CN103911350B - 分泌抗柑橘碎叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分泌抗柑橘碎叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。克隆了柑橘碎叶病毒(CTLV)的外壳蛋白基因，利用原核表达系统表达了该病毒的外壳蛋白，用表达纯化的蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能稳定传代并分泌抗CTLV特异性单抗的杂交瘤细胞株6C5，其保藏号为CGMCC？No.8779。该单克隆抗体腹水间接ELISA效价均达到10^-7，抗体类型及亚类均为IgG1，kappa链。利用单抗建立的检测柑橘中CTLV的dot-ELISA方法，当病叶1:640倍稀释(w/v,g/mL)时仍能检测到病毒。分泌抗CTLV单抗杂交瘤细胞及其单抗的获得和相关血清学检测方法的建立为该柑橘病毒病的诊断、预测预报及科学防控提供技术和物质支撑。

Description

分泌抗柑橘碎叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗柑橘碎叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。

背景技术

柑橘碎叶病毒（Citrustatterleafvirus,CTLV）引起的柑橘碎叶病在我国分布广泛，台湾、浙江、广西、湖南、湖北和四川等省（区）均有分布，为我国继柑橘衰退病和裂皮病之后的一种重要的柑橘病毒病。起源于我国的柑橘品种温州蜜桔和北京柠檬被认为是该病毒的最初来源，因北京柠檬的感病接穗在厚皮莱蒙植株上，能引起叶片黄斑、变小、叶缘破碎，故称碎叶病。在我国的临近地区如韩国、日本、菲律宾CTLV的发生也极其普遍，在南非、美国和澳大利亚的北京柠檬上检测到了CTLV。CTLV病毒为发状病毒属（Capillovirus）成员，是侵染柑橘的重要病原之一。CTLV病毒粒子为曲杆状，大小约为600-700nm×13-15nm。致死温度为60-70℃（10min），稀释终点10^-4-10^-5，体外保毒期为4-8d。它主要通过嫁接和受污染的工具传播，实验室发现昆诺黎、豇豆和大豆的种子可以传播CTLV，至今还未发现昆虫传播介体。碎叶病毒在柑橘类植物中有广泛的寄主，在本地早、早橘、朱红、北京柠檬、文旦柚、蕉柑、兴津早温、宫川早温、红心柚、冰糖橙、大红甜橙、雪柑、暗柳、新会橙、改良橙、森田脐橙、贡柑、砂糖柑等品种中都鉴定到CTLV。在日本发现野百合也是CTLV的寄主。人工汁液摩擦接种条件下，CTLV侵染豇豆、菜豆、黄瓜、烟草、向日葵、苋色藜、昆诺黎和克里夫兰烟。柑橘碎叶病毒在昆诺黎的接种叶片表现黄色斑点，上部未接种叶片表现出明脉或皱缩，在克里夫兰烟上表现为系统斑驳、花叶，在豇豆上表现为局部枯斑，在鸡冠花上表现为局部环斑。CTLV在多种柑橘品种上存在隐症现象，只有在一些敏感品种上才出现症状，且不同品种、不同接种条件和不同接种方式都会引起症状上存在一定差异。为了掌控柑橘发病状况，强化我国柑橘碎叶病早期监测和预警，科学指导防控，急需建立检测柑橘中CTLV的高通量的检测方法，而目前没有这种高通量的检测方法，仅用低效率的电镜观察、RT-PCR方法、核酸电泳等方法进行小样本检测。本发明以原核表达的CTLV衣壳蛋白（CP）为抗原通过杂交瘤技术制备了1株抗CTLV的特异性单克隆抗体，以制备的单抗为核心建立了检测CTLV的高通量的血清学方法，并成功应用于田间CTLV的检测，从而为我国柑橘碎叶病毒病早期监测和预警，防控策略提供物质和技术支持。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗柑橘碎叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗应用。

分泌抗柑橘碎叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株6C5，它能分泌抗柑橘碎叶病毒的特异性单克隆抗体，杂交瘤细胞株6C5保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.8779。

抗柑橘碎叶病毒的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，该单克隆抗体能与柑橘碎叶病毒27kD的外壳蛋白亚基有特异性免疫结合反应。

