CN105219732A - 一种永生化人肝癌血管内皮细胞系及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域。本发明提供了一种永生化人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-1，其保藏号为CCTCC？NO：C2015172，于2015年10月15日保藏于中国典型培养物保藏中心。本发明还提供了ECDHCC-1的构建方法和鉴定。本发明获得的细胞系经单克隆传代，传代培养历时长达18月之久，至保藏日期共计119代，其生物学特性保持一致；本发明的细胞系彻底改善了目前研究肿瘤血管只能“现用现取”的烦琐程序以及人肝癌手术标本的资源匮乏现状，为相关研究者提供了商品化的稳定的肿瘤源性血管内皮细胞系，真正做到省时、省力、高效、便利。

Description

一种永生化人肝癌血管内皮细胞系及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种永生化人肝癌血管内皮细胞系的构建、体外培养体系、鉴定及其应用。

背景技术

癌症是严重危害人类健康的重大疾病，攻克癌症治愈的任务仍很艰巨。迄今为止，虽然抗癌药物以雨后春笋般的出市，但是癌症的根治问题仍未解决。研究表明，肿瘤的生长和转移与肿瘤血管密切相关。近年来，临床上利用“饥饿疗法”配合化疗治疗癌症，就是阻断肿瘤的新生血管使肿瘤细胞所需的营养和氧分供应缺失，从而导致癌细胞饿死。然而，靶向血管抗癌药如贝伐单抗在目前临床应用中出现疗效不一，其原因之一可能与在药物研发中采用的靶细胞来源于正常血管而不是肿瘤组织血管细胞有关。资料报道，肿瘤血管的生物学特性是有别于正常血管，所以基于正常血管的靶向药物用于抗癌治疗(严格来讲)是不精准的。

对此，建立肿瘤血管内皮细胞模型对研发肿瘤血管靶向药物是十分必要的。既往国内外的实验室已采用免疫磁珠法分离提取出实体肿瘤血管内皮细胞(孔令群等，人肝癌血管内皮细胞分离培养、鉴定及比较，中华实验外科杂志，2011,28(2)：236-238)，但是这种方法获得血管内皮细胞的纯度不高，并且由于体外培养细胞寿命的自然极限(海弗利克极限，Hayflicklimit，ShayJW,WrightWE:Hayflick,hislimit,andcellularageing,NatRevMolCellBiol,2000,1(1):72-76)，通常随着时间的推延，培养的细胞逐渐出现生长缓慢，有丝分裂停滞，细胞渐渐衰老死亡(CampisiJ:Replicativesenescence:anoldLives’tale？,Cell,1996,84:497-500)。经检索专利数据库发现，中国专利申请CN201510143871.3，申请公布号为CN104726408A，发明名称为“血管内皮细胞的快速提取方法”，该专利申请也公开了用免疫磁珠法分离肿瘤血管内皮细胞的方法，包括以下步骤：用眼科剪剪碎离体的肿瘤组织得到破碎肿瘤组织，用胶原酶和/或胰酶消化破碎肿瘤组织得到肿瘤单细胞；利用免疫磁珠法分选得到所述肿瘤血管内皮细胞。应该指出，该专利申请也是采用“现用现取”方法获得肿瘤血管内皮细胞。迄今为止，本领域相关研究者只能采用新鲜分离的肿瘤血管细胞作为材料，然而这种每次“现用现取”的方法都需要消耗大量的时间作细胞性能的鉴定，这样在人力、物力、财力上都是巨大的浪费和低效。

目前在市面上还没有一株鉴定为肿瘤血管内皮细胞系出售，这种长期以来缺乏稳定的肿瘤源性血管内皮细胞系及其体外培养体系已构成了研究肿瘤血管生成机制以及血管靶向药物筛选的瓶颈问题。因此，建立纯化的人肿瘤血管内皮细胞模型势在必行，特别是获得永生化的人肿瘤血管内皮细胞更是本领域研究人员翘首以盼的。

