CN1632103A - 一种枯草芽孢杆菌,其复合制剂及该复合制剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌，其复合制剂，以及该复合制剂的制备方法。枯草芽孢杆菌名称为Bacillus subtilis LY－35，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是：CGMCC NO.1222。该制剂是枯草芽孢杆菌活菌培养物与葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、变形杆菌、假单胞菌、沙门氏菌、志贺菌、巴氏杆菌和克雷伯氏杆菌等致病菌的噬菌体的混合物。制剂可以治疗并预防条件致病菌引起的各种疾病，是替代抗生素或与抗生素混合使用的一种无药残、无污染、疗效高、安全型的微生态制剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌，和利用该菌种制备的复合制剂，以及该复合制剂的制备方法。
背景技术
近年来，随着我国养殖业的发展，集约化程度的提高，细菌性疾病已经成为制约养殖业进一步发展的障碍。特别是由葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、变形杆菌、假单胞菌、沙门氏菌、志贺菌、巴氏杆菌和克雷伯氏杆菌等环境中大量存在的条件致病菌引起的化脓发炎疾病广泛流行。由于缺乏科学的管理和滥用抗生素，不但破坏了正常菌群的微生态平衡，而且产生了大量的耐药性菌株，造成临床治疗效果有限，导致肉类产品质量降低，食用安全性下降。特别是幼龄畜，经常以病死而告终。肉制品中的残留药物和耐药菌株通过食物链可传给人类，对人类的健康造成极大的威胁。
根据我国畜禽饲养方面的资料统计：30公斤以下的仔猪，肠道疾病的平均发生率为46.5％，死亡率为10.3％。家禽大肠杆菌引起的疾病死率为55.4％，特别是4-12周龄家禽易感染各种不同的细菌性疾病，死亡率有时高达70％-80％；奶牛乳房炎发病率约占整个牛群的70％，子宫内膜炎发病率20-30％，占不育症的68.34％。
在国外，根据俄罗斯联邦畜牧局提供的年度报告统计，仔猪消化器官疾病患病率为75％，其中20％为消化不良，26-35％为胃肠炎，6-8％表现为肝功能低下，1.5％为腹膜炎和其他疾病。仔猪的细菌性胃肠道疾病的病死率为40-50％。
世界上应用抗生素的实践表明，采用交替使用抗生素和化学制剂，甚至是最新一代的抗生素也通常达不到应有的效果，相反使情况更糟。因为在养殖场里大量存在的葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、变形杆菌、假单胞菌、沙门氏菌、志贺菌、巴氏杆菌和克雷伯氏杆菌已经具有很强的抗生素耐药性。
根据专利CN1177637A，我们知道，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis BS-3对E.Coli O157具有拮抗性，以此为基础成分的制剂可治疗消化不良、急、慢性肠炎和菌群失调性腹泻。活菌量为5×108时仔猪使用三日效果很好。但它的不足之处是对Salmonella D enteriditis、Staphylococcus aureus、StreptococcusPyogenes、Proteus mirabili、Proteus Vulgaris、Pseudomonas aeruginosa、Klebsillapneumoniae没有拮抗作用，Bacillus subtilis BS-3也不具有耐抗生素性，因而该制剂是否可与抗生素同时使用有待研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是创造一种新的枯草芽孢杆菌及其微生态制剂。制剂既能够与抗生素和化学制剂共同使用，降低抗生素和化学制剂的副作用，同时对耐药性菌株引起的疾病有较好的治疗效果，而且使用本制剂也可以防止致病菌的扩散，提高畜禽的自然免疫性。
为了解决上述问题，本发明采用了以下技术方案。
一种枯草芽孢杆菌，名称为Bacillus subtilis LY-35，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是：CGMCC NO.1222。
利用上述枯草芽孢杆菌制备的第一种复合制剂，以具有典型形态、培养、生化特性的Bacillus subtilis LY-35和E.Coli，Salmonella D enteriditis、Staphylococcus aureus、Streptococcus Pyogenes、Proteus mirabili、Proteus Vulgaris、Pseudomonas aeruginosa、Klebsilla pneumoniae的噬菌体为基础成分，制备复合制剂。制剂含有：
1)、一毫升复合制剂中Bacillus subtilis LY-35的活菌数为1×109；
