CN101802208A - 通过提取式发酵减少原料中杂质的毒性作用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了生物产品和改善由工程微生物细胞产生生物产品的的方法，该方法包括：提供包含粗碳源的发酵液；用所述微生物细胞接种所述发酵液；以及培养接种的发酵液；其中所述生物产品是与所述发酵液不混溶的疏水性溶剂，并且其中存在于所述粗碳源中的毒副产品在所述疏水性溶剂中是可溶的。还提供了用于实施改善生物产品产生的方法的试剂盒。

Description

通过提取式发酵减少原料中杂质的毒性作用

引用的相关申请

本专利申请要求享有于2007年9月27日提交的U.S.临时专利申请No.60/975,798的优先权，通过引用将其并入。

背景技术

石油是在地球上发现的以液态、气态或固态形式存在的有限的、天然资源。石油主要由碳氢化合物组成，碳氢化合物主要由碳和氢组成。它也含有大量的以不同形式存在的其他成分，例如，氮、氧或硫。除了勘探、提取、运输和精炼石油这些问题之外，石油还是有限的以及缩减的资源。估计世界上石油的消耗量是每年300亿桶。据一些估算，预计以现在的生产水平，世界上石油的储量会在2050年之前耗尽。

石油是宝贵的资源，但是开发石油产品的成本相当大，不管是财政上还是环境上。首先，必须发现石油资源。石油勘探是昂贵的并且有风险的投资。勘探深水井的成本可超过1亿美元。并且，不能保证这些井一定含有石油。估计只有40％的钻井是可产生商业碳氢化合物的可生产性井。石油提取还伴随环境成本。例如，石油提取能导致大量石油渗出到表面。此外，近海钻井包括挖掘海床，这会破坏或毁坏周围的海洋环境。

在发现可生产性井之后，必须以巨大的花费从地里提取石油。在一次开采(primary recovery)中，地下的自然压力足够将井里约20％的石油提取出来。当自然压力下降后，应用二次开采(secondary recovery)方法。通常，二次开采包括例如通过水喷射、天然气喷射或气升来提高井压。使用二次开采的方法，可以开采另外的5％-15％的石油。一旦二次开采的方法耗尽，可以使用三次开采方法。三次方法包括降低石油的粘性来使它更容易提取。使用三次开采方法，可以开采另外的5％-15％的石油。因此，即使是在最好的情况下，在一口井中也只能提取50％的石油。

由于发现石油矿层并不是均一地遍及地球，必须通过很长的距离将石油从石油生产地运输到石油消耗地。除了运输成本外，同样也有毁灭性的漏油的环境风险。

从地表提取的天然形式的原油几乎没有商业用途。它是不同长度和复杂性的碳氢化合物(例如，链烷烃(或烷烃)、烯烃(或烯)、炔、napthenes(或环烷)、脂肪族化合物，芳香族化合物等)的混合物。此外，原油含有其他有机化合物(例如，含有氮、氧、硫等的有机化合物)和杂质(例如，硫、盐、酸、金属等)。

因此，在商业化使用之前，必须精炼及纯化原油。由于其高能量密度及其容易可运输性，将大多数石油精炼成燃料，诸如运输燃料(例如，汽油、柴油、航空燃料等)，民用燃料油和液化石油气等。

原油也是用于生产石化产品的原料的主要来源。源自石油的原料的两种主要类型是短链烯烃(例如，乙烯和丙烯)和芳香族化合物(例如，苯和二甲苯异构体)。这些原料源自原油中的链更长的碳氢化合物，通过使用多种方法以相当大的费用将其裂化而获得，例如催化裂化、蒸汽裂化，或催化重整。这些原料用于制造石化产品，这些产品不能直接从原油中精炼而来，例如单体、溶剂、去垢剂，或粘合剂。

源自原油的原料的一个实例是乙烯。乙烯可用于生产石化产品，例如聚乙烯、乙醇、环氧乙烷、乙二醇、聚酯、乙二醇醚，乙氧基化物、醋酸乙烯、1，2-二氯乙烷、三氯乙烯、四氯乙烯、氯乙烯，以及聚氯乙烯。原料的另一个实例是丙烯，可用于生产异丙醇、丙烯腈、聚丙烯、环氧丙烷、丙二醇、乙二醇醚、丁烯、异丁烯、1，3-丁二烯、合成橡胶、聚烯烃、α-烯烃、脂肪醇、丙烯酸、丙烯酸聚合体、烯丙基氯、表氯醇，以及环氧树脂。

随后用这些石化产品制造特种化学品(speciality chemicals)，例如塑胶、树脂、纤维、人造橡胶、药物、润滑剂或凝胶。可以由石化产品原料生产的具体特种化学品为：脂肪酸、碳氢化合物(例如，长链、支链、饱和的、不饱和的等)、脂肪醇、酯、脂肪醛、酮、润滑剂等。

特种化学品有许多商业用途。脂肪酸在商业上被用作表面活性剂，例如，在去垢剂和肥皂中。它们也可以用作燃料、润滑油、涂料、油漆、蜡烛、色拉油、起酥油、化妆品以及乳化剂中的添加剂。此外，脂肪酸在橡胶制品中被用作促进活性剂。脂肪酸液可以用作给料，生产甲酯、酰胺、胺、酰基氯、酸酐、乙烯酮二聚体，以及过氧酸与酯。

碳氢化合物有许多商业用途。例如，用链较短的烷烃作为燃料。甲烷和乙烷是天然气的主要成分。用链较长的烷烃(例如，5-16个碳)作为运输燃料(例如，汽油、柴油或航空燃料)。具有多于16个碳原子的烷烃是燃料油和润滑油的重要成分。可以用在室温下是固态的更长的烷烃作为，例如，固体石腊。发现含有约35个碳的烷烃存在于沥青中，用于路面铺平。此外，链较长的烷烃可以经裂化产生商业上有用的链较短的碳氢化合物。

与短链烷烃一样，短链烯烃用于运输燃料中。链较长的烯烃用于塑胶、润滑剂以及人造润滑剂中。此外，烯用作给料，生产酒精、酯、可塑剂、表面活性剂、叔胺、增强型采油剂(enhanced oil recovery agent)、脂肪酸、硫醇、烯基琥珀酸酐、环氧化物、氯化烷、氯化烯、蜡、燃料添加剂，以及粘性流还原剂(drag flow reducer)。

脂肪醇有许多商业用途，包括例如，链较短的脂肪醇在化妆品和食品工业中用作乳化剂、润肤剂和增稠剂。由于它们的两性性质，脂肪醇表现为非离子性表面活性剂，这作为去垢剂很有用。此外，脂肪醇用于蜡、橡胶、树脂、医药品药膏和洗液、织物抗静电和抛光试剂、可塑剂、化妆品、工业溶媒，以及脂肪溶剂中。

酯有许多商业用途，包括例如，生物柴油作为另一种燃料。生物柴油由酯(例如，脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯)组成。一些低分子量的酯是易挥发的，带有令人愉悦的气味，这使它们可用作香料(fragrances)或调味剂。此外，酯可用作油漆、涂料以及清漆的溶剂。并且，一些天然存在的物质，例如蜡、脂肪以及油，是由酯组成的。酯也可在树脂和塑胶中用作软化剂，在汽油和油中用作可塑剂、阻燃剂以及添加剂。另外，酯可用来制造聚合体、胶片、纺织品、染料以及药物。

醛用于生产许多特种化学品，包括例如，产生多聚体、树脂(例如，酚醛树脂)、染料、调味品、可塑剂、香水、药物，以及其他化学品。一些被用作溶剂、防腐剂或消毒剂。一些天然的和合成的化合物是醛类，例如维生素和激素。此外，许多糖类含有醛基。

酮在商业上用作溶剂。例如，丙酮经常用作溶剂，但是它也是用于制备多聚体的原料。酮也用于油漆、涂料、炸药、香水以及纺织品的加工中。此外，酮用于生产酒精、烯烃、烷烃、亚胺以及烯胺。

另外，原油是润滑剂的来源。源自石油的润滑剂通常由烯烃，尤其是聚烯烃和α-烯烃组成。润滑剂可以从原油中精炼而来或使用从原油提炼的原料制造而来。

从原油中获得这些特种化学品需要极大的财政投资以及大量的精力。这同时也是一个低效的过程，因为原油中的长链碳氢化合物经常经裂化产生更小的单体。这些单体随后被用作原料来生产更复杂的特种化学品。

最后，基于石油的燃料的燃烧会释放温室气体(例如，二氧化碳)和其他形式的空气污染(例如，一氧化碳、二氧化硫等)。由于世界对燃料的需求增加，温室气体和其他形式的空气污染的排放也增加了。大气中温室气体的积累导致全球温度的升高。因此，除了破坏当地环境(例如，漏油、海洋环境的挖掘等)，燃烧石油也会破坏全球的环境。

由于石油引起的内在难题，因此需要避免与石油勘探、提取、长途运输和精炼有关的成本、时间和精力的可再生的石油资源。也需要可再生的石油资源，其可以经济地产生，而不产生由石油工厂和基于石油的燃料的燃烧所产生的环境破坏。基于类似的原因，也需要通常源自石油的可再生的化学品资源。

生产可再生石油的一种方法是通过工程微生物产生可再生的石油产品。一些微生物具有产生化学品的天然能力。例如，数百年来酵母被用于产生乙醇(例如，啤酒、葡萄酒等)。近年来，通过先进的生物技术，人工改造生物体的新陈代谢来产生不是生物体正常所能产生(或者产生水平非常低)的生物产品。源自这些细胞活动的产品，例如，化学品，称为生物产品(bioproduct)。由这些细胞活动产生的燃料称为生物燃料。生物燃料是基于石油的燃料的可再生的替代物。生物燃料可以取代任何基于石油的燃料(例如，汽油、柴油、航空燃料、民用燃料油等)。生物燃料可以源自可再生资源，例如植物物质、动物物质或甚至废品。这些可再生资源统称为生物质。生物燃料相对于基于石油的燃料的一个优势是，它们不需要昂贵的和有风险的勘探或提取。另外，生物燃料可以在本地生产。因此，它们不需要长途运输。并且，生物燃料可以直接生产而不需要精炼原油所需要的昂贵的和精力集中的精炼，或者它可能需要有限的和成本有效的水平的精炼。此外，生物燃料的使用通过减少基于石油的燃料的燃烧释放的环境有害性排放物(例如，室温气体，空气污染等)从而改善了环境。由于燃烧生物燃料所释放的碳的量等于其由生物质生产所使用的碳的量，因此生物燃料被认为是碳中立的。例如，由于生物燃料是由作为可再生天然资源的生物质所产生，因此生物燃料保持了碳循环的平衡。虽然燃烧生物燃料会释放碳(例如，二氧化碳)，但是这种碳会在生物质生产(例如，农作物耕作)中再循环，从而平衡碳循环，这与基于石油的燃料是不同的。

基于类似的原因，生物学方式获得的化学品相对于基于石油的燃料提供了与生物燃料相同的优势。生物学方式获得的化学品是石化产品的可再生代替物。生物学方式获得的化学品，例如碳氢化合物(例如，烷烃、烯或炔)、脂肪醇、酯、脂肪酸、脂肪醛以及酮优于石化产品，因为它们是直接生产的而不需要大量精炼。不同于石化产品，生物学方式获得的化学品不需要像原油一样被精炼来开采原料，原料随后必须被进一步处理来产生更复杂的石化产品。生物学方式获得的化学品是从生物质直接转化成所需要的化学产品。

