CN103564198A - 饲用固体甘露聚糖酶及其在含棕榈粕饲料中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物发酵和酶工程技术及应用领域，尤其涉及一种由改良后的毕赤酵母菌发酵生产的饲用固体甘露聚糖酶及其在降解含棕榈粕饲料中的应用。饲用固体甘露聚糖酶的制备方法，该方法包括下述的步骤：活化菌种、扩大培养、二次扩大培养、发酵、过滤、超滤浓缩、喷雾干燥。该饲用固体甘露聚糖酶具有耐高温和耐酸的优点，适合作为饲料酶添加剂，特别是作为饲料添加剂添加到含棕榈粕的禽畜饲料中，使用的添加量很少，功效明显，成本较低。不仅降低了棕榈粕中高含量的甘露聚糖对禽畜的负面影响，提高了棕榈粕的消化率，而且可以改善禽畜肠胃功能，促进禽畜的良好生长。

Description

饲用固体甘露聚糖酶及其在含棕榈粕饲料中的应用

技术领域

本发明设计微生物发酵和酶工程技术及应用领域，尤其涉及一种由改良后的毕赤酵母菌发酵生产的饲用固体甘露聚糖酶及其在降解含棕榈粕饲料中的应用。

背景技术                          

甘露聚糖酶属于半纤维素酶类，是一种新型酶制剂。它一方面具有一般非淀粉多糖（NSP）酶类的作用——降解NSP，降低肠道粘度，促进营养物质的消化和吸收；另一方面，近年来很多研究表明甘露聚糖酶还是一种多功能的促生长剂，它不仅可以促进类胰岛素生长因子IGF-Ⅰ的分泌，促进蛋白质的合成，提高瘦肉率。而且还可以消除饲料中棕榈粕、豆粕等所富含的β-甘露聚糖酶对葡萄糖吸收的干扰，极大地提高了饼粕的能量消化率。实际使用过程中还可以看出，添加了甘露聚糖酶后的动物抵抗力及整齐度都有提高。实践证明，甘露聚糖酶已经超脱了传统酶制剂的作用，成为一种新型的促生长饲料添加剂。

棕榈仁粕是油棕树上的棕果(Elaeis Guineensis)中机械榨取棕榈油后的副产品。它是高质量的家畜饲料，是适合大多数家畜的安全饲料，更可以替换谷物饲料。家畜能够很快适应这种饲料产品，可被自由采食而不用担心有任何危害家畜健康的风险。棕榈粕含有较高的能值蛋白质、矿物质、维生素B、维生素E、锰、钾、硅等，氨基酸也很平衡，具有安全性高、可替代玉米或麸皮、成本较低、适用于多种禽畜饲料、提高能量饲料利用率等优势，因此越来越多的饲料企业会利用棕榈粕替代部分玉米或麸皮、豆粕等，使禽畜生长更迅速、更健康的同时，达到减低饲料成本的目的。

棕榈粕的应用存在一定限制，主要体现在：①适口性，有一定苦涩味，致使饲料中应该比例受到限制。②高甘露聚糖，棕榈粕中甘露聚糖含量30-35%，甘露聚糖有较强的抗营养作用，能引起肠道免疫系统应激反应和能量利用障碍，若在饲料中使用量过高，会造成稀便、采食量下降等问题。

甘露聚糖酶可以分解含棕榈粕饲料中的甘露聚糖为甘露寡糖，甘露寡糖作为一种生物化学益生素，可以改善肠道微生物组成，形成以双歧杆菌和乳酸菌为优势的肠道菌群。据报道，甘露寡糖可以作为营养物质被双歧杆菌和乳酸杆菌选择性发酵利用，并促进其生长繁殖。但大肠杆菌、沙门氏菌等致病菌却因无法利用甘露寡糖而导致饥饿死亡。除此之外，甘露寡糖可与病原菌细胞壁上的受体结合，从而阻止细菌与动物肠粘膜上的糖基集合，保护肠粘膜结构与功能的完整，又由于甘露寡糖为非消化性物质，这种复合物就顺利通过胃肠道被排出体外，因而起到吸附肠道病原菌的作用，对动物具有保健功效。甘露寡糖不仅能连接到细菌上，而且能连接到毒素、病毒、真核生物上，结合后甘露寡糖可以作为这些外源性抗原的助剂，缓解抗原的吸收，增强机体的细胞免疫和体液免疫。甘露寡糖不仅直接参与免疫调节而部分替代抗生素，在其与抗生素共用中，还能起到降低机体组织抗生素残留的作用。

