CN100586475C - 戊型肝炎口服疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种用于预防戊型肝炎的戊型肝炎口服疫苗，其特征在于含有2-6×10⁹CFU活菌和辅料，该活菌是将编码戊型肝炎病毒中和抗原表位的基因片段与质粒pYA3341进行重组，再将该重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门菌(attenuatedSalmonella enterica serotype Typhimurium)。制备所述戊型肝炎口服疫苗的方法，其特征在于将编码戊型肝炎病毒中和抗原表位的优选基因片段与质粒pYA3341进行重组，再将该重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门菌(attenuated Salmonella entericaserotype Typhimurium)。本发明提供一种安全、高效、低成本、方便易行的戊型肝炎口服疫苗及其制备方法。

Description

戊型肝炎口服疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，是一种预防戊型肝炎的口服疫苗及其制备方法。

背景技术

戊型肝炎病毒(HEV)是单链、线性、正股的RNA病毒，引起以黄疸为主的急性肝炎，简称戊肝。主要经肠道传播，占经肠道传播的非甲、非乙型肝炎的大部分。中国是戊肝高发区之一，曾发生11次该病的爆发或流行。1986年至1988年新疆曾发生迄今为止最大的戊肝暴发性流行，共计119280人发病，死亡707例，感染孕妇平均病死率13.46％，晚期妊娠病死率高达20.96％，流行原因主要是污染的水和食物。据卫生部发布的传染病疫情公示，我国戊肝发病数呈现连续快速增长的态势，已经被列为因戊肝发病和死亡而引起的经济负担最为严重的国家之一，构成了严重的公共问题。由于人群对戊肝普遍易感，研究和开发预防性疫苗具有重要的理论意义和现实意义，世界卫生组织已经将戊型肝炎疫苗推荐为21世纪最优先发展的疫苗之一。

对戊肝的预防，疫苗的应用是根本手段。HEV由于细胞培养非常困难，因此近年来研究较多的是重组蛋白疫苗。现有的HEV重组蛋白疫苗的研究大多经注射途径免疫，通常不能诱导机体产生肠胃道局部粘膜免疫反应，而局部粘膜免疫反应在阻断类似戊型肝炎等的胃肠道传染病的发病中具有重要作用。口服脊髓灰质炎疫苗在计划免疫中已使用多年就是一个例子，与注射接种的灭活脊髓灰质炎疫苗相比，口服脊髓灰质炎疫苗的优势不仅在于能够在病毒侵入和增殖的局部肠粘膜诱导产生分泌型IgA抗体，有效阻止病毒的传播，而且价廉、服用方便，提高了疫苗覆盖率，为全球根除脊髓灰质炎提供了强有力的手段。

现有的戊型肝炎口服疫苗大都是以重组蛋白直接口服免疫，一方面蛋白在消化道易被降解免疫效果持续时间短，需要反复接种，有时还需要添加佐剂，而

且有时还会引起免疫耐受；另一方面采用口服途径免疫时需要的重组蛋白疫苗剂量大，而基因工程重组蛋白的制备和纯化过程复杂、操作繁琐，大剂量蛋白的使用将使疫苗的成本大大提高，导致疫苗价格升高，影响疫苗的普及。

活载体疫苗是将编码病原微生物特异性抗原的DNA片段插入减毒的活细菌或病毒载体基因组的某些部位，使之高效表达，从而诱生强有力的抗体和细胞介导的免疫应答，使机体获得对插入基因相关疾病的抵抗力。减毒沙门菌是最早用作活疫苗载体的病原菌之一，在承载异源抗原方面具有很确定的作用。该菌具有泛嗜性，有广泛的宿主谱，能在细胞内生存与繁殖并表达所载目的抗原，还可以提供Toll样受体的配体以及“危险信号”诱导抗原提呈细胞的激活与成熟，通过粘膜免疫后可以诱导产生广泛而持续的局部免疫和全身免疫。然而，迄今为止，以减毒沙门菌做载体制备戊型肝炎口服疫苗在国内外尚未有报道。

发明内容

本发明提供一种安全、高效、低成本、方便易行的戊型肝炎口服疫苗及其制备方法。

本发明所述的一种用于预防戊型肝炎的戊型肝炎口服疫苗，含有2-6×109CFU活菌和辅料，该活菌是将编码戊型肝炎病毒中和抗原表位的基因片段与质粒pYA3341进行重组，再将该重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门菌(attenuatedSalmonella enterica serotype Typhimurium)。所表达的戊型肝炎病毒重组蛋白的氨基末端位于其开放阅读框架2编码衣壳蛋白的380位至480位氨基酸之间，其羧基末端位于580位至650位氨基酸之间或由此蛋白片段产生的衍生物，优选片段是戊型肝炎病毒第4基因型毒株开放读码框架2中编码中和抗原表位的位于第453位至631位氨基酸序列的基因片段。