在由细胞进行生物转化产生所需要的生物产品之前，可以处理生物质，从而使生物质转化为可溶的碳源，或粗碳源(crude carbon source，例如，碳水化合物、糖、葡萄糖等)。将生物质转化为粗碳源包括使用，例如，酶，稀释的无机酸或碱如石灰溶液(lime solution)。这种处理也可以包括，例如，温度升高的热加工步骤。这些处理的常见副作用是副产品的产生，其对细胞通常是有毒的或抑制的。例如，在木质纤维素物质水解过程中，会产生抑制细胞的副产品的复杂混合物。可以将这些化合物分为3种主要的类群：弱酸(例如，乙酸、蚁酸等)、呋喃衍生物(例如，糠醛、羰甲基糠醛等)以及酚类化合物。这些副产品对微生物的生长产生有害影响，从而降低了将碳源转化为商业上有价值的化合物的总效率。同样，去除或稀释这些多余的毒素的需要，导致最终产品成本的实质性增加。

因此，需要使用粗碳源由工程微生物产生商业上有价值的生物产品例如生物燃料的方法，其中粗碳源含有抑制细胞生物转化的副产品。特别是，所需要的方法是在大规模生产中有效并且经济的那些方法。

发明概述

本发明一方面包括改进由工程微生物细胞产生生物产品的方法，该方法包括提供包含粗碳源的发酵液(fermentation broth)；用所述微生物细胞接种所述发酵液；以及培养接种的发酵液；其中所述生物产品是与所述发酵液不混溶的疏水性溶剂，并且其中存在于所述粗碳源中的毒副产品在所述疏水性溶剂中是可溶的。

本发明的另一方面包括从发酵液的水相中被动地相分离毒副产品的方法，发酵液是粗碳源和微生物细胞的混合物，该微生物细胞经人工改造在所述的微生物细胞培养物的发酵中产生生物产品，该方法包括：提供包含粗碳源的发酵液；用所述微生物细胞接种所述发酵液形成发酵培养物；以及培养所述发酵培养物来产生所述生物产品；其中所述生物产品是疏水性溶剂，并且其中存在于所述粗碳源中的毒副产品在所述疏水性溶剂中是可溶的。

本发明的另一方面包含用于由生物工程细胞产生生物产品的试剂盒，该试剂盒包含：经生物工程改造从而由碳源产生生物产品的生物工程细胞的样品；包含源自生物质转化的粗碳源的发酵液；与所述发酵液不混溶并且能提取在所述生物质转化过程中形成的毒副产品的疏水性溶剂；以及使用所述生物工程细胞样品、发酵液和疏水性溶剂的发酵方法的说明书。

本发明另一方面包括由工程微生物细胞产生生物产品的持续发酵方法，该方法包括：提供所述微生物细胞的培养物；将包含粗碳源的一定量的发酵液的连续流引入所述培养物中；用所述发酵液使所述培养物发酵；以及从所述培养物中去除一定量的所述发酵液的连续流；其中所述生物产品是与所述发酵液不混溶的疏水性溶剂，并且其中存在于所述粗碳源中的毒副产品在所述疏水性溶剂中是可溶的。

在本发明另一方面中，提供的是通过一种方法由工程微生物细胞产生的生物产品，该方法包括：制备包含粗碳源的发酵液；用所述微生物细胞接种所述发酵液；培养接种的发酵液；从培养的发酵液中回收所述生物产品；其中所述生物产品是与所述发酵液不混溶的疏水性溶剂，并且其中存在于所述粗碳源中的毒副产品在所述疏水性溶剂中是可溶的。

在本发明另一方面中，提供的是由能量驱动的交通工具(vehicles)，该能量是通过一种方法由工程微生物细胞产生的生物产品的燃烧获得的，该方法包括：制备包含粗碳源的发酵液；用所述微生物细胞接种所述发酵液；培养接种的发酵液；从培养的发酵液中回收所述生物产品；其中所述生物产品是与所述发酵液不混溶的疏水性溶剂，并且其中存在于所述粗碳源中的毒副产品在所述疏水性溶剂中是可溶的。

优选实施方案的详细描述

“生物转化”和“发酵”在本文中互换使用。发酵是由活的生物(例如，细菌、单细胞植物，如酵母、霉菌或真菌)或酶引起的化学变化。该反应可以包括将碳源(例如，糖、淀粉、碳水化合物等)转化成生物产品。如本文所用的，该反应可以在厌氧、微需氧或需氧的条件下发生。

本文所用的术语“生物柴油”是指生物燃料的特殊类型。生物柴油可以是源自石油的柴油的替代品。生物柴油可以以称为“纯的”生物柴油的纯的形式，或作为任何浓度的与基于石油的柴油的混合物，用于内燃柴油发动机。生物柴油可以由碳氢化合物或酯组成。在一个实施方案中，生物柴油由脂肪酯组成，例如脂肪酸甲基酯(FAME)或脂肪酸乙基酯(FAEE)。在优选实施方案中，这些FAME和FAEE由碳链长度为约8-20、10-18或12-16个碳的脂酰基部分组成。用作生物柴油的脂肪酯可以含有饱和的或不饱和的碳链。

本文所用的术语“生物燃料”是指由长链碳氢化合物或酯制成的易燃燃料，优选那些生物可降解的，更优选那些清洁燃烧的可燃物。术语生物燃料也包括生物柴油。

本文所用的术语“生物质”是指任何可获得碳源的生物材料。碳源随后由本文所讨论的工程微生物细胞转化为合成的生物产品，包括在某些情况下的生物燃料。生物质可以包括来自工厂、农业、林业或家庭的废品。可以用作生物质的此类废品的实例为发酵废弃物(fermentationwaste)、稻草(straw)、木材(lumber)、污物(sewage)、垃圾(garbase)和食物剩余物(food leftovers)。生物质也包括碳源，例如碳水化合物(例如，单糖、二糖或多糖)。用所提供的方法使用的生物质优选是那些在被用于生物转化成生物产品之前需要一些初始加工的生物质。生物质的加工会导致有毒化学品的形成。这类有毒化学品或毒副产品的实例包括糠醛、5-羟甲基糠醛、脂肪族酸、酚类化合物、4-羟基苯甲醛、4-羟基苯甲酸、对苯二酸、儿茶酚、4-甲基儿茶酚、丁香醛、丁香酸、邻甲氧基苯酚、香草酸或香草醛。

本文所用的术语“生物产品”是指由工程微生物细胞(例如，E.coli细胞)所产生的有机分子。优选地，工程微生物细胞经人工改造产生所述生物产品。生物产品可以是几乎任何可以由工程微生物细胞的新陈代谢机制产生的有机分子，并且优选地是可以用作工业产品、工业产品的起始反应物或生物燃料的有机分子。例如，生物产品可以包括烷烃、酯、烯烃(例如，内烯烃、末端烯烃等)、脂肪酸、脂肪醇醛或酮。

本文所用的短语“碳源”是指适合用作支持原核或简单真核细胞生长的碳源的基质或化合物。

碳源可以成多种形式，包括但不限于多聚体、碳水化合物、酸、醇、醛、酮、氨基酸、肽以及气体(例如，CO和CO₂)。这些包括，例如，各种单糖，如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、木糖以及阿拉伯糖；寡糖，如果糖-寡糖和半乳糖-寡糖；二糖，如蔗糖、麦芽糖以及松二糖；纤维素物质，如甲基纤维素和羧甲基纤维素钠；木质纤维素物质；半纤维素物质；有机酸，如琥珀酸、乳酸以及醋酸；醇，如乙醇；或其混合物。

碳源也可以是光合作用的产物，包括但不限于葡萄糖。

优选地，碳源是最终源自加工的或处理的生物质的一种碳源。例如，生物质经处理可以产生单糖，如葡萄糖；多糖，如淀粉；或例如源自甜菜或糖浆的二糖。优选的碳源是葡萄糖。

在生物质处理之后，碳源处于未加工的状态，并且通常需要纯化以达到工程微生物细胞有效利用的纯度水平。

本文所用的短语“生物质的转化”或“生物质的处理”是指处理或转化生物质来产生可溶的碳源，或粗碳源(例如，碳水化合物、糖等)。将生物质转化成粗碳源包括使用，例如酶，稀释无机酸或碱，如石灰溶液。这类处理也可以包括，例如，温度升高的热加工步骤。然而，这些处理常见副作用是产生经常毒害或抑制细胞的副产品。

本文所用的“粗碳源”是指处于自然状态或碳源不纯的加工状态的碳源，并且除了其他化学品外，包括存在抑制细胞生长或细胞功能的有毒化学品或毒副产品。粗碳源源自生物质。将生物质加工成粗碳源会导致有毒化学品的形成，包括例如，糠醛、5-羟甲基糠醛、脂肪族酸、酚类化合物、4-羟基苯甲醛、4-羟基苯甲酸、对苯二酸、儿茶酚、4-甲基儿茶酚、丁香醛、丁香酸、邻甲氧基苯酚、香草酸或香草醛。

本文所用的“工程微生物细胞”是指新陈代谢被人工改造的微生物或微生物细胞，例如，通过用核酸序列转染或转化来修饰微生物细胞，所述核酸序列优选为异源序列。微生物细胞称为生产宿主(production host，例如，新陈代谢被人工改造用于产生生物产品的微生物宿主)。

在本文中可互换使用的“发酵液”或“生物转化液(bioconversionbroth)”是指用于维持微生物细胞的液体培养基或化学品或材料的含水混合物，并且通常包括粗碳源，氮源(例如，铵盐、酵母提取物或蛋白胨)、无机物、盐、辅因子、缓冲液以及本领域技术人员所知的其他成分。发酵液也为本文所述的工程微生物细胞提供细胞产生所需的生物产品而需要的起始反应物。

本文所用的术语“疏水性溶剂”是指液相的有机化合物，或可选地指有疏水特性的液相的有机化合物的混合物，其中这种疏水特性导致疏水性溶剂与发酵液不混溶。可以用下文所述的方法使用疏水性溶剂，并且优选地用疏水性溶剂预处理粗碳源，例如加工过的生物质，去除毒副产品。在优选的实施方案中，生物产品是疏水性溶剂，虽然生物产品通常称为由工程微生物细胞产生的所需的生物产品而不是用于处理粗碳源的溶剂。在其他实施方案中，用于处理粗碳源的疏水性溶剂可以是与生物产品产生的相同的化合物。

本文所用的术语“不混溶”是描述不能均一地混合或混成一体的相同相或状态的物质的性质，并且优选地是指发酵液的水相和疏水性溶剂(和/或生物产品)的有机相的分离。此外，不混溶也可以指不是完全不混溶(例如，部分混溶)的相同相或状态的物质的性质。

术语“毒素”，“有毒产品”，“毒副产品”当涉及本文所提供的方法时是可以互换使用，并且指在将生物质加工成可为微生物细胞所用的碳源时所产生的副产品。例如，在木质纤维素物质水解过程中，形成了3种主要类型的毒副产品：弱酸(例如，乙酸、蚁酸)、呋喃衍生物(例如，糠醛和羰甲基糠醛)以及酚类化合物。

工程微生物细胞

可以用本文所讨论的方法和试剂盒来使用多种工程微生物细胞。选择用于生物转化，优选为大规模生物转化来生产生物合成产品，优选为生物燃料的细胞菌株，将取决于所使用的粗碳源，因为一些粗碳源包含某些毒副产品，以及所使用的溶剂(从发酵液中将同一毒素分相出来)。

通过引用将PCT公开WO 2007/136762A2(“WO‘762pub”)中公开的全部内容并入本发明。特别是，将WO‘762pub所讨论的工程微生物细胞并入本发明，包括产生有特定碳链长度、分枝和饱和度的脂肪酸衍生物的微生物。

在一些实例中，微生物经人工改造已包括一个或多个外源核酸序列，该序列编码硫酯酶(EC 3.1.2.14)、酯合酶(EC 2.3.1.75)、醇乙酰基转移酶(2.3.1.84)、酰基辅酶A还原酶(EC 1.2.1.50)、醇脱氢酶(EC 1.1.1.1)、脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶(1.1.1.*)或其他本领域可获得的脂肪酸(或其衍生物)代谢酶。可以选择由外源核酸序列编码的硫酯酶肽来提供均一的产物。

在一些实施方案中，可以被人工改造的细胞选自哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、真菌细胞、丝状真菌细胞和细菌细胞。