2)、一毫升复合制剂E.Coli、Salmonella D、enteriditi、Staphylococcus aureus、Streptococcus Pyogenes、Proteus mirabilis、Proteus Vulgaris、Pseudomonasaeruginosa、Klebsilla pneumoniae的噬菌体效价为106(十倍序列稀释法)；
3)、酶抑制稳定剂：制剂量0.5％的EDTA(乙二胺四乙酸)。
利用上述枯草芽孢杆菌制备的第二种复合制剂，以具有典型形态、培养、生化特性的Bacillus subtilis LY-35和E.Coli，Salmonella D enteriditis、Staphylococcus aureus、Streptococcus Pyogenes、Proteus mirabili、，ProteusVulgaris、Pseudomonas aeruginosa、Klebsilla pneumoniae的噬菌体为基础成分，制备复合制剂。制剂含有：
1)、一毫升复合制剂中Bacillus subtilis LY-35的活菌数为1×109。
2)、一毫升复合制剂E.Coli，Salmonella D enteriditis，Staphylococcus aureus，Streptococcus Pyogenes，Proteus mirabilis，Proteus Vulgaris，Pseudomonasaeruginosa，Klebsilla pneumoniae的噬菌体效价为106(十倍序列稀释法)。
3)、抗菌稳定剂：制剂量1％的8-羟基喹啉硫酸盐。
利用上述枯草芽孢杆菌制备的第三种复合制剂，以具有典型形态、培养、生化特性的Bacillus subtilis LY-35和E.Coli，Salmonella D enteriditis、Staphylococcus aureus、Streptococcus Pyogenes、Proteus mirabili、Proteus Vulgaris、Pseudomonas aeruginosa、Klebsilla pneumoniae的噬菌体为基础成分，制备复合制剂。制剂含有：
1)、一毫升复合制剂中Bacillus subtilis LY-35的活菌数为1×109。
2)、一毫升复合制剂E.Coli，Salmonella D enteriditis，Staphylococcus aureus，Streptococcus Pyogenes，Proteus mirabilis，Proteus Vulgaris，Pseudomonasaeruginosa，Klebsilla pneumoniae的噬菌体效价为106(十倍序列稀释法)。
3)、抗菌稳定剂和酶抑制稳定剂用量：制剂量1％的8-羟基喹啉硫酸盐及0.5％的EDTA(乙二胺四乙酸)。
利用上述枯草芽孢杆菌制备的第四种复合制剂，以具有典型形态、培养、生化特性的Bacillus subtilis LY-35和E.Coli，Salmonella D enteriditis、Staphylococcus aureus、Streptococcus Pyogenes、Proteus mirabili、Proteus Vulgaris、Pseudomonas aeruginosa、Klebsilla pneumoniae的噬菌体为基础成分，制备复合制剂。制剂含有：
1)、一毫升复合制剂中Bacillus subtilis LY-35的活菌数为1×109。
2)、一毫升复合制剂E.Coli，Salmonella D enteriditis，Staphylococcus aureus，Streptococcus Pyogenes，Proteus mirabilis，Proteus Vulgaris，Pseudomonasaeruginosa，Klebsilla pneumoniae的噬菌体效价为106(十倍序列稀释法)。
3)、无稳定剂和酶抑制剂
所述的枯草芽孢杆菌复合制剂的制备方法是：
1)Bacillus subtilis LY-35的制备：
使用含有蛋白胨、葡萄糖、无机盐和微量元素的合成培养基培养Bacillussubtilis LY-35；把Bacillus subtilis LY-35菌株接种到细胞培养瓶内的含有蛋白胨、葡萄糖、无机盐和微量元素的合成琼脂培养基上，置于37℃的恒温箱中，培养18-24小时，然后，将菌苔从琼脂表面上冲洗下来，接种到含相同培养基的种子罐中；发酵培养3-4小时，达到对数生长期，把发酵物作为种子接种到100升、250升、或500升的发酵罐中，发酵培养18-20小时，到培养物变成芽孢时止；将所得物浓缩到(100-120)×109CFU/毫升；除去培养基，用0.9％的灭菌氯化钠溶液替换之；浓缩物为生长期的活细胞和芽孢的混合物，进行性能检测后，为制备复合制剂时使用。
2)噬菌体的制备：