在饲料加工过程中和动物采食后，酶制剂一般要经受高温高湿制粒工序的破坏、胃酸和胃蛋白酶的损害，最终能够到达动物体内作用位点还依然存留活性的那部分酶活称为有效酶活。这要求相应酶种具有良好耐热耐酸性能、抗胃蛋白酶、胰蛋白酶特性等。良好的饲料酶有较宽的温度及中性酸性pH作用范围，保证既能在动物体温的温度下表现有较高的酶活，又能对饲料高温高湿制粒过程表现出较高的耐受性；既能耐受胃酸的损害，在胃的酸性环境及小肠的中性环境下也能具有较高的酶活表现。

本发明拟采用基因工程技术构建β-甘露聚糖酶的毕赤酵母基因工程菌，高效表达获得适于饲用的耐高温耐酸型甘露聚糖酶，并应用于含棕榈粕的饲料中，用于降解棕榈粕中高含量的甘露聚糖成为甘露寡糖。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种饲用固体甘露聚糖酶，还提供了上述的饲用固体甘露聚糖酶。

饲用固体甘露聚糖酶的制备方法，该方法包括下述的步骤：

活化菌种：对含有Mann基因的毕赤酵母基因工程菌活化，活化条件为25-35℃下，22-26小时；

扩大培养：将活化好的菌种接入摇瓶中，28-32℃下以180-220r/min的转速振荡，扩大培养22-26小时；

二次扩大培养：扩大培养后接入种子罐，于25-35℃下以180-220r/min的转速振荡二次扩大培养22-26小时；

发酵：二次扩大培养后接入发酵罐，25-35℃条件下进行发酵，170-190小时后发酵结束；

过滤：将发酵结束的料液打入板框压滤机进行过滤；

超滤浓缩：膜分子量10000Da，浓缩至所需要的酶活；

喷雾干燥：浓缩液：玉米淀粉：羧甲基纤维素钠=1：0.1-0.3：0.01-0.06，搅拌均匀；进风温度：170℃，出风温度：75℃，物料终水分：＜8%。

活化菌种步骤中，活化条件为30℃下培养24小时。

扩大培养步骤中，将活化好的菌种接入摇瓶中，30℃下于 200r/min的速度振荡，扩大培养24小时。

二次扩大培养步骤中，于30℃下以200r/min的转速振荡二次扩大培养，培养的时间为24小时。

发酵步骤中，24小时后接入发酵罐，30℃条件下进行发酵，180小时后发酵结束。

上述饲用固体耐高温酸性甘露聚糖酶，具有耐高温耐酸的优点，其含甘露聚糖酶10000U/ml。

由上述方法制作饲用固体耐高温酸性甘露聚糖酶也在本发明的保护范围之内。

本发明中的饲用固体甘露聚糖酶在含棕榈粕饲料中的应用，也是要保护的范围。

饲用固体甘露聚糖酶在含棕榈粕饲料中的应用其具体步骤为：

棕榈粕饲料包括下述的组分：固体甘露聚糖酶、棕榈粕、日粮；

将固体甘露聚糖酶、棕榈粕和日粮相充分混合，所述的各组分的重量份数分别为：

棕榈粕饲料包括下述的组分：固体甘露聚糖酶、棕榈粕、日粮；

将固体甘露聚糖酶、棕榈粕和日粮相充分混合，各组分的重量份数分别为：

固体甘露聚糖酶：0.1-2；

棕榈粕：1-10；

日粮为：玉米、豆粕、棉籽粕、菜籽粕、玉米蛋白粉、植物油；上述组分的重量份数分别为：

玉米 ：20-100                  豆粕：10-30                  

菜籽粕：1-10                   玉米蛋白粉:1-10

植物油1-6；                    棉籽粕：1-10

甘露聚糖酶的酶活单位不低于2000 U/g。

优选的，本发明中，饲料包括下述重量份数的组分：

固体甘露聚糖酶：0.1-2；

棕榈粕：1-20；

所述的日粮为：玉米、豆粕、次粉、棉籽粕、菜籽粕、DDGS、植物油；上述组分的重量份数分别为：

玉米 ：20-100                  豆粕：1-15

次粉：1-15                     棉籽粕：1-10

菜籽粕：1-10                   DDGS:1-10

植物油0.5-4；

甘露聚糖酶的酶活单位不低于2000 U/g。

作为本发明的一种改进，本发明的饲料中，还包括复合酶，复合酶的重量份数为0.1-2份，复合酶为：木聚糖酶、纤维素酶、α-半乳糖苷酶，所述的甘露聚糖酶、木聚糖酶、纤维素酶、α-半乳糖苷酶=2：1：1：1（w/w），且所述的甘露聚糖酶的酶活单位不低于2000 U/g、木聚糖酶的酶活单位不低于10000U/g、纤维素酶的酶活单位不低于1000U/g、α-半乳糖苷酶的酶活单位不低于200U/g。