在一些实施方案中，工程微生物细胞是革兰氏阳性菌细胞。在其他实施方案中，宿主细胞是革兰氏阴性菌细胞。

在一些实施方案中，可以被人工改造的微生物细胞选自埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、脉孢菌属(Neurospora)、镰刀霉菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、根毛霉属(Rhizomucor)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、毛霉属(Mucor)、蚀丝霉属(Myceliophtora)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、侧耳属(Pleurotus)、栓菌属(Trametes)、金孢属(Chrysosporium)、酵母菌属(Saccharomyces)、寡养单胞菌属(Stenotrophamonas)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)或链霉菌属(Streptomyces)。

在具体实施方案中，可以被人工改造的微生物细胞是迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)细胞、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)细胞、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)细胞、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)细胞、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)细胞、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)细胞、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)细胞、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)细胞、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细胞、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)细胞、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)细胞、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞，或解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)细胞。

在其他实施方案中，工程微生物细胞是康宁木霉(Trichodermakoningii)细胞、绿色木霉(Trichoderma viride)细胞、里氏木霉(Trichodermareesei)细胞、长梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)细胞、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)细胞、烟曲霉(Aspergillus fumigates)细胞、臭曲霉(Aspergillus foetidus)细胞、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)细胞、黑曲霉(Aspergillus niger)细胞、米曲霉(Aspergillus oryzae)细胞、特异腐质霉(Humicola insolens)细胞、疏棉状嗜热丝孢菌(Humicola nuginose)细胞、混浊红球菌(Rhodococcus opacus)细胞、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)细胞，或米黑毛霉(Mucor michei)细胞。

在其他实施方案中，工程微生物细胞是变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)细胞或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)细胞。在其他实施方案中，宿主细胞是放线菌(Actinomycetes)细胞。

在一些实施方案中，可以被人工改造的微生物细胞是CHO细胞、COS细胞、VERO细胞、BHK细胞、HeLa细胞、Cv1细胞、MDCK细胞、293细胞、3T3细胞，或PC12细胞。

在具体实施方案中，工程微生物细胞是E.coli细胞，如菌株B、菌株C、菌株K，或E.coli菌株W细胞。

在一些实施方案中，经人工改造产生生物产品的微生物的一些实例是，运动发酵单胞菌(Z.mobilis)、真养雷氏菌(Ralstonia eutropha)、弗氏弧菌(Vibrio furnissii)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophila)或藤黄微球菌(Micrococus luteus)及其亲缘生物。

在一些实例中，可以通过优化本文所述的脂肪酸生物合成途径人工改造内源性产生生物产品的微生物来过量产生生物产品。已知可以产生生物产品并且可以使用本文所提供的方法经人工改造产生有机化合物或生物产品的示例性微生物包括，节杆菌(Arthrobacter sp.)、布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)、红硫细菌(Chromatium sp.)、Cladosporium resina(ATCC2271 I)、巴氏梭菌VKM(Clostridiumpasteurianum VKM)、假破伤风梭菌(Clostridium tenanomorphum)、尿酸梭菌(Clostridium acidiurici)、棒杆菌属(Corynebacterium)种类、蓝细菌属(Cyanobacterial)种类(灰色念珠蓝细菌(Nostoc muscorum)、巢状组囊蓝细菌(Anacystis(Synechococcus)nidulans)、浅黄席蓝细菌(Phormnidiumluridum)、佛氏绿胶蓝细菌(Chlorogloea fritschii)、红海束毛蓝细菌(Trichodesmium erythaeum)、Oscillatoria williamsii、原型体微鞘蓝细菌(Microcoleus chthonoplaseis)、球蓝藻(Coccochloris elabens)、阿格门氏藻(Agmenellum quadruplicatum)、细小织线藻(Plectonema terebrans)、具鞘微鞘藻(M.Vaginatus)以及C.scopulorum)、脱硫弧菌(Desulfovibriodesulfuricans)(ATCC29577)、耐辐射动球菌(Kineococcus radiotolerans)(BAA-149)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)(FD533，ATCC 272，381，382，lSD，540，4698，7468，27141)、微球菌(Micrococcus sp.)(ATCC146，398，401，533)、玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)(ATCC 412，416，516)、溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、分支杆菌属(Mycobacterium)种类、绿色木霉(Trichoderma virida)、出芽茁霉(Pullularia pullulans)、Jeotgalicoccus sp.(M.candicans)(ATCC 8456)、球红假单孢菌(Rhodopseudomonas spheroids)、绿菌属(Chlorobium sp.)、深红红螺菌(Rhodospirillium rubrum)(ATCCI1170)、万尼氏红微菌(Rhodomicrobium vannielii)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)(ATCC 13637，17444，17445，17666，11668，17673，17674，17679，17617)、路德类酵母(Saccharomycodes ludwigii)(ATCC 22111)、酵母(Saccharomyces sp.)(卵形、路德类、热带)、弗氏弧菌(Vibrio furnissii)M1、海产弧菌(Vibrio marinus)MP-1、Vibrio ponticus、海红沙雷氏菌(Serratia marinorubra)、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)、裸黑粉菌(Ustilagonuda)、冰草条黑粉菌(Urocystis agropyri)、玉米丝黑穗病菌(Sphacelothecareiliana)、Tilletfa sp.(foetida，caries，controversa)、解酯假丝酵母(Candidalipolytica)、E.Coli、节杆菌(Arthrobacter)AK 19、红酵母粘红酵母(Rhodotorula glutinins)、不动杆菌(Acinetobacter sp.)菌株M-1，以及解酯假丝酵母(Candida lipolytica)。

除了经人工改造表达产生诸如脂肪酸衍生物的生物产品的外源核酸序列外，微生物还可以有一个或多个内源基因功能缺失或衰减。例如，ackA(EC 2.7.2.1)、ackB(EC 2.7.2.1)、adhE(EC 1.1.1.1，1.2.1.10)、fabF(Ee2.3.1.119)、fabR(accession NP_418398)、fadE(Ee 1.3.99.3，1.3.99.-)、GST(EC 6.3.2.3)、gpsA(EC 1.1.1.94)、ldhA(EC 1.1.1.28)、pflB(EC 2.3.1.54)、plsB(EC 2.3.1.15)、poxB(EC 1.2.2.2)、pta(BC 2.3.1.8)、谷胱甘肽合酶(EC6.3.2.3)及其组合可以衰减。

此外，微生物还可以有一个或多个超表达的额外基因。例如，pdh、panK、aceEF(编码丙酮酸和2-氧代戊二酸酯脱氢酶复合物的E1p脱氢酶成分和E2p二氢硫辛酰胺(dihydrolipoamide)酰基转移酶成分，登录号：NP_414656，NP_414657，EC：1.2.4.1，2.3.1.61，2.3.1.12)、accABCD/fabH/fabD/fabG/acpP/fabF(编码FAS，登录号：CAD85557，CAD85558，NP_842277，NP_841683.NP_415613，EC：2.3.1.180，2.3.1.39，1.1.1.100，1.6.5.3，2.3.1.179)、编码脂酰基辅酶A还原酶的基因(登录号：AAC45217，EC 1.2.1.-)、UdhA或相似基因(编码嘧啶核苷酸转氢酶，登录号：CAA46822，EC：1.6.1.1)以及编码脂酰基辅酶A还原酶的基因(登录号：AAC45211，EC 1.2.1.-)。

优选地，工程微生物细胞是生产宿主或包括修饰的核酸序列来超表达编码酰基辅酶A合酶、硫酯酶或酯合酶的基因的微生物。在一些实例中，修饰核酸序列来超表达编码酰基辅酶A合酶和硫酯酶或酯合酶的基因。在一些实例中，修饰核酸序列，超表达编码酰基辅酶A合酶、硫酯酶和酯合酶的基因。在一些实例中，核酸序列还包含编码酰基辅酶A脱氢酶的核酸序列，该序列经修饰而使酰基辅酶A脱氢酶的表达衰减。

可以通过修饰所选择的硫酯酶的表达，可以选择脂肪酸衍生物底物的链长。硫酯酶会影响所产生的脂肪酸的链长。因此，宿主细胞经人工改造可以表达、超表达、衰减表达，或不表达一个或多个选择的硫酯酶，从而提高优选的脂肪酸衍生物底物的产生。例如，可以通过表达优先产生C₁₀脂肪酸的硫酯酶且使优先产生非C₁₀脂肪酸(例如，优先生产C₁₄脂肪酸的硫酯酶)的硫酯酶衰减来产生C₁₀脂肪酸。这将产生相对均一量的碳链长度为10的脂肪酸。在其他实例中，可以通过使产生非C₁₄脂肪酸的内源硫酯酶衰减并表达使用C₁₄-ACP的硫酯酶来产生C₁₄脂肪酸。在一些实例中，可以通过表达使用C₁₂-ACP的硫酯酶并使产生非C₁₂脂肪酸的硫酯酶衰减来产生C₁₂脂肪酸。酰基辅酶A、丙二酰基辅酶A以及脂肪酸的过量产生可以使用本领域已知的方法来检验，例如，通过将放射性前体、HPLC或GC-MS随后细胞裂解。可以用于本文所述方法的硫酯酶的非限制性实施例列于表1。

表1：硫酯酶

登录号	生物来源	基因
			AAC73596	E.coli	不带前导序列的 tesA
AAC73555	E.coli	tesB

登录号	生物来源	基因
			Q41635，AAA34215	加利福尼亚桂树(Umbellularia California)	fatB
AAC49269	萼距花(Cuphea hookeriana)	fatB2
			Q39513；AAC72881	萼距花	fatB3
Q39473，AAC49151	樟树(Cinnamonum camphorum)	fatB
			CAA85388	拟南芥(Arabidopsis thaliana)	fatB[M141T]*
NP 189147：NP 193041	拟南	fatA
			CAC39106	大豆慢生根瘤菌 (Bradvrhiizobium japonicum)	fatA
AAC72883	萼距花	fatA
			AAL79361	向日葵(Helianthus annus)	fatA1

*Mayer et al.，BMC Plant Biology 7：1-11，2007

E.coli酰基辅酶A合酶(ACS)酶FadD和脂肪酸转运蛋白FadL是脂肪酸摄取系统的重要成员。FadL介导脂肪酸转运到细菌细胞内，而FadD介导酰基辅酶A酯的形成。当没有其他碳源可利用时，细菌吸收外源的脂肪酸，并且将其转化成酰基辅酶A酯，该酯结合于转录因子FadR上并且解除编码负责脂肪酸转运(FadL)、激活(FadD)和β-氧化(FadA、FadB、FadE以及FadH)的蛋白的fad基因的表达抑制。当可选的碳源可利用时，细菌合成脂肪酸如酰基-ACP，其被用于磷脂合成，但不是β-氧化的底物。因此，酰基辅酶A和酰基-ACP是可产生不同终产物的脂肪酸的独立来源。参见Caviglia et al.，J.Biol.Chem.279(12)：1163-1169，2004。

可以使用已知的肽人工改造生产宿主从而产生可转化为酰基辅酶A的各种长度的脂肪酸。产生脂肪酸衍生物的一种方法包括提高一个或多个酰基辅酶A合酶肽(EC 6.2.1.-)的表达，或表达更过活性形式的一个或多个酰基辅酶A合酶肽(EC 6.2.1.-)。表B显示了可以表达产生酰基辅酶A和脂肪酸衍生物的酰基辅酶A合酶的列表。

