CN104031971A - 一种游离细胞发酵法生产n—氨甲酰谷氨酸及其代谢产物应用的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种游离细胞发酵法生产N—氨甲酰谷氨酸及其代谢产物应用的方法,其包含如下工艺：菌种培养、一级种子培养、种子罐培养、发酵和真空浓缩收集成品，制得的发酵添加剂成品为N—氨甲酰谷氨酸及其代谢产物的混合物，其可以作为一种新型的畜禽绿色饲料添加剂，在猪的全价饲料中添加0.1%可提高不同阶段猪的整体免疫健康水平，提高妊娠母猪的活产仔数和初生重量，使窝产仔数提高；在肉鸡、蛋鸡的全价饲料中添加0.15%的该发酵添加剂，可显著减轻鸡的啄羽啄肛癖，消除因某些氨基酸过多而产生的应激反应，影响肉鸡生长和蛋鸡产蛋率；该产品能调节畜禽体内生物平衡，降低料肉比，缩短饲养周期。

Description

一种游离细胞发酵法生产N—氨甲酰谷氨酸及其代谢产物应用的方法

技术领域

本发明涉及一种游离细胞发酵法生产N—氨甲酰谷氨酸及其代谢产物应用的方法。

背景技术

我国是一个畜禽产品生产大国，拥有丰富的畜牧资源和发达的养殖产业，大力发展养殖业供给人类食品，增加养殖收入，振兴当地产业，繁荣市场经济做出了卓越贡献。但是随着规模化养殖业的迅速发展，禽畜高密度养殖以及单纯追求产量和经济效益，由此引发的一系列问题必须引起广大养殖户的高度重视。

饲料原料的不足，尤其是高蛋白饲料资源的短缺和浪费，高蛋白饲料原料资源短缺且转化利用率不高，饲料报酬低和成本高。抗生素，激素等药物的滥用，给养殖业带来了种种弊端，破坏了动物肠道的微生态平衡，不利于动物机体健康，畜禽产品中的药物残留，激素超标，抗生素，激素的残留性和耐药性已危及到人类的身体健康。

因此，大力发展绿色、高效环保的饲料资源，无公害畜禽产品，保护人类健康，保护环境已成为二十一世纪关注的焦点。

精氨酸是一种重要的功能性氨基酸，在动物细胞信息传递和营养代谢中起重要作用，但其受价格高且与赖氨酸、色氨酸和组氨酸有拮抗作用，而未能作为饲料添加剂在动物生产中大量推广使用。作为精氨酸内源合成激活剂的N—氨甲酰谷氨酸，可以激活动物体内精氨酸合成过程中的酶，促进动物体内精氨酸的合成。

若从动物日粮中直接添加精氨酸，精氨酸会被母猪乳腺组织分解而无法传递给仔猪，而乳腺组织无法分解N—氨甲谷氨酸，故N—氨甲酰谷氨酸可通过乳汁传递给仔猪，进而仔猪体内进一步合成机体必需的精氨酸，保证了仔猪机体内精氨酸水平。

目前研究N—氨甲酰谷氨酸的生产方法已成为焦点，但是现阶段的生产方法主要依靠化学合成法，该方法生产工艺复杂，设备利用率和产品收率低，有效物质单一，使用效果不显著，适用范围小，能耗大，生产成本过高，仅限于用在猪饲料中作为一种添加剂，生产中采用的是化学原料，会对环境造成污染。

利用游离细胞发酵法生产N—氨甲酰谷氨酸及其代谢产物的优点在于，具有生产工艺简单，易操作，生产周期短，设备利用率和产品收率高，能耗低，原料易得，设备投资少，主要原料是L—谷氨酸钠（味精），生产中无有三废排放，发酵代谢产物丰富，成本更加低廉，使用效果更加明显广泛，根据不同动物采用不同的添加量，可用于猪、肉鸡、蛋鸡、牛等饲料中，发酵产物中包括N—氨甲酰谷氨酸，、L—丙氨酸、生物抗菌肽、有机酸、生物多糖、免疫调节因子、各种消化酶等，这是化学合成法生产N—氨甲酰谷氨酸无法相比较的。