近年来，随着基因工程技术的发展，使体外培养细胞的有限寿命转化为无限繁殖的永生化细胞系成为可能，其基本原理是将可持续复制的外源基因插入到基因载体，然后转入到靶细胞(原代细胞)，使该外源性基因能整合到靶细胞基因组中，从而获得稳定的永生化细胞系。目前常用的可持续复制外源性基因有simianvirus40largeT(SV40-LT)病毒基因，SV40-LT慢病毒转染哺乳动物细胞后可使细胞无限制繁殖即永生化转化。因此，SV40-LT慢病毒是制备永生化细胞模型的常用工具(解慧琪，杨志明，屈艺，SV40与细胞永生化，中国修复重建外科杂志2000，14(3)：170-174)。经检索专利数据库，相关的应用可见中国专利申请CN01130757.9，申请公布号为CN1336431A，发明名称为“人卵巢癌永生化细胞株的建立”，该专利申请公开了一种人卵巢癌永生化细胞株的建立方法，是将SV40T抗原基因导入人卵巢癌原代细胞，经筛选，抗性克隆扩大培养，得到一株体外长期稳定生长和传代的人卵巢肉瘤样癌细胞株BUPH:OVSC－2，保藏号为NO.0606。

目前尚未见文献报道有关SV40相关基因导入原代人肿瘤血管内皮细胞或其他方式建立的永生化人肿瘤血管内皮细胞株及其构建的方法和鉴定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种永生化人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-1，本发明另一目的在于提供该永生化人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-1的构建方法和鉴定，本发明的第三目的在于提供该永生化人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-1的应用,为研究肿瘤血管生成的调控以及血管靶向抗癌药物的筛选提供根本的物质基础。

本发明的主要技术方案：考虑到被转染的靶细胞是原代人肝癌血管内皮细胞，常规的转染技术(即物理介导、化学介导以及生物介导中的一些病毒如腺病毒和逆转录病毒)对这种真核原代细胞的转染效率极低，因而很难建立稳定的转染细胞株。对此，本发明采用慢病毒转染技术，构建SV40-LT慢病毒载体(SV40-LTLentiviralvector)(见图1)，其中包含有SV40-LT基因(PSV40)和用于真核细胞转染筛选的抗嘌呤霉素基因(Puro)。由于考虑到被该病毒转染的靶细胞在下一步应用中会用到带荧光报告基因(比如GFP)的转染方法，所以构建SV40-LT慢病毒载体中没有携带GFP基因。在制备靶细胞方面，本发明采用CD31免疫磁珠联合流式细胞仪双分选技术，高度纯化人肝癌血管内皮细胞：首先用磁珠富集肝癌组织中血管内皮，培养传代到第6代时，采用流式细胞仪进一步纯化血管内皮细胞。本发明的另一个创新举措是，用先进的流式细胞分选仪对经嘌呤霉素多次筛选后的活细胞进行单细胞分选纯化，确保稳定转染的靶细胞是CD31阳性肝癌血管内皮细胞。

本发明的第一方面，是提供了一种永生化人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-1，其保藏号为CCTCCNO：C2015172，于2015年10月15日保藏于中国典型培养物保藏中心。

本发明的第二方面，提供了该永生化人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-1的构建方法和鉴定。

本发明的构建方法包括：

A、分离提取人肝癌(中分化)组织血管内皮细胞。

B、原代人肝癌血管细胞的培养及培养体系。

C、构建SV40-LT慢病毒载体，用该病毒转染原代人肝癌血管内皮细胞，并药物筛选出阳性细胞。

D、用流式细胞仪单细胞模板分选，高度纯化携带SV40-LT基因的CD31阳性细胞。

步骤A具体为：经知情同意和医学伦理批准，取人肝癌(中分化)手术切除新鲜标本，经酶消化分解组织，制备单细胞悬液。随后进行CD31免疫磁珠分选，当细胞培养传代至6代时，用流式细胞仪分选，进一步纯化CD31阳性血管内皮细胞。

步骤B具体为：将步骤A获得的CD31阳性细胞悬浮在T25培养瓶含ECM完全培养基，置37℃，5％CO₂,95％湿度的孵箱中培养。ECM完全培养基：ECM+5％胎牛血清+1％ECGS+青霉素100单位/mL+链霉素100μg/mL。

步骤C具体为:构建SV40-LT慢病毒载体,制备病毒，将该病毒转入纯化的原代肝癌血管内皮细胞，在培养中加入嘌呤霉素，筛选出阳性细胞并继续传代培养。用实时定量PCR仪检测转染细胞中的SV40-LT基因表达，确认SV40-LT已整合到靶细胞的基因组里。