表B：酰基辅酶A合酶

基因名称/基因座	来源	NCBI ID	与E.coliFadD的同一性％	与E.coliFadD的相似性％
					fadD	E.coli	NP_416319	-	-
fadK	E.coli	YP_416216	45	27
					fadD	不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADP1	YP_045024	51	70
fadD	流感嗜血菌(Haemophilusinfluenza)RdKW20	NP_438551	64	78
					BH3103	嗜碱芽孢杆菌(Bacillushalodurans)C-125	NP_243969	40	58
yhfL	枯草芽孢杆菌	NP_388908	39	57
					Pfl-4354	荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)Pfo-1	YP_350082	52	71
EAV15023	睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosterone)KF-1	ZP_01520072	55	72
					fadD1	铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)	NP_251989	54	72
fadD2	铜绿假单胞菌PAO1	NP_251990	55	72
					fadD	根瘤菌(Rhizobium etli)CFN42	YP_533919	55	72
RPC_4074	血色红假单胞菌(Rhodopseudomo naspalustris)Bis B18	YP_533919	56	72
					fadD1	茄科雷尔氏菌(RasltoniaSolanacearum)GMI 1000	NP_520978	56	72
fadDD35	结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)H37Rv	NP_217021	28	46

基因名称/基因座	来源	NCBI ID	与E.coliFadD的同一性％	与E.coliFadD的相似性％
					fadDD22	结核分支杆菌H37Rv	NP_217464	23	42
PRK0059	嗜麦芽糖寡养单胞菌(StenotrophomonasMaltophilia)R551-3	ZP_01644857	59	75

编码酯合酶的基因已知来自加州希蒙得木植物和细菌不动杆菌(Acinetobacter sp.)菌株ADP1(以前为乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)ADP1)。细菌酯合酶是双功能酶，表现酯合酶活性以及可由甘油二酯底物和脂酰基辅酶A形成甘油三酯的能力(酰基辅酶A：二甘油酰基转移酶(DGAT)活性)。基因wax/dgat编码酯合酶和DGAT两者。参见Cheng et al.，J.Biol.Chem.279(36)：37798-37807，2004；Kalscheuerand Steinbuchel，J.Biol.Chem.278：8075-8082，2003。酯合酶也可以用于产生某些脂肪酯，该脂肪酯可以用作本文所述的燃料，例如生物柴油。脂肪酯，包括蜡，由酰基辅酶A和醇的生产，可以用已知的多肽进行人工改造，例如一种或多种酯合酶(EC 2.3.1.20，2.3.1.75)。酯合酶肽序列可以公开获得，例如基因aft1，一种双功能蜡酯合酶/酰基辅酶A：甘油二酯酰基转移酶(登录号AAO17391)；以及基因mWS，其为蜡酯合酶(希蒙德木(simmondsia))(登录号AAD38041)。此外，美国专利No.7,118,896提供了鉴定酯合酶活性的方法，通过引用将其全部内容并入。

在具体实例中，如果所需的产物是基于酯的生物燃料，则人工改造生产宿主，从而产生由粗碳源产生的酯。这种生产宿主包括编码酯合酶的外源DNA序列，该酯合酶经表达从而赋予所述生产宿主由粗碳源合成饱和的、不饱和的、或分枝的脂肪酯的能力。在一些实施方案中，生产宿主也可以表达编码以下示例性蛋白的DNA序列：脂肪酸延长酶、酰基辅酶A还原酶、酰基转移酶、酯合酶、脂酰基转移酶、甘油二酯酰基转移酶、酰基辅酶A蜡醇酰基转移酶。在可选的实施方案中，生物表达编码双功能的酯合酶/酰基辅酶A：甘油二酯酰基转移酶的DNA序列。例如，双功能的酯合酶/酰基辅酶A：甘油二酯酰基转移酶可以选自多酶复合物，该多酶复合物来自希蒙得木(Simmondsia chinensis)、不动杆菌(Acinetobacter sp.)菌株ADP1(以前为乙酸钙不动杆菌ADP1)，泊库岛食烷菌(Alcanivorax borkumensis)、铜绿假单胞菌、Fundibacter jadensis、拟南芥或真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)(后来重命名为真养雷氏菌)。在一个实施方案中，脂肪酸延长酶、酰基辅酶A还原酶或蜡合酶来自真养产碱杆菌(后来重命名为真养雷氏菌)的或其他在文献中已知产生诸如蜡或脂肪酯的生物的多酶复合物。

编码在脂肪酯产生过程中有用的酯合酶的外源DNA序列的另外的来源包括但不限于，高山被孢霉(Mortierella alpina)(例如，ATCC32222)、弯曲隐球酵母(Cryptococcus curvatus)(也称为Apiotricumcurvatum)、Alcanivorax jadensis(例如，T9T＝DSM 12718＝ATCC700854)、不动杆菌(Acinetobacter sp.)HO1-N(例如，ATCC 14987)和混浊红球菌(例如，PD630，DSMZ 44193)。

在一个实例中，使用了来自不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADP1基因座AO17391(Kalscheuer and Steinbuchel，J.Biol.Chem.278：8075-8082，2003中有描述，通过引用并入本发明)处的酯合酶。在另一个实例中，使用了来自希蒙得木基因座AAD38041处的酯合酶。

示例性的生产宿主是LS9001。通过修饰C41(DE3)产生LS9001，C41(DE3)是从www.overexpress.com(Saint Beausine，France)获得并敲除了fadE基因(酰基辅酶A脱氢酶)的E.coli B菌株。简而言之，使用引物YafV_NotI和Ivry_O1来扩增约fadE的约830bp的上游以及引物Lpcaf_o1和LpcaR_Bam来扩增fadE的约960bp的下游，制备fadE敲除的E.coli菌株。使用重叠PCR来产生整个fadE基因框架内缺失构件体。将fadE基因缺失构件体克隆到温度敏感性质粒pKOV3中，pKOV3含有用于反向选择的sacB基因，并且根据Link et al.，J.Bact.179：6228-6237，1997的方法，进行fadE的染色体缺失。所产生的菌株不能降解脂肪酸和脂酰基辅酶A。该敲除菌株在本文中称为ΔfadE。

包括于生产宿主中的另外的修饰包括引入带四种基因的质粒，这些基因负责E.coli的乙酰辅酶A羧化酶(accA、accB、accC以及accD，登录号：NP_414727，NP_417721，NP_417722，NP_416819，EC 6.4.1.2)的活性。将accABCD基因作为双顺反操纵子以两个步骤克隆到pACYCDuet-1(Novagen，Madison，WI)的NcoI/HindIII和NdeI/AvrII位点中，并且产生的质粒称为pAS004.126。

包括于生产宿主中的另外的修饰包括如下：超表达aceEF(编码丙酮酸和2-氧代戊二酸酯脱氢酶复合物的E1p脱氢酶成分和E2p二氢硫辛酰胺酰基转移酶成分)；以及来自E.coli、欧洲亚硝基单胞菌(Nitrosomonas europaea)(ATCC 19718)、枯草芽孢杆菌、啤酒酵母、链球菌(Streptomyces spp)、雷氏菌属(Ralstonia)、红球菌属、棒杆菌(Corynebacteria)、短杆菌(Brevibacteria)、分枝杆菌(Mycobacteria)和油质酵母(oleaginous yeast)的fabH/fabD/fabG/acpP/fabF(编码FAS)。同样，生产宿主经人工改造表达来自豌豆(Pisum savitu)的accABCD(编码乙酰辅酶A羧化酶)。然而，当生产宿主也生产丁醇时，就不是很合适用于表达豌豆的同源物。

在一些生产宿主中，使用Link，et al.，J.Bacteriol.179：6228-6237，1997的方法来敲除或削弱基因。被敲除或削弱的基因包括gpsA (编码生物合成的sn-甘油3-磷酸脱氢酶，登录号NP_418065，EC：1.1.1.94)；ldhA(编码乳酸脱氢酶，登录号NP_415898，EC：1.1.1.28)；pflb(编码甲酸乙酰转移酶1，登录号：P09373，EC：2.3.1.54)；adhE(编码醇脱氢酶，登录号：CAA47743，EC：1.1.1.1，1.2.1.10)；pta(编码磷酸转乙酰酶，登录号：NP_416800，EC：2.3.1.8)；poxB(编码丙酮酸氧化酶，登录号：NP_415392，EC：1.2.2.2)；ackA(编码乙酸激酶，登录号：NP_416799，EC：2.7.2.1)及其组合。

同样，将PlsB[D311E]突变引入LS9001，使plsB衰减。该突变减少了转化成磷脂产物的碳的量。通过将编码天冬胺酸311的GAC密码子替换成编码谷氨酸的GAA密码子来产生编码PlsB[D311E]的等位基因。通过合成来产生改变的等位基因，并且用Link等的方法将染色体的plsB野生型等位基因替换成突变的plsB[D311E]等位基因。

工程微生物细胞的一个实施例是LS9-ID1 MG1655 fadE ::PTRC-tesA-fadD-AtfA1菌株。该菌株带四种遗传修饰：敲除的fadE，其可消除细胞利用脂肪酸作为碳源的能力，和整合入染色体的操纵子，其由修饰的细胞内硫酯酶组成，酰基辅酶A合酶和酯合酶。这三种酶赋予细胞产生和分泌脂肪酸酯的能力。类似的菌株，除了它们也有额外的敲除以及自身或外源基因表达或超表达外，还允许其他目的生物产品的产生，例如，烷烃、烯烃、酮以及脂肪醇。

生物质/粗碳源

以生物质，优选可再生生物质(或给料)开始，可以产生用于微生物培养的碳源。本文所提供的方法允许使用粗碳源，例如带高水平毒素(相对于糖)的加工过的生物质被用于生物转化成生物产品。可以在生物转化过程中将粗碳源递增或持续添加到微生物培养物中，并且随着在生物转化的进行，基本上去除毒素。碳源(例如，基本的糖)被大量转化为所需的产品或生物产品。毒素在本文称为毒副产品。本文也提供了通过运用一个步骤提高粗碳源的利用率的方法，在该步骤中，将疏水性溶剂作为成分添加到发酵液(或生物转化液)制剂中，从而在毒副产品接触到微生物之前可以就地将其提取。如果需要，也可以在生物转化之前而不是之中，进行这种处理。

纤维素和半纤维素物质

木质纤维素物质是生物质的来源，并且可以包含木材、草、林业废弃物和农业残留物(例如，玉米秸、甘蔗渣、稻草等)。可以加工木质纤维素物质从而产生碳源。例如，如果碳水化合物成分可以被廉价地解聚成可溶的和可发酵的糖，那么这些物质可以作为用于不同生物转化的底物。木质纤维素物质的成分主要取决于生物质的来源，但是所有都是由半纤维素、纤维素和木质素组成。半纤维素是带不同乙酰化水平的戊糖、己糖和糖醛酸等分枝的多糖；纤维素是D-葡萄糖的高分子量的线性多聚体；木质素是酚类化合物的芳香类多聚体。碳水化合物多聚体均可以被无机酸或酶水解，并且大部分方法应用半纤维素的稀酸水解作为最初的步骤，产生可溶的糖并且提高纤维素的酶的消化性。

在稀酸水解过程中，产生了微生物毒素的复杂混合物。这些毒素包括来自木聚糖脱乙酰作用的醋酸盐、呋喃降解产物(例如，糠醛和5-羟甲基糠醛)、来自糖的脂肪酸(例如，蚁酸和乙酰丙酸)，以及来自木质素的几种酚类化合物。没有一种化合物被鉴定为主要的毒素，但是呋喃及其衍生物是最常引用的。在水解产物中发现的也被报道为微生物毒素的一些化合物包括：4-羟基苯甲醛、4-羟基苯甲酸、对苯二酚(1，4-二-羟基苯)、儿茶酚(1，2-二-羟基苯)、由紫丁香基丙烷单元降解得到的丁香醛和丁香酸，以及由木质素的愈创木基(guaiacylpropane)单元降解衍生而来的香草酸和香草醛。

已经报道不同类型的毒素对微生物的不同的作用方式。尤其对E.coli而言，但同样也对很多其他微生物而言，Zaldivar等(Biotech.Bioeng.Vol.65，1，24-33，1999)报道称，几种毒素的效力随它们各自的疏水性以及化学反应性而提高。毒素的抑制浓度对于不同的的生物是不同的，并且也随环境条件而变化，环境条件可以加强或减弱它们的作用。本申请优选用于疏水性毒素，疏水性毒素可以优先地分离进入疏水性生物产品或目的溶剂中(例如，脂肪酸、脂肪醇、脂肪酸酯、烷烃、烯等)。

