CN107868766B - 菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物领域，特别涉及菌株及其应用。针对香草兰根(茎)腐病、香草兰疫病和香草兰细菌性软腐病等3种香草兰主要病害提供的广谱高效生防菌VS15。平板拮抗试验结果显示，生防菌VS15对香草兰根(茎)腐病、香草兰疫病和香草兰细菌性软腐病等3种病害的病原菌均有良好的抑制效果。离体生防试验结果显示，生防菌VS15喷雾处理对香草兰离体茎蔓和叶片上的香草兰根(茎)腐病、香草兰疫病和香草兰细菌性软腐病均有良好的防治效果，防效在60％以上。田间生防试验结果显示，生防菌VS15喷雾处理对能够有效降低香草兰苗圃上各种病害的发病率，防效达65.22％；而且能够大幅促进香草兰苗生长，促生率达104.84％。

Description

菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别涉及菌株及其应用。

背景技术

香草兰(Vanilla planifolia Ames)是一种经济价值极高的兰科香料作物，被称为“食品香料之王”，被广泛的应用于化妆品、食品和医药领域。该作物原产于墨西哥，于20世纪60年代引入我国，在海南和云南西双版纳地区栽培种植。种植香草兰虽然收益极高，但病害严重。在我国香草兰病害主要有香草兰根(茎)腐病、香草兰疫病和香草兰细菌性软腐病。

香草兰根(茎)腐病是一种毁灭性的土传病害，在国内外均危害严重，其病原物是尖孢镰刀菌(Fusarium.oxysporum)。该病害主要危害香草兰根系和茎蔓，初期感病部位出现水渍状、褐色病斑，内部纤维束变褐色。病斑随纤维束扩展，造成植株萎蔫、干枯。该病害的病原菌可以在土壤中存活多年，病原菌的总量随种植年限逐年积累，发病率也呈逐年加重趋势。目前，香草兰根(茎)腐病在我国各种植区普遍发生，危害严重，可造成50％以上的产量损失，严重时可以造成种植园毁灭。

香草兰疫病在国内外均普遍发生，其病原物是烟草疫霉(Phytophthoranicotianae)。该病害主要为害香草兰嫩梢、果荚、茎蔓和叶片。该病害最易侵染嫩梢和近地面果荚、茎蔓等，初期形成水渍状褐色病斑，随后呈黑褐色软腐症状，气候湿润时出现白色霉层。该病害在雨季频发，随雨水滴溅流动传播迅速，可以引起果荚大量脱落，严重时导致减产50％以上。

香草兰细菌性软腐是我国香草兰上主要病害之一，其病原物是达坦狄克氏菌(Dickeya dadantii)，即原分类学上的菊欧文氏杆菌(Erwinia.chrysanthemi)。该病害主要为害香草兰叶片，初期发病部位产生水渍状斑点，后期病部叶肉软腐、与表皮脱离，腐烂病痕边缘有褐色边纹，潮湿条件下病部溢出乳白色菌脓。该病害主要导致叶片腐烂脱落，在我国香草兰种植区普遍发生，发病率在15％-30％。

香草兰是多年生作物难以轮作换茬，病原物经年累积容易造成病害爆发流行，而且香草兰园内隐蔽潮湿是病害发生的理想场所，导致香草兰上病害发生频率高、防治难度大。多年以来，通常使用多菌灵、甲霜灵、农用链霉素等化学农药来防治香草兰病害。但是长期使用该类化学药剂，病害容易产生抗药性，继续这类药品难以有效控制病害的发生和流行。而且长期大量使用化学药剂容易导致农药残留和环境污染问题，不利于高附加值有机产品的打造和生态农业体系的创建。

利用有益微生物防治农作物病害是减少化学农药用量、提高作物品质和创建生态农业的重要手段。微生物杀菌剂开发和应用在国内外已经初具规模形成潮流。目前，美国已登记微生物杀菌剂产品122个；加拿大登记微生物杀菌剂产品82个；中国登记微生物杀菌剂产品135个。其中芽孢杆菌类微生物因具有诸多优点，包括：1)防病机制多样，不易产生抗药性；2)具有定殖作用，菌体可以随着植物生长而扩展保护，有效期长；3)能够产生耐逆境的芽孢，易于生产加工且货架期较长。其微生物登记的产品数量也远高于其他类群。以我国为例，135个已登记产品中芽孢杆菌类有83个，芽孢杆菌复配类有27个。我国已登记微生物杀菌剂产品的防治范围涵盖水稻、黄瓜、番茄、烟草等20种作物上的54种病害，但是尚未有针对香草兰病害的微生物产品。香草兰园内栽培环境阴蔽湿热迥异于其他作物，普通微生物产品难以在该环境中发挥理想效果，急需针对性的生防菌来为高附加值的香草兰产业保驾护航。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种菌株及其应用。本发明的目的是生物防治香草兰根(茎)腐病、香草兰疫病和香草兰细菌性软腐病等3种香草兰主要病害，通过平板拮抗、室内离体和田间试验从香草兰根际土壤中筛选出对3种香草兰主要病害均有良好防效的甲基营养型芽孢杆菌VS15，防治效果在60％以上。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一株菌株，其保藏编号为CGMCC NO.14478。