步骤D具体为:收集经多次嘌呤霉素处理筛选的SV40-LT慢病毒转染细胞，用CD31荧光抗体染色，设置流式细胞仪BDFACSAriaⅡ单细胞分选模板,进行CD31阳性单细胞提取，机器自动收集细胞到含有ECM完全培养基的96孔培养板，每孔1个细胞。当细胞培养形成单克隆后，胰酶消化制备单细胞悬液，进行CD31抗体染色，进一步用流式细胞仪再次分析血管内皮细胞的纯化度。

步骤D之后，本发明的构建方法还包括：传代培养、冻存、复苏。

冻存：在细胞处于指数生长期，吸除培养瓶里的培养基，经胰酶消化制备单细胞悬液，用冻存液(90％的胎牛血清和10％的DMSO)调整细胞浓度为1X10⁶～2X10⁶/mL，分装1mL细胞悬液至EP管，置入冻存盒并存放到-80℃过夜，次日移入液氮。

复苏：从液氮中取出冻存管，迅速置于37℃温水中，将细胞悬液吸至离心管中，1500r/min，离心10min,弃去上清液，用ECM完全培养基制备单细胞悬液后转入培养瓶，置37℃，5％CO₂,95％湿度的孵箱中培养。

本发明还提供了对永生化人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-1的鉴定方法，包括：

E、血管内皮细胞形态学和表型分析

(1)透射电镜检测经CD31免疫磁珠联合流式细胞仪双分选技术提取并培养的肝癌血管内皮细胞，观察细胞质中具有血管内皮细胞特征性的Webel-Palade小体；

(2)激光共聚焦显微镜检测CD31与CD105和vWF等内皮细胞标志物在SV40-LT转染细胞上的共表达。

F、血管内皮细胞功能检测

用经典的内皮细胞功能检测方法包括Transwell小室迁移，划痕迁移以及管腔形成，观察SV40-LT转染后的细胞的这些功能变化。

G、转染细胞潜在恶变的检测

将SV40-LT基因整合后的ECDHCC-1细胞注射到裸鼠皮下，定期观察动物成瘤情况，以排除细胞的致瘤潜在性。

本发明从人肝癌组织中提取原代血管内皮细胞，采用SV40-LT慢病毒(见图1)转染细胞，并经过药物筛选和流式细胞仪单细胞分选纯化，其内皮细胞标志物CD31的表达为99.7％(见图2)。进行单克隆培养并传代至119代，历时18个月(截止保藏日期)，其细胞形态和活性以及生物学性能与原代细胞保持高度一致(见图3-图6)。最终，本发明成功地构建了一株永生化人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-1。

本发明进一步提供了ECDHCC-1质控方法和血管内皮细胞表型的分析：(1)实时定量PCR验证显示，转染阳性细胞的SV40-LT基因表达Ct值为19循环数(见图7)，与空载比较，说明ECDHCC-1已含有SV40-LT基因整合；(2)激光共聚焦显微镜检测到CD31与CD105、vWF、ICAM等内皮标志物在ECDHCC-1上共表达(图5)，说明SV40-LT基因整合后的细胞仍与原代细胞的内皮表型保持高度一致。

本发明进一步提供了ECDHCC-1细胞功能验证：经transwell,划痕，管腔形成实验，结果显示ECDHCC-1仍具有迁移和管腔形成能力的血管内皮细胞生物学特性(见图6)。

本发明还提供了动物成瘤验证，对接受该细胞皮下注射的裸鼠观察了2个月，尚未见裸鼠皮下成瘤，排除了携带SV40-LT基因的ECDHCC-1潜在的恶变性。

本发明的第三方面，提供了永生化人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-1的应用。

用本发明提供的ECDHCC-1细胞为实验对象(材料)，研究了Dicer、miRNA-210、FGFRL-1对血管调控的作用。采用过表达或基因沉默技术，发现Dicer、miRNA-210过表达时，细胞迁移功能增强(见图8)，而当用基因沉默FGFRL-1时，ECDHCC-1细胞的迁移力明显受抑制(图9)。说明了这些效应与在正常血管内皮细胞中的研究结果相对应。

本发明的永生化人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-1为研究肿瘤血管生成的调控机制提供了细胞材料。