本发明的有益效果在于，该饲用固体甘露聚糖酶具有耐高温和耐酸的优点，适合作为饲料酶添加剂，特别是作为饲料添加剂添加到含棕榈粕的禽畜饲料中，使用的添加量很少，功效明显，成本较低。本发明的的酶应用于饲料中，不仅降低了棕榈粕中高含量的甘露聚糖对禽畜的负面影响，提高了棕榈粕的消化率，而且可以改善禽畜肠胃功能，促进禽畜的良好生长。 

附图说明

图1为实施例4中甘露聚糖酶产品对高棕榈粕日粮的樱桃谷肉鸭生产性能的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。

实施例1

活化菌种：对含有Mann基因的毕赤酵母基因工程菌进行活化，活化条件为30℃，24小时；

扩大培养：将活化好的菌种接入摇瓶中，30℃ 200r/min条件下进行扩大培养；

进一步扩大培养：24小时后接入种子罐，30℃条件下进一步扩大培养；

发酵：24小时后接入发酵罐，30℃条件下进行发酵，180小时后发酵结束；

过滤：将发酵结束的料液打入板框压滤机进行过滤；

超滤浓缩：膜分子量10000Da，浓缩至所需要的酶活；

喷雾干燥：浓缩液：玉米淀粉：羧甲基纤维素钠=1：0.2：0.03,搅拌均匀，进风温度：170℃，出风温度：75℃，物料终水分：<8%。

实施例2

活化菌种：对含有Mann基因的毕赤酵母基因工程菌进行活化，活化条件为28℃，25小时；

扩大培养：将活化好的菌种接入摇瓶中，30℃ 180r/min条件下进行扩大培养；

进一步扩大培养：26小时后接入种子罐，32℃条件下进一步扩大培养；

发酵：22小时后接入发酵罐，30℃条件下进行发酵，190小时后发酵结束；

过滤：将发酵结束的料液打入板框压滤机进行过滤；

超滤浓缩：膜分子量10000Da，浓缩至所需要的酶活；

喷雾干燥：浓缩液：玉米淀粉：羧甲基纤维素钠=1：0.2：0.03,搅拌均匀，进风温度：170℃，出风温度：75℃，物料终水分：<8%。

实施例3

活化菌种：对含有Mann基因的毕赤酵母基因工程菌进行活化，活化条件为30℃，24小时；

扩大培养：将活化好的菌种接入摇瓶中，32℃ 220r/min条件下进行扩大培养；

进一步扩大培养：26小时后接入种子罐，32℃条件下进一步扩大培养；

发酵：26小时后接入发酵罐，32℃条件下进行发酵，180小时后发酵结束；

过滤：将发酵结束的料液打入板框压滤机进行过滤；

超滤浓缩：膜分子量10000Da，浓缩至所需要的酶活；

喷雾干燥：浓缩液：玉米淀粉：羧甲基纤维素钠=1：0.3：0.05,搅拌均匀，进风温度：170℃，出风温度：75℃，物料终水分：<8%。

实施例4

选取3周龄体重相近的健康樱桃谷肉鸭900羽，分成对照组、试验组Ⅰ、试验组Ⅱ，每组3个重复，每个重复100羽。

试鸭采用地面圈养，人工持续光照制度。鸭舍自然通风，相对湿度保持55-65%，自由饮水，自由采食，按常规免疫。

试验期内观察鸭的生长和健康状况，试验结束时，禁食8h，称重，计算日增重、采食量、料肉比及死淘率。

  日粮组成及营养水平

                                                 

对照组仅饲喂日粮：

日粮为：玉米59份、豆粕23份、棕榈粕5份、棉籽粕4份、菜籽粕2份、玉米蛋白粉3份、植物油1.8份；

试验组Ⅰ饲喂日粮+复合酶：

日粮为：玉米59份、豆粕23份、棕榈粕5份、棉籽粕4份、菜籽粕2份、玉米蛋白粉3份、植物油1.8份；复合酶1份，复合酶为木聚糖酶、纤维素酶、α-半乳糖苷酶这三种酶，木聚糖酶、纤维素酶、α-半乳糖苷酶=1：1：1（w/w）；木聚糖酶的酶活单位不低于10000U/g、纤维素酶的酶活单位不低于1000U/g、α-半乳糖苷酶的酶活单位不低于200U/g；