本发明所述戊型肝炎口服疫苗的制备方法方法：将编码戊型肝炎病毒中和抗原表位的优选基因片段与质粒pYA3341进行重组，再将该重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门菌(attenuated Salmonella enterica serotype Typhimurium)，上述优选基因片段的核苷酸序列为：GTTATCCAGGACTATGATAATCAACATGAGCAAGACCGCCCTACCCCCTCCCCTGCTCCTTCTCGCCCTTTTTCTGTGCTTCGTGCTAATGATGTGCTTTGGCTCTCTCTCACCGCCGCCGAGTATGATCAGACTACCTACGGCTCTTCTACTAACCCTATGTATGTTTCTGATACTGTAACGTTTGTCAATGTGGCCACTGGCGCCCAGGGGGTTTCGCGCTCTCTGGACTGGTCTAAGGTTACCCTTGATGGGCGTCCACTAACTACTATCCAGCAGTATTCCAAGACTTTCTATGTTCTGCCTCTTCGTGGTAAGCTTTCTTTTTGGGAGGCTGGTACTACTAAAGCCGGCTACCCATACAATTATAATACTACTGCTAGTGATCAGATCCTGATTGAGAATGCAGCTGGCCATCGGGTTTGTATTTCTACTTATACTACTAATTTGGGCTCCGGGCCTGTTTCTATCTCTGCTGTCGGTGTCCTCGCACCCCATTCTGCATTGGCCGTTTTGGAGGACACTGTTGATTACCCT。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1)本发明的重组疫苗是以口服途径接种。比起注射途径来，一方面口服粘膜免疫廉价、方便，毋需专门医护人员，适用于大群体免疫，且可避免因注射接种而感染血源传播疾病；另一方面，HEV是经过粪口传播，通常情况下，注射免疫很少能在粘膜位点诱导特异性免疫反应，而粘膜免疫具有泛化性，一处粘膜免疫可在多处粘膜产生免疫作用，形成抗感染的首道防线，能够阻止病原微生物从多处粘膜的入侵，并刺激机体产生持续的免疫保护反应。

2)与现有的研制中的戊型肝炎口服疫苗相比，本发明具有诸多优点。直接口服重组蛋白，一方面蛋白在消化道易被降解免疫效果持续时间短，需要反复接种，有时还需要添加佐剂，而且有时还会引起免疫耐受；另一方面采用口服途径免疫时需要的重组蛋白疫苗剂量大，而基因工程重组蛋白的制备和纯化过程复杂、操作繁琐，大剂量蛋白的使用将使疫苗的成本大大提高，导致疫苗价格升高，影响疫苗的普及。本发明的疫苗容易大量获得，不需要佐剂，也不需要纯化等繁琐的操作，因而降低了成本，易推广。

附图说明：

图1为PCR扩增产物、重组质粒pYA3341及酶切鉴定图：1.DNA分子量标准；

2.PCR阴性对照；3.PCR产物；4.质粒pYA3341；5.pYA3341/Nco I-Pst I双酶切；6.pYA3341-179/Nco I-Pst I双酶切。

图2为克隆测序报告(上游测序，引物3)图。

图3为克隆测序报告(下游测序，引物4)图。

图4为菌体蛋白SDS-PAGE电泳图：1.蛋白分子量标准；2.χ4550(pYA3341-179)(克隆1)；3.χ4550(pYA3341-179)(克隆2)；4.χ4550(pYA3341)。

图5为p179蛋白与4种不同基因型抗HEV单克隆抗体的Western-blot分析结果图：

1.阴性对照；2.3G₁(第I基因型)；3.E₅E₁₂(第II基因型)；4.4D₃(第III基因型)；5.1G₁₀(第IV基因型)。

图6为p179蛋白与HE病人血清标本的Western-blot分析结果图：1.阴性对照；

2.戊型肝炎病人血清标本。

图7为血清抗HEV-IgG P/N比值图。

图8为粪便抗HEV-sIgAP/N比值图。

图9为不同剂量重组菌免疫小鼠血清抗HEV-IgG的P/N比值图。

图10为不同剂量重组菌免疫小鼠粪便抗HEV-sIgA的P/N比值图。

具体实施方式

本发明选用编码HEV第4基因型毒株ORF2中的编码HEV中和抗原表位的基因片段，位于453至631位共179个氨基酸，简称p179。通过分子克隆的方法，将其插入质粒pYA3341中，构建重组质粒pYA3341-179，再将该重组质粒化学转化入E.coliχ6212，然后再抽取重组E.coliχ6212(pYA3341-179)中的重组质粒，电转化进减毒鼠伤寒沙门菌(attenuated Salmonella enterica serotypeTyphimurium)疫苗株χ4550，获得重组菌株χ4550(pYA3341-179)。应用Western-blot对重组菌所表达的重组蛋白进行免疫分析，其结果显示该重组菌可表达目的蛋白，并且目的蛋白可以与病人血清和不同基因型HEV单克隆抗体发生免疫反应；该重组菌株在体外营养选择压力下可较稳定地携带重组质粒传代繁殖。动物实验表明，该重组疫苗对小鼠没有毒性，能够诱导机体持续产生针对HEV的特异性粘膜免疫和体液免疫，抗体的体外中和试验为阳性。表明减毒鼠伤寒沙门菌重组菌株χ4550(pYA3341-179)可作为预防HEV感染的候选疫苗。口服免疫一定范围内不同剂量的该疫苗菌株，均能诱导小鼠产生体液免疫和粘膜免疫，免疫反应的强弱和接种剂量的高低相关，口服免疫小鼠的优选剂量是10⁹CFU。

实施例1

本实施描述了重组菌χ4550(pYA3341-179)的构建方法：

(a)目的基因的获得：以HEV第4基因型中国株序列为模板，用引物1

(5’-CCCCCCATGGTTATCCAGGACTATGATAATC-3’)和引物2(5’-CCCCTCGAGTCAAGGGTAATCAACAGTGTCCTCCA-3’)扩增ORF2编码多肽453-631(p179)的基因片段。PCR条件为：94℃-45秒，52℃-45秒，72℃-50秒，35个循环。PCR产物经琼脂糖凝胶回收纯化，克隆入质粒pET28(a)+中。以pET28(a)+为模板，用引物3(5’-GACCATGGCTACCCCCTCCCCTGTC-3’，含Nco I酶切位点)和引物4(5’-GCCTGCAGCTAAGGATAATCAACAGTGTC-3’，含Pst I酶切位点以及终止密码子)扩增目的片段。PCR条件为94℃-45秒，52℃-60秒，72℃-60秒，35个循环。

