CN100379349C - 抗消化道致病微生物免疫牛奶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗消化道致病微生物免疫牛奶的制备方法。该方法包括免疫抗原的提取和免疫疫苗的制作和奶牛免疫疫苗接种。本发明选取常见的四种消化道疾病的致病微生物抗原制备免疫疫苗，针对性选择致病微生物免疫疫苗一种，或二种，或两种以上混合制备成灭活免疫疫苗，对健壮母牛产后一个月采用注射和黏膜结合免疫。

Description

抗消化道致病微生物免疫牛奶的制备方法
技术领域
本发明涉及一种免疫生物制品的制作工艺，具体地说是一种抗消化道致病微生物免疫牛奶的制备方法。
技术背景
免疫牛奶经过了人类长时间的研究，已取得了阶段性的成果。通过对致病微生物疫苗的制取，再对奶牛进行免疫而获得免疫牛奶，可以有效地减小致病微生物对消化道侵袭的力度，提高肌体对抗消化道疾病的免疫能力。目前的技术现状从致病微生物抗原的提取到免疫疫苗的处理标准，亦有了规范化的程序和鉴定方法。目前免疫牛奶的制备技术上，存在单一疫苗和单一免疫方法的局限性。就致消化道疾病的微生物而言，主要有以下几种：①空肠弯曲菌(CampylobaCler-jeiuni.CJ)②输状病毒(Rute virus Rv)③幽门螺杆菌(Helicobacter-pylori.Hp)④变形链球菌(Mutans-spreptococer.Ms)。它们是肠炎、婴幼儿急性腹泻、多种胃炎、胃及十二指肠溃疡、口腔龋齿、以及胆囊炎、尿路感染、格林巴氏综合症的致病原因之一。但目前采取免疫法制备的牛奶，仅限于单一种疫苗，而且免疫方法为简单注射，生成抗体也单一，对抑制消化道致病微生物效果不显著，成本高，免疫牛奶产量少，而有待于进一步的改进。
发明内容
本发明的目的是针对消化道病的致病微生物提供一种制备富含相应微生物IgG和IgA抗体牛奶的方法。
本发明的关键在于采取消化道病的致病微生物抗原，再按国家制备生物疫苗的标准制备对应标准的疫苗，然后选取其中一种、二种或二种以上疫苗混合制配成针对性消化道混合疫苗，选取健壮母牛在产后一个月进行免疫处理。具体处理方法为选择健壮母牛四肢腿窝部淋巴注射和鼻孔点滴结合的免疫方法接种疫苗，每15天一次，共进行3-5次。经免疫处理后的奶牛40-60天后牛奶中即可检出富含针对性致病微生物的IgG和IgA抗体，将其采集灭菌，消毒包装后即可做为免疫生物制品出售。
下面结合给出的实施例进一步说明本发明的目的是如何实现的。
具体实施方式
(一)首先制备单项疫苗：
1空肠弯曲菌(CJ)疫苗的制备：
(1)在该病菌感染的病人粪便中取出菌种，在布氏肉汤或Campy-BAP培养基中培养、增菌。
(2)将以上菌种置入微氧环境下，O2 5％，CO2 10％，N2 85％培养24小时，温度42℃。
(3)按国家标准菌血清做比对核定后制成109×3CFu/ml，冰冻保存备用。
2轮状病毒(rv)疫苗的制备：
(1)由兰州生物制品研究所购买RV标准毒株。
(2)将毒株置入非洲绿猴肾细胞培养液中增生繁殖。
(3)将增强毒株引入该细胞培养液内，在37℃、CO2环境下吸附处理0.5-1小时，弃去吸附液。
(4)将非洲绿猴肾细胞(BGMK)置入盛有RPM1640液体培养基内培养3-4天，弃去培养液用汉克氏(HANKS)液洗1-2次制成细胞培养基。
(5)将处理后的毒株引入细胞培养基在37℃、CO2气体中培养5-6天，至细胞变圆或部分破坏呈++～+++时视为疫苗培养成功，直接冷冻备用。