抗柑橘碎叶病毒的单克隆抗体仅与柑橘碎叶病毒有特异性免疫反应，而与柑橘衰退病毒、柑橘裂皮病类病毒、芜菁花叶病毒、番茄花叶病毒、烟草花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、黄瓜花叶病毒、香蕉线条病毒、香蕉苞片嵌纹病毒均不发生免疫反应；

抗柑橘碎叶病毒单克隆抗体在柑橘碎叶病毒检测上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。

本发明与现有技术相比具有的有益效果：1）提供的杂交瘤细胞株6C5分泌抗柑橘碎叶病毒特异性单克隆抗体，以该单抗为核心建立的TAS-ELISA和dot-ELISA等免疫学方法及用这些方法建立的试剂盒能高度特异、准确、灵敏的检测柑橘碎叶病毒；2）利用本发明所制备的单克隆抗体检测柑橘碎叶病毒，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3）利用本发明所制备的单克隆抗体，可有效地用于田间柑橘类样品中的柑橘碎叶病毒的检测。

附图说明

图1是dot-ELISA方法检测柑橘CTLV的灵敏度分析；

图2是dot-ELISA方法检测柑橘田间样品中CTLV的结果；

生物保藏

杂交瘤细胞株6C5保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏日期为：2014年1月22日，保藏号为CGMCCNo.8779。

具体实施方式

分泌抗柑橘碎叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株6C5于2014年1月22日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.8779，它能分泌抗柑橘碎叶病毒的单克隆抗体。

抗柑橘碎叶病毒的单克隆抗体腹水间接ELISA效价均达10^-7，抗体类型及亚类均为IgG1、kappa链，该单克隆抗体能与柑橘碎叶病毒27kD的外壳蛋白亚基有特异性免疫结合反应。

抗柑橘碎叶病毒的单克隆抗体仅与柑橘碎叶病毒有特异性免疫反应，而与柑橘衰退病毒、柑橘裂皮病类病毒、芜菁花叶病毒、番茄花叶病毒、烟草花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、黄瓜花叶病毒、香蕉线条病毒、香蕉苞片嵌纹病毒均不发生免疫反应。

抗柑橘碎叶病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。

本发明提供的杂交瘤细胞株6C5能大量分泌抗柑橘碎叶病毒单抗，且其分泌的单抗特异性强、效价高、稳定性好。以该单抗为核心建立了检测CTLV的高通量的血清学方法及其试剂盒，可成功应用于田间CTLV的检测，从而为我国柑橘碎叶病早期监测和预警，科学指导防控提供物质和技术支持。

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

一、杂交瘤细胞获得及其单克隆抗体的制备

1.免疫原及检测抗原的制备

根据已报道的CTLV编码外壳蛋白基因序列（登录号：FJ223212）设计一对特异引物：CP-F(5′-TTG GGATCC ATGAGTTTGGAAGACGTGCT-3′，划线部分为BamHⅠ酶切位点和CP-R(5′-TAAA GAGCTC CTAACCCTCCAGTTCC-3′，划线部分为XhoⅠ酶切位点），并由上海英骏生物技术有限公司合成。利用Trizol法提取柑橘病样的总RNA，以总RNA为模板，进行反转录，37℃，15min逆转录反应后，98℃5min灭活酶后将cDNA保存于4℃或者-20℃待用。以cDNA为模板进行PCR反应，即上述反转录的cDNA模板1μl，5×PrimeSTARTMBuffer（含Mg²⁺）10μl，dNTPMix4μl，PrimeSTARTMDNAPolymerase（2.5U/μL）0.5μl，上下游引物各1μl，最后加无菌双蒸水补足反应终体积为50μl。PCR反应参数如下：预变性94℃2min，变性94℃30s，退火54℃45s，延伸72℃45s，循环扩增35次，最后72℃延伸10min。扩增产物于0.8%琼脂糖凝胶进行电泳分析，并用PCR凝胶回收试剂盒(AxyGEN)回收DNA片段，具体操作参照产品试剂盒说明书进行。将纯化的PCR产物末端加A与克隆载体pMD-18Tvector连接，重组质粒命名为pMD18-T-CP，并转化到大肠杆菌DH5α的感受态细胞中，用质粒提取试剂盒(AxyGEN)提取重组质粒，对提取的重组质粒进行PCR和双酶切鉴定，并通过测序验证重组克隆载体pMD18-T-CP中所携带的CP基因序列及读码框的正确性，序列分析软件为DNAstar、NCBI-BLAST，所用的数据库为GeneBank等。重组质粒pMD18-T-CP中CP基因片段经BamHI和XhoⅠ双酶切后定向插入经同样酶切的pET-28a表达载体中。PCR、酶切筛选阳性克隆，并通过测序验证重组原核表达载体pET-28a-CP中所携带CP基因序列未突变且读码框正确。并把原核表达质粒pET-28a-CP42℃热击转化入大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中，挑取单菌落接种到含氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃培养过夜，按1﹕100的比例将培养物接种于含氨苄青霉素的新鲜LB培养基中，振荡培养至OD600≈0.5,加入终浓度为1mMIPTG诱导表达4h，离心收集菌体。部分菌体加入1×SDS-PAGE上样缓冲液悬浮，沸水中变性5-l0min,12000rpm离心后取上清10μ1进行12.5％SDS-PAGE电泳分析，其余菌体经超声波破碎，收集上清按照产品说明书进行用Ni²⁺-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白。SDS-PAGE电泳发现纯化到了大小为27kD的重组蛋白条带，纯度达到90%。以纯化的重组CP蛋白作为免疫原和检测抗原。