利用液体培养基，在处于对数生长繁殖的细菌中定期控制培养噬菌体，根据细菌的不同种类，以马氏肉汤、霍金格氏肉汤、普通肉汤或者以酵化血液水解物为基本成分作为培养细菌的培养基；每一种噬菌体单独培养，但是所有细菌的培养条件相同，把浓度达到5×107CFU/毫升的菌悬液加到培养基中，在温度为37℃溶氧度为30-70％的条件下培养1.0-1.5小时，使其浓度达到(2-5)×108CFU/毫升，然后将感染量为1/30的噬菌体添加进去，在相同条件下继续培养1-2小时，直到细菌被完全裂解；在发酵培养后，采用切向流微滤和超滤除去噬菌体制剂中的细菌代谢物和培养基的蛋白质；使用孔径为0.2um的滤膜进行微滤，使用滤限为150-200 KD的膜进行超滤；将不同噬菌体的吞噬细胞溶解物混合起来，搅拌后，进行最后的除菌微滤，所得到的复合噬菌体成分是各种条件致病菌的噬菌体的混合物；进行性能检测后，作为制备复合制剂时使用。
3)在无菌条件下，将各种成分综合在一起，制成复合制剂，灌装。
枯草芽孢杆菌对大多数致病菌和条件致病菌具有拮抗作用，能够刺激机体免疫功能，提高机体的抵抗力，并且容易培养，对环境的适应性强，易于保存。所以枯草芽孢杆菌是目前制备微生态制剂的理想菌株之一。
噬菌体是一类能够杀灭细菌的病毒，对人和动物无害，在抗生素发现以前的年代，噬菌体是治疗细菌性疾病的主要制剂之一。
本发明通过使用含有Bacillus subtilis LY-35菌株和特异高效的葡萄球菌、大肠杆菌、变形杆菌、假单胞菌、沙门氏菌、志贺菌、巴氏杆菌和克雷伯氏杆菌的噬菌体的复合制剂来实现治疗细菌性疾病的目的。
本发明的制剂与专利CN1177637A的制剂其相比具有下列优点：
1、Bacillus subtilis LY-35不仅对E.Coli具有拮抗性，而且对Salmonella Denteriditis、Staphylococcus aureus、Streptococcus Pyogenes、Proteus mirabili、Proteus Vulgaris、Pseudomonas aeruginosa、Klebsilla pneumoniae也具有很高的拮抗性。
2、Bacillus subtilis LY-35耐青霉素系列的抗生素和链霉素。
3、Bacillus subtilis LY-35能够提高条件致病菌对抗生素的敏感性。
4、复合制剂的主要成分噬菌体对于E.Coli、Salmonella D enteriditis、Staphylococcus aureus、Streptococcus Pyogenes、Proteus mirabili、Proteus Vulgaris、Pseudomonas aeruginosa、Klebsilla pneumoniae具有很高的裂解活性。
复合制剂还具有以下优点：
1、安全，无毒副作用，本制剂所用微生物皆为存在于正常环境中的有益微生物，对人畜无毒副作用。
2、通过枯草芽孢杆菌对病原菌的天然拮抗作用和噬菌体对病原菌的裂解杀灭达到消灭病原菌的目的，可替代抗生素或与抗生素混用，减少药物残留，提高肉奶等食品的安全性。
3、Bacillus subtilis LY-35耐青霉素系列和链霉素，因而可与上述抗生素共用。
4、Bacillus subtilisLY-35菌株可降低病原菌的耐药性，缩短疗程。
使用的微生物
本制剂使用的微生物有两种，一种是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，菌株编号为Bacillus subtilis LY-35，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC NO.1222；另一种微生物为针对各种病原菌的噬菌体，所有的噬菌体按通用的方法从畜禽的生活环境中分离出来，以后也在该环境下使用。
Bacillus subtilis LY-35菌株特征
1、培养、形态特征
杆菌，利用琼脂经过一昼夜培养，细胞大小为(2-3)×0.6um，单个、成对或成串排列。细胞运动，形成需氧的椭圆形端生芽孢，形成芽孢时，细胞不膨胀，格兰氏染色呈阳性，没有荚膜。菌落在肉胨琼脂中呈灰白色，有细小皱纹，波浪边缘，粘稠，轻轻嵌入琼脂。在肉汤培养基中，经过37℃，18-24小时的培养，形成微白的菌膜和底部沉淀，造成培养基浑浊。
2、生理特征
需氧，最佳生长条件：37℃，PH 7.0-7.5
3、生物化学特性
菌株发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇，形成酸，不产气，不分解乳糖。不形成吲哚，硫化氢。V-P反应为阳性，制造过氧化氢酶，蛋白酶，解胶酶，酰胺酶，不形成卵酯酶，脂肪酶，脲酶，不形成溶血素和纤维蛋白溶酶，菌株耐青霉素系列的抗生素(苄基青霉素，羧苄基青霉素，氨苄青霉素)、多粘菌素、安曲南，对林可酶素、万古酶素、四环素不敏感。
4、菌株的培养方法
普通肉胨培养基生长良好
5、拮抗性
菌株对不同血清型的E.Coli，Salmonella D enteriditis，Staphylococcusaureus，Streptococcus pyogenes，Proteus mirabilis，Proteus Vulgaris，Pseudomonasaeruginosa，Klebsiella Pneumoniae具有拮抗性。
菌株Bacillus Subtilis LY-35的耐抗生素性和拮抗性
表一：菌株Bacillus subtilis LY-35的耐抗生素性