本发明的永生化人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-1为血管靶向抗癌药物的筛选提供了细胞模型，尤其是应用于抗肝癌药物的筛选、抑制血管内皮细胞增殖药物的筛选等。

本发明的有益效果如下：

1.血管内皮细胞源于人肝癌手术标本，能真实地反映肿瘤血管生物学特性，因此优于既往用正常血管内皮细胞作研究材料来筛选血管靶向抗癌药物。

2.本发明首次采用SV40-LT慢病毒载体工具转染人原代培养肿瘤血管内皮细胞，打破了无永生化人肿瘤血管内皮细胞模型的纪录。

3.本发明首次采用流式细胞仪单细胞分选，提取和纯化肿瘤血管内皮细胞；

4.本发明首次进行肿瘤血管内皮细胞单细胞水平体外培养，以及单克隆传代，其传代培养历时长达18月之久，至保藏日期共计119代(并且将继续传代观察)，其生物学特性保持一致；

5.本发明首次采用精确先进的检测仪器和相关功能的手段，进行多角度全面分析ECDHCC-1的血管内皮细胞特性。

6.本发明的永生化人肝癌血管内皮细胞系将彻底改善本领域相关研究者只能采用“现用现取”的细胞制备方法，以致每次都需要消耗大量时间的现状，做到了省时、省力、高效，同时也弥补了人肝癌手术标本的资源匮乏。

7.本发明为本技术领域的相关研究者提供了商品化的稳定的肿瘤源性血管内皮细胞系，将为研究肿瘤血管生成机制以及血管靶向药物筛选提供便利而又充足的细胞原材料。

生物材料样品的保藏信息：

保藏单位：中国典型培养物保藏中心

地址：中国武汉武汉大学

保藏日期：2015年10月15日

保藏编号：CCTCCNO：C2015172

分类命名：永生化人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-1

附图说明

图1为SV40-LT慢病毒载体构建示意图。

图2为流式细胞仪单细胞分选CD31强阳性细胞以及细胞纯度分析，P4为分选设门。

图3为ECDHCC-1单克隆传代培养的显微镜下细胞状态，其中“P29，P38，P54，P122”表示第29，38，54，122代；“200X”表示显微镜的放大倍数。

图4为ECDHCC-1细胞的透射电镜下W-P小体超微结构。箭头指向细胞质里1粒W-P小体。

图5为激光共聚焦显微镜分析ECDHCC-1细胞的内皮标志物表达，其中箭头所指为CD31分别与CD105、VEGFR-2、vWF、ICAM共定位表达。

图6为血管内皮细胞功能鉴定；其中A为transwell小室迁移实验结果；B为划痕迁移实验结果；C为管腔形成。

图7为实时定量PCR验证转染后ECDHCC-1细胞中SV40-LT基因表达。SV40-LT阳性细胞Ct值(循环数)为19，说明SV40-LT慢病毒转染率极高。图8为miRNA-210过表达或FGFRL-1沉默后ECDHCC-1细胞transwell小室迁移能力改变。其中A示miRNA-210基因通过慢病毒载体(LV)转入ECDHCC-1细胞，与空载比较明显增加；B示对照组空载转染ECDHCC-1细胞迁移；C示miRNA-210过表达(LV-miR210)时，细胞transwell小室迁移能力增强(结晶染色阳性颗粒增加)；D示3个病毒(shRNA-F1,shRNA-F2,shRNA-F3)分别转染ECDHCC-1细胞，其中shRNA-F1抑制FGFRL-1表达最明显；E对照组空载时ECDHCC-1细胞transwell小室迁移；F.当shRNA-F1沉默FGFRL-1基因时，细胞transwell小室迁移能力明显下降(结晶染色颗粒明显减少)。

图9为Dicer或miRNA-210过表达时ECDHCC-1划痕迁移功能增强。其中A、B分别为Dicer、miRNA-210基因通过慢病毒载体转入ECDHCC-1细胞引起两个分子表达比较明显增加；C、D分别为Dicer、miRNA-210过表达时ECDHCC-1细胞划痕迁移增强。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。