2.免疫动物

用纯化的CTLVCP蛋白免疫四周龄体重18-20gBALB/C雌性小鼠：纯化的CP蛋白以生理盐水稀释与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射0.2ml每只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔注射0.2ml每只，过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。

3.细胞融合

取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）按6：1的比例，在无血清的RPMI-1640（Gibco）培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基，用50%PEG（Sigma，分子量1500）作为融合剂，在37℃下水浴下加入1ml，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37℃，5%CO2的细胞培养箱中培养。

4.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆

细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10%-50%时，以CTLVCP重组蛋白和感病叶子汁液为检测抗原包被ELISA板，用常规间接ELISA方法筛选阳性孔，共获50多个阳性孔。选择7个呈强阳性反应的细胞孔进行有限稀释法克隆，获得1株能分泌抗CTLV的特异性单抗的杂交瘤细胞株6C5。经6个月以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。

5.单克隆抗体的特异性检测

用感染芜菁花叶病毒（TuMV）、番茄花叶病毒（ToMV）、烟草花叶病毒（TMV）、马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯Y病毒(PVY)、黄瓜花叶病毒（CMV）、香蕉线条病毒（BSV）、香蕉苞片嵌纹病毒（BBrMV）、柑橘衰退病毒（CTV）和柑橘裂皮病类病毒（CEV）的病叶汁包被ELISA板，以相应的健叶提取液作阴性对照，以感染柑橘碎叶病毒病叶为阳性对照，用ACP-ELISA法测定单抗的特异性反应。ACP-ELISA方法具体为上述病毒感染的病叶用液氮研磨成粉末，按1:30（w/v,g/mL）加入ELISA包被液研磨后100ul/孔包被ELISA板，4℃过夜或37℃2小时，使其吸附于聚苯乙烯ELISA板孔；PBST洗涤三次后用3％的脱脂奶粉或1％BSA或4％牛血清封闭30-60min;加入单抗100ul/孔，37℃1-2小时；PBST洗涤三次后加入稀释10000倍的碱性磷酸脂酶(AP)标记兔抗鼠IgG二抗（Sigma公司）100ul/孔，37℃1-2小时，PBST洗涤四次后，用PNPP底物显色，2mol/L氢氧化钠终止反应后，用酶标仪读取OD₄₀₅的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。结果发现，6C5单抗对CTLV有特异性反应，而与柑橘衰退病毒、柑橘裂皮病类病毒、芜菁花叶病毒、番茄花叶病毒、烟草花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、黄瓜花叶病毒、香蕉线条病毒、香蕉苞片嵌纹病毒和健康植物均无免疫反应。