| 试验次数 | 耐抗生素性(圆盘检验法)抑制生长范围mm | |||
| 多粘菌素 | 利福霉素 | 青霉素 | 链霉素 | |
| 10 | 10 | 0 | 0 | 10±2 |
该数据表明：新的菌株是有很高的耐抗生素性
表二：菌株Bacillus subtilis LY-35的拮抗性
| 试验次数 | 检测菌 | 抑制生长范围mm |
| 10 | E.Coli | 25±2 |
| 10 | Salmonella D enteriditis | 20±2 |
| 10 | Staphylococcus aureus | 28±2 |
| 10 | Streptococcus Pyogenes | 20±2 |
| 10 | Proteus mirabilis | 20±2 |
| 10 | Proteus Vulgaris | 20±2 |
| 10 | Pseudomonas aeruginosa | 10±1 |
| 10 | Klebsiella Pneumoniae | 17±2 |
该数据表明菌株Bacillus subtilis LY-35对条件致病菌具有很高的拮抗性
表三：在Bacillus subtilis LY-35的拮抗作用下抗菌制剂对某些条件致病菌的最低抑制浓度发生的变化(毫克/毫升)
本表充分证明，条件致病菌对医疗上广泛使用的抗菌制剂的敏感性发生了变化，这些变化是稳定的，具有继承性。
6、菌株Bacillus subtilis LY-35的安全性
根据我国新生物制剂的实验规定，按通行的方法检测了菌株Bacillussubtilis LY-35的急、慢性毒素。在进行急、慢性毒素测定后，肉眼观察了试验白鼠的活动情况，利用显微镜检查了白鼠的内脏和中枢神经系统，即使使用了最大的可耐受的剂量也没有发现因菌株Bacillus subtilis LY-35的毒素作用而发生病理变化。在经口注入制剂后，在舌根和胃里没有发现任何反应。将制剂注入腹腔，发现个别白鼠在脾膜，肝膜和脾、肝、肾周围的细胞组织中有轻微的发炎症状，一周以后，以上症状大大减轻。这样，就可以得出菌株Bacillus subtilisLY-35非常安全，因为它没有对实验白鼠的内脏和组织产生毒副作用。
噬菌体的特性
噬菌体是一类能够杀灭细菌的病毒，对人和动物无害，在抗生素发现以前的年代，噬菌体是治疗细菌性疾病的主要制剂之一。本制剂所用的噬菌体是按通用的方法从畜禽的生活环境中分离出来，以后也在该环境下使用。
1、噬菌体的工作浓度(效价)
噬菌体原液按十倍序列稀释法，测定效价为106-107时，对不同血清型的E.Coli，Salmonella D enteriditis，Staphylococcus aureus，Streptococcus Pyogenes，Proteus mirabilis，Proteus Vulgaris，Pseudomonas aeruginosa，Klebsilla pneumoniae细菌均具有活性。确定噬菌体在制剂中的效价为106-107。
2、噬菌体的安全性
在生产过程中除去细菌细胞的代谢物和培养基中的蛋白质，蛋白质的净化程度达到98±1.1％。按照单位体重计算人用剂量法，把白鼠用剂量扩大3500倍，经口腔注入到白鼠体内。根据实验结果，白鼠没有死亡。体重没有下降，内脏没有病理变化。此外，将治疗剂量的噬菌体成分(按体重计算出)注入到腹腔内，在以后21天内也没有发现毒性(慢性毒性)。
制剂的生产
复合制剂的各种成分单独生产。
使用含有蛋白胨、葡萄糖、无机盐和微量元素的合成培养基培养Bacillussubtilis LY-35。把Bacillus subtilis LY-35菌株接种到细胞培养瓶内的含有蛋白胨、葡萄糖、无机盐和微量元素的合成琼脂培养基上，置于37℃的恒温箱中，培养18-24小时，然后，将菌苔从琼脂表面上冲洗下来，接种到含相同培养基的种子罐中。发酵培养3-4小时，达到对数生长期，把发酵物作为种子接种到100、250、或500升的发酵罐中，发酵培养18-20小时，到培养物变成芽孢时止。将所得物浓缩到(100-120)×109CFU/毫升。除去培养基，用0.9％的灭菌氯化钠溶液替换之。浓缩物为生长期的活细胞和芽孢的混合物，进行性能检测后，为制备复合制剂时使用。利用液体培养基，在处于对数生长繁殖的细菌中定期控制培养噬菌体，根据细菌的不同种类，以马氏肉汤、霍金格氏肉汤、普通肉汤或者以酵化血液水解物为基本成分作为培养细菌的培养基。
每一种噬菌体单独培养，但是所有细菌的培养条件相同，把浓度达到5×107CFU/毫升的菌悬液加到培养基中，在温度为37℃溶氧度为30-70％的条件下培养1.0-1.5小时，使其浓度达到(2-5)×108CFU/毫升，然后将感染量为1/30的噬菌体添加进去，在相同条件下继续培养1-2小时，直到细菌被完全裂解。
为避免不良反应和清除毒素，在发酵培养后，采用切向流微滤和超滤除去噬菌体制剂中的细菌代谢物和培养基的蛋白质。使用孔径为0.2um的滤膜进行微滤，使用滤限为150-200 KD的膜进行超滤。将不同噬菌体的吞噬细胞溶解物混合起来，搅拌后，进行最后的除菌微滤，所得到的复合噬菌体成分是各种条件致病菌的噬菌体的混合物。进行性能检测后，作为制备复合制剂时使用。