下述实施例如无特殊说明所用方法均为常规方法。

实施例1：人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-1的建立、传代

1.分离提取人肝癌(中分化)组织血管内皮细胞及原代培养：

1.1.经知情同意和医学伦理批准，取人肝癌(中分化)手术切除新鲜标本，制备单细胞悬液：将组织液、红细胞及冰基础培养基冲洗干净后组织剪成1-2mm³碎块，移入装有10mL0.5％的Ⅰ、Ⅳ型胶原酶混合Hank’s溶液中，37℃孵育25min，10％BSA/PBS终止消化，用不同规格针头注射器反复抽吸细胞悬液，经70μm、40μm滤器过滤细胞悬液，在4℃1000r/min离心10min，弃上清后再作单细胞悬液，并在细胞悬液中加入DNase酶，防止细胞成团。

1.2.免疫磁珠分选:CD31免疫磁珠及磁珠分选系统购自德国美天妮生物技术有限公司。每60μL(1x10⁶个)细胞悬液，加入40μLCD31免疫磁珠抗体混合液，置于旋转混匀机4℃孵育20min。将LSColumn装在磁珠铁架磁性区上，磁柱中加入3mL的抽气PBS进行冲洗、湿润和排除空气。将待分选的细胞灌入过柱，用3mLPBS进行冲洗3次后，移除磁柱并放在一个无菌15-mL收集管中，用PBS将吸附在磁柱里的CD31阳性细胞冲入收集管，离心后细胞悬浮在ECM完全培养基，移至T25培养瓶,置于37℃，5％CO₂，95％湿度孵箱中培养。当细胞培养传代至6代时，制备单细胞悬液，CD31-PE抗体(购自美国BD公司)染色，进行流式细胞仪(BDFACSAriaⅡ，购自美国BD公司)分选，进一步纯化CD31阳性血管内皮细胞，继续培养。

2.构建SV40-LT慢病毒载体，建立本发明的永生化人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-1：

通常肝癌血管内皮细胞原代培养至第5代时，细胞增殖速度减慢，数量开始减少，到第8代时细胞停止生长，因此为了能获得延续稳定的培养细胞，本发明建立永生化细胞模型。

2.1.构建SV40-LT慢病毒载体(见图1)，制备病毒(委托上海吉凯基因化学技术有限公司)。本发明选用容易转化人原代细胞的慢病毒载体骨架，重组构建SV40-LT慢病毒载体(SV40-LTLentiviralvector)(见图1)，其中包含有SV40-LT基因(PSV40)和用于真核细胞转染筛选的抗嘌呤霉素基因(Puro)。由于考虑到被该病毒转染的靶细胞在下一步应用中会用到带荧光报告基因(比如GFP)的转染方法，所以构建SV40-LT慢病毒载体中没有携带GFP基因。

2.2.SV40-LT慢病毒转染原代人肝癌血管细胞以及药物筛选阳性细胞：取1例中分化肝癌手术标本，按上述1.1和1.2方法制备原代人肝癌血管内皮细胞，将第6代细胞按1x10⁵个铺至6孔培养板，细胞密度为30％-40％，将滴度为1×10⁸eTU/ml的SV40-LT慢病毒加入细胞培养板，放置在37℃，5％CO₂。湿度90％的孵箱培养3天。在第3天换新鲜培养基，同时加入嘌呤霉素，终浓度为10μg/mL,此后每3天换含嘌呤霉素新鲜培养基，药物处理4-5次。

2.3.单克隆纯化转染阳性细胞，确保稳定转染的靶细胞是CD31阳性肝癌血管内皮细胞：收集经嘌呤霉素多次筛选后的活细胞，用CD31-PE抗体染色，设置流式细胞仪BDFACSAriaⅡ(购自美国BD公司)单细胞分选模板,分选CD31阳性细胞，机器自动收集细胞到96孔培养板，每孔1个细胞。培养体系为ECM完全培养基。当细胞形成克隆后，0.25％胰酶消化制备单细胞悬液，收集部分细胞作CD31抗体染色，用流式细胞仪再次分析血管内皮细胞的纯化度，达99.7％(见图2)。