生物质水解产物中的所提及的毒素的浓度，取决于生物质的类型以及处理条件。一般而言，低于1.5g/L的呋喃总值曾被提到，其中糠醛作为主要成分。全部酚类化合物的值为约几百mg/L，其中每种主要类型(羟苯基单体，愈创木基单体和紫丁香基单体)的重量不超过100-200mg/L。本文所介绍的实施例所使用的浓度要高得多，从而清楚地证明所述的处理的好处可以延伸至比正常水解产物要高得多的浓度。用所述工程微生物细胞进行批量生物转化的方法可以允许在批量过程持续期间收集和浓缩毒素。然而，本方法允许从包含细胞的水层中去除这种毒素，从而减少毒素的任何抑制或毒害作用。

发酵

本文所述的方法使用了发酵的一些基本概念，并且并可以以此程度并入本领域用于发酵尤其是大规模发酵的已知的原料和方法。

用目前的方法，工程微生物细胞在发酵液的存在下可以培养于发酵罐中。可以使用任何合适的发酵罐，包括搅拌槽发酵罐、气动发酵罐、泡沫发酵罐或其任意组合。用于微生物培养物的维持和生长的材料和方法为微生物学或发酵科学领域的技术人员所熟知(参见，例如，Bailey etal.，Biochemical Engineering Fundamentals，second edition，McGraw Hill，New York，1986)。必须考虑适合生长的培养基、pH、温度，以及需氧、微需氧或厌氧条件的需求，这些取决于对微生物、发酵和加工方法的特殊要求。所使用的液体培养基不是关键性的，但是它必须维持所使用的细胞的生长并且促进产生所需产品必须的酶促通路。示例性的培养基可以包括基本培养基、复杂培养基、或已知成分培养基。培养基通常包括发酵碳源、氮源(例如，铵盐、酵母提取物或蛋白胨)、无机物、盐、辅因子、缓冲液、以及本领域技术人员所知的其他成分。

可以通过应用特殊的发酵技术促进化合物的产生和分离。在降低成本的情况下使产量最大化的一种方法是提高来自转化成生物产品的碳源中的碳的百分比。在正常的细胞生命周期中，碳被用于细胞功能中，包括，例如，产生脂质、糖类、蛋白质、有机酸和核酸。减少生长相关活动所需的碳量会提高碳生物转化成生物产品的效率。这可以通过先使微生物生长至所需密度而完成，例如达到对数生长期最高点的密度。在最高点时，可以控制复制检查点基因，从而使细胞生长停止。

给料碳转化成生物产品的百分比是关键的成本操纵者——效率越高(例如，转化百分比越高)则加工费用就越低。对含氧的碳源(例如，葡萄糖或其他碳水化合物)而言，氧必须以二氧化碳的形式被释放。释放每2个氧原子，就也要释放一个碳原子从而产生约34％(w/w)的最大理论新陈代谢效率(对于脂肪酸衍生物产物而言)。然而，对于其他生物产品和碳源而言，这一数值会发生改变。在文献中典型的效率为低于约5％。产生生物产品的工程细胞的效率可以高约1、3、5、10、15、20、25或30％。在一个实例中，细胞可以呈现约10％至约25％的效率。在其他实例中，这种细胞可以呈现约25％至约30％的效率，并且在其他实例中，这种细胞可以呈现约30％或更高的效率。

在一些实例中，可以应用持续的方法。在该方法中，带有可产生生物产品的工程微生物细胞的反应器可以通过多种途径来组装。在一个实例中，将发酵液持续供应到发酵罐中，并且将剩余的发酵液、工程微生物细胞、生物产品和副产品从发酵罐中不断去除。在可选的实施方案中，可以将去除的细胞分离并且放回发酵罐中再利用。在另一实施方案中，去除一些或全部的生物产品，并且放回发酵罐中再利用从而从含于新添加的发酵液中的新引入的粗碳源中去除疏水性毒素。

在一个实例中，生物转化会不断减少。在该实例中，需要建立稳定的还原性环境。可以通过在厌氧性环境中进行生物转化从而建立还原性环境。可以通过二氧化碳气体的释放维持电子平衡。可选地，在缺少氧气的情况下，可以将硝酸盐或琥珀酸盐提供于液体培养基中作为电子供体用于生物转化。

促进增强NAD(H)和NADP(H)平衡也可以促进稳定电子平衡。通过人工改造生产宿主表达NADH:NADPH转氢酶，也可以增强细胞内NADPH的有效性。一个或多个NADH:NADPH转氢酶的表达使糖酵解产生的NADH转化为NADPH，从而提高脂肪酸衍生物的产生。

可以选择生产宿主或微生物细胞(将被人工改造的)释放碳氢化合物或生物产品的内在能力。生物产品生产和释放到培养基的效率可以表示为细胞内生物产品和细胞外生物产品的比例。在一些实例中，比例可以是约5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4或1∶5。生产宿主可以经另外的人工改造，表达重组多纤维素酶体(cellulosomes)，从而使生产宿主使用纤维素物质作为碳源。可选地，生产宿主可以经另外的人工改造，来表达转化酶(EC 3.2.1.26)，从而使可以用蔗糖作为碳源。同样，可以使用一个或多个美国专利5,000,000、5,028,539、5,424,202、5,482,846和5,602,030(Ingram et al.)中所描述的方法来人工改造生产宿主，从而使生产宿主可以有效地吸收碳并且利用纤维素物质作为碳源，据此将这些专利通过引用全文并入。

对于发酵方法或生物处理的一个重要考虑事项是，是否使用批量或持续的发酵方法。会影响所产生的生物产品量的这两种方法的一个不同点在于，批量方法除了存在指数生长期外还存在准备期、延缓期和稳定期。相反，持续方法保持在持续的指数生长状态，并且如果操作适当，可以一次运行数月。对生物产品的形成而言，由于去除了准备期、延缓期和稳定期，持续方法提供了高得多的生产率(例如，稀释率乘以细胞量)。例如，持续方法获得的生产率据估计要增强8倍(Shuler et al.，Prentice Hall，Inc.：Upper Saddle River，N.J.，245-247)。

虽然在生产率上有压倒性优势，但是由于多种原因在操作中批量方法要比持续方法应用更多。首先，批量系统的生产率可以极大地超越持续方法的生产率，因为后者必须在非常低的稀释率下操作，而当该方法依赖于加工的生物质时由于产生的毒素存在于液体培养基中，就不容易达到非常低的稀释率。其次，生产菌株通常经历了遗传物质的改良，从而来提高它们的生化或蛋白生产性能。这些专门的菌株可能不如它们的亲代补体生长的快，然而持续方法，例如使用恒化器(以持续模式操作的发酵罐)的方法，对生长最快的细胞而言，施加了极大的选择性压力。含有重组DNA或携带点突变来获得需要的过量生产的表型的细胞，对于突变回原始的低产的亲代菌株是敏感的。对于带有单基因缺失的菌株而言，进行补偿性突变是有可能的，该突变会倾向恢复野生型生长表型。为了有限的营养，生长越快的细胞通常会将它们的更多产的对手竞争出局，这会极大地减少生产率。在另一方面，批量方法通过在每一轮的最后不重复使用细胞从而限制了可用的代数，因此降低了生产菌株恢复成其野生型表型的可能性。最后，由于潜在的技术障碍，持续方法对于长期操作来说更困难，例如设备故障和外来生物污染。比起批量方法，这些故障的后果对于持续方法而言更是相当大。

对于化合物小规模生产而言，持续方法的生产率的提高很少超过与菌株稳定性和可靠性有关的风险。然而，对于大规模生产而言，相比于批量方法，持续方法的生产率的提高可以产生极大的经济增益。虽然有关持续生物方法操作的技术障碍总是存在，可以通过新陈代谢工程方法来克服菌株稳定性问题，该方法通过变更分子途径来减少或消除负选择压力并且在指数成长期促进所需生物产品的产生。

双阶段发酵方法

本发明的一个方面包括改善由工程微生物细胞产生生物产品的方法，该方法包括提供包含粗碳源的发酵液；用所述微生物细胞接种所述发酵液；以及培养接种的发酵液；其中所述生物产品是与所述发酵液不混溶的疏水性溶剂，并且其中存在于所述粗碳源中的毒副产品在所述疏水性溶剂中是可溶的。

本发明的另一方面包括从发酵液的水相中被动地相分离毒副产品的方法，发酵液是粗碳源和微生物细胞的混合物，该微生物细胞经人工改造在所述的微生物细胞培养物的发酵中产生生物产品，该方法包括：提供包含粗碳源的发酵液；用所述微生物细胞接种所述发酵液，形成发酵培养物；以及培养所述发酵培养物来产生所述生物产品；其中所述生物产品是疏水性溶剂，并且其中存在于所述粗碳源中的毒副产品在所述疏水性溶剂中是可溶的。

本发明的另一方面包含用于由生物工程细胞产生生物产品的试剂盒，该试剂盒包括：经生物工程改造由碳源产生生物产品的生物工程细胞的样品；包含源自生物质转化的粗碳源的发酵液；与所述发酵液不混溶的并且能提取在所述生物质转化过程中形成的毒副产品的疏水性溶剂；以及使用所述生物工程细胞、发酵液和疏水性溶剂的发酵方法的说明书。

本发明另一方面包括由工程微生物细胞产生生物产品的持续发酵方法，该方法包括：提供所述微生物细胞的培养物；将包含粗碳源的一定量的发酵液的连续流引入所述培养物中；用所述发酵液使所述培养物发酵；以及从所述培养物中去除一定量的所述发酵液的连续流；其中所述生物产品是与所述发酵液不混溶的疏水性溶剂，并且其中存在于所述粗碳源中的毒副产品在所述疏水性溶剂中是可溶的。

在本发明另一方面中，所提供的是通过一种方法由工程微生物细胞产生的生物产品，该方法包括：准备包含粗碳源的发酵液；用所述微生物细胞接种所述发酵液；培养接种的发酵液；从培养的发酵液中回收所述生物产品；其中所述生物产品是与所述发酵液不混溶的疏水性溶剂，并且其中存在于所述粗碳源中的毒副产品在所述疏水性溶剂中是可溶的。

在本发明另一方面中，所提供的是由能量驱动的交通工具，该能量是通过一种方法由工程微生物细胞产生的生物产品的燃烧获得的，该方法包括：制备包含粗碳源的发酵液；用所述微生物细胞接种所述发酵液；培养接种的发酵液；从培养的发酵液中回收所述生物产品；其中所述生物产品是与所述发酵液不混溶的疏水性溶剂，并且其中存在于所述粗碳源中的毒副产品在所述疏水性溶剂中是可溶的。

在一些实施例中，方法也包括用初始量的疏水性溶剂预处理发酵液的步骤；以及将所述液从所述疏水性溶剂中分离去除。在一些实施方案中，初始量的疏水性溶剂与所述发酵液以疏水性溶剂∶发酵液为至多约1∶1(体积∶体积)的比例混合；从约1∶1到约1∶10,000；从约1∶1到约1∶1,000；从约1∶1到约1∶100；从约1∶3到约1∶10,000；从约1∶3到约1∶1,000；从约1∶3到约1∶100；从约1∶10到约1∶10,000；从约1∶10到约1∶1,000；从约1∶10到约1∶100；从约1∶100到约1∶10,000；从约1∶100到约1∶1,000；从约1∶100到约1∶9,000；从约1∶100到约1∶8,000；从约1∶100到约1∶7,000；从约1∶100到约1∶6,000；从约1∶100到约1∶5,000；从约1∶100到约1∶4,000；从约1∶100到约1∶3,000；从约1∶100到约1∶2,000。优选地，体积∶体积的比例为从约1∶3到约1∶100的疏水性溶剂∶发酵液。普通技术人员可以使用常规的技术来确定最佳的比例，从而提供足够的疏水性溶剂来促进毒副产品有效溶解于疏水性溶剂中。