上述第453位至631位氨基酸序列(p179)，其所述的氨基酸序列如下：VIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQTTYGSSTNPMYVSDTVTFVNVATGAQGVSRSLDWSKVTLDGRPLTTIQQYSKTFYVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVCISTYTTNLGSGPVSISAVGVLAPHSALAVLEDTVDYP。

上述第453位至631位氨基酸序列(p179)，其所述的核苷酸序列如下：GTTATCCAGGACTATGATAATCAACATGAGCAAGACCGCCCTACCCCCTCCCCTGCTCCTTCTCGCCCTTTTTCTGTGCTTCGTGCTAATGATGTGCTTTGGCTCTCTCTCACCGCCGCCGAGTATGATCAGACTACCTACGGCTCTTCTACTAACCCTATGTATGTTTCTGATACTGTAACGTTTGTCAATGTGGCCACTGGCGCCCAGGGGGTTTCGCGCTCTCTGGACTGGTCTAAGGTTACCCTTGATGGGCGTCCACTAACTACTATCCAGCAGTATTCCAAGACTTTCTATGTTCTGCCTCTTCGTGGTAAGCTTTCTTTTTGGGAGGCTGGTACTACTAAAGCCGGCTACCCATACAATTATAATACTACTGCTAGTGATCAGATCCTGATTGAGAATGCAGCTGGCCATCGGGTTTGTATTTCTACTTATACTACTAATTTGGGCTCCGGGCCTGTTTCTATCTCTGCTGTCGGTGTCCTCGCACCCCATTCTGCATTGGCCGTTTTGGAGGACACTGTTGATTACCCT。

(b)减毒鼠伤寒沙门菌χ4550的构建方法：本发明优选的减毒鼠伤寒沙门菌χ4550的减毒方式是腺苷酸环化酶基因(cya)和环化Amp受体蛋白基因(crp)缺失突变，同时缺失了编码天门冬氨酸基因形成营养缺陷菌(asd-)，与含有野生型asd基因的质粒pYA3341组成了平衡致死系统。这些都可以用已知技术来制备。这项技术在U.S.Pat.No.5468485、U.S.Pat.No.5672345和U.S.Pat.No.6872547中已被公开。

(b-1)具有Δcrp-1和Δcya-1缺失突变的减毒鼠伤寒沙门杆菌的构建：采用类似于Curtiss、Kelly(1987)和Nakayama、Kelly、Curtiss(1988)所述经典遗传方法，将野生型鼠伤寒SR-11株从遗传上加以改性，构建Δcrp-1，Δcya-1减毒疫苗株。其构建方法如下：将Tn10(编码四环素抗性)放在Δcrp-1或Δcya-1突变附近，通过P22HTint中介转导将连接特性转导入高毒性鼠伤寒沙门菌SR-11菌株并选择四环素抗性和筛选麦芽糖负表型。将连接Δcrp-1的zhc-1431::Tn10和连接Δcya-1的zid-62::Tn10用于该目的，没有一种插入独自影响鼠伤寒沙门菌的毒性。在含Δcrp-1和zhc-1431::Tn10突变的鼠伤寒沙门菌菌株首先制得一高滴度噬菌体P22HTint溶菌产物。并在含Δcya-1的zid-62::Tn10突变的鼠伤寒沙门菌菌株中制成另一种溶菌产物以促进具有连接转座子的基因缺失的转导。然后用得到的P22HTint溶菌产物将遗传特性转导入野生型受体菌株SR-11。

在Δcrp-1和zhc-1431::Tn10突变的鼠伤寒沙门菌中繁殖的P22HTint被使用于转导毒性菌株为筛选出具有Mal^-的四环素抗性。将噬菌体感染混合物在37℃保温20分钟，然后将100微升样品涂布在MacConkey培养基上，该培养基还有1％麦芽糖(最终浓度)，添加12.5微克/毫升四环素。在37℃保温约26小时后，收集四环素抗性Mal^-转导体，在同样的培养基中纯化。再在LB液体培养基中加12.5微克/毫升四环素培养获得的这些细菌，用含明胶的缓冲盐水(BSG)以1∶10稀释培养物，取100微升涂布在含镰孢菌酸(FA)的培养基的平板上，将该板在37℃下保温约36小时。收集FA抗性的菌落至0.5毫升BSG中，在FA培养基中进行纯化。将已纯化的FA抗性的菌落置LB液体培养基中，在37℃下培养至出现混浊，检测Tn 10的损失，完全LPS的存在和营养缺陷。这些新的菌株具有基因型Δcrp-1Δzhc-1431::Tn10。

由于cya^-和crp^-突变体的表型是相同的，携带经克隆的crp⁺基因并具有氨苄青霉素抗性的质粒pSD110被暂时用于补充染色体中的Δcrp突变，当通过转导引入时，能鉴定Δcya突变。用含有pSD110质粒的鼠伤寒沙门菌中培养的P22HTint转导上述制备好的菌株(Δcrp-1Δzhc-1431::Tn10)在LB液体培养基生长的培养物。在含有1％麦芽糖和100微克/毫升氨苄青霉素的MacConkey琼脂中进行选择。26小时后，收集氨苄青霉素抗性，Mal⁺菌落，在含有1％麦芽糖和100微克/毫升氨苄青霉素的MacConkey琼脂中进行纯化。获得pSD110⁺的菌株(Δcrp-1Δzhc-1431::Tn10)。在含有100微克/毫升氨苄青霉素的LB液体培养基中培养该菌株，用在含有Δcya-1和zid-62::Tn10突变的菌株中繁殖的P22HTint转导菌株以引入连接的Δcya-1和zid-62::Tn10突变。将该转导混合物涂布在含1％麦芽糖、100微克/毫升氨苄青霉素和12.5微克/毫升四环素的MacConkey琼脂平板上，收集氨苄青霉素抗性、四环素抗性、Mal^-的菌落，在含1％麦芽糖、100微克/毫升氨苄青霉素和12.5微克/毫升四环素的MacConkey琼脂中纯化。将已纯化的菌落置LB液体培养基中，培养至出现混浊，检测完全LPS的存在和营养缺陷。得到的菌株具有基因型Δcrp-1Δzhc-1431::Tn10pSD110⁺Δcya-1Δzid-62::Tn10。在LB液体培养基中加12.5微克/毫升四环素和100微克/毫升氨苄青霉素培养获得的这些细菌，用BSG以1∶10稀释培养物，取100微升涂布在含镰孢菌酸的培养基的平板上，将该板在37℃下保温约36小时。收集FA抗性的菌落在FA培养基中进行纯化。将已纯化的FA抗性的菌落置LB液体培养基中，培养至出现混浊，检测Tn10的损失，完全LPS的存在和营养缺陷。在该工序中pSD110质粒通常从该菌株中自然消失以导致氨苄青霉素敏感性。最后得到的菌株具有Δcya-1和Δcrp-1突变的基因型。

