal of Nematology，1987，19:218-221)。根结指数计算公式如下：
幼虫减少百分率(相对减退率)计算方法：每小区用取土钻(2cm×H20cm)从作物根围(0-20cm深)采集5个点的土样，充分混匀后，取100g用离心漂浮分离法(Karssen G.ThePlant Parasitic Nematode Genus Meloidogyne Goldi,(Tylenchida)in Europe[M].Gent:Drukkeru Modern,1982:5-24.)分离土样中的二龄幼虫，热杀死后用4％福尔马林固定，在倒置显微镜下计数，计算100g土样内根结线虫二龄幼虫数及幼虫减少百分率(相对减退率)。计算公式如下：
相对防治效果计算公式如下：
2实验结果
实验结果见表6。
表6厚垣普可尼亚菌航天诱变突变株Pc-m-10可湿性粉剂对花椒根结线虫的防治效果实验
从表6的试验数据可见，试验菌剂(用厚垣普可尼亚菌航天诱变突变株Pc-m-10制备的可湿性粉剂)对根结线虫的相对防治效果比对照菌剂(用厚垣普可尼亚菌原始菌株制备的可湿性粉剂)高出了20.83个百分点，试验菌剂的幼虫减少百分率比对照菌剂高出了18.1个百分点。田间防治根结线虫的试验结果表明，厚垣普可尼亚菌航天诱变突变株Pc-m-10对于根结线虫的生物防治效果要远优于原始菌株对于根结线虫的生物防治效果。

Claims (10)

1.一株厚垣普可尼亚菌(Pochonia chamydosporia)航天诱变株Pc-m-10，其特征在于，其微生物保藏号是：CGMCC No.12511。
2.权利要求1所述的厚垣普可尼亚菌航天诱变株Pc-m-10在防治植物害虫中的应用。
3.按照权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的植物害虫是线虫。
4.按照权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的线虫是根结线虫。
5.一种防治植物害虫的生防制剂，其特征在于，包括：权利要求1所述的厚垣普可尼亚菌航天诱变株Pc-m-10的孢子粉或发酵液以及载体。
6.按照权利要求5所述的生防制剂，其特征在于：所述的载体是硅藻土、高岭土、木屑、活性炭、草炭、农作物秸秆或干燥的农家肥。
7.按照权利要求5所述的生防制剂，其特征在于：还含有辅料或助剂。
8.按照权利要求7所述的生防制剂，其特征在于：所述的辅料是蟹壳粉或几丁质；所述的助剂是润湿剂、分散剂或稳定剂。
9.按照权利要求5所述的生防制剂，其特征在于：所述的植物害虫是根结线虫。
10.一种制备权利要求5所述生防制剂的方法，包括以下步骤：(1)培养权利要求1所述的厚垣普可尼亚菌航天诱变株Pc-m-10，获得孢子粉或发酵液；(2)将所获得的孢子粉或发酵液和载体混合在一起，搅拌均匀，粉碎过筛，得到生防制剂。
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