粗碳源选自那些已知包含或带有毒副产品等杂质的物质。优选地，毒副产品是有机副产品，如那些在生物质转化过程中产生的物质(例如，纤维素物质)。在一些实施方案中，毒副产品包含糠醛、5-羟甲基糠醛、脂肪族酸、酚类化合物、4-羟基苯甲醛、4-羟基苯甲酸、对苯二酸、儿茶酚、4-甲基儿茶酚、丁香醛、丁香酸、邻甲氧基苯酚、香草酸或香草醛。优选地，毒副产品包括糠醛或糠醛衍生物，例如5-羟甲基糠醛。疏水性溶剂是针对疏水特性而选择的溶剂，该疏水特性允许从水性的生物转化液中相分离。普通技术人员使用常规技术，可以轻易地挑选提供的方法所使用的疏水性溶剂，允许相分离。在一些实施方案中，疏水性溶剂包含烷烃、酯、烯烃、脂肪酸、脂肪醇、醛或酮。在一些实施方案中，疏水性溶剂包含十六烷、二十碳十烯(eicosadecene)、C1C12:0酯、C1C12:1酯、C1C14:0酯，C1C14:1酯、C1C16:0酯、C1C16:1酯、C1C18:1酯、C2C12:0酯、C2C12:1酯、C2C14:0酯、C2:C14:1酯、C2C16:0酯、C2C16:1酯、C2:C18:1酯，或商业生物柴油。在一些实施方案中，疏水性溶剂可以是与细胞所产生的生物产品一样的化学品。

在一个优选的实例中，粗碳源可以是糖浆。正如以下所提供的，可以进行提取式发酵或双相发酵的测试。流速为10,000kg/hr的糖浆流可以与流速为10,000kg/hour的FAME接触。杂质以每个50.5ppm的模式浓度(model concentration)存在于糖浆流中。如果一种种类提取大于10％，那么可以认为该种类是部分疏水或是疏水的。这些种类是糖浆中所发现的甘蔗或甜菜汁降解产物的典型化学物质的代表。疏水性种类的一些例证性的实例包括：1-乙酰基-9H-吡啶并[3，4B]吲哚、1-乙酰基吡咯烷、2，3-二氢苯并呋喃、2，5-二甲基-4-羟基-3(2H)-furnine、2，5-二甲基吡嗪、2-羟基-3-甲基-2-环戊烯-1-酮、5，6-二氢-6-戊基-2H-吡喃-4-酮、苯乙酸、苯甲酸、呋喃羧酸甲基乙基酯、十六烷酸、己酸、戊酸、三甲基吡嗪、糠醛、呋喃、n-己酸，以及4-羧基苯甲醛。

本文所讨论的由所提供的工程微生物细胞产生的生物产品，是生物衍生性产品，无论作为终产品还是中间产物(或用于进一步加工的反应物)均具有商业价值。本文所提供的生物产品具有疏水特性，并且可以作为疏水性溶剂。生物产品可以包括例如生物燃料、多聚体、有机试剂和其他工业化学品等产品。在一些实施方案中，生物产品包含烷烃、酯、烯烃、脂肪酸、脂肪醇、醛或酮。优选地，生物产品是生物燃料。

本文所提供的生物质是用于产生碳源的起始材料，通常需要处理或转化步骤，以便将生物质分解为可用的碳源，例如碳水化合物或糖分子，从而被工程微生物细胞所利用，其在无需进一步纯化而仍然处于自然的或加工的状态(粗碳源)。优选地，生物质包含糖浆、水解的纤维素或水解的半纤维素物质。在一些实施方案中，纤维素或半纤维素物质包含木材、草、林业废弃物或农业残留物(例如，玉米秸、甘蔗渣、稻草等)。

在一些实施方案中，所提供的生物转化方案也可以包括稀释用于生物转化的培养基来降低毒素浓度的步骤。在一个实例中，可以将培养基稀释5倍或更多。

燃料成分

可以优化本文所提供的可通过已公开方法生产的生物燃料，来提供用于产生生物燃料的大规模和商业可行的方法。优选地，该方法是有成本效益的且环境友好的。在一个实施方案中，生物燃料可以提供可再生的能源，用于柴油机设备，包括汽车与飞机。生物燃料可以用作能源，无论是作为散装燃料或者作为其他可用燃料源的成分或添加剂。

交通工具

本文所提供的交通工具，是那些为了使用生物燃油而制造的交通工具并且是那些为了有效利用生物燃料的改进型的交通工具。该交通工具是由工程微生物细胞产生的生物燃油燃烧所获得的能量而供以动力。优选地，该生物燃料由工程微生物细胞直接从粗碳源产生。

实施例

以下的实施例进一步说明本发明。应当理解的是，当表示本发明的优选实施方案时，这些实施例只是通过例证的方式给出。根据以上的讨论和这些实施例，本领域的技术人员可以了解本发明的基本特征，并且在背离本发明的精神和范围的情况下就可以对本发明进行多种改变和修改来使它适应多种用途和条件。因此，除了本文所展示和所描述的那些实施例外，根据前面的描述，本发明的多种修改对本领域的技术人员来说是显而易见的。这些修改也落入附加的权利要求书的范围内。

以下的实施例包括发酵方法以及由此产生的生物产品，该发酵方法用于使用遗传工程微生物产生疏水性化合物，例如生物柴油(乙基和甲基酯培养基以及长链脂肪酸)、脂肪醇、烯烃和烷烃。一般而言，该方法使用碳水化合物作为原料。这种原料可以来自多种不同的生物材料源，包括例如玉米、甘蔗或植物生物质的水解产物。优选地，发酵方法由基于发酵产物的生物质的预处理组成。同样优选地，发酵方法由以发酵产物作为提取剂进行双相发酵。

实施例1-发酵糖产生生物柴油的方法

E.coli的遗传工程菌株LS9-ID1的培养物从冷冻储存中被转移出来，并且在Luria-Bertani培养基中培养约3个小时。将培养物转移到通常用于E.coli M9的已知成分的无机培养基中，该培养基用硫胺素和微量无机物缓冲并补充。将培养物进一步培养并且用于接种带有50g/L的碳水化合物(葡萄糖、果糖、一些戊糖)的同一发酵液中。

在初始生长之后，用IPTG诱导培养物，并且添加10ml/L的甲醇或乙醇来起动生物柴油的生产。葡萄糖通常在24-40小时之内被耗尽，同样地生物柴油生产达到其峰值。进行发酵之后，测量OD600值(600nm光密度)、葡萄糖消耗量和酯的产量。该方法可以在摇瓶或发酵罐中进行。

是通过高压液相层析(HPLC)分析发酵过程的葡萄糖消耗。根据本领域通常用于一些糖和有机酸的方法进行HPLC分析，该方法包括以下条件：带有折射率检测器的Agilent HPLC 1200系列；柱子：AminexHPX-87H，300mm×7.8mm；柱子温度：35℃；流动相：0.01M H₂SO₄(水性的)；流速：0.6mL/min；注射体积：20μL。

通过气相层析和火焰电离检测仪(GC-FID)，分析脂肪酸甲基和乙基酯的产生。用乙酸乙酯以1∶1vol/vol的比例从发酵液中提取样品。在强力涡旋之后，收集样品并且通过气相层析(GC)分析有机相。分析条件如下：仪器：Trace GC Ultra；Thermo Electron Corporation的火焰电离检测仪(FID)；柱子：Thermo Electron Corporation的DB-1(1％二苯基硅氧烷；99％二甲基硅氧烷)CO1 UFM 1/0.1/5 01 DET，相pH5，FT：0.4μm，长度5m，内径(id)：0.1mm；入口条件：250℃不分流法，所用的3.8min1/25分流方法取决于分流流速为75ml/min的样品浓度；运载气体，流速：氦，3.0ml/min；阻遏温度：330℃；炉温：在50℃维持0.5分钟；100℃/分钟至330℃；330℃维持0.5分钟；检测器温度：300℃注射体积：2μL；运行时间/流速：6.3min/3.0ml/min(不分流法)，3.8min/1.5ml/min(分流1/25方法)，3.04min/1.2ml/min(分流1/50方法)。

实施例2-生产菌株生长过程中产生的通常毒素的效果测定

已分别检测半纤维素和纤维素水解产物中许多化合物对微生物菌株的毒性。在E.coli的情况下，毒性与毒素的疏水性有关。评估了几种这类化合物对某些微生物菌株生长的作用。通过类似于所述实施例1中所述的方法，但不诱导及添加乙醇，在摇瓶中进行测试。

如文献所报道添加MIC(最小的抑制浓度来完全抑制生长)的毒素并且在细胞生长之后测量OD值。也测试其他浓度来测定所观测的效果的范围。结果呈现于表1和表2。将抑制水平报道为不存在毒素(对照)的生长减去存在毒素的生长与对照中的生长之比。

表1

毒素	报道的MIC(g/L)	LS9-ID1的％抑制
			对照	0	0
糠醛	3.5	100
			丁香醛	2.5	100
4-羟基苯甲醛	1.25	100
			5-羟甲基糠醛	4.0	100
4-甲基儿茶酚	1.5	25
			邻甲氧基苯酚	3.0	100

表2

实施例3-提取式发酵

为了使用E.coli工程菌株LS9-ID1产生的产物测定实施提取式发酵的能力，提高在毒素的存在下发酵的性能，采用类似于所述实施例1中所述的方法进行发酵。准备两组双份摇瓶，带有用于测试的不同浓度的毒素。一组用作对照，其包括不带提取剂即疏水性溶剂的毒素。在第二组中，每3体积发酵液以1体积溶剂的比例添加提取剂。随后接种摇瓶，并且在37℃下，培养在振动的摇床中。当OD 600值达到1时，添加1mM IPTG和20ml/L甲醇，诱导培养物。在24小时时测量细胞的生长和脂肪酸甲基酯(FAME)的产量。在不含疏水性溶剂的培养物(对照)中，直接在发酵液中测量OD值。在含溶剂的摇瓶中，OD值的测量有干扰，为了排除这一问题，离心液体培养基并且将细胞颗粒重悬浮于相同体积的蒸馏水中。在该悬浮液中测量OD值。

为了分析FAME产量，将0.5ml的液体培养基与0.5ml的乙酸乙酯混合。通过气相层析分析有机相。在含溶剂的样品中，进行了另外的稀释。用油酸乙酯(C2:C18酯，或C2:C18)作为代表生物柴油的溶剂来测试所有的毒素。每种毒素所得的结果显示于表3-7。将生长和FAME产量报道为对照条件(不添加毒素)的百分比。每个结果是双份实验的平均值。

表3：糠醛

表4：丁香醛

表5：4-羟基苯甲醛

表6：5-羟甲基糠醛

表7：邻甲氧基苯酚

实施例4-不同溶剂的测试

使用其他溶剂进行类似于所述实施例3所示的测试，这些溶剂也可以由遗传工程微生物产生。在细胞生长过程中获益并且并且产物浓度基于在溶剂与发酵液间每种毒素分离的差异。

测试了溶剂月桂酸甲酯(C1:C12酯，或C1:C12)、十六烷(烷烃)、二十碳十烯(eicosadecene，烯烃)以及商业生物柴油。结果呈现于表8-11。

表8

表9

表10

表11

实施例5-提取物和发酵物的分离

在发酵之前可以处理原料，去除毒素。基于这一目的，在最初的纯化步骤(例如离心分离)之后但在任何滤清或结束步骤之前使用生物产品将是有可能的。可以将含有原料的糖与批量或持续逆流模式的溶剂相接触。提取之后，可以通过倾析或离心从溶剂中将原料(水相)分离出来。

这一方法对于去除毒素尤其有用，该毒素不同于发酵中所需的那些条件下能更有效地分离进入有机溶剂。例如，当生物质水解产物中的弱有机酸(羟基苯甲酸的、香草酸的、丁香酸的)在低pH值下不离子化时，它们能更好地分离到有机溶剂中。这种低pH值可能对细胞并不是有利的，所以在发酵之前优选去除毒素。生物质水解产物通常是酸性的，所以它们可以被预处理而不需要其他调节。