3幽门螺杆菌(HP)疫苗的制备：
(1)从国家疾病防治中心微生物研究所购此菌苗(NCTC11637)，
(2)取Campy-BAP培养基，按1克加水20-30毫克配兑后在10磅压力、100℃压菌30分钟，再按无菌操作加入1-3毫升脱纤维羊血，摇匀制成专用培养基。
(3)将培养皿加入专用培养基置入厌氧箱，通入O25％、CO2 10％和N2 85％混合气体，置入抗原菌苗培养2-3天。
(4)经鉴定合格制配成109×3CFu/ml疫苗冷冻备用。
4变形链球菌(MS)疫苗的制备：
(1)从龋齿病者的病患处采集病菌抗原
(2)采用绵羊血做培养基，控制PH7.0、环境气氛CO2 5％、N2 95％，平板培养法接种后形成0.5-1mm白色菌落。
(3)将菌落用生理盐水洗2-3次制成3×109 CFu/ml的合格疫苗，冷冻备用。
(二)乳化疫苗的制取
针对性选择一种二种或二种以上的疫苗，按体积比对等原则配伍后加入等量的付氏佐剂，充分混合后用超声波破碎，或冻融10次制成乳化悬浮状疫苗，即可提供免疫操作。如四种疫苗等量配伍即为全消化道免疫牛奶，如仅取其中一种或两种疫苗混配则为有针对性免疫牛奶，亦可根据不同的选配方产成具有不同免疫功能的免疫牛奶。
(三)免疫方法的选择
注射免疫主要使牛奶中产生对应微生物的IgG抗体，而粘膜免疫处理后会产生分泌性IgA抗体。后者对消化道内的致病微生物作用直接，高效价、特异性显著，所以本发明所采用的方法是注射和滴鼻相结合的免疫操作方法。将针对性制备的灭活乳化疫苗，向所选择产后一个月的强壮母牛后腿鼠蹊部和前肢腋窝处淋巴共四处注射各0.5mm的乳化疫苗，同时在牛两鼻孔中滴入疫苗各0.5mm，每15天进行一次免疫处理连续处理3-5次，在45-60天后即可完成免疫处理，获取富含致病微生物IgG和IgA抗体的牛奶。
将免疫牛的牛奶采集、灭菌、包装即可做为成品销售。本发明为保持免疫牛奶的活性采用消毒方法是60℃保持8小时。
必要时将该奶牛间隔四个月后重复免疫一次可获得全产奶期免疫牛奶产出。
本方法所产生的牛奶有整个产奶期均会产生有同样高效价，特异性好的IgG、IgA抗体的牛奶，必要时可以重复免疫处理，这就大大降低了免疫牛奶的成本。
本发明中的选的四种微生物均属消化道常见疾病的致病菌，它们之间有共同的抗原能产生共同的抗体，能在免疫功能上起到互补作用，且在免疫方法采用注射免疫与粘膜免疫的结合，吏免疫牛奶中的抗体中的IgA成份加大，可直接在消化道中与致病微生物接触而产生免疫功效，因而效果显著。
本发明中的四种微生物免疫牛奶中的抗体均和相应微生物抗原做过凝集试验，结果均在++以上(强阳性)且经过免疫扩散法，免疫确联法，中和检测法分别验证，说明本牛奶制品中含有活性抗体蛋白质(免疫球蛋白)，能抑制和杀灭相应微生物，同时具备国际食品绿色、营养、安全、保健与食用方便的基本要素，是对现有免疫生物制品工艺的一次改进。

Claims (8)

1.一种抗消化道致病微生物免疫牛奶的制备方法，该方法包括免疫抗原的提取和免疫疫苗的制作、奶牛及其免疫操作期选择、免疫疫苗接种和免疫抗体的培育、含抗体牛奶的收集、消毒灭菌处理各道工序，其特征在于：
(1)选取致消化道疾病的致病微生物抗原，参照国家相关标准制备免疫疫苗，
(2)针对性选择致病微生物免疫疫苗一种，或二种，或两种以上混合制备成免疫疫苗的悬浮液，并进行灭活处理，
(3)选取健壮母牛，在产后一个月开始免疫操作，
(4)选择母牛四肢腿窝部淋巴注射和鼻孔点滴结合的免疫方法接种疫苗，每15天一次，共进行3-5次。