(b-2)具有ΔasdA1突变的鼠伤寒沙门菌菌株的构建：在无毒沙门菌属菌株中的重组质粒上稳定的维持和高水平的表达克隆基因，取决于使用的平衡-致死寄主-载体系统，为此编码天冬氨酸β-半醛脱氢酶的asd基因的染色体突变，被引入Δcya-1和Δcrp-1突变体中，以此强加上需二氨基庚二酸(DAP)这一必要条件，该酸是细菌细胞壁坚硬层的主要成分，而且它不能在动物体内合成。染色体Δasd突变由具有野生型Δasd⁺基因的质粒克隆载体pYA3341加以补充，质粒的丧生会导致细菌在无DAP的条件下死亡及溶解。

构建方法包括：移动ΔasdA1突变至Δcya-1Δcrp-1突变菌株，该步骤的完成通过放置转座子Tn10靠近ΔasdA1突变，再通过P22HTint转导作用，将连接特性转导入Δcya-1Δcrp-1突变鼠伤寒沙门菌株，同时挑选四环素抗性和筛选二氨基庚二酸阴性表型。连接ΔasdA1的zhf-4::Tn10用于该目的。带连接转座子的基因缺失，按下述方法进行：首先在含ΔasdA1和zhf-4::Tn10突变的鼠伤寒沙门菌上制成高滴度的噬菌体P22HTint溶胞产物，所得到的P22HTint溶胞产物再用于感染和转导遗传特性至受体Δcya-1Δcrp-1突变鼠伤寒沙门菌株，其感染复制率为10。噬菌体细菌感染混合物于37℃下保温20分钟，然后取100微升样品涂布于含50微克/毫升DAP的Penassay琼脂上，并补充以12.5微克/毫升四环素，于37℃下保温约26小时后，检出转导体并于相同培养基上纯化。将得到的衍生物在含有12.5微克/毫升四环素和50微克/毫升DAP的LB液体培养基中培养，该培养基用BSG以1∶10比例稀释。取100微升样品涂布于含FA和50微克/毫升DAP的培养基上，再将平板于37℃下保温约36小时。FA抗性菌落取出放入0.5毫升BSG中，并于含FA和50微克/毫升DAP的培养基上纯化。纯化过的FA抗性菌落放入含50微克/毫升DAP的LB液体培养基中，于37℃下培养至溶液发生混浊，再检验Tn10缺失，完全LPS和Vi抗原的存在以及在标准培养基上半胱氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸和DAP的营养缺陷，得到的新菌株即为减毒鼠伤寒沙门菌χ4550，其基因型为ΔasdA1Δ[zhf-4::Tn10]Δcya-1Δcrp-1。

(c)重组质粒的构建：本实施例中，琼脂糖凝胶回收纯化均是使用上海申能博彩生物科技有限公司的“3S Spin DNA Agarose Gel Purification Kit”产品，按照说明书操作即可。PCR产物经琼脂糖凝胶回收纯化，用PstI和NcoI双酶切后再经琼脂糖凝胶回收纯化。同时质粒pYA3341用PstI和NcoI双酶切后进行琼脂糖凝胶回收纯化。然后，将酶切纯化过的PCR片段和质粒pYA3341按摩尔比3∶1混匀，在T4DNA连接酶作用下进行连接，最后转化E.coliχ6212筛选阳性克隆。E.coliχ6212是asd基因突变的营养缺陷型，具有奈啶酮酸(NA)抗性，只有转化进携带asd基因的pYA3341才能在不含二氨基庚二酸(DAP)的培养基中生长，据此达到筛选目的。

转化过程如下：将连接反应液5μl和50μl E.coliχ6212新鲜感受态细菌混匀，冰浴30min；42℃水浴100s，立即冰浴2min；加600μlLB，37℃1h后，取100μl涂布于含50μg/ml NA的LB固体培养基，37℃培养过夜。筛选过程如下：首先挑取平皿上若干个单克隆，首先用引物3和引物4进行PCR筛选，PCR条件为94℃预变性3min，然后94℃变性1.5min，52℃退火2min，72℃延伸3min，30个循环，最后72℃延伸7min。然后，筛出的PCR阳性的克隆，抽取质粒，并用PstI和NcoI双酶切鉴定(见图1)。最后，双酶切鉴定阳性的克隆进行测序(见图2及3)。测序完全正确的克隆即为含有重组质粒pYA3341-179的E.coliχ6212，抽提质粒即可获得重组质粒pYA3341-179。