进行类似于所述实施例所述的测试。制备发酵培养基并且掺入所需浓度的毒素。月桂酸甲酯用作代表生物柴油的溶剂。将其以1∶3体积∶体积的比例添加到发酵培养基中。将溶剂和液体培养基在37℃下充分混合60分钟。将水层轻轻倒入分离漏斗，并收集。随后用LS9-ID1接种产生的培养基，并且其生长与未处理的含有毒素的相似培养进行比对。结果呈现于表12中。

表12

Claims (102)

1.改善由工程微生物细胞产生生物产品的方法，包括：

提供包含粗碳源的发酵液；

用所述微生物细胞接种所述发酵液；以及

培养接种的发酵液；

其中所述生物产品是与所述发酵液不混溶的疏水性溶剂，并且其中存在于所述粗碳源中的毒副产品在所述疏水性溶剂中是可溶的。

2.如权利要求1的方法，还包括：

用初始量的疏水性溶剂预处理所述发酵液；以及

从所述疏水性溶剂中去除所述发酵液。

3.如权利要求2的方法，其中所述预处理步骤包括：

将所述初始量的疏水性溶剂与所述的发酵液以疏水性溶剂∶发酵液至多约1∶1(体积∶体积)的比例混合。

4.如权利要求2的方法，其中所述预处理步骤包括：

将所述初始量的疏水性溶剂与所述的发酵液以疏水性溶剂∶发酵液为约1∶3至约1∶100(体积∶体积)的比例混合。

5.如权利要求1的方法，还包括：

将一定量的疏水性溶剂引入所提供的发酵液中。

6.如权利要求5的方法，其中引入的一定量的疏水性溶剂是疏水性溶剂∶发酵液的比例为至多1∶1(体积∶体积)。

7.如权利要求5的方法，其中引入的一定量的疏水性溶剂是疏水性溶剂∶发酵液的比例为从约1∶3至约1∶100(体积∶体积)。

8.如权利要求1-7中任一项的方法，其中所述的毒副产品包含以下至少一种：糠醛、5-羟甲基糠醛、脂肪族酸、酚类化合物、4-羟基苯甲醛、4-羟基苯甲酸、对苯二酸、儿茶酚、4-甲基儿茶酚、丁香醛、丁香酸、邻甲氧基苯酚、香草酸、香草醛、1-乙酰基-9H-吡啶并[3，4B]吲哚、1-乙酰基吡咯烷、2，3-二氢苯并呋喃、2，5-二甲基-4-羟基-3(2H)-furnine、2，5-二甲基吡嗪、2-羟基-3-甲基-2-环戊烯-1-酮、5，6-二氢-6-戊基-2H-吡喃-4-酮、苯乙酸、苯甲酸、呋喃羧酸甲基乙基酯、十六烷酸、己酸、戊酸、三甲基吡嗪、呋喃；n-己酸，或4-羧基苯甲醛。

9.如权利要求1-8中任一项的方法，其中所述的疏水性溶剂包含烷烃、酯、烯烃、脂肪酸、脂肪醇、醛或酮。

10.如权利要求1-9中任一项的方法，其中所述的疏水性溶剂包含十六烷、二十碳十烯、C1C12:0酯、C1C12:1酯、C1C14:0酯、C1C14:1酯、C1C16:0酯、C1C16:1酯、C1C18:1酯、C2C12:0酯、C2C12:1酯、C2C14:0酯、C2:C14:1酯、C2C16:0酯、C2C16:1酯、C2:C18:1酯或生物柴油。

11.如权利要求1-10中任一项的方法，其中所述的生物产品包含烷烃、酯、烯烃、脂肪酸、脂肪醇、醛或酮。

12.如权利要求1-11中任一项的方法，其中所述的生物产品包含十六烷、二十碳十烯、C1C12:0酯、C1C12:1酯、C1C14:0酯、C1C14:1酯、C1C16:0酯、C1C16:1酯、C1C18:1酯、C2C12:0酯、C2C12:1酯、C2C14:0酯、C2:C14:1酯、C2C16:0酯、C2C16:1酯、C2:C18:1酯或生物柴油。

13.如权利要求1-12中任一项的方法，其中所述的生物产品是生物燃料。

14.如权利要求1-13中任一项的方法，其中所述的疏水性溶剂和所述的生物产品是相似的分子。

15.如权利要求1-14中任一项的方法，其中所述的粗碳源源自生物质。

16.如权利要求15的方法，其中所述的粗碳源包含水解的纤维素、水解的半纤维素物质或糖浆。

17.如权利要求16的方法，其中所述的纤维素或半纤维素物质包含木材、草、林业废弃物、农业残留物或工农业残留物。

18.如权利要求1-17中任一项的方法，其中所述工程微生物细胞经人工改造，提高编码酶的基因的表达，所述酶选自硫酯酶、酰基辅酶A合酶和酯合酶。

19.如权利要求18的方法，其中所述工程微生物细胞中编码酰基辅酶A合酶的基因衰减或缺失。

20.如权利要求19的方法，其中所述编码酰基辅酶A合酶的基因是fadE。

21.从发酵液的水相中被动地相分离毒副产品的方法，所述发酵液是粗碳源和微生物细胞的混合物，所述微生物细胞经人工改造在所述微生物细胞培养物的发酵中产生生物产品，所述方法包括：

提供包含粗碳源的所述发酵液；

用所述微生物细胞接种所述发酵液来形成发酵培养物；以及

培养所述发酵培养物来产生所述生物产品；

其中所述生物产品是疏水性溶剂，并且其中存在于所述粗碳源中的毒副产品在所述疏水性溶剂中是可溶的。

22.如权利要求21的方法，还包括：

用初始量的疏水性溶剂预处理所述发酵液来产生预处理的发酵液；以及

从所述疏水性溶剂中去除所述发酵液。

23.如权利要求22的方法，其中所述的预处理步骤包括：

将所述的初始量疏水溶剂与所述的发酵液以疏水性溶剂∶发酵液为至多约1∶1(体积∶体积)的比例混合。

24.如权利要求22的方法，其中所述的预处理步骤包括：

将所述的初始量疏水溶剂与所述的发酵液以疏水性溶剂∶发酵液为从约1∶3至约1∶100(体积∶体积)的比例混合。

25.如权利要求21的方法，还包括：

将一定量的疏水性溶剂引入所述发酵液中。

26.如权利要求25的方法，其中引入的一定量的疏水性溶剂是疏水性溶剂∶发酵液的比例为至多1∶1(体积∶体积)。

27.如权利要求25的方法，其中引入的一定量的疏水性溶剂是疏水性溶剂∶发酵液的比例为从约1∶3至约1∶100(体积∶体积)。

28.如权利要求21-27中任一项的方法，其中所述的毒副产品包括以下至少一种：糠醛、5-羟甲基糠醛、脂肪族酸、酚类化合物、4-羟基苯甲醛、4-羟基苯甲酸、对苯二酸、儿茶酚、4-甲基儿茶酚、丁香醛、丁香酸、邻甲氧基苯酚、香草酸、香草醛、1-乙酰基-9H-吡啶并[3，4B]吲哚、1-乙酰基吡咯烷、2，3-二氢苯并呋喃、2，5-二甲基-4-羟基-3(2H)-furnine、2，5-二甲基吡嗪、2-羟基-3-甲基-2-环戊烯-1-酮、5，6-二氢-6-戊基-2H-吡喃-4-酮、苯乙酸、苯甲酸、呋喃羧酸甲基乙基酯、十六烷酸、己酸、戊酸、三甲基吡嗪、呋喃、n-己酸，或4-羧基苯甲醛。

29.如权利要求21-27中任一项的方法，其中所述的疏水性溶剂包含烷烃、酯、烯烃、脂肪酸、脂肪醇、醛或酮。

30.如权利要求21-27中任一项的方法，其中所述的疏水性溶剂包含十六烷、二十碳十烯、C1C12:0酯，C1C12:1酯、C1C14:0酯、C1C14:1酯、C1C16:0酯、C1C16:1酯、C1C18:1酯、C2C12:0酯、C2C12:1酯、C2C14:0酯、C2:C14:1酯、C2C16:0酯、C2C16:1酯、C2:C18:1酯，或生物柴油。

31.如权利要求21-30中任一项的方法，其中所述的生物产品包含烷烃、酯、烯烃、脂肪酸、脂肪醇、醛或酮。

32.如权利要求21-31中任一项的方法，其中所述的生物产品包括十六烷、二十碳十烯、C1C12:0酯、C1C12:1酯、C1C14:0酯、C1C14:1酯、C1C16:0酯、C1C16:1酯、C1C18:1酯、C2C12:0酯、C2C12:1酯、C2C14:0酯、C2:C14:1酯、C2C16:0酯、C2C16:1酯、C2:C18:1酯，或生物柴油。

33.如权利要求21-32中任一项的方法，其中所述的生物产品是生物燃料。

34.如权利要求21-33中任一项的方法，其中所述的疏水性溶剂和所述的生物产品是相似的分子。

35.如权利要求21-34中任一项的方法，其中所述的粗碳源源自生物质。

36.如权利要求35的方法，其中所述的粗碳源包含水解的纤维素，水解的半纤维素物质或糖浆。

37.如权利要求36的方法，其中所述的纤维素或半纤维素物质包含木材、草、林业废弃物、农业残留物或工农业残留物。

38.如权利要求21-37中任一项的方法，其中所述的工程微生物细胞经人工改造提高编码酶的基因的表达，所述酶选自硫酯酶、酰基辅酶A合酶和酯合酶。

39.如权利要求38的方法，其中所述的工程微生物细胞中编码酰基辅酶A合酶的基因衰减或缺失。

40.如权利要求39的方法，其中所述的编码酰基辅酶A合酶的基因是fadE。

41.用于由生物工程细胞产生生物产品的试剂盒，包含：

经生物工程改造从而由碳源产生生物产品的生物工程细胞的样品；

包含源自生物质转化的粗碳源的发酵液；

与所述发酵液不混溶并且能提取在所述生物质转化过程中形成的毒副产品的疏水性溶剂；以及

使用所述生物工程细胞样品、发酵液和疏水性溶剂的发酵方法的说明书。

42.如权利要求41的试剂盒，还包括用于培养所述的生物工程细胞培养物的设备。

43.如权利要求41-42中任一项的试剂盒，其中所述的疏水性溶剂和所述的发酵液是疏水性溶剂∶发酵液的体积比为至多1∶1(vol∶vol)。

44.如权利要求41-43中任一项的试剂盒，其中所述的疏水性溶剂包含烷烃、酯、烯烃、脂肪酸、脂肪醇、醛或酮。

45.如权利要求41-44中任一项的试剂盒，其中所述的疏水性溶剂包含十六烷、二十碳十烯、C1C12:0酯、C1C12:1酯、C1C14:0酯、C1C14:1酯、C1C16:0酯、C1C16:1酯、C1C18:1酯、C2C12:0酯、C2C12:1酯、C2C14:0酯、C2:C14:1酯、C2C16:0酯、C2C16:1酯、C2:C18:1酯，或商业生物柴油。

46.如权利要求41-45中任一项的试剂盒，其中所述的生物产品包含烷烃、酯、烯烃、脂肪酸、脂肪醇、醛或酮。

47.如权利要求41-46中任一项的试剂盒，其中所述的生物产品包含十六烷、二十碳十烯、C1C12:0酯、C1C12:1酯、C1C14:0酯、C1C14:1酯、C1C16:0酯、C1C16:1酯、C1C18:1酯、C2C12:0酯、C2C12:1酯、C2C14:0酯、C2:C14:1酯、C2C16:0酯、C2C16:1酯、C2:C18:1酯，或生物柴油。