所采用的发酵菌种是我国农业部获准使用的益生菌种，市售可得。

（1）丁酸梭菌，菌号为CGMCC—1.209 中国普通微生物菌种保藏管理中心；

菌号为 CCTMCC—1.335 中国普通微生物菌种保藏管理中心；

菌号为 CICC—8015 中国工业微生物菌种保藏管理中心；

（2）消化乳杆菌，菌号为ACCC—10174 中国农业微生物菌种保藏管理中心；

动物乳杆菌，菌号为 CCTMCC—1.2623 中国普通微生物；

布氏乳杆菌，菌号为 CCTMCC—1.13中国普通微生物。

产品应用效果：

游离细胞发酵法生产的N—氨甲酰谷氨酸及其代谢产物的用途在于，可以作为一种新型的畜禽绿色饲料添加剂，在猪的全价饲料中添加0.1%可提高不同阶段猪的整体免疫健康水平，提高妊娠母猪的活产仔数和初生重量，使窝产仔数提高。

提高公猪的性欲和精液品质，可以使精子数量显著提高，并使精子活力得到显著改善；提高断奶仔猪的生长性能及成活率，显著提高仔猪日增重；促进母猪排卵，扩大子宫和胎容积，提高胚胎着床率。

减少猪应激症的发生，大量试验证明，添加该发酵添加剂可防止猪因断奶、饲养密度过大而发生的咬尾等应激现象，防止因应激反应导致的猪采食量急剧下降，影响猪的生长。

该发酵添加剂能促进动物对钙的吸收，防止仔猪腹泻，有效的改善动物的消化机能，减少疾病，增强动物的抗病能力。

促进育肥猪的生长，日增重明显，改善肉质，提高瘦肉率，降低猪体内脂肪等。

在肉鸡、蛋鸡方面的效果：在肉鸡、蛋鸡的全价饲料中添加0.15%的该发酵添加剂，可显著减轻鸡的啄羽啄肛癖，消除因某些氨基酸过多而产生的应激反应，影响肉鸡生长和蛋鸡产蛋率；提高肉鸡的胸肌率，减少脂肪沉积，可延长蛋鸡的产蛋高峰期，可使蛋壳厚度增加，减少蛋的破损率，便于运输；提高肉鸡、蛋鸡对球虫病感染的抵抗力，有助于抗球虫病药的效果。

明显改善犊牛的腹泻及脱水症状等。

该发酵添加剂中所含的生物多糖能促进禽畜肠道中的双歧杆菌增值，双歧杆菌的增殖代谢产物短链脂肪酸还可以刺激动物肠道的蠕动，缩短食糜在肠道内的停留时间，从而减少有害物质对禽畜机体造成的危害。

所含的有机酸及抗菌肽，免疫调节因子能有效抑制肠道大肠杆菌的增值，增强畜禽机体免疫和抗病能力，降低饲料中的药物用量，减少药物残留、激素，提高畜禽产品品质，改善禽畜肠道的微生态平衡等作用。

该产品的各种酶能分解畜禽肠道中产生的肠毒素，毒性胺，调节畜禽体内生物平衡，修复受损伤的消化道粘膜，清除饲料中的抗营养因子，补充畜禽体内内源酶的不足，促进禽畜的消化吸收能力，降低料肉比，缩短饲养周期。

我国是一个世界上最大的养殖国之一，同时也是饲料原料的需求大国，如何开发生产质优价廉的饲料原料，特别是利用微生物发酵氨基酸或氨基酸的替代品，因微生物发酵在生产中无有污染，是环境友好型的生产方法，已迫在眉睫。

针对以上所存在的技术问题，济南环亿生物科技有限公司，经多年的研究开发，动物试验，成功的利用游离细胞法发酵生产出了一种新型禽畜饲用生物添加剂，N—氨甲酰谷氨酸及其发酵代谢产物，显得尤为重要，据资料显示，利用游离细胞法发酵生产N—氨甲酰谷氨酸及其代谢产物的利用，在国际上属首次成功，前景广阔。

发明内容

本发明提供一种游离细胞发酵法生产N—氨甲酰谷氨酸及其代谢产物的方法，其包含如下工艺：菌种培养、一级种子培养、种子罐培养、发酵和真空浓缩收集成品，其特征在于：

所述菌种培养工艺中安瓿管菌种的扩大培养、培养基的配方为：葡萄糖20-30克、蛋白胨12-20克、牛肉浸粉5-8克、L—半胱氨酸盐酸盐10-15克、乙酸钠3-7克、吐温80 3-10克、余量为水、PH值自然；