(d)重组菌χ4550(pYA3341-179)的构建：减毒鼠伤寒沙门杆菌χ4550是asd基因突变的营养缺陷型，都有奈啶酮酸(NA)抗性，只有转化进携带asd的pYA3341才能在不含二氨基庚二酸(DAP)的培养基中生长。将用LB培养基(含NA，50ug/ml)培养的E.coliχ6212(pYA3341-179)阳性重组子，用引物3和引物4进行PCR扩增，PCR产物测序正确后以常规碱变性法提取经E.coli χ6212修饰过的重组质粒，再电转化进χ4550。电转化条件为：电容25μF/电压2.5kV/电阻200Ω。将用LB培养的χ4550(pYA3341-179)阳性重组子，进行酶切鉴定，并用Western-blot鉴定p179蛋白的表达。鉴定阳性的菌落即为所要构建的戊肝疫苗候选菌株。

(e)重组菌χ4550(pYA3341-179)蛋白表达分析(如图4-图6所示)：应用重组候选疫苗菌χ4550(pYA3341-179)和含空质粒菌χ4550(pYA3341)提取全菌体蛋白后进行SDS-PAGE电泳，转膜并进行Western-blot分析，结果显示重组菌在20KD左右有一条新生的蛋白条带，位置与p179预期分子量大小一致，而对照空载体菌在相对应的位置无该条蛋白带；结果还显示重组菌所表达的重组p179蛋白能与I、II、III、IV型HEV单抗发生免疫印迹反应，呈单一清晰条带；同时候选疫苗菌表达的p179也可与戊型肝炎病人血清发生反应，膜上出现多条条带，但在相同的位置有一较强显色条带；而含空质粒菌χ4550免疫印迹分析无阳性免疫条带出现。总之，候选疫苗菌所表达蛋白p179与各型抗HEV的单抗和病人血清标本均有较好的免疫反应性。

实施例2

本实施描述了候选疫苗菌χ4550(pYA3341-179)的体外稳定性实验：

挑取上述构建好的候选疫苗菌χ4550(pYA3341-179)单菌落分别接种于含DAP(无选择压力)和不含DAP(有选择压力)的LB液体培养基(含NA，50ug/ml)中；次日，分别用不含DAP和含有DAP的LB培养基稀释1000倍，再培养，重复10次。经上述反复传代后分别取少量菌液涂布于含DAP的LB平板培养过夜，24h后各挑取100个单菌落分别点种于不含DAP的LB平板，观察其中菌落数量，同时在每个不含DAP的LB平皿中随机各挑取20个菌落提取质粒。

结果在有选择压力传代的重组菌生长于含DAP平皿上的100个菌落在不含DAP的平皿上生长菌落数为95个，从中随机挑取的20个菌落提取质粒，显示90％含有重组质粒。在无选择压力传代的重组菌长于含DAP平皿上挑取的100个菌落在不含DAP的平皿上生长菌落数为70个，仅占70％，从中随机挑取20个菌落提取质粒，显示仅有8个含有重组质粒，仅占40％。体外稳定性实验显示候选疫苗菌在有选择压力的情况下重组质粒能够保持较高的稳定性。

实施例3

本实施描述了候选疫苗菌χ4550(pYA3341-179)毒性实验：

挑取LB平板上单个菌落于LB液体培养基(含NA，50ug/ml)中培养至对数生长期，加入灭菌的5M NaCl溶液，使菌液中NaCl终浓度为300mM，于37℃静置保温4-5h以增加沙门菌的侵袭力，同时按照平板计数法进行细菌的计数。将重组菌以4000rpm转速，4℃离心20分钟收集菌体，然后PBS洗两次，用PBS调节菌液浓度分别为4×10¹¹/100μl和4×10⁹CFU/100μl。取6周龄BALB/C小鼠18只，随机分为3组，每组6只。灌胃前过夜禁食禁水，接种前半小时用10％碳酸氢钠溶液100μl灌胃中和胃酸。取两组小鼠口服上述两种剂量的重组菌，另外一组口服PBS，观察小鼠服菌后的反应及成活率。

接种30天后，对照组和口服疫苗组小鼠全部存活。与PBS对照组相比，口服疫苗组活动情况及体重改变均无明显差异，表明上述候选疫苗株具有良好的安全性。

实施例4

本实施描述了候选疫苗菌χ4550(pYA3341-179)的免疫原性研究：

(a)实验动物分组和免疫方案：选用6-8周龄的雌性BALB/C小鼠(扬州大学比较医学实验中心提供)16只，随机分为两组：①口服候选疫苗菌χ4550(pYA3341-p179)组，4×10¹¹CFU/100μl，每小鼠口服100μl菌液；②口服χ4550(pYA3341)组，4×10¹¹CFU/100μl，每小鼠口服100μl菌液；小鼠口服免疫前，需要过夜禁食禁水，在口服菌液前半小时先用10％碳酸氢钠100μl灌胃中和胃酸。两组都于0周、4周、8周按上述剂量各口服免疫一次。

(b)标本采集：小鼠眼眶后静脉丛采集新鲜血液，隔周采集一次，分离收集血清，置-20℃备用，用于检测血清抗HEV-IgG；小鼠新鲜粪便，每周采集一次，用0.01mol/LPBS溶液配成10％的混悬液，用震荡器使其充分混匀，离心取上清，置-20℃备用，用于检测粪便抗HEV-sIgA。

(c)检测方法：

(c-1)用间接ELISA法分别检测血清抗HEV-IgG和粪便抗HEV-sIgA。

根据HEV缅甸(Bur)株、墨西哥(Mex)株、美国(Us)株、中国(Chi)株、摩洛哥(Mor)株、巴基斯坦(Pak)株、新西兰猪(Nz-s)病毒株结构区基因序列，采用RT-PCR技术扩增编码HEV ORF2452～617位氨基酸的基因片段，将此片段连接于PGEX-4T-2质粒表达GST-p166融合蛋白，经GST-Sepharose 4B(Pharmacia产品)亲和层析纯化得到7种重组抗原(分别简称为：p166Bur、p166Mex、p166Us、p166Chi、p166Mor、p166Pak、p166Nz-s)，将7种重组抗原等量混合(简称p166Mix)后作为包被抗原。