6.单克隆抗体腹水制备及纯化

取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷（Sigma），7-10天后腹腔注入5-10×10⁵个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，3000rpm离心3min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水。取1倍体积腹水加2倍体积0.06MPH4.8醋酸缓冲液稀释，加辛酸（30ul/ml腹水），室温下边加边搅拌，4℃澄清1小时，12000rpm离心20min，收集上清，再用50%饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4℃放置2小时，3000rpm离心20min，沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4℃流动透析24小时后即获纯化的腹水抗体，-70℃保存。

7.单克隆抗体的类型和亚类鉴定及其腹水效价测定

将纯化的单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/C小鼠IgG₁、IgG_2a、IgG_2b、IgG₃、IgM抗体作双向琼脂扩散试验，结果发现上述单抗的抗体类型和亚类为IgG1、kappa链。用间接ELISA方法检测单抗腹水效价，结果为上述单抗腹水效价达到10^－7。

二、病毒免疫学检测方法及其试剂盒

1.检测CTLV的TAS-ELISA检测方法

1.1.TAS-ELISA方法的操作流程：

1)抗CTLV的兔抗血清1:4000倍稀释后（原核表达的CTLVCP重组蛋白免疫兔子获得）100ul/孔包被聚苯乙烯板，37℃，2-4h或4℃，过夜；

2)PBST洗涤三次后加1-10％的脱脂奶粉或1-3％BSA或3-6％牛血清封闭200ul/孔于37℃封闭30-60min；

3)加入检测样品100ul/孔。以CTLV病叶为阳性对照，以相应的健康样品为作阴性对照，37℃1-2h；

4)洗涤后用封闭液稀释5000倍的单抗腹水100ul/孔，37℃1-2h

5)PBST洗涤后加入10000倍稀释的AP标记兔抗鼠IgG二抗（Sigma）100ul/孔，37℃1-2h

6)PBST洗涤后加PNPP底物于室温显色5-30min，肉眼观察底物颜色变成黄绿色的孔为阳性，2mol/L氢氧化钠终止反应后，用680型酶联免疫检测仪测405nm的OD值，以P/N>2.1作为阳性判断标准。

1.2.TAS-ELISA检测方法最适条件的确定：

采用TAS-ELISA方阵试验进行，即横向分别加用包被缓冲液从1﹕100至1﹕102400倍比稀释的兔抗CTLV血清；加入CTLV病叶汁；纵向分别加用封闭液从1﹕5至1﹕2048000倍比稀释单抗腹水；AP标记的兔抗鼠IgG二抗（Sigma公司产品）1﹕10000倍稀释；按TAS-ELISA方法流程进行操作。结果为CTLV的兔抗血清及单抗的最适稀释度分别为1﹕5000、1﹕8000。

2.3.TAS-ELISA方法检测灵敏度的确定

在兔抗血清和单抗腹水最适工作浓度下，将CTLV病叶汁用PBS倍比稀释后进行TAS-ELISA测定，结果表明TAS-ELISA检测病叶达到1:6000倍稀释（w/v,g/mL），说明本方法具有很好的灵敏度。

2.dot-ELISA方法的建立及田间检测应用

2.1dot-ELISA方法的操作流程：

将柑橘叶片称重后用液氮研磨成粉末，按1:10～30（w/v,g/mL）加入0.01mol/LPBS（pH7.4）后研磨；病汁液5000rpm离心3min;取3μl上清点到硝酸纤维素膜（NC）上，同时设置健康和感病柑橘叶汁分别作为阴性和阳性对照；室温干燥10～20min;NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST(含0.05%Tween-20的0.01mol/LPBS)封闭液中室温封闭30min；NC膜放入适度稀释的单抗中室温孵育30～60min；用PBST洗膜3～4次，每次3min；NC膜放入适度稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30~60min;PBST洗膜4～5次，每次3min;66μLNBT和33μLBCIP底物(Promega)加入到10ml底物缓冲液(0.1mol/LTrisCl、0.1mol/LNaCl、0.025mol/LMgCl、pH9.5)混匀，膜放入底物液中反应，肉眼观察结果。待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。