在无菌条件下，将各种成分综合在一起，制成复合制剂，灌装到100毫升、250毫升或500毫升的包装瓶中。
具体实施方式
复合制剂实例：
复合制剂的成分。以具有典型形态、培养、生化特性的Bacillus subtilis LY-35和E.Coli，Salmonella D enteriditis、Staphylococcus aureus、StreptococcusPyogenes、Proteus mirabili、Proteus Vulgaris、Pseudomonas aeruginosa、Klebsillapneumoniae的噬菌体为基础成分，制备了四种复合制剂，为便于使用与运输，复合制剂为浓缩制剂。
第一种制剂含有
1、一毫升复合制剂中Bacillus subtilis LY-35的活菌数为1×109。
2、一毫升复合制剂E.Coli、Salmonella D、enteriditi、Staphylococcus aureus、Streptococcus Pyogenes、Proteus mirabilis、Proteus Vulgaris、Pseudomonasaeruginosa、Klebsilla pneumoniae的噬菌体效价为106(十倍序列稀释法)。
3、酶抑制稳定剂：制剂量0.5％的EDTA(乙二胺四乙酸)。
第二种制剂含有
1、一毫升复合制剂中Bacillus subtilis LY-35的活菌数为1×109。
2、一毫升复合制剂E.Coli，Salmonella D enteriditis，Staphylococcus aureus，Streptococcus Pyogenes，Proteus mirabilis，Proteus Vulgaris，Pseudomonasaeruginosa，Klebsilla pneumoniae的噬菌体效价为106(十倍序列稀释法)。
3、抗菌稳定剂：制剂量1％的8-羟基喹啉硫酸盐。
第三种制剂含有
1、一毫升复合制剂中Bacillus subtilis LY-35的活菌数为1×109。
2、一毫升复合制剂E.Coli，Salmonella D enteriditis，Staphylococcus aureus，Streptococcus Pyogenes，Proteus mirabilis，Proteus Vulgaris，Pseudomonasaeruginosa，Klebsilla pneumoniae的噬菌体效价为106(十倍序列稀释法)。
3、抗菌稳定剂和酶抑制稳定剂用量：制剂量1％的8-羟基喹啉硫酸盐及0.5％的EDTA(乙二胺四乙酸)。
第四种制剂含有
1、一毫升复合制剂中Bacillus subtilis LY-35的活菌数为1×109。
2、一毫升复合制剂E.Coli，Salmonella D enteriditis，Staphylococcus aureus，Streptococcus Pyogenes，Proteus mirabilis，Proteus Vulgaris，Pseudomonasaeruginosa，Klebsilla pneumoniae的噬菌体效价为106(十倍序列稀释法)。
3、无稳定剂和酶抑制剂
制备的制剂在无菌条件下灌入灭菌瓶中并封盖。对四种制剂按下列特性进行了综合检测。
1、Bacillus subtilis LY-35对条件致病菌的特异拮抗性。
2、Bacillus subtilis LY-35对抗菌制剂的敏感性。
3、E.Coli，Salmonella D enteriditis，Staphylococcus aureus，StreptococcusPyogenes，Proteus mirabilis，Proteus Vulgaris，Pseudomonas aeruginosa，Klebsillapneumoniae噬菌体对检测菌的裂解活性。
4、利用白鼠检测安全性。
5、存放过程中复合制剂的有效成分的浓度变化。
检测制剂对各种致病菌的特异拮抗性
采用延迟拮抗法进行检验。用接种环将瓶中物沿培养皿直径划线，接种到高氏2号培养基(半合成培养)中，在37℃条件下恒温培养24小时，然后22℃条件下再培养24小时，最后垂直于培养物划线接种致病菌(0.5×109/毫升的24小时培养物的菌悬液)，经过18-24小时37℃的恒温培养后，参照同时培养的只接种检测菌而无Bacillus subtilis LY-35的对照培养皿，统计检测菌的生长情况。
表四：四种不同制剂中Bacillus subtilis LY-35的拮抗性(mm)
| 制剂种类 | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 抑制检测菌的生长范围 | E.Coli | 25±2 | 24±2 | 26±2 | 25±2 |
| Salmonella D enteriditis | 20±2 | 21±2 | 20±2 | 20±2 | |
| Staphylococcus aureus | 28±2 | 27±2 | 28±2 | 27±2 | |