具体步骤如下：①用0.01mol/LPBS稀释后包被微孔板，100μl/孔，浓度为10μg/孔，4℃过夜。②1×PBST洗板3次，扣干。③用5％脱脂牛奶将血清标本作1∶20稀释，粪便标本作1∶5稀释，100μl/孔，37℃孵育40分钟。④1×PBST洗板5次，扣干。⑤用20％甘油将HRP标记的羊抗鼠IgG作1∶10000稀释，HRP标记的羊抗鼠IgA作1∶1000稀释，100μl/孔，37℃孵育40分钟。⑥1×PBST洗板5次，扣干。⑦用底物A液和B液显色10分钟后，以2mol/L H₂SO4终止显色后，用酶标仪测定各孔A₄₅₀值。

(c-2)用间接ELISA法分别检测血清抗LPS-IgG和粪便抗LPS-sIgA

抗原包被选用LPS，浓度为10μg/孔。将LPS抗原用0.1M碳酸盐缓冲液(PH9.6)稀释同时加入浓度为10mg/ml的牛血清白蛋白，包被微孔板，100μl/孔，放置4℃冰箱过夜。具体操作步骤同前。

(d)检测结果：

(d-1)血清抗HEV-IgG(见图7)：口服χ4550(pYA3341)组小鼠血清始终未检测到抗HEV-IgG，疫苗免疫组小鼠血清中抗HEV-IgG于2周开始呈阳性(P/N＞2.1)，之后逐渐上升，第10周达到高峰。表明小鼠口服候选疫苗菌χ4550(pYA3341-179)后可产生特异性抗HEV-IgG，刺激小鼠产生体液免疫。

(d-2)粪便抗HEV-sIgA(见图8)：口服χ4550(pYA3341)组小鼠粪便中始终未检测到抗HEV-sIgA。疫苗免疫组小鼠粪便抗HEV-sIgA于首次免疫接种后一直保持较低水平，首次加强免疫后，抗HEV-sIgA水平即开始缓慢上升，第9周达到高峰。粪便检测的结果显示候选疫苗菌χ4550(pYA3341-179)可以刺激小鼠产生特异性抗HEV-sIgA，诱导小鼠的粘膜免疫应答。

(d-3)血清抗LPS-IgG：口服疫苗组小鼠于接种后2周，其抗LPS-IgG水平即开始升高，于第4周抗体的A₄₅₀值达到最高峰，其后的首次加强免疫和二次加强免疫，抗LPS-IgG水平均未见明显升高，仍维持在较高水平；抗LPS-IgG的A₄₅₀值于第12周开始下降。

(d-4)粪便抗LPS-sIgA：口服疫苗组小鼠免疫后粪便抗LPS-IgA抗体水平于初次加强免疫后2周才逐渐升高，抗LPS-sIgA水平一直维持较低水平。

实施例5

本实施描述了戊肝抗体体外中和实验。

采用基于PCR的体外中和实验方法，将1∶40稀释的抗血清100ul与含100

TCID₅₀/100ul戊肝病毒悬液混合，37℃作用1小时后接种PLC/PRF/5细胞，37℃培养2小时后，Hank’s液洗涤细胞3次，使用Trizol法提取核酸，采用引物3(5’-CCGACA GAA TTG ATT TCG TCG GC-3’)、引物4(5’-GTT GTC TCG GCC AAT GGCGAG CC-3’)、引物5(5’-TCG GCG GCG GTG AGA GAG AGC CA-3’)、引物6(5’-CCG TAA GTG GAC TGG TCGTAC TC-3’)进行逆转录-巢式PCR检测戊型肝炎病毒核酸，巢式PCR条件为：第一轮：94℃-45秒，50℃-45秒，72℃-50秒，35个循环，引物为引物3和引物6；第二轮：94℃-45秒，52℃-45秒，72℃-50秒，30个循环，引物为引物4和引物5；PCR阴性判为中和试验阳性，最后将能中和病毒的抗血清判为阳性血清。

结果显示空菌免疫小鼠血清均为阴性，口服疫苗组小鼠血清均为阳性。可见口服免疫χ4550(pYA3341-179)，小鼠体内可以诱导产生中和抗体。

实施例6

本实施例描述了不同剂量χ4550(pYA3341-179)口服免疫小鼠后免疫效果的比较。

(a)实验动物分组和免疫方案：选用6-8周龄的雌性BALB/C小鼠(扬州大学比较医学实验中心提供)32只，随机分为五组：①口服PBS组，每小鼠口服100μl②口服χ4550(pYA3341-p179)组，4×10³CFU/100μl，每小鼠口服100μl菌液；③口服χ4550(pYA3341-p179)组，4×10⁷CFU/100μl，每小鼠口服100μl菌液；④口服χ4550(pYA3341-p179)组，4×10⁹CFU/100μl，每小鼠口服100μl菌液；⑤口服χ4550(pYA3341-p179)组，4×10¹¹CFU/100μl，每小鼠口服100μl菌液。小鼠口服免疫前，需要过夜禁食禁水，在口服菌液前半小时先用10％碳酸氢钠100μl灌胃中和胃酸。各组都于0周、4周、8周按上述剂量分别口服免疫一次。

(b)标本采集：小鼠眼眶后静脉丛采集新鲜血液，隔周采集一次，分离收集血清，置-20℃备用，检测血清抗HEV-IgG；小鼠新鲜粪便，用0.01mol/LPBS溶液配成10％的混悬液，用震荡器使其充分混匀，离心取上清，置-20℃备用，检测粪便抗HEV-sIgA。