本发明还提供了上述菌株在预防和/或治疗香草兰病害的制剂中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述香草兰病害为香草兰根(茎)腐病、香草兰疫病或香草兰细菌性软腐病。

在本发明的一些具体实施方案中，所述菌株的有效浓度为1×10⁷～5×10⁷CFU/ml，每亩喷施100～200L。

本发明还提供了上述菌株在制备香草兰生长促进剂中的应用。

本发明还提供了上述菌株的发酵方法，将上述的菌株接种于LB培养基，于30～37℃150～200rpm条件下震荡培养10～14h制备种子菌；将所述种子菌以3％比例接种于Landy培养基，于30～37℃150～180rpm条件下发酵36～40h。

本发明还提供了上述发酵方法获得的发酵液。

本发明还提供了上述发酵液在预防和/或治疗香草兰病害的制剂中的应用。在本发明的一些具体实施方案中，所述香草兰病害为香草兰根(茎)腐病、香草兰疫病或香草兰细菌性软腐病。

本发明还提供了一种预防和/或治疗香草兰病害的制剂，包括上述菌株或上述发酵液及可接受的辅料。

本发明还提供了一种预防和/或治疗香草兰病害的方法，将本发明提供的菌株发酵液喷施于香草兰植株表面及其周围土壤，活菌浓度为1×10⁷～5×10⁷CFU/ml；每亩喷施100～200L，每3个月喷施1次。

本发明提供了一株菌株，其保藏编号为CGMCC NO.14478。生物材料：VS15，分类命名：甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)，已于2017年7月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

本发明的优点和积极效果表现在：本发明针对香草兰根(茎)腐病、香草兰疫病和香草兰细菌性软腐病等3种香草兰主要病害开发的广谱高效生防菌VS15。

平板拮抗试验结果显示，生防菌VS15对香草兰根(茎)腐病、香草兰疫病和香草兰细菌性软腐病等3种病害的病原菌均有良好的抑制效果(图1)。

离体生防试验结果显示，生防菌VS15喷雾处理对香草兰离体茎蔓和叶片上的香草兰根(茎)腐病、香草兰疫病和香草兰细菌性软腐病均有良好的防治效果，防效在60％以上(图2～4、表1～3)。

田间生防试验结果显示，生防菌VS15喷雾处理对能够有效降低香草兰苗圃上各种病害的发病率，防效达65.22％；而且能够大幅促进香草兰苗生长，促生率达104.84％(图5、表4)。

甲基营养性芽孢杆菌VS15来自于香草兰根系，具有广谱防治3种香草兰主要病害的能力，使用后不会产生抗药性、农药残留、环境污染等化学农药常见问题，不仅有利于香草兰有机品牌打造和提高产品经济价值，而且对人畜健康、对环境友好符合人们对生态农业的需求。

生物保藏说明

生物材料：VS15，分类命名：甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)，已于2017年7月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.14478。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示生防菌VS15对香草兰根茎腐病菌(A)、香草兰疫病菌(B)和香草兰细菌性软腐病菌(C)的抑制效果；

图2示清水(A)和生防菌处理(B)对离体茎蔓上香草兰根(茎)腐病的防治效果；

图3示清水(A)和生防菌处理(B)对离体茎蔓上香草兰疫病的防治效果；

图4示清水(A)和生防菌处理(B)对离体茎蔓上香草兰细菌性软腐病的防治效果；

图5示清水(A)和生防菌处理(B)对香草兰苗的影响效果。

具体实施方式

本发明公开了一种菌株及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

生防菌发酵方法：菌种接种于LB培养基中，在30～37℃150～200rpm条件下震荡培养10～14小时制备种子菌。种子菌以3％比例接种于Landy培养基中，在30～37℃150～180rpm条件下发酵36～40h形成发酵液。

生防菌发酵液使用方法：将发酵液用无菌水稀释10倍，稀释液活菌浓度约为1×10⁷～5×10⁷CFU/ml，喷雾于香草兰表面及其周围土壤上。每3个月喷雾处理1次。

培养基及其配制方法：

LB培养基：酵母粉5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，琼脂粉15g(仅做固体培养基时添加)，加去离子水定容1000ml，混匀后分装于三角瓶中，121℃灭菌20min。