| Streptococcus Pyogenes | 22±2 | 21±2 | 22±2 | 24±2 | |
| Proteus mirabilis | 20±2 | 22±2 | 21±2 | 20±2 | |
| Proteus Vulgaris | 20±2 | 21±2 | 20±2 | 19±2 | |
| Pseudomonas aevruginosa | 10±1 | 12±2 | 12±1 | 11±1 | |
| Klebsiella Pneumoniae | 18±2 | 17±2 | 19±2 | 17±2 | |
检测制剂对抗生素的敏感性
利用浸有抗生素的标准圆盘检测制剂对抗生素的敏感性。方法如下：从用0.9％的氯化钠溶液制备成的含有Bacillus subtilis LY-35微生物细胞1×109/ml的复合制剂中分离出菌种，培养一昼夜后制成菌悬液。取菌悬液1毫升滴入肉胨琼脂培养皿中，均匀涂在琼脂表面上，多余的菌悬液用滴管吸出，用镊子将浸有抗生素的圆盘滤纸片放到琼脂表面上。每个培养皿放五片。把培养皿放入(37±1)℃的恒温箱中培养(18-24)小时。然后计算出圆盘纸片周围的抑菌范围，包括纸片本身的直径。
表五：四种不同制剂中Bacillus subtilis LY-35对抗生素的敏感性
| 制剂种类 | 对抗生素的敏感性(圆盘检测)抑制范围mm | |||
| 多粘菌素 | 利福霉素 | 青霉素 | 链霉素 | |
| 1 | 10 | 0 | 0 | 10±2 |
| 2 | 10 | 0 | 0 | 10±2 |
| 3 | 10 | 0 | 0 | 10±2 |
| 4 | 10 | 0 | 0 | 10±2 |
检测制剂中噬菌体的裂解活性
检验复合制剂中噬菌体成分的裂解活性，采用十倍序列稀释法。把Bacillussubtilis LY-35过滤除去，将制剂按十倍序列稀释到肉汤培养基中，再把一定量的标准条件致病检测菌滴入，观察到肉汤澄清的最大稀释效价可以作为检测结果。
表六：四种不同制剂中制剂中噬菌体对条件致病菌的裂解活性
| 制剂种类 | 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 对条件致病菌的特异抗菌活 | E.Coli | 106-107 | 106-107 | 106-107 | 106-107 |
| Salmonella D enteriditis | 106-107 | 106-107 | 106-107 | 106-107 | |
| Staphylococcus aureus | 106-107 | 106-107 | 106-107 | 106-107 | |
| Streptococcus Pyogenes | 106-107 | 106-107 | 106-107 | 106-107 | |
| Proteus mirabilis | 106-107 | 106-107 | 106-107 | 106-107 | |
| Proteus Vulgaris | 106-107 | 106-107 | 106-107 | 106-107 | |
| Pseudomonas aeruginosa | 106-107 | 106-107 | 106-107 | 106-107 | |
| Klebsiella Pneumoniae | 106-107 | 106-107 | 106-107 | 106-107 | |
检测制剂的安全性
检验复合制剂的安全性。取瓶中制剂0.5毫升经口腔注入到白鼠体内，使用十只以上重量为15-16克的白鼠，检测每一种制剂。如果白鼠在五天的观察期内全部存活，并且无一出现患病症状，则制剂认为安全无害。
表七：per os使用复合制剂一个计量后白鼠的体重变化
| 制剂种类 | 实验白鼠数 量 | 白鼠存活数 量 | 白鼠平均体重(克) | ||
| 服用前 | 服用后 | ||||
| 一昼夜 | 五昼夜 | ||||
| 1 | 10 | 10 | 15.10 | 15.30 | 15.52 |
| 2 | 10 | 10 | 15.42 | 15.45 | 16.08 |
| 3 | 10 | 10 | 15.80 | 15.80 | 16.42 |
| 4 | 10 | 10 | 15.60 | 15.65 | 17.00 |
实验表明，全部白鼠存活下来，体重增加，没有出现发病症状。
检测制剂(液体)存贮中有效成分浓度的变化
表八：四种不同制剂中Bacillus subtilis LY-35的浓度的变化
| 存贮期(月) | 不同制剂的细菌细胞浓度 CFU/毫升 | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 0(初始浓度) | 1×108 | 1×108 | 1×108 | 1×108 |
| 3个月后 | 1×108 | 5×107 | 5×107 | 1×107 |
| 6个月后 | 1×107 | 1×106 | 1×106 | 5×105 |
| 9个月后 | 1×106 | 1×105 | 1×105 | 5×104 |