所述一级种子培养的配方为：葡萄糖20-25克、蛋白胨5-8克、牛肉浸粉3-6克、L—半胱氨酸盐酸盐5-10克，L—谷氨酸钠20-30克，乙酸钠2-5克，吐温—80 1.5-15克，自来水1000毫升，PH自然；

所述种子罐培养工艺使用的培养基的配方中各组分重量百分比为：葡萄糖5%-10%，蛋白胨0.5%-5%，豆饼粉（细度90目的）3%-10%，L—半胱氨酸盐酸盐1%-8%，L—谷氨酸钠10%-20%，乙酸钠0.2%-2.5%，吐温80 0.1%-1.5%，莲子淀粉2%-15%，含量95%的甘油0.2%-2.5%，聚醚消泡剂0.1%-0.3%，余量为水，PH值自然；

所述发酵工艺中的培养基配方中各组分的重量百分比为：葡萄糖7%-17%，蛋白胨0.4%-4%，豆饼粉（细度90目的）5%-10%，L—半胱氨酸盐酸盐0.5%-5.5%，L—谷氨酸钠22%-40%，乙酸钠0.1%-1%，吐温80 0.2%-2%，莲子淀粉2.5%-10%，含量95%的甘油1%-8%，甘蔗糖蜜0.7%-8%，含量95%的L—精氨酸0.1%-1.5%，氯化钾0.1%-1.5%，硫酸镁0.1%-1%，玉米浆0.2%-2%，聚醚消泡剂0.1%-0.2%，余量为水，共100公斤。

其中所述安瓿管菌种的扩大培养、培养基的配制过程为：将所述安瓿管菌种的扩大培养、培养基的配方中的原料不分前后的加入到配方中的1000毫升水中，搅拌30分钟使之溶化，然后分装于18*180的试管中，每只试管装10毫升，然后进行培养基灭菌处理；

所述菌种培养工艺中包含接种工艺，即在无菌条件下分别打开购进的丁酸梭菌和消化乳杆菌进行分别培养，然后分别向每个安瓿管中加入以上灭好菌的培养基2毫升，摇动溶化备用，此称为安瓿管菌悬液，然后再取以上灭好菌的试管培养基2支，分别将溶化好的菌悬液各取1毫升加入试管中，用胶塞、牛皮纸封好管口，用手轻摇匀，放入恒温培养箱中37℃静置培养50小时即可，此称为扩大菌种液。

所述一级种子培养过程为：将所述一级种子培养的配方中的原料称好后不分前后的加入到配方中的自来水中，开动搅拌机，搅拌30分钟，使全部溶化，此称为一级种子培养液；将搅拌溶化好的一级种子培养液进行灭菌处理，取出灭好菌的培养基放入超净工作台中自然降温，当温度降至37℃时，将以上培养好的扩大菌种液分别移接到三角瓶灭好菌的一级培养液中，每100毫升一级种子培养液，接入扩大菌种液为3毫升，然后放恒温箱中在37℃的条件下培养40小时即可，此称为一级菌种液。

所述种子罐培养的过程为：首先将所述种子罐培养工艺使用的培养基配方中所使用的自来水投入到已空罐灭菌的种子罐中，开动搅拌机，分别加入配方中所需的原料，加入顺序不分前后，然后在不停的搅拌下通入蒸汽加温，首先利用罐夹层蒸汽加热到95℃时，再改用直接蒸汽加热，当罐中温度达到121℃时保持30分钟即可达到灭菌的效果，然后关闭蒸汽，开始通过罐夹层的自来水冷却降温，当罐内温度降到37℃时备用，此称为种子培养基；然后将以上培养好的一级菌种培养液在无菌条件下接种到种子罐中去，接种量为每100公斤种子罐培养基分别接入一级菌种液3公斤；然后盖好罐上的接种帽开始搅拌培养，培养条件：温度37℃，PH值自然，搅拌转速100转/每分钟，罐压0.05兆帕，培养时间30小时即可达到要求，如果罐压降低，可通入无菌空气保持罐压，罐压过高可用罐顶的放气阀调整，此称为种子罐菌种。