2.2用方阵试验确定检测柑橘病叶的dot-ELISA单抗和酶标二抗的最适工作浓度，试验表明6C5单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1:5000和1:8000倍稀释。以上述抗体的最适工作浓度建立检测CTLV的dot-ELISA方法。灵敏度分析表明，当柑橘叶片稀释到1:640倍（w/v,g/mL）时，以6C5单抗建立的dot-ELISA检测均呈现紫色的阳性斑点，即其检测病叶的灵敏度达到1:640倍稀释（图1）。

2.3建立的dot-ELISA方法的田间检测应用

用建立的dot-ELISA方法对2012、2013年采自浙江、重庆等田间疑似发病柑橘样品进行检测，结果发现，50个柑橘科植物检测样品中有41个样品产生紫色的阳性斑点，部分样品的检测结果如图2。阳性样品进一步用RT-PCR分析，结果表明所有的dot-ELISA阳性样品均检测到CTLV特异性的PCR产物，PCR产物核酸测序表明阳性样品感染CTLV。说明该dot-ELISA方法能准确、可靠地用于柑橘类样品中柑橘碎叶病毒的检测。

3柑橘碎叶病毒dot-ELISA检测试剂盒

1）试剂盒主要成分：

CTLV单克隆抗体1管0.2ml

AP标记羊抗鼠IgG二抗1管0.1ml

NBT/BCIP底物各1瓶分别为2ml和1ml

阳性对照（含CTLV柑橘叶片汁液）1管2ml

阴性对照（健康柑橘叶片汁液）1管2ml

抗体稀释液（10X）1瓶80ml

以上试剂均保存于4℃下

硝酸纤维素膜(NC)10张

2）检测柑橘样品的操作步骤：

a.将柑橘叶片称重后用液氮研磨成粉末，按1:10～30（w/v,g/mL）加入0.01mol/LPBS（pH7.4）后研磨；

b.病汁液5000rpm离心3min;

c.取3μl上清点到NC上，同时设置健康和感病柑橘叶汁分别作为阴性和阳性对照，室温干燥10-20min;

d.NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST(含0.05%Tween-20的0.01mol/LPBS)封闭液中室温封闭30min；

e.NC膜放入1:2000倍稀释的单抗中室温孵育30-60min；

f.用PBST洗膜3～4次，每次3min；NC膜放入1:3000稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30～60min;

g.PBST洗膜4～5次，每次3min;66μLNBT和33μLBCIP底物加入到10ml底物缓冲液(0.1mol/LTrisCl、0.1mol/LNaCl、0.025mol/LMgCl、pH9.5)混匀，膜放入底物液中反应，肉眼观察结果；

h.待阳性对照显色明显（紫色），而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。

3）保存及有效期于2～8℃避光保存，有效期12个月。

4）缓冲液配方：

磷酸盐缓冲液（PBS，0.01mol/L，pH7.4）：

NaCl8g

KCl0.2g

KH₂PO₄0.2g

Na₂HPO₄12H₂O3g

叠氮化钠0.2g

加蒸馏水950ml溶解后调pH至7.4，定容至1000ml，ELISA洗涤液（0.01mol/LPBST）：1000ml0.01mol/LPBS中加0.5mlTween-20，ELISA封闭液：0.01mol/LPBST中加入脱脂奶粉至终浓度5%（W/V）。

Claims (4)

1.一种分泌抗柑橘碎叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株6C5，其特征在于能分泌抗柑橘碎叶病毒的特异性单克隆抗体，杂交瘤细胞株6C5保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.8779。

2.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株6C5分泌的抗柑橘碎叶病毒的单克隆抗体，其特征在于该单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，该单克隆抗体能与柑橘碎叶病毒27kD的外壳蛋白亚基有特异性免疫结合反应。

3.如权利要求2所述的杂交瘤细胞株6C5分泌的抗柑橘碎叶病毒的单克隆抗体，其特征在于该单克隆抗体仅与柑橘碎叶病毒有特异性免疫反应，而与柑橘衰退病毒、柑橘裂皮病类病毒、芜菁花叶病毒、番茄花叶病毒、烟草花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、黄瓜花叶病毒、香蕉线条病毒、香蕉苞片嵌纹病毒均不发生免疫反应。

4.一种如权利要求2所述的抗柑橘碎叶病毒单克隆抗体在柑橘碎叶病毒检测上的应用，其特征在于以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。