Landy培养基：葡萄糖10g，L-谷氨酸5g，磷酸二氢钾1g，七水合硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，L-苯丙氨酸2μg，硫酸锰5μg，五水合硫酸铜0.16μg，七水合硫酸亚铁0.15μg，加去离子水定容至1000ml，用NaOH调节pH值至7.0，121℃灭菌20min。

PDA培养基：马铃薯200g(切成边长约1cm的小块，放入800ml去离子水种煮沸15min，双层纱布过滤后留取滤液)，葡萄糖20g，琼脂粉20g，加去离子水定容至1000ml，121℃灭菌20min。

本发明提供的菌株及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

一株防治香草兰根(茎)腐病、香草兰疫病和香草兰细菌性软腐病等3种香草兰主要病害的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)VS15，分离自海南省琼海市香草兰根际土壤。

菌株分离方法：选择栽培香草兰15年以上的老香草兰园，取长势最为旺盛的香草兰植株根围土壤5g用无菌水稀释10000倍，取100μl涂布PDA平板，在30℃环境中培养12h，挑取单菌落在新PDA平板上划线纯化，再次挑取单菌落接种在PDA培养基上备用。

生防菌筛选方法：菌株先后通过“平板拮抗试验”、“离体生防试验”和“田间生防试验”多重筛选(分别见实例2、3、4)，最终筛选出对香草兰根(茎)腐病、香草兰疫病和香草兰细菌性软腐病等3种香草兰主要病害均有良好防治效果的生防菌株。

生防菌处理液制备：

将菌种VS15接种于LB培养基中，在37℃200rpm条件下震荡培养12小时制备种子菌。种子菌以3％比例接种于Landy培养基中，在30℃180rpm条件下发酵36h形成发酵液。发酵液的活菌浓度约为10⁸CFU/ml，在使用前用无菌水稀释10倍配置成浓度约为1×10⁷～5×10⁷CFU/ml的生防菌处理液。

实施例2平板拮抗试验

香草兰根(茎)腐病菌(Fusarium oxysporum，高圣风等，2015，香草兰根(茎)腐病病原菌鉴定及其致病性测定)和香草兰疫病菌(Phytophthora nicotianae，刘爱勤等，2008，海南香草兰疫病发生情况调查及疫霉菌种类鉴定)接种在PDA培养基上在26℃条件下培养5～7d，用灭过菌的打孔器将菌落打成直径为0.5cm的圆形菌丝块，将菌丝块接种到PDA平板中央，接种点周围放置4个直径为0.5cm的无菌滤纸片，每个滤纸片上接种生防菌处理液5μl，将平板放入26℃恒温箱中培养5d后观察结果。香草兰细菌性软腐病菌(Dickeyadadantii，高圣风等，2016，First Report of Bacterial Soft Rot of Vanilla Causedby Dickeya dadantii in China)接种于LB培养基上在28℃条件下培养24h，以1～3％比例接种到冷却至50℃的PDA培养基中混匀后倒平板，平板凝固后放置4个直径为0.5cm的无菌滤纸片，每个滤纸片上接种生防菌处理液5μl，将平板放入28℃恒温箱中培养2～4d后观察结果。

结果发现，生防菌VS15对香草兰根(茎)腐病、香草兰疫病和香草兰细菌性软腐病等3种香草兰主要病害的病原菌均有良好的抑制效果(图1)。

实施例3离体生防试验

1、香草兰根茎腐病离体生防试验

香草兰根(茎)腐病菌接种在PDA培养基上在26℃条件下培养3～5d，用灭过菌的打孔器将菌落打成直径为0.5cm的圆形菌丝块备用。选取香草兰健康茎蔓，剪成包含2叶1节的小段，用活菌浓度约为1×10⁷～5×10⁷CFU/ml生防菌VS15处理液25ml进行喷雾处理，24h后用大头针在茎蔓中央位置刺1个深约0.3cm的小孔，将准备好的菌丝块覆盖于伤口上，放入26℃恒温箱中在湿度≥85％的条件下放置7天后调查结果。对照组：分别用清水和80％多菌灵1000倍液代替生防菌处理液，其他条件均相同。

结果显示，生防菌VS15喷雾处理能够有效降低香草兰根(茎)腐病的病斑长度，防治效果可达75.46％，明显好于80％多菌灵1000倍液处理(表1)。

表1生防菌处理对离体茎蔓上香草兰根(茎)腐病的防治效果

处理	平均病斑长度(cm)	防效(％)
			VS15	0.93	75.46
多菌灵	1.47	61.21
			清水	3.79	-

2、香草兰疫病离体生防试验

香草兰疫病菌接种在PDA培养基上在26℃条件下培养5d，用灭过菌的打孔器将菌落打成直径为0.5cm的圆形菌丝块备用。选取完全展开的香草兰嫩叶，用活菌浓度约为1×10⁷～5×10⁷CFU/ml生防菌VS15处理液25ml进行喷雾处理，24h后用大头针在叶片中央位置刺透形成伤口，将准备好的菌丝块覆盖于伤口上，放入26℃恒温箱中在湿度≥85％的条件下放置3天后调查结果。对照组：分别用清水和25％甲霜灵500倍液代替生防菌处理液，其他条件均相同。