所述发酵工艺的过程为：首先将所述发酵配方中所使用的自来水投入到已空罐灭菌的发酵罐中去，开动搅拌机，向发酵罐中投入配方中所使用的原料，加入顺序不分前后，然后通入蒸汽加热进行灭菌处理，灭菌处理完毕后进行冷却降温，当罐中的温度降到37℃时开始接入菌种，接种前首先提高种子罐的罐压力达到0.1兆帕，发酵罐的罐压保持0.05兆帕，然后打开接种管道阀门，将种子罐培养好的种子罐菌种通过压差的方式输送到发酵罐中去，然后关闭接种管道阀门；接种量是每100公斤发酵罐中的培养基接入种子罐混合培养的菌种6公斤，培养条件：发酵温度37℃，搅拌速度90转/每分钟，发酵时间40小时即可，罐压保持0.05兆帕，PH值自然，如果罐压降低可通入无菌空气保持罐压，罐压过高可用罐顶的排气阀调整，此称为发酵液。

所述真空浓缩收集成品的过程为：发酵完毕后，将发酵液抽入到贮罐中开始真空浓缩，采用低温真空浓缩除去多余水分；所述低温真空浓缩的质量要求为：100公斤发酵液浓缩还剩余50公斤，然后将浓缩液放入混合机中加入90目的玉米芯粉吸附，所述玉米芯粉的用量为：50公斤浓缩液加入50公斤玉米芯粉，然后在混合机中混合搅拌制得浓缩混合料；然后将所述浓缩混合料进行干燥、粉碎处理制得N—氨甲酰谷氨酸及其代谢产物的混合物，称为发酵添加剂成品。

所述发酵添加剂成品中含发酵代谢产物，L-丙氨酸0.5%，抗菌肽1.2%，有机酸0.5%，生物多糖0.3%。

所述低温真空浓缩的过程为：启动真空浓缩设备，首先向浓缩罐中加入发酵液，加入量是浓缩罐总容量的30%，然后开始加温，当浓缩罐的发酵液温度达到55℃时，开动真空泵开始浓缩，真空度0.075兆帕，边浓缩边通过管道向浓缩罐中输入发酵液，直至浓缩完为止。

将所述发酵添加剂成品按0.1%的用量添加到猪的全价饲料或预混料中搅拌均匀，让其自由采食；或按0.15%的用量添加到肉鸡和蛋鸡的全价料或预混料中，搅拌均匀，让其自由采食。

附图说明

无。

具体实施方式

我们在原有菌种的基础上，对菌种培养基进行了筛选优化，所使用的菌种在发酵过程中性能稳定，对产品的转化率高，菌种易保存，不会发生变异，成功设计出了一整套配方及生产工艺和产品的最佳用量，确保了工业化生产的顺利进行。

生产中所使用的设备：医用消毒器、鼓风干燥箱、恒温培养箱、真空干燥箱、玻璃三角瓶、试管、超净工作台、种子罐、发酵罐、真空浓缩罐、混合搅拌机、粉碎机。

菌种培养：

购进菌种的扩大培养、培养基的配制：葡萄糖20-30克、蛋白胨12-20克、牛肉浸粉5-8克、L—半胱氨酸盐酸盐10-15克、乙酸钠3-7克、吐温80 3-10克、自来水1000毫升、PH值自然。

操作：将以上配方中的葡萄糖等原料不分前后的加入到配方中的1000毫升水中，搅拌30分钟使之溶化，然后分装于18*180的试管中，每只试管装10毫升，胶塞牛皮纸封口，放医用消毒器中0.1—0.12兆帕灭菌25分钟，培养基灭菌完毕。

接种：在无菌条件下（超净工作台中）分别打开购进的安瓿管菌种，因用的丁酸梭菌和消化乳杆菌二株菌种，在此须分别培养，然后分别向每个冻干管中加入以上灭好菌的培养基2毫升，摇动溶化备用，此称为安瓿管菌悬液，然后再取以上灭好菌的试管培养基2支，分别将溶化好的菌悬液各取1毫升加入试管中，用胶塞、牛皮纸封好管口，用手轻摇匀，放入恒温培养箱中37℃静置培养50小时即可，此称为扩大菌种液。

一级种子培养：

配方：葡萄糖20-25克、蛋白胨5-8克、牛肉浸粉3-6克、L—半胱氨酸盐酸盐5-10克，L—谷氨酸钠20-30克，乙酸钠2-5克，吐温80 1.5-15克，余量为水，PH自然；