(c)观察指标以及检测方法：

(c-1)接种后，每天观察以下指标至少连续7天：是否死亡、体重增减、毛顺与否、活动状况、是否厌食、精神状态、是否腹泻等小鼠的一般状况。

(c-2)用间接ELISA法分别检测血清抗HEV-IgG和粪便抗HEV-sIgA。

根据HEV缅甸(Bur)株、墨西哥(Mex)株、美国(Us)株、中国(Chi)株、摩洛哥(Mor)株、巴基斯坦(Pak)株、新西兰猪(Nz-s)病毒株结构区基因序列，采用RT-PCR技术扩增编码HEV ORF2452～617位氨基酸的基因片段，将此片段连接于PGEX-4T-2质粒表达GST-p166融合蛋白，经GST-Sepharose 4B(Pharmacia产品)亲和层析纯化得到7种重组抗原(分别简称为：p166Bur、p166Mex、p166Us、p166Chi、p166Mor、p166Pak、p166Nz-s)，将7种重组抗原等量混合(简称p166Mix)后作为包被抗原。

具体步骤如下：①用0.01mol/L PBS稀释后包被微孔板，100μl/孔，浓度为10μg/孔，4℃过夜。②1×PBST洗板3次，扣干。③用5％脱脂牛奶将血清标本作1∶20稀释，粪便标本作1∶5稀释，100μl/孔，37℃孵育40分钟。④1×PBST洗板5次，扣干。⑤用20％甘油将HRP标记的羊抗鼠IgG作1∶10000稀释，HRP标记的羊抗鼠IgA作1∶1000稀释，100μl/孔，37℃孵育40分钟。⑥1×PBST洗板5次，扣干。⑦用底物A液和B液显色10分钟后，以2mol/L H₂SO4终止显色后，用酶标仪测定各孔A₄₅₀值。以P/N比值(待检样品OD₄₅₀值/阴性样品OD₄₅₀)≥2.1判为阳性。

(d)检测结果：

(d-1)小鼠灌胃后，出现短暂呼吸加快，行动迟缓，活动减少。经过大约半小时后，上述状况好转，2-3小时后完全好转，但对照组和疫苗免疫组在免疫初2-3天均有竖毛现象。疫苗组以及PBS对照组在免疫期间未出现腹泻，无小鼠死亡。免疫后小鼠体重有所降低，与免疫剂量没有相关性，且与免疫前相比差异没有统计学意义(P＞0.05)，在三次免疫完成后体重又开始上升。表明灌胃对小鼠有一定的的伤害，小鼠对减毒鼠伤寒沙门杆菌耐受良好。

(d-2)血清抗HEV-IgG(见图9)

口服PBS对照组小鼠血清始终未检测到抗HEV-IgG，而各疫苗免疫组小鼠抗HEV-IgG水平呈稳定上升趋势。如图9所示，自第6周后，口服4×10¹¹CFU和4×10⁹CFU两组小鼠一直保持高滴度抗HEV-IgG，两者抗体水平差异没有统计学意义(P＞0.05)。口服4×10³CFU组小鼠的抗体水平也呈上升趋势，但均低于同期高剂量组，与口服4×10¹¹CFU和4×10⁹CFU两组相比，差别均具有统计学意义(P＜0.05)。首次免疫后66周各疫苗免疫组小鼠的血清抗HEV-IgG均呈阳性，而以剂量高者P/N比值高。

(d-3)粪便抗HEV-sIgA(见图10)

口服PBS组小鼠粪便未检测到抗HEV-sIgA，各疫苗免疫组小鼠粪便抗HEV-sIgA呈缓慢上升趋势。其中口服4×10¹¹CFU的抗HEV-sIgA于第4周开始呈阳性，而后快速上升，之后维持在较高水平，于第23周左右开始出现下降趋势，至66周抗体呈阴性。其它免疫组也有类似的规律，但是各组抗体水平随着接种剂量的高低而有所增减，其中口服4×10¹¹CFU与4×10³CFU组之间的抗体水平差异具有统计学意义(P＜0.05)。

(d-4)综合各方面因素，优选剂量为口服4×10⁹CFU。

实施例7

本实施例描述的是口服疫苗χ4550(pYA3341-179)的冻干方法。

(a)样品准备：挑取χ4550(pYA3341-179)单克隆于LB液体培养基中，37℃同时以250rpm振荡培养，直至对数生长期。4℃，5000rpm离心20分钟收集菌体沉淀。

(b)添加冻干保护剂冻干：将冻干保护剂和沉淀充分混匀，所加保护剂的量为发酵液的1/4-1/2，优选1/3。预冷后，经冷冻真空干燥制成产品，4℃保存。

所用冻干保护剂是由蔗糖3-20克，维生素C 0.5-2克，氨基酸混合物1-3克，水1000克组成。其中维生素C和氨基酸混合物采用过滤除菌，蔗糖高压灭菌。

冻干粉做成后，用生理盐水重悬疫苗冻干粉，并按1∶10²，1∶10¹，1∶10⁶，1∶10⁸，1∶10¹⁰系列稀释后在平板上进行活菌计数，得到每克冻干粉含有的活菌数。

(c)灌制胶囊：选用肠溶胶囊壳，每颗胶囊的成分为：含有2-6×10⁹CFU活菌的冻干粉、乳糖100-180mg、硬脂酸镁3.6-4.4mg，利用全自动胶囊灌装封口机灌制成胶囊。