试验组Ⅱ饲喂日粮+复合酶+甘露聚糖酶：

日粮为：玉米59份、豆粕23份、棕榈粕5份、棉籽粕4份、菜籽粕2份、玉米蛋白粉3份、植物油1.8份、固体甘露聚糖酶0.4份、复合酶0.6份，复合酶为木聚糖酶、纤维素酶、α-半乳糖苷酶，甘露聚糖酶、木聚糖酶、纤维素酶、α-半乳糖苷酶=2：1：1：1（w/w）；甘露聚糖酶的酶活单位不低于2000 U/g、木聚糖酶的酶活单位不低于10000U/g、纤维素酶的酶活单位不低于1000U/g、α-半乳糖苷酶的酶活单位不低于200U/g。

 以上的三组试验其结果如附图1所示：

从附图1中可以看出，仅饲喂日粮组肉鸭其成活率要低于试验组Ⅰ和试验组Ⅱ，而日粮组+复合酶组的成活率又要低于试验组Ⅱ，以上的数据说明甘露聚糖酶的加入，提高了肉鸭的免疫力，增强了其抗病能力，从而提高了成活率；

试验组Ⅱ中的料肉比是最低的，说明甘露聚糖酶的加入，具有显著的作用，降低肉鸭的料肉比；

试验组Ⅱ中的肉鸭增重相对于对照组和试验组Ⅰ。

试验结果表明，添加甘露聚糖酶产品可提高肉鸭平均日增重，降低料肉比，提高存活率。

实施例5

选取3周龄体重相近的健康樱桃谷肉鸭900羽，分成对照组、试验组Ⅰ、试验组Ⅱ，每组3个重复，每个重复100羽。

试鸭采用地面圈养，人工持续光照制度。鸭舍自然通风，相对湿度保持55-65%。自由饮水，自由采食，按常规免疫。

试验期内观察鸭的生长和健康状况，试验结束时，禁食8h，称重，计算日增重、采食量、料肉比及死淘率。

  日粮组成及营养水平

 

对照组仅饲喂日粮，日粮的重量份数见以上表格；

试验组Ⅰ饲喂日粮+复合酶：

日粮为：日粮的饲喂量见如上表；复合酶1份，复合酶为木聚糖酶、纤维素酶、α-半乳糖苷酶，木聚糖酶、纤维素酶、α-半乳糖苷酶=1：1：1（w/w）；木聚糖酶的酶活单位不低于10000U/g、纤维素酶的酶活单位不低于1000U/g、α-半乳糖苷酶的酶活单位不低于200U/g；

试验组Ⅱ饲喂日粮+复合酶+甘露聚糖酶：

日粮为：日粮的饲喂量见以上表格；固体甘露聚糖酶0.4份；复合酶0.6份，复合酶为木聚糖酶、纤维素酶、α-半乳糖苷酶，甘露聚糖酶、木聚糖酶、纤维素酶、α-半乳糖苷酶=2：1：1：1（w/w）；甘露聚糖酶的酶活单位不低于2000 U/g、木聚糖酶的酶活单位不低于10000U/g、纤维素酶的酶活单位不低于1000U/g、α-半乳糖苷酶的酶活单位不低于200U/g。

 从上述的对比中可以看出，将复合酶和甘露聚糖酶结合，饲料的效果要优于单一的日粮、棕榈粕和复合酶或者是日粮、棕榈粕和甘露聚糖酶的组合。

对比例1

与实施例5中的试验组Ⅱ相比，甘露聚糖酶4份，复合酶6份，复合酶由木聚糖酶、纤维素酶组成，木聚糖酶、纤维素酶之比为1：1（2000U/g:10000U/g:1000U/g），试验期21天，其余条件与实施例5中试验组Ⅱ相同。

对比例2

与实施例5中的试验组Ⅱ相比，甘露聚糖酶4份，复合酶6份，复合酶由木聚糖酶、α-半乳糖苷酶组成，木聚糖酶、α-半乳糖苷酶之比为1：1（2000U/g:10000U/g:1000U/g），试验期21天，其余条件与实施例5中试验组Ⅱ相同。

对比例3

与实施例5中的试验组Ⅱ相比，甘露聚糖酶4份，复合酶6份，复合酶由木聚糖酶、纤维素酶组成，木聚糖酶、纤维素酶之比为1：1（2000U/g:10000U/g:1000U/g），试验期21天，其余条件与实施例5中试验组Ⅱ相同。