操作：将上述原料称好后不分前后的加入到配方中的自来水中，开动搅拌机，搅拌30分钟，使全部溶化，此称为一级种子培养液。

将搅拌溶化好的一级种子培养液按用量加入到三角瓶中，然后用8层纱布外加一层牛皮纸扎好平口，放入医用消毒器中灭菌，灭菌前首先打开消毒器上的排气阀门等有少量蒸汽排出时关闭，当消毒器上的压力达到0.05兆帕时，打开消毒器上的排气阀门排气6—8分钟，然后关闭排气阀门，继续加温，当消毒器中的蒸汽压力达到0.1—0.12兆帕时开始计时，灭菌时间为25分钟，完毕后离开加热源，让其自然降温，当消毒器上的压力表归零时，打开消毒器，取出灭好菌的培养基放入超净工作台中自然降温，当温度降至37℃时，将以上培养好的扩大菌种液分别移接到三角瓶灭好菌的培养液中，接种量分别是3%，即一级种子培养液100毫升，接入扩大菌种液为3毫升，完毕后用原有纱布及牛皮纸将瓶口封好，用手稍加摇动使接入的菌种与培养液混合均匀，然后放恒温箱中在37℃的条件下培养40小时即可，此称为一级菌种液。

发酵设备、管道及无菌过滤系统的灭菌：

操作：首先打开各进出管道及无菌空气管道的阀门，通入0.12—0.14兆帕的蒸汽，让蒸汽与管道阀门联通并有少量蒸汽排出，通气40分钟，让管道内的蒸汽压力保持0.12—0.14兆帕，保持40分钟，然后关闭各进出管道阀门，备用。

种子罐及发酵罐的空罐灭菌：

关闭各个阀门，打开罐底部的排污阀及罐夹层的排污阀，打开直接蒸汽阀门向罐内通入0.12—0.14兆帕的蒸汽，当罐内达到121℃时开始计时，灭菌时间为40分钟，然后关闭罐底部排污阀及夹层排污阀，罐中温度自然降至37℃备用。

种子罐培养：

配方：（培养基各组分的重量百分比）葡萄糖5%-10%，蛋白胨0.5%-5%，豆饼粉（细度90目的）3%-10%，L—半胱氨酸盐酸盐1%-8%，L—谷氨酸钠10%-20%，乙酸钠0.2%-2.5%，吐温80 0.1%-1.5%，莲子淀粉2%-15%，含量95%的甘油0.2%-2.5%，聚醚消泡剂0.1%-0.3%，余量为水，PH值自然。

具体操作：首先将配方中所使用的自来水投入到已空罐灭菌的种子罐中，开动搅拌机，分别加入配方中所需的原料（加入顺序不分前后），然后在不停的搅拌下通入蒸汽加温，首先利用罐夹层蒸汽加热到95℃时，再改用直接蒸汽加热，当罐中温度达到121℃时保持30分钟即可达到灭菌的效果，然后关闭蒸汽，开始通过罐夹层的自来水冷却降温，当罐内温度降到37℃时备用，此称为种子培养基。然后将以上培养好的一级菌种培养液在无菌条件下接种到种子罐中去，接种量分别是罐内培养基的3%（因使用的是二株菌种接种时各3%，在这里是混合培养），即可100公斤种子罐培养基分别接入一级菌种液3公斤即可。然后盖好罐上的接种帽开始搅拌培养，培养条件：温度37℃，PH值自然，搅拌转速100转/每分钟，罐压0.05兆帕，培养时间30小时即可达到要求，如果罐压降低，可通入无菌空气保持罐压，罐压过高可用罐顶的放气阀调整，此称为种子罐菌种。

发酵：

配方：培养基各组分的重量百分比

葡萄糖7%-17%，蛋白胨0.4%-4%，豆饼粉（细度90目的）5%-10%，L—半胱氨酸盐酸盐0.5%-5.5%，L—谷氨酸钠22%-4%，乙酸钠0.1%-1%，吐温80 0.2%-2%，莲子淀粉2.5%-10%，含量95%的甘油1%-8%，甘蔗糖蜜0.7%-8%，含量95%的L—精氨酸0.1%-1.5%，氯化钾0.1%-1.5%，硫酸镁0.1%-1%，玉米浆0.2%-2%，聚醚消泡剂0.1%-0.2%，余量为水，共100公斤。