2.4.单克隆培养及其传代：96孔板中的单细胞培养至克隆融合度达到80％，吸去孔中的培养基，100μLPBS清洗一遍，30μL0.25％胰酶消化1.5min后加入150μL完全培养基，然后直接转入已含有1mL培养基的24孔板中，继续培养。当在24孔板中细胞融合度达到80％，500μLPBS清洗一遍，200μL0.25％胰酶消化2min，加入1mL5％FBS/PBS终止消化，1200rpm，6min离心，以2X105个/孔细胞密度转种入6孔板，加入2mL培养基。当6孔板中细胞融合度达到80％，同24孔板方法传代，并4X10⁵个/孔细胞密度转种入T25培养瓶中，加入5mL培养基继续培养。用此方法，对克隆1号细胞传代至今(截止保藏日期)已达119代，历时18个月。取其早、中、晚期培养的细胞，在显微镜下观察并拍照。结果表明，显微镜观察不同代数转染后的细胞形态，代表早期的第29,中期第38，第54代以及晚期122代的细胞生长状态良好，呈单细胞贴壁生长，各代的细胞形态几乎相同，呈梭形和铺路石特征，折光性强，都有接触性抑制现象出现(见图3)。

3.冻存和复苏

冻存：在细胞处于指数生长期，无菌条件下，制备单细胞悬液(步骤细胞同传代)，将细胞悬液吸至离心管中，1500r/min，离心10min,弃去上清液，用用冻存液(90％的胎牛血清和10％的DMSO)调整细胞浓度为1X10⁶～2X10⁶/mL，分装1mL细胞悬液至EP管，置入冻存盒并存放到-80℃过夜，次日移入液氮里。

复苏：从液氮中取出冻存管，迅速置于37℃温水中，待冻存管中的冻存物融化成液体后，将细胞悬液吸至离心管中，1500r/min，离心10min,弃去上清液，用ECM完全培养基制备单细胞悬液后转入培养瓶，置37℃，5％CO₂,95％湿度的孵箱中培养。

本发明涉及的培养液配方如下：

ECM完全培养基：ECM+5％胎牛血清+1％ECGS+青霉素100单位/mL+链霉素100μg/mL。

ECM培养基和内皮细胞生长因子ECGS：购自北京裕恒丰公司。

细胞冻存液(使用前现配)：含90％的胎牛血清和10％的DMSO。

综上所述，本发明的ECDHCC-1细胞，能在体外长期生长和无限传代，细胞生长状态良好，呈单细胞贴壁生长，不依赖任何基质细胞的支持而持续生长，能耐受冻存和复苏。

目前中国典型培养物保藏中心保藏的是我们培养的第119代的ECDHCC-1细胞株。

实施例2：人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-1的生物学特性鉴定

1.采用透射电镜观察到ECDHCC-1细胞质里存在W-P小体超微结构(见图4箭头处)，这是血管内皮细胞的形态特征之一。收集64代ECDHCC-1细胞，按透射电镜常规方法制作电镜检测切片，电镜放大一万倍拍照。

2.激光共聚焦显微镜检测CD31和CD105等表达：六孔板内制备培养细胞爬片，用4％多聚甲醛固定15min，PBS洗涤3x5min，0.3％TritonX-100/PBS10min，PBS洗涤1x5min，用指甲油标记边缘以防封闭液或抗体外漏，将100μL10％BSA/PBS滴在样本上封闭30min，随后加一抗孵育4℃过夜。次日PBS洗涤3x10min，在避光条件下加稀释的二抗染色，室温下孵育45-60min，PBS洗涤3x10min，染片上加DAPI使细胞核着色，最后在激光共聚焦显微镜(LeicaTCSSP5，德国)下观察，摄取图像。

结果显示：在共聚焦图片上，所有ECDHCC-1细胞呈CD31阳性，其中有些共表达CD105，VEGFR-2,vWF,ICAM(如图5箭头所示)。这些分子都是血管内皮细胞表明标志物，说明ECDHCC-1细胞具有血管内皮细胞的表型。

3.血管内皮细胞功能鉴定：

3.1.Transwell小室迁移：24孔板上放置小室(上室)，在其中加入1x10⁵个细胞，24孔板(下室)中加入含血清的培养基，培养24小时后取出上室，用PBS清洗掉未穿膜的细胞，并将上室放置4％多聚甲醛固定，结晶紫染色，在显微镜下拍照。24小时染色，

结果显示：经过24小时共培养，可见很多的ECDHCC-1细胞穿越上室微孔膜，出现大片结晶紫染色颗粒，说明ECDHCC-1也具有血管内皮细胞穿膜迁移的功能(见图6A)。