3周龄的肉鸭平均重量为925g；

 

将上述的酶制剂配方应用于肉鸡饲养中，选择3周龄肉鸡，使每组的平均体重相接近；3周龄的肉鸡，其平均体重为508g。

 从以上的对比中可以看出，只有本发明中各原料和酶及酶量的组合，才能使肉鸭的料肉比、成活率、腹脂率达到最佳值。缺少其中一种复合酶，都会对结果产生影响。

Claims (9)

1.饲用固体甘露聚糖酶的制备方法，该方法包括下述的步骤：

活化菌种：对含有Mann基因的毕赤酵母基因工程菌活化，活化条件为25-35℃下，22-26小时；

扩大培养：将活化好的菌种接入摇瓶中，28-32℃下以180-220r/min的转速振荡，扩大培养22-26小时；

二次扩大培养：扩大培养后接入种子罐，于25-35℃下以180-220r/min的转速振荡二次扩大培养22-26小时；

发酵：二次扩大培养后接入发酵罐，25-35℃条件下进行发酵，170-190小时后发酵结束；

过滤：将发酵结束的料液打入板框压滤机进行过滤；

超滤浓缩：膜分子量10000Da，浓缩至所需要的酶活；

喷雾干燥：浓缩液：玉米淀粉：羧甲基纤维素钠=1：0.1-0.3：0.01-0.06，搅拌均匀；进风温度：170℃，出风温度：75℃，物料终水分：＜8%。

2.如权利要求1所述的饲用固体甘露聚糖酶的制备方法，其特征在于，所述的活化菌种步骤中，活化条件为30℃下培养24小时。

3.如权利要求1所述的饲用固体甘露聚糖酶的制备方法，其特征在于，所述的扩大培养步骤中，将活化好的菌种接入摇瓶中，30℃下于 200r/min的速度振荡，扩大培养24小时。

4.如权利要求1所述的饲用固体甘露聚糖酶的制备方法，其特征在于，所述的二次扩大培养步骤中，于30℃下以200r/min的转速振荡二次扩大培养，培养的时间为24小时。

5.如权利要求1所述的饲用固体甘露聚糖酶的制备方法，其特征在于，所述的发酵步骤中，24小时后接入发酵罐，30℃条件下进行发酵，180小时后发酵结束。

6.如权利要求1所述的饲用固体甘露聚糖酶在含棕榈粕的饲料中的应用。

7.如权利要求6所述的饲用固体甘露聚糖酶在含棕榈粕饲料中的应用，其具体为：

所述的棕榈粕饲料包括下述的组分：固体甘露聚糖酶、棕榈粕、日粮；

将固体甘露聚糖酶、棕榈粕和日粮相充分混合，所述的各组分的重量份数分别为：

固体甘露聚糖酶：0.1-2；

棕榈粕：1-10；

所述的日粮为：玉米、豆粕、棉籽粕、菜籽粕、玉米蛋白粉、植物油；上述组分的重量份数分别为：

玉米 ：20-100                  豆粕：10-30                  

菜籽粕：1-10                   玉米蛋白粉:1-10

植物油1-6；                    棉籽粕：1-10

所述的甘露聚糖酶的酶活单位不低于2000 U/g。

8.如权利要求6所述的饲用固体甘露聚糖酶在含棕榈粕饲料中的应用，其具体为：

固体甘露聚糖酶：0.1-2；

棕榈粕：1-20；

所述的日粮为：玉米、豆粕、次粉、棉籽粕、菜籽粕、DDGS、植物油；上述组分的重量份数分别为：

玉米 ：20-100                  豆粕：1-15

次粉：1-15                     棉籽粕：1-10

菜籽粕：1-10                   DDGS:1-10

植物油0.5-4；

所述的甘露聚糖酶的酶活单位不低于2000 U/g。

9.含有如权利要求7所述的饲用固体甘露聚糖酶在含棕榈粕饲料中的应用，其特征在于，所述的饲料中，还包括复合酶，所述的复合酶的重量份数为0.1-2份，复合酶为：木聚糖酶、纤维素酶、α-半乳糖苷酶，所述的甘露聚糖酶、木聚糖酶、纤维素酶、α-半乳糖苷酶α-半乳糖苷酶=2：1：1：1（w/w），且所述的甘露聚糖酶的酶活单位不低于2000 U/g、木聚糖酶的酶活单位不低于10000U/g、纤维素酶的酶活单位不低于1000U/g、α-半乳糖苷酶的酶活单位不低于200U/g。

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