具体操作：首先将配方中所使用的自来水投入到已空罐灭菌的发酵罐中去，开动搅拌机，向发酵罐中投入配方中所使用的原料（加入顺序不分前后），然后通入蒸汽加热，首先利用夹层蒸汽加热到95℃，然后再改用直接蒸汽加热，当罐中温度达到121℃时开始计时，保持40分钟即可达到灭菌效果，然后通过夹层的自来水冷却降温，当罐中的温度降到37℃时开始接入菌种，接种前首先提高种子罐的罐压力达到0.1兆帕，发酵罐的罐压保持0.05兆帕，然后打开接种管道阀门，将种子罐培养好的种子罐菌种通过压差的方式输送到发酵罐中去，然后关闭接种管道阀门。

接种量是每100公斤发酵罐中的培养基接入种子罐混合培养的菌种6公斤，培养条件：发酵温度37℃，搅拌速度90转/每分钟，发酵时间40小时即可，罐压保持0.05兆帕，PH值自然，如果罐压降低可通入无菌空气保持罐压，罐压过高可用罐顶的排气阀调整，此称为发酵液。

真空浓缩收集成品：

发酵完毕后，将发酵液抽入到贮罐中开始真空浓缩，因发酵液中还含有一定的水分，为了保证发酵代谢产物中的活性物质、酶等，须采用低温真空浓缩除去多余水分。

操作：启动真空浓缩设备，首先向浓缩罐中加入发酵液，加入量是浓缩罐总容量的30%，然后开始加温，当浓缩罐的发酵液温度达到55℃时，开动真空泵开始浓缩，真空度0.075兆帕，边浓缩边通过管道向浓缩罐中输入发酵液，直至浓缩完为止。

浓缩的质量要求：100公斤发酵液浓缩还剩余50公斤，然后将浓缩液放入混合机中加入玉米芯粉吸附（玉米芯粉的细度要求90目），玉米芯粉的用量为：50公斤浓缩液加入50公斤玉米芯粉，然后在混合机中混合搅拌1小时即可，此称为浓缩混合料。

干燥：将搅拌好的浓缩混合料放入真空干燥箱中进行真空干燥，干燥条件为：干燥温度55℃，真空度0.075兆帕，干燥时间50小时，水分含量8%，如果水分含量高可继续干燥，直至小分含量合格为止。

粉碎：将干燥好的浓缩混合料用粉碎机粉碎，细度90目即可。

包装：将粉碎的混合料装入铝塑袋可直接出售。该混合料为N—氨甲酰谷氨酸及其代谢产物的混合物，此称为发酵添加剂成品。所述发酵添加剂成品中含发酵代谢产物，L-丙氨酸0.5%，抗菌肽1.2%，有机酸0.5%，生物多糖0.3%。

用法与用量：可将本发酵产品按0.1%的用量添加到猪的全价饲料或预混料中搅拌均匀，让其自由采食，效果显著。

按0.15%的用量添加到肉鸡和蛋鸡的全价料或预混料中，搅拌均匀，让其自由采食，效果显著。

同样按0.15%的添加量添加到牛特别是犊牛的饲料中，对防止犊牛的腹泻及脱水症效果明显。

畜禽试验结果：

杜洛克猪（增重效果）

组别	数量	初重平均每头	试验60天平均每头增重	死亡	备注
						实验组	400头	40公斤	67公斤	1头	生病2天自然恢复，未使用药物
对照组	400头	40.3公斤	55公斤	6头	生病采用药物治疗，除死亡的，其他6天恢复

杜洛克猪（窝产仔数出生重及成活率）

组别	数量	断奶应激反应	生长60天的猪换料	咬尾现象	备注
						实验组	300头	无影响，不腹泻，采食正常	无影响	无有	不影响猪生长
对照组	300头	腹泻，采食量急剧下降	采食量下降，是正常采食量的三分之一，但5天恢复	有10%的咬尾，但10天恢复	影响猪的正常生长

海拔益加（AA）肉鸡的试验

组别

数量

10日龄平均每只重

10日—54天出栏

死亡

阶段换料应激反应

啄肛啄羽

实验组

1000只

60克

平均每只重3.5公斤

4只

正常采食

无

对照组

1000只

63克

平均每只重3.12公斤

16只

采食减半，3天恢复

有10%啄肛，15%啄羽，影响生长

海兰蛋鸡

组别	数量	12个月试验期	外观	胆固醇	雌激素
						实验组	1000只	平均每只产蛋320枚	蛋壳厚、蛋黄红	每枚全蛋205毫克	每枚全蛋2.1纳克
对照组	1000只	平均每只产蛋265枚	蛋壳薄、蛋黄白	每枚全蛋505毫克	每枚全蛋7.2纳克