结果显示，生防菌VS15喷雾处理能够有效降低香草兰疫病的病斑扩展，病斑面积明显低于对照组，防治效果可达71.77％，明显好于25％多菌灵500倍液处理(表2)。

表2生防菌处理对离体茎蔓上香草兰疫病的防治效果

处理	平均病斑面积(cm<sup>2</sup>)	防效(％)
			VS15	2.73	71.77
甲霜灵	3.87	59.98
			清水	9.67	-

3、香草兰细菌性软腐病离体生防试验

香草兰细菌性软腐病菌接种在LB固体培养基上在28℃条件下培养3d，用无菌水冲洗菌落，配置成浓度约为10⁷CFU/ml的接种液备用。选取健康的香草兰叶片，用活菌浓度约为1×10⁷～5×10⁷CFU/ml生防菌VS15处理液25ml进行喷雾处理，24h后用大头针在叶片中央位置刺透形成伤口，将浸透接种液的脱脂棉覆盖于伤口上，放入28℃恒温箱中在湿度≥85％的条件下放置3天后调查结果。对照组：分别用清水和6％春雷霉素800倍液代替生防菌处理液，其他条件均相同。。

结果显示，生防菌VS15喷雾处理对香草兰细菌性软腐病有良好效果，处理组的病斑面积明显低于对照组，防治效果可达62.87％，明显好于6％春雷霉素800倍液处理(表3)。

表3生防菌处理对离体茎蔓上香草兰细菌性软腐病的防治效果

处理	平均病斑面积(cm<sup>2</sup>)	防效(％)
			VS15	13.18	62.78
春雷霉素	13.11	62.98
			清水	35.41	-

实施例4田间生防试验

选取田间香草兰苗圃作为试验场所。在香草兰茎蔓扦插于苗床7d后，用活菌浓度约为1×10⁷～5×10⁷CFU/ml生防菌VS15处理液25ml对香草兰表面及其周围土壤进行喷雾处理，3个月后重复处理1次。按常规方法进行日常管理，每半个月检查自然发病植株，记录后及时清除病株。6个月后统计总发病率和香草兰在苗圃期间新抽茎蔓长度。对照组：分别用清水和80％多菌灵1000倍液代替生防菌处理液，其他条件均相同。

结果发现，以清水组为对照，生防菌株VS15处理组的防效达65.22％，明显好于80％多菌灵1000倍处理组的防效42.94％。此外，VS15处理对香草兰的生长也有明显的促进作用，在试验期间新抽茎蔓长度可达对照组的104.84％(表4)。

表4生防菌喷雾处理对香草兰促生长作用和防病效果

	新抽茎蔓长度(cm)	促生率(％)	发病率(％)	防效(％)
					清水	34.93	-	38.33	-
多菌灵	37.24	6.61	21.87	42.94
					VS15	71.55	104.84	13.33	65.22

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种甲基营养型芽孢杆菌（ Bacillus methylotrophicus ） 菌株，其特征在于，其保藏编号为CGMCC NO. 14478。

2.根据权利要求1所述的菌株在预防和/或治疗香草兰病害的制剂中的应用；

所述香草兰病害为香草兰根(茎)腐病、香草兰疫病或香草兰细菌性软腐病；

所述菌株的有效浓度为1×10⁷~5×10⁷CFU/ml，每亩喷施 100~ 200 L。

3.根据权利要求1所述的菌株在制备香草兰生长促进剂中的应用。

4.如权利要求1所述菌株的发酵方法，其特征在于，将如权利要求1所述的菌株接种于LB培养基，于30~37℃ 150~200rpm条件下震荡培养10~14h制备种子菌；将所述种子菌以3%比例接种于Landy培养基，于30~37℃ 150~180rpm条件下发酵36~40h。

5.如权利要求4所述的发酵方法获得的发酵液。

6.根据权利要求5所述的发酵液在预防和/或治疗香草兰病害的制剂中的应用；

所述香草兰病害为香草兰根(茎)腐病、香草兰疫病或香草兰细菌性软腐病。

7.一种预防和/或治疗香草兰病害的制剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的菌株或如权利要求5所述的发酵液及可接受的辅料。

8.一种预防和/或治疗香草兰病害的方法，其特征在于，将如权利要求1所述的菌株或如权利要求5所述的发酵液喷施于香草兰植株表面及其周围土壤，活菌浓度为1×10⁷~5×10⁷CFU/ml；每亩喷施 100~ 200 L，每3个月喷施1次。

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