(d)动物实验：

(d-1)选用6-8周龄的雌性BALB/C小鼠(扬州大学比较医学实验中心提供)12只，随机分为PBS对照组和疫苗组，每组6只。口服前过夜禁食禁水，接种前30分钟用10％碳酸氢钠溶液100μl灌胃中和胃酸。PBS对照组于0周、4周、8周分别口服100μL无菌PBS。将含有2-6×10⁹CFU活菌的冻干粉(每颗胶囊的含量)用100μL无菌生理盐水重悬，疫苗组小鼠分别于0周、4周、8周口服上述剂量。

(d-2)标本采集：小鼠眼眶后静脉丛采集新鲜血液，隔周采集一次，分离收集血清，置-20℃备用，检测血清抗HEV-IgG；小鼠新鲜粪便，每周采集一次，用0.01mol/L PBS溶液配成10％的混悬液，用震荡器使其充分混匀，离心取上清，置-20℃备用，检测粪便抗HEV-sIgA。

(d-3)检测方法：

用间接ELISA法分别检测血清抗HEV-IgG和粪便抗HEV-sIgA。

根据HEV缅甸(Bur)株、墨西哥(Mex)株、美国(Us)株、中国(Chi)株、摩洛哥(Mor)株、巴基斯坦(Pak)株、新西兰猪(Nz-s)病毒株结构区基因序列，采用RT-PCR技术扩增编码HEV ORF2452～617位氨基酸的基因片段，将此片段连接于PGEX-4T-2质粒表达GST-p166融合蛋白，经GST-Sepharose 4B(Pharmacia产品)亲和层析纯化得到7种重组抗原(分别简称为：p166Bur、p166Mex、p166Us、p166Chi、p166Mor、p166Pak、p166Nz-s)，将7种重组抗原等量混合(简称p166Mix)后作为包被抗原。

具体步骤如下：①用0.01mol/L PBS稀释后包被微孔板，100μl/孔，浓度为10μg/孔，4℃过夜。②1×PBST洗板3次，扣干。③用5％脱脂牛奶将血清标本作1∶20稀释，粪便标本作1∶5稀释，100μl/孔，37℃孵育40分钟。④1×PBST洗板5次，扣干。⑤用20％甘油将HRP标记的羊抗鼠IgG作1∶10000稀释，HRP标记的羊抗鼠IgA作1∶1000稀释，100μl/孔，37℃孵育40分钟。⑥1×PBST洗板5次，扣干。⑦用底物A液和B液显色10分钟后，以2mol/L H₂SO4终止显色后，用酶标仪测定各孔A₄₅₀值。以P/N比值(待检样品OD₄₅₀值/阴性样品OD₄₅₀)≥2.1判为阳性。

(d-4)检测结果：

如表7-1和7-2所示，做成的胶囊制剂可以诱导小鼠产生高滴度血清抗HEV-IgG和粪便抗HEV-sIgA

表7-1血清抗HEV-IgG P/N比值

表7-2粪便抗HEV-sIgA P/N比值

HEV p179核苷酸序列

gttatccagg actatgataa tcaacatgag caagaccgcc ctaccccctc ccctgctcct     60

tctcgccctt tttctgtgct tcgtgctaat gatgtgcttt ggctctctct caccgccgcc    120

gagtatgatc agactaccta cggctcttct actaacccta tgtatgtttc tgatactgta    180

acgtttgtca atgtggccac tggcgcccag ggggtttcgc gctctctgga ctggtctaag    240

gttacccttg atgggcgtcc actaactact atccagcagt attccaagac tttctatgtt    300

ctgcctcttc gtggtaagct ttctttttgg gaggctggta ctactaaagc cggctaccca    360

tacaattata atactactgc tagtgatcag atcctgattg agaatgcagc tggccatcgg    420

gtttgtattt ctacttatac tactaatttg ggctccgggc ctgtttctat ctctgctgtc    480

ggtgtcctcg caccccattc tgcattggcc gttttggagg acactgttga ttaccct       537

Claims (2)

1、一种用于预防戊型肝炎的戊型肝炎口服疫苗，其特征在于含有2-6×10⁹CFU活菌和辅料，该活菌是将编码戊型肝炎病毒中和抗原表位的基因片段与质粒pYA3341进行重组，再将该重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门菌(attenuatedSalmonella enterica serotype Typhimurium)，所述抗原表位的基因片断表达的戊型肝炎病毒重组蛋白的片段是戊型肝炎病毒第4基因型毒株开放读码框架2中编码中和抗原表位的位于第453位至631位氨基酸序列的基因片段。

2、一种用于制备权利要求1所述戊型肝炎口服疫苗的方法，其特征在于将编码戊型肝炎病毒中和抗原表位的基因片段与质粒pYA3341进行重组，再将该重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门菌(attenuated Salmonella enterica serotypeTyphimurium)，所述基因片断为GTTATCCAGGACTATGATAATCAACATGAGCAAGACCGCCCTACCCCCTCCCCTGCTCCTTCTCGCCCTTTTTCTGTGCTTCGTGCTAATGATGTGCTTTGGCTCTCTCTCACCGCCGCCGAGTATGATCAGACTACCTACGGCTCTTCTACTAACCCTATGTATGTTTCTGATACTGTAACGTTTGTCAATGTGGCCACTGGCGCCCAGGGGGTTTCGCGCTCTCTGGACTGGTCTAAGGTTACCCTTGATGGGCGTCCACTAACTACTATCCAGCAGTATTCCAAGACTTTCTATGTTCTGCCTCTTCGTGGTAAGCTTTCTTTTTGGGAGGCTGGTACTACTAAAGCCGGCTACCCATACAATTATAATACTACTGCTAGTGATCAGATCCTGATTGAGAATGCAGCTGGCCATCGGGTTTGTATTTCTACTTATACTACTAATTTGGGCTCCGGGCCTGTTTCTATCTCTGCTGTCGGTGTCCTCGCACCCCATTCTGCATTGGCCGTTTTGGAGGACACTGTTGATTACCCT。

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