出生120天的肉牛试验

组别	数量	腹泻及脱水症状	治疗情况	采食情况	饲喂添加剂时间
						实验组	100头	1头发病	未采用药物治疗，2天恢复	采食正常	28天
对照组	100头	9头发病	采用药物治疗，3天恢复	采食减半，2天恢复

Claims (10)

1.一种游离细胞发酵法生产N—氨甲酰谷氨酸及其代谢产物的方法，其包含如下工艺：菌种培养、一级种子培养、种子罐培养、发酵和真空浓缩收集成品，其特征在于：

所述菌种培养工艺中安瓿管菌种的扩大培养、培养基的配方为：葡萄糖20-30克、蛋白胨12-20克、牛肉浸粉5-8克、L—半胱氨酸盐酸盐10-15克、乙酸钠3-7克、吐温80 3-10克、余量为水、PH值自然；

所述一级种子培养的配方为：葡萄糖20-25克、蛋白胨5-8克、牛肉浸粉3-6克、L—半胱氨酸盐酸盐5-10克，L—谷氨酸钠20-30克，乙酸钠2-5克，吐温—80 1.5-15克，自来水1000毫升，PH自然；

所述种子罐培养工艺使用的培养基的配方中各组分重量百分比为：葡萄糖5%-10%，蛋白胨0.5%-5%，豆饼粉（细度90目的）3%-10%，L—半胱氨酸盐酸盐1%-8%，L—谷氨酸钠10%-20%，乙酸钠0.2%-2.5%，吐温80 0.1%-1.5%，莲子淀粉2%-15%，含量95%的甘油0.2%-2.5%，聚醚消泡剂0.1%-0.3%，余量为水，PH值自然；

所述发酵工艺中的培养基配方中各组分的重量百分比为：葡萄糖7%-17%，蛋白胨0.4%-4%，豆饼粉（细度90目的）5%-10%，L—半胱氨酸盐酸盐0.5%-5.5%，L—谷氨酸钠22%-40%，乙酸钠0.1%-1%，吐温80 0.2%-2%，莲子淀粉2.5%-10%，含量95%的甘油1%-8%，甘蔗糖蜜0.7%-8%，含量95%的L—精氨酸0.1%-1.5%，氯化钾0.1%-1.5%，硫酸镁0.1%-1%，玉米浆0.2%-2%，聚醚消泡剂0.1%-0.2%，余量为水，共100公斤。

2.如权利要求1所述的游离细胞发酵法生产N—氨甲酰谷氨酸及其代谢产物的方法，其中所述安瓿管菌种的扩大培养、培养基的配制过程为：将所述安瓿管菌种的扩大培养、培养基的配方中的原料不分前后的加入到配方中的1000毫升水中，搅拌30分钟使之溶化，然后分装于18*180的试管中，每只试管装10毫升，然后进行培养基灭菌处理。

3.如权利要求1或2所述的游离细胞发酵法生产N—氨甲酰谷氨酸及其代谢产物的方法，其中所述菌种培养工艺中包含接种工艺，即在无菌条件下分别打开购进的丁酸梭菌和消化乳杆菌进行分别培养，然后分别向每个安瓿管中加入以上灭好菌的培养基2毫升，摇动溶化备用，此称为安瓿管菌悬液，然后再取以上灭好菌的试管培养基2支，分别将溶化好的菌悬液各取1毫升加入试管中，用胶塞、牛皮纸封好管口，用手轻摇匀，放入恒温培养箱中37℃静置培养50小时即可，此称为扩大菌种液。

4.如权利要求1所述的游离细胞发酵法生产N—氨甲酰谷氨酸及其代谢产物的方法，其中所述一级种子培养过程为：将所述一级种子培养的配方中的原料称好后不分前后的加入到配方中的自来水中，开动搅拌机，搅拌30分钟，使全部溶化，此称为一级种子培养液；将搅拌溶化好的一级种子培养液进行灭菌处理，取出灭好菌的培养基放入超净工作台中自然降温，当温度降至37℃时，将以上培养好的扩大菌种液分别移接到三角瓶灭好菌的一级培养液中，每100毫升一级种子培养液，接入扩大菌种液为3毫升，然后放恒温箱中在37℃的条件下培养40小时即可，此称为一级菌种液。