3.2划痕迁移：取六孔板每孔种植2x10⁵个细胞，待融合密度长至80％-85％，弃去培养基，PBS洗一次，取100ul枪头在细胞培养皿中间划开一条线，使两边细胞间有比较宽的距离，PBS洗去漂浮的细胞，加入培养基，20小时后拍照观察。

结果显示：经过20小时划痕后培养，在显微镜下可见细胞移动生长，划痕距离缩短。说明ECDHCC-1具有血管内皮细胞划痕迁移的功能(见图6B)。

3.3.管腔形成实验:将matrigel胶(购自BD公司)置于4℃过夜溶解，预先冷却96孔板和移液枪头，4℃环境下96孔板每孔加入60ul胶，放入37℃孵箱孵育30分钟。每孔加入2.5×10⁴个细胞，37℃，5％CO2孵箱中培养，10h后显微镜下观察成管现象。

结果显示：ECDHCC-1细胞经过10小时在matrigel胶中培养，它们犹如体内血管内皮细胞生长发芽形成血管腔，在显微镜下可见管状物，说明ECDHCC-1具有血管内皮细胞管腔形成能力，进一步证明ECDHCC-1是肿瘤血管内皮细胞(见图6C)。

3.4.验证SV40-LT慢病毒基因转染后细胞是否突变为瘤性：收集培养瓶中对数生长期的ECDHCC-1，取3只鼠龄六周半免疫功能低下的裸鼠，在其背部皮下注射1.3X10⁶个/200μLEDCHCC-1细胞，定期观察皮下成瘤情况。

结果显示：注射细胞后每周观察动物，直至2个月后3只荷瘤裸鼠都未见成瘤。说明可排除携带SV40-LT基因的ECDHCC-1的潜在恶变性。

3.5.定期检测不同代数ECDHCC-1细胞表达SV40-LT基因情况，确保转染的稳定性。参照实时定量PCR相对定量实验指南ABI7300-7500，按其常规检测转染细胞中SV40-LT基因表达水平。

SV40-LT引物如下：

SV40-F：TGGAACTGATGAATGGGAGCA(SEQIDNO:1)，

SV40-R：GAGAGTCAGCAGTAGCCTCATCATC(SEQIDNO:2)。

结果显示：转染阳性细胞的SV40-LT基因表达Ct值为19循环数(见图7)，与空载比较，说明ECDHCC-1已含有SV40-LT基因整合。

综上所述，本发明一方面利用SV40-LT慢病毒有很强的侵入真核细胞(如人原代培养细胞)及其所携带的SV40-LT容易整合到细胞的基因组,并且有无限复制的功能，另一方面利用先进的流式细胞分选仪，进行单细胞分选纯化等这些优势，从肝癌患者肿瘤组织里分离提取CD31阳性血管内皮细胞，经过上述慢病毒转染后进一步作单细胞分离培养，对单克隆进行多方面的验证，最终结果显示:本发明提供的ECDHCC-1是一株纯化的，稳定的而且有无限繁殖传代趋势的永生化人肝癌血管内皮细胞系，其生物学特性与原代的保持高度一致，并且没有致癌性。

实施例3：永生化人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-1的应用实验

将本发明提供的细胞系ECDHCC-1应用于基础研究：血管调控相关分子Dicer(GENBANKNW-177438)、miRNA-210(Accession：MIMAT0000267)、FGFRL-1(GENBANKNW-021923)对ECDHCC-1的功能影响。

采用慢病毒载体携带这些目的基因或沉默这些基因转染ECDHCC-1细胞，验证确认其有效转染，检测细胞功能改变。实验方法：参见XiaoF,QiuH,ZhouL,ShenX,YangL,andDingK.WSS25inhibitsDicer,downregulatingmicroRNA-210whichtargetsEphrin-A3,tosuppresshumanmicro-vascularendothelialcell(HMEC-1)tubeformation.Glycobiology,2013；23(5):524-535，将携带Dicer基因病毒，miRNA-210基因病毒，沉默(sh)FGFRL-1基因病毒(所有病毒购自上海吉凯生物有限公司)分别转入本发明提供的ECDHCC-1细胞，采用实时定量PCR验证转染效率，测定细胞过表达或抑制的功能改变。