| 12个月后 | 1×105 | 5×104 | 5×104 | 1×104 |
表九：四种不同制剂对条件致病菌裂解活性的变化(十倍序列稀释)
| 存贮期(月) | 噬菌体成分的裂解活性的效价(平均值) | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 0(初始浓度) | 10-8 | 10-8 | 10-8 | 10-8 |
| 3个月后 | 10-7 | 10-5 | 10-7 | 10-7 |
| 6个月后 | 10-6 | 10-3 | 10-6 | 10-5 |
| 9个月后 | 10-6 | 10-3 | 10-6 | 10-5 |
| 12个月后 | 10-5 | 10-2 | 10-5 | 10-5 |
从表八和表九中可以看出，含酶抑制稳定剂0.5％EDTA的制剂和含酶抑制稳定剂0.5％EDTA+抗菌剂1％的8-羟基喹啉硫酸盐贮存效果最佳，即第一种和第三种制剂。
应用实例
应用实例一：使用复合制剂治疗牛乳房炎、子宫内膜炎。
在使用过程中，测定治疗牛乳房炎的日均最佳用量为一公斤体重对Bacillussubtilis LY-35活菌数1×109，噬菌体的裂解活性为106。治疗牛子宫内膜炎时，使用注射器注入子宫腔。治疗乳房炎时，利用导管注入到乳池内。与抗生素同时使用时，治疗费用下降了20％，劳动费用下降了50％，对于牛卡他性和化脓卡他性乳房炎的有效性在55％-95％之间，比乳池内使用其他抗菌制剂的有效性高13.7-25.0％。
应用实例二：使用复合制剂治疗幼畜，测定了液体制剂对仔猪的作用效果。
测定仔猪的日均最佳用量为一公斤体重对Bacillus subtilis LY-35活菌数(0.3-0.5)×109，噬菌体的裂解活性为106。在10-30日内每日使用，制剂的效果最佳。仔猪的体重平均增加15-30％，在不增加饲料和饲养费用的情况下，因胃肠道疾病和肺病造成的幼畜死亡率降低，除此之外，使用新制剂可缩短仔猪对新饲料和新饲养条件的适应期。另外，采用模拟试验方法检测了制剂的效果。将1.5-2周龄的牛犊感染Escherichia Coli和ProteusVulgaris致病菌，制剂的效果很好，具有很强的抑制致病菌生长，恢复胃肠道微菌群的能力，即表现为患腹泻病的幼畜大大减少，与对照组相比，每日体重多增长50％以上。
Claims (6)
1、一种枯草芽孢杆菌，名称为Bacillus subtilis LY-35，其生物化学特性为：菌株发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇，形成酸，不产气，不分解乳糖；不形成吲哚，硫化氢；V-P反应为阳性，制造过氧化氢酶，蛋白酶，解胶酶，酰胺酶，不形成卵酯酶，脂肪酶，脲酶，不形成溶血素和纤维蛋白溶酶，菌株耐青霉素系列的抗生素(苄基青霉素，羧苄基青霉素，氨苄青霉素)、多粘菌素、安曲南，对林可酶素、万古酶素、四环素不敏感；其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是：CGMCC NO.1222。
2、利用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌制备的复合制剂，其特征是：以具有典型形态、培养、生化特性的Bacillus subtilis LY-35和E.Coli，Salmonella Denteriditis、Staphylococcus aureus、Streptococcus Pyogenes、Proteus mirabili、Proteus Vulgaris、Pseudomonas aeruginosa、Klebsilla pneumoniae的噬菌体为基础成分，制备复合制剂；制剂含有：
1)、一毫升复合制剂中Bacillus subtilis LY-35的活菌数为1×109；
2)、一毫升复合制剂E.Coli、Salmonella D、enteriditi、Staphylococcus aureus、Streptococcus Pyogenes、Proteus mirabilis、Proteus Vulgaris、Pseudomonasaeruginosa、Klebsilla pneumoniae的噬菌体效价为106(十倍序列稀释法)；
3)、酶抑制稳定剂：制剂量0.5％的EDTA(乙二胺四乙酸)。
3、利用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌制备的复合制剂，其特征是：以具有典型形态、培养、生化特性的Bacillus subtilis LY-35和E.Coli，Salmonella Denteriditis、Staphylococcus aureus、Streptococcus Pyogenes、Proteus mirabili、Proteus Vulgaris、Pseudomonas aeruginosa、Klebsilla pneumoniae的噬菌体为基础成分，制备复合制剂；制剂含有：
1)、一毫升复合制剂中Bacillus subtilis LY-35的活菌数为1×109；