5.如权利要求1所述的游离细胞发酵法生产N—氨甲酰谷氨酸及其代谢产物的方法，其中所述种子罐培养的过程为：首先将所述种子罐培养工艺使用的培养基配方中所使用的自来水投入到已空罐灭菌的种子罐中，开动搅拌机，分别加入配方中所需的原料，加入顺序不分前后，然后在不停的搅拌下通入蒸汽加温，首先利用罐夹层蒸汽加热到95℃时，再改用直接蒸汽加热，当罐中温度达到121℃时保持30分钟即可达到灭菌的效果，然后关闭蒸汽，开始通过罐夹层的自来水冷却降温，当罐内温度降到37℃时备用，此称为种子培养基；然后将以上培养好的一级菌种培养液在无菌条件下接种到种子罐中去，接种量为每100公斤种子罐培养基分别接入一级菌种液3公斤；然后盖好罐上的接种帽开始搅拌培养，培养条件：温度37℃，PH值自然，搅拌转速100转/每分钟，罐压0.05兆帕，培养时间30小时即可达到要求，如果罐压降低，可通入无菌空气保持罐压，罐压过高可用罐顶的放气阀调整，此称为种子罐菌种。

6.如权利要求1所述的游离细胞发酵法生产N—氨甲酰谷氨酸及其代谢产物的方法，其中所述发酵工艺的过程为：首先将所述发酵配方中所使用的自来水投入到已空罐灭菌的发酵罐中去，开动搅拌机，向发酵罐中投入配方中所使用的原料，加入顺序不分前后，然后通入蒸汽加热进行灭菌处理，灭菌处理完毕后进行冷却降温，当罐中的温度降到37℃时开始接入菌种，接种前首先提高种子罐的罐压力达到0.1兆帕，发酵罐的罐压保持0.05兆帕，然后打开接种管道阀门，将种子罐培养好的种子罐菌种通过压差的方式输送到发酵罐中去，然后关闭接种管道阀门；接种量是每100公斤发酵罐中的培养基接入种子罐混合培养的菌种6公斤，培养条件：发酵温度37℃，搅拌速度90转/每分钟，发酵时间40小时即可，罐压保持0.05兆帕，PH值自然，如果罐压降低可通入无菌空气保持罐压，罐压过高可用罐顶的排气阀调整，此称为发酵液。

7.如权利要求1所述的游离细胞发酵法生产N—氨甲酰谷氨酸及其代谢产物的方法，其中所述真空浓缩收集成品的过程为：发酵完毕后，将发酵液抽入到贮罐中开始真空浓缩，采用低温真空浓缩除去多余水分；所述低温真空浓缩的质量要求为：100公斤发酵液浓缩还剩余50公斤，然后将浓缩液放入混合机中加入90目的玉米芯粉吸附，所述玉米芯粉的用量为：50公斤浓缩液加入50公斤玉米芯粉，然后在混合机中混合搅拌制得浓缩混合料；然后将所述浓缩混合料进行干燥、粉碎处理制得N—氨甲酰谷氨酸及其代谢产物的混合物，称为发酵添加剂成品。

8.如权利要求7所述的游离细胞发酵法生产N—氨甲酰谷氨酸及其代谢产物的方法，其中所述发酵添加剂成品中含发酵代谢产物，L-丙氨酸0.5%，抗菌肽1.2%，有机酸0.5%，生物多糖0.3%。

9.如权利要求1或6所述的游离细胞发酵法生产N—氨甲酰谷氨酸及其代谢产物的方法，其中所述低温真空浓缩的过程为：启动真空浓缩设备，首先向浓缩罐中加入发酵液，加入量是浓缩罐总容量的30%，然后开始加温，当浓缩罐的发酵液温度达到55℃时，开动真空泵开始浓缩，真空度0.075兆帕，边浓缩边通过管道向浓缩罐中输入发酵液，直至浓缩完为止。

10.一种游离细胞发酵法生产N—氨甲酰谷氨酸的代谢产物的应用方法，其特征在于，将根据权利要求1-9任一权利要求制得的发酵添加剂成品，该发酵添加剂成品按0.1%的用量添加到猪的全价饲料或预混料中搅拌均匀，让其自由采食；或按0.15%的用量添加到肉鸡和蛋鸡的全价料或预混料中，搅拌均匀，让其自由采食。