48.如权利要求41-47中任一项的试剂盒，其中所述的生物产品是生物燃料。

49.如权利要求41-48中任一项的试剂盒，其中所述的疏水性溶剂和所述的生物产品是相似的分子。

50.如权利要求41-49中任一项的试剂盒，其中所述的粗碳源源自生物质。

51.如权利要求50的试剂盒，其中所述的粗碳源包含水解的纤维素、水解的半纤维素物质或糖浆。

52.如权利要求51的试剂盒，其中所述的纤维素或半纤维素物质包含木材、草、林业废弃物、农业残留物或工农业残留物。

53.如权利要求41-52中任一项的试剂盒，其中所述的工程微生物细胞经人工改造提高编码酶的基因的表达，所述酶选自硫酯酶、酰基辅酶A合酶和酯合酶。

54.如权利要求53的试剂盒，其中所述的工程微生物细胞中编码酰基辅酶A合酶的基因衰减或缺失。

55.如权利要求54的试剂盒，其中所述编码酰基辅酶A合酶的基因是fadE。

56.用于由生物工程细胞产生生物产品的持续发酵方法，包括：

提供所述的微生物细胞的培养物；

将包含粗碳源的一定量的发酵液的连续流引入所述培养物中；

用所述发酵液使所述培养物发酵；以及

从所述培养物中去除一定量的所述发酵液的连续流；

其中所述生物产品是与所述发酵液不混溶的疏水性溶剂，并且其中存在于所述的粗碳源中的毒副产品在所述疏水性溶剂中是可溶的。

57.如权利要求56的持续发酵方法，还包括：

用初始量的疏水性溶剂预处理所述的发酵液；以及

从所述疏水性溶剂中去除所述发酵液。

58.如权利要求57的持续发酵方法，包括：

将所述的初始量疏水溶剂与所述的发酵液以疏水性溶剂∶发酵液为至多约1∶1(体积∶体积)的比例混合。

59.如权利要求58的持续发酵方法，包括：

将所述的初始量疏水溶剂与所述的发酵液以疏水性溶剂∶发酵液为从约1∶3至约1∶100(体积∶体积)的比例混合。

60.如权利要求56的持续发酵方法，还包括：

将一定量的疏水性溶剂引入所述发酵液中。

61.如权利要求60的持续发酵方法，其中引入的一定量的疏水性溶剂是疏水性溶剂∶发酵液的比例为至多1∶1(体积∶体积)。

62.如权利要求60的持续发酵方法，其中引入的一定量的疏水性溶剂是疏水性溶剂∶发酵液的比例为从约1∶3至约1∶100(体积∶体积)。

63.如权利要求56-62中任一项的持续发酵方法，其中所述的毒副产品包含以下至少一种：糠醛、5-羟甲基糠醛、脂肪族酸、酚类化合物、4-羟基苯甲醛、4-羟基苯甲酸、对苯二酸、儿茶酚、4-甲基儿茶酚、丁香醛、丁香酸、邻甲氧基苯酚、香草酸、香草醛、1-乙酰基-9H-吡啶并[3，4B]吲哚、1-乙酰基吡咯烷、2，3-二氢苯并呋喃、2，5-二甲基-4-羟基-3(2H)-furnine、2，5-二甲基吡嗪、2-羟基-3-甲基-2-环戊烯-1-酮、5，6-二氢-6-戊基-2H-吡喃-4-酮、苯乙酸、苯甲酸、呋喃羧酸甲基乙基酯、十六烷酸、己酸、戊酸、三甲基吡嗪、呋喃、n-己酸，或4-羧基苯甲醛。

64.如权利要求56-63中任一项的持续发酵方法，其中所述的疏水性溶剂包含烷烃、酯、烯烃、脂肪酸、脂肪醇、醛或酮。

65.如权利要求56-64中任一项的持续发酵方法，其中所述的疏水性溶剂包含月桂酸甲酯、十六烷、二十碳十烯、C1C12:0酯、C1C12:1酯、C1C14:0酯、C1C14:1酯、C1C16:0酯、C1C16:1酯、C1C18:1酯、C2C12:0酯、C2C12:1酯、C2C14:0酯、C2:C14:1酯、C2C16:0酯、C2C16:1酯、C2:C18:1酯，或商业生物柴油。

66.如权利要求56-65中任一项的持续发酵方法，其中所述的生物产品包含烷烃、酯、烯烃、脂肪酸、脂肪醇、醛或酮。

67.如权利要求56-66中任一项的持续发酵方法，其中所述的生物产品包含十六烷、二十碳十烯、C1C12:0酯、C1C12:1酯、C1C14:0酯、C1C14:1酯、C1C16:0酯、C1C16:1酯、C1C18:1酯、C2C12:0酯、C2C12:1酯、C2C14:0酯、C2:C14:1酯、C2C16:0酯、C2C16:1酯、C2:C18:1酯，或生物柴油。

68.如权利要求56-67中任一项的持续发酵方法，其中所述的生物产品是生物燃料。

69.如权利要求56-68中任一项的持续发酵方法，其中所述的疏水性溶剂和所述的生物产品是相似的分子。

70.如权利要求56-69中任一项的持续发酵方法，其中所述的粗碳源源自生物质。

71.如权利要求70的持续发酵方法，其中所述的粗碳源包含水解的纤维素、水解的半纤维素物质或糖浆。

72.如权利要求71的持续发酵方法，其中所述的纤维素或半纤维素物质包含木材、草、林业废弃物、农业残留物或工农业残留物。

73.如权利要求56-72中任一项的持续发酵方法，其中所述的工程微生物细胞经人工改造提高编码酶的基因的表达，所述酶选自硫酯酶、酰基辅酶A合酶和酯合酶。

74.如权利要求73的持续发酵方法，其中所述的工程微生物细胞中编码酰基辅酶A合酶的基因衰减或缺失。

75.如权利要求74的持续发酵方法，其中所述的编码酰基辅酶A合酶的基因是fadE。

76.通过一种方法由工程微生物细胞产生的生物产品，所述方法包括：

制备包含粗碳源的发酵液；

用所述微生物细胞接种所述发酵液；

培养接种的发酵液；

从培养的发酵液中回收所述生物产品；

其中所述生物产品是与所述发酵液不混溶的疏水性溶剂，并且其中存在于所述粗碳源中的毒副产品在所述疏水性溶剂中是可溶的。

77.如权利要求76的方法所产生的生物产品，所述的方法还包括：

用初始量的疏水性溶剂预处理所述发酵液；以及

从所述疏水性溶剂中去除所述发酵液。

78.如权利要求77的方法所产生的生物产品，其中所述预处理步骤包括：

将所述的初始量疏水溶剂与所述的发酵液以疏水性溶剂∶发酵液为至多约1∶1(体积∶体积)的比例混合。

79.如权利要求78的方法所产生的生物产品，其中所述预处理步骤包括：

将所述的初始量疏水溶剂与所述的发酵液以疏水性溶剂∶发酵液为从约1∶3至约1∶100(体积∶体积)的比例混合。

80.如权利要求76的方法所产生的生物产品，其中所述方法还包括：

将一定量的疏水性溶剂引入所述发酵液中。

81.如权利要求80的方法所产生的生物产品，其中引入的疏水性溶剂的量是疏水性溶剂∶发酵液的比例为至多1∶1(体积∶体积)。

82.如权利要求80的方法所产生的生物产品，其中引入的疏水性溶剂的量是疏水性溶剂∶发酵液的比例为从约1∶3至约1∶100(体积∶体积)。

83.如权利要求76-82中任一项的方法所产生的生物产品，其中所述回收步骤包括：

将所述生物产品合并到所述发酵液中。

84.如权利要求76-83中任一项的方法所产生的生物产品，所述方法还包括：

纯化所回收的生物产品。

85.如权利要求84的方法所产生的生物产品，其中所述的纯化步骤包括：离心、过滤、或溶剂提取。

86.如权利要求84-85中任一项的方法所产生的生物产品，所述方法还包括：

滤清所述的纯化的生物产品。

87.如权利要求86的方法所产生的生物产品，其中所述的滤清步骤包括：去离子化、吸附、脱色(decolizing)或干燥。

88.如权利要求76-87任一项的方法所产生的生物产品，其中所述的毒副产品包含以下至少一种：糠醛、5-羟甲基糠醛、脂肪族酸、酚类化合物、4-羟基苯甲醛、4-羟基苯甲酸、对苯二酸、儿茶酚、4-甲基儿茶酚、丁香醛、丁香酸、邻甲氧基苯酚、香草酸、香草醛、1-乙酰基-9H-吡啶并[3，4B]吲哚、1-乙酰基吡咯烷、2，3-二氢苯并呋喃、2，5-二甲基-4-羟基-3(2H)-furnine、2，5-二甲基吡嗪、2-羟基-3-甲基-2-环戊烯-1-酮、5，6-二氢-6-戊基-2H-吡喃-4-酮、苯乙酸、苯甲酸、呋喃羧酸甲基乙基酯、十六烷酸、己酸、戊酸、三甲基吡嗪、呋喃、n-己酸，或4-羧基苯甲醛。

89.如权利要求76-88中任一项的方法所产生的生物产品，其中所述的疏水性溶剂包含烷烃、酯、烯烃、脂肪酸、脂肪醇、醛或酮。

90.如权利要求76-89中任一项的方法所产生的生物产品，其中所述的疏水性溶剂包含十六烷、二十碳十烯、C1C12:0酯、C1C12:1酯、C1C14:0酯、C1C14:1酯、C1C16:0酯、C1C16:1酯、C1C18:1酯、C2C12:0酯、C2C12:1酯、C2C14:0酯、C2:C14:1酯、C2C16:0酯、C2C16:1酯、C2:C18:1酯，或商业生物柴油。

91.如权利要求76-90中任一项的方法所产生的生物产品，其中所述的生物产包含烷烃、酯、烯烃、脂肪酸、脂肪醇、醛或酮。

92.如权利要求76-91中任一项的方法所产生的生物产品，其中所述的生物产品包括十六烷、二十碳十烯、C1C12:0酯、C1C12:1酯、C1C14:0酯、C1C14:1酯、C1C16:0酯、C1C16:1酯、C1C18:1酯、C2C12:0酯、C2C12:1酯、C2C14:0酯、C2:C14:1酯、C2C16:0酯、C2C16:1酯、C2:C18:1酯，或生物柴油。

93.如权利要求76-92中任一项的方法所产生的生物产品，其中所述的生物产品是生物燃料。

94.如权利要求76-93中任一项的方法所产生的生物产品，其中所述的疏水性溶剂和所述的生物产品是相似的分子。

95.如任一权利要求76-94中任一项的方法所产生的生物产品，其中所述的粗碳源源自生物质。

96.如权利要求95的方法所产生的生物产品，其中所述的粗碳源包含水解的纤维素、水解的半纤维素物质或糖浆。

97.如权利要求96的方法所产生的生物产品，其中所述的纤维素或半纤维素物质包含木材、草、林业废弃物、农业残留物或工农业残留物。

98.由能量驱动的交通工具，该能量是通过一种方法由工程微生物细胞产生的生物产品的燃烧获得的，该方法包括：

制备包含粗碳源的发酵液；

用所述微生物细胞接种所述发酵液；

培养接种的发酵液；

从培养的发酵液中回收所述生物产品；

其中所述生物产品是与所述发酵液不混溶的疏水性溶剂，并且其中存在于所述粗碳源中的毒副产品在所述疏水性溶剂中是可溶的。

99.如权利要求98的交通工具，所述的方法还包括：

用初始量的疏水性溶剂预处理所述发酵液；以及

从所述疏水性溶剂中去除所述发酵液。

100.如权利要求98-99中任一项的方法，其中所述的工程微生物细胞经人工改造提高编码酶的基因的表达，所述酶选自硫酯酶、酰基辅酶A合酶和酯合酶。

101.如权利要求100的方法，其中所述的工程微生物细胞中编码酰基辅酶A合酶的基因衰减或缺失。

102.如权利要求101的方法，其中所述的编码酰基辅酶A合酶的基因是fadE。