2)、一毫升复合制剂E.Coli，Salmonella D enteriditis，Staphylococcus aureus，Streptococcus Pyogenes，Proteus mirabilis，Proteus Vulgaris，Pseudomonasaeruginosa，Klebsilla pneumoniae的噬菌体效价为106(十倍序列稀释法)；
3)、抗菌稳定剂：制剂量1％的8-羟基喹啉硫酸盐。
4、利用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌制备的复合制剂，其特征是：以具有典型形态、培养、生化特性的Bacillus subtilis LY-35和E.Coli，Salmonella Denteriditis、Staphylococcus aureus、Streptococcus Pyogenes、Proteus mirabili、Proteus Vulgaris、Pseudomonas aeruginosa、Klebsilla pneumoniae的噬菌体为基础成分，制备复合制剂；制剂含有：
1)、一毫升复合制剂中Bacillus subtilis LY-35的活菌数为1×109；
2)、一毫升复合制剂E.Coli，Salmonella D enteriditis，Staphylococcus aureus，Streptococcus Pyogenes，Proteus mirabilis，Proteus Vulgaris，Pseudomonasaeruginosa，Klebsilla pneumoniae的噬菌体效价为106(十倍序列稀释法)；
3)、抗菌稳定剂和酶抑制稳定剂用量：制剂量1％的8-羟基喹啉硫酸盐及0.5％的EDTA(乙二胺四乙酸)。
5、利用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌制备的复合制剂，其特征是：以具有典型形态、培养、生化特性的Bacillus subtilis LY-35和E.Coli，Salmonella Denteriditis、Staphylococcus aureus、Streptococcus Pyogenes、Proteus mirabili、Proteus Vulgaris、Pseudomonas aeruginosa、Klebsilla pneumoniae的噬菌体为基础成分，制备复合制剂；制剂含有：
1)、一毫升复合制剂中Bacillus subtilis LY-35的活菌数为1×109；
2)、一毫升复合制剂E.Coli，Salmonella D enteriditis，Staphylococcus aureus，Streptococcus Pyogenes，Proteus mirabilis，Proteus Vulgaris，Pseudomonasaeruginosa，Klebsilla pneumoniae的噬菌体效价为106(十倍序列稀释法)。
6、如权利要求2或3或4或5所述的枯草芽孢杆菌复合制剂的制备方法，其特征是：
1)Bacillus subtilis LY-35的制备：使用含有蛋白胨、葡萄糖、无机盐和微量元素的合成培养基培养Bacillus subtilis LY-35；把Bacillus subtilis LY-35菌株接种到细胞培养瓶内的含有蛋白胨、葡萄糖、无机盐和微量元素的合成琼脂培养基上，置于37℃的恒温箱中，培养18-24小时，然后，将菌苔从琼脂表面上冲洗下来，接种到含相同培养基的种子罐中；发酵培养3-4小时，达到对数生长期，把发酵物作为种子接种到100、250、或500升的发酵罐中，发酵培养18-20小时，到培养物变成芽孢时止；将所得物浓缩到(100-120)×109CFU/毫升；除去培养基，用0.9％的灭菌氯化钠溶液替换之；浓缩物为生长期的活细胞和芽孢的混合物，进行性能检测后，为制备复合制剂时使用；
2)噬菌体的制备：利用液体培养基，在处于对数生长繁殖的细菌中定期控制培养噬菌体，根据细菌的不同种类，以马氏肉汤、霍金格氏肉汤、普通肉汤或者以酵化血液水解物为基本成分作为培养细菌的培养基；每一种噬菌体单独培养，但是所有细菌的培养条件相同，把浓度达到5×107CFU/毫升的菌悬液加到培养基中，在温度为37℃溶氧度为30-70％的条件下培养1.0-1.5小时，使其浓度达到(2-5)×108CFU/毫升，然后将感染量为1/30的噬菌体添加进去，在相同条件下继续培养1-2小时，直到细菌被完全裂解；在发酵培养后，采用切向流微滤和超滤除去噬菌体制剂中的细菌代谢物和培养基的蛋白质；使用孔径为0.2um的滤膜进行微滤，使用滤限为150-200KD的膜进行超滤；将不同噬菌体的吞噬细胞溶解物混合起来，搅拌后，进行最后的除菌微滤，所得到的复合噬菌体成分是各种条件致病菌的噬菌体的混合物；进行性能检测后，作为制备复合制剂时使用；
3)在无菌条件下，将各种成分综合在一起，制成复合制剂。
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