以上所说的消化道致病微生物是空肠弯曲菌(Campylobacterjeiuni，CJ)、或轮状病毒(Rotavirus，RV)、或幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，HP)或变形链球菌(Mutans-spreptococer，MS)。
2.根据权利要求1所说的抗消化道致病微生物免疫牛奶的制作方法，其特征在于采取空肠弯曲菌(CJ)的抗原时制备疫苗按以下步骤进行：
(1)在该病菌感染的病人粪便中取出菌种，在布氏肉汤或Campy-BAP培养基中培养、增菌，
(2)将以上菌种置入微氧环境下，即O2 5％，CO2 10％，N2 85％培养24小时，温度42℃，
(3)按国家标准菌血清做比对核定后制成109×3CFu/ml，冰冻保存备用。
3.根据权利要求1所说的抗消化道致病微生物免疫牛奶的制作方法，其特征在于采用轮状病毒(RV)抗原时的疫苗制备按以下步骤进行：
(1)由兰州生物制品研究所购买RV毒株，
(2)将毒株置入非洲绿猴肾细胞培养液中增生繁殖，
(3)将增强毒株引入该细胞培养液内，在37℃、CO2环境下吸附处理0.5-1小时，弃去吸附液，
(4)将非洲绿猴肾细胞(BGMK)置入盛有RPM1640液体培养基内培养3-4天，弃去培养液用汉克氏(HANKS)液洗1-2次制成细胞培养基，
(5)将处理后的毒株引入细胞培养基在37℃、CO2气氛中培养5-6天，至细胞变圆或部分破坏为++～+++时视为疫苗培养成功，冷冻备用.
4.根据权利要求1所说的抗消化道致病微生物免疫牛奶的制备方法，其特征在于采用幽门螺杆菌(HP)抗原制备疫苗时按以下步骤进行：
(1)从国家疾病防治中心微生物研究所购此菌苗NCTC11637，
(2)取Campy-BAP培养基，按1克加水20-30毫克配兑后在10磅压力、100℃压菌30分钟，再按无菌操作加入1-3毫升脱纤维羊血，摇匀制成专用培养基，
(3)将培养皿加入专用培养基置入厌氧缸，通入O2 5％、CO2 10％和N2 85％混合气体，置入抗原菌苗培养2-3天，
(4)经鉴定合格制配成109×3CFu/ml疫苗冷冻备用。
5.根据权利要求1所说的抗消化道致病微生物免疫牛奶的制备方法，其特征在于采用变形链球菌(MS)抗原制备疫苗时按以下步骤进行：
(1)采集病菌抗原，
(2)在绵羊血琼脂平板培养基上培养，控制PH值7.0、环境气氛CO2 5％、N2 95％，平板培养法引种后形成0.5-1mm白色菌落，
(3)将菌落用生理盐水洗2-3次制成3×109CFu/ml的合格疫苗，冷冻备用。
6.根据权利要求1所说的抗消化道致病微生物免疫牛奶的制备方法，其特征在于制备免疫疫苗的悬浮液时采取权利要求2-5中所说的一种、二种或二种以上的冷冻疫苗，按体积等比例配伍，加入等体积的付氏佐剂后经过超声波粉碎，或反复冻融10次，获取灭菌全菌抗原乳化悬浮疫苗。
7.根据权利要求1所说的抗消化道致病微生物免疫牛奶的制备方法，其特征在于所说免疫注射部为奶牛前肢掖窝处和后腿鼠蹊处淋巴结，每个部位注射0.5毫升，鼻孔滴入为双鼻孔同时滴入，每次滴入总量为乳化疫苗1.0毫升，四次为一个免疫疗程，经过三～四个月后进行第二次免疫处理。
8.根据权利要求1所说的抗消化道致病微生物免疫牛奶的制备方法，其特征在于所说的含抗体牛奶消毒方法是60℃保持8小时。
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