结果显示：当miRNA-210过表达时，transwell小室迁移能力增强，而当FGFRL-1基因沉默时，小室迁移能力下降(见图8)。当Dicer或miRNA-210过表达时，均引起ECDHCC-1细胞划痕迁移功能增强(见图9)。

通过本发明ECDHCC-1的应用性研究，结果提示了ECDHCC-1细胞能真正代表肿瘤血管内皮细胞，可为研究肿瘤血管生成机制以及调控提供实质性的“原材料”。基于ECDHCC-1具有高纯度、无限繁殖但无致瘤性的肿瘤血管内皮细胞特性，这就排除了异质性，为今后血管靶向抗癌药物筛选的提供很好的基础材料。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (10)

1.一种永生化人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-1，其保藏号为CCTCCNO：C2015172，于2015年10月15日保藏于中国典型培养物保藏中心。

2.一种如权利要求1所述的永生化人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-1的构建方法，包括以下步骤：

A、分离提取人肝癌组织血管内皮细胞，先进行CD31免疫磁珠分选，再用流式细胞仪分选，进一步纯化CD31阳性血管内皮细胞；

B、原代人肝癌血管细胞的培养，将步骤A获得的CD31阳性血管内皮细胞悬浮培养于ECM完全培养基，37℃，5％CO₂,95％湿度；ECM完全培养基的配方为ECM+5％胎牛血清+1％ECGS+青霉素100单位/mL+链霉素100μg/mL；

C、构建SV40-LT慢病毒载体，用SV40-LTM慢病毒转染步骤B培养的原代人肝癌血管细胞，并进行嘌呤霉素筛选；

D、用流式细胞仪单细胞模板分选，纯化携带SV40-LT基因的CD31阳性血管内皮细胞。

3.根据权利要求2所述的永生化人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-1的构建方法，步骤A具体为：

经知情同意和医学伦理批准，取人肝癌中分化手术切除新鲜标本，经酶消化分解组织，制备单细胞悬液；随后进行CD31免疫磁珠分选，当细胞培养传代至6代时，用流式细胞仪分选，进一步纯化CD31阳性血管内皮细胞。

4.根据权利要求2所述的永生化人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-1的构建方法，步骤B具体为：

将步骤A获得的CD31阳性血管内皮细胞悬浮在T25培养瓶含ECM完全培养基，置37℃，5％CO₂,95％湿度的孵箱中培养；ECM完全培养基的配方为ECM+5％胎牛血清+1％ECGS+青霉素100单位/mL+链霉素100μg/mL。

5.根据权利要求2所述的永生化人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-1的构建方法，步骤C具体为：

构建SV40-LT慢病毒载体,制备病毒，将SV40-LT病毒转入纯化的原代肝癌血管内皮细胞，在培养中加入嘌呤霉素，筛选出阳性细胞并继续传代培养；用实时定量PCR仪检测转染细胞中的SV40-LT基因表达，确认SV40-LT已整合到靶细胞的基因组里。

6.根据权利要求2所述的永生化人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-1的构建方法，步骤D具体为：

收集经多次嘌呤霉素处理筛选的SV40-LT慢病毒转染细胞，用CD31荧光抗体染色，设置流式细胞仪BDFACSAriaⅡ单细胞分选模板,进行CD31阳性单细胞提取，机器自动收集细胞到含有ECM完全培养基的96孔培养板，每孔1个细胞；当细胞培养形成单克隆后，胰酶消化制备单细胞悬液，进行CD31抗体染色，进一步用流式细胞仪再次分析血管内皮细胞的纯化度。

7.根据权利要求2所述的永生化人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-1的构建方法，步骤D之后还包括：传代培养、冻存、复苏。

8.一种如权利要求1所述的永生化人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-1的鉴定方法，包括以下步骤：

E、血管内皮细胞形态学和表型分析；

F、血管内皮细胞功能检测；

G、转染细胞潜在恶变的检测。

9.一种如权利要求1所述的永生化人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-1在研究肿瘤血管生成调控机制中的细胞材料应用。

10.一种如权利要求1所述的永生化人肝癌血管内皮细胞系ECDHCC-1在血管靶向抗癌药物筛选中的细胞模型应用。