CN101558150A

CN101558150A - 螺杆菌的体外培养

Info

Publication number: CN101558150A
Application number: CNA2007800419916A
Authority: CN
Inventors: M·巴埃莱; F·黑斯布鲁克
Original assignee: Universiteit Gent
Current assignee: Universiteit Gent
Priority date: 2006-11-14
Filing date: 2007-11-14
Publication date: 2009-10-14
Also published as: MX2009004922A; WO2008058727A1; CN103667127A; EP2087095B1; ES2492922T3; EP2087095A1

Abstract

本发明涉及用于分离和培养“暂定猪螺杆菌”的培养基和方法以及通过这些方法获得的“暂定猪螺杆菌”分离株。本发明进一步涉及将这些细菌用于抗原制剂和疫苗的生产。

Description

螺杆菌的体外培养

发明领域

本发明涉及用于体外分离和/或培养螺杆菌、尤其是“暂定猪螺杆菌(Candidatus Helicobacter suis)”的方法和工具。本发明还涉及由分离的螺杆菌培养物制备抗原和疫苗。

发明背景

人群中的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)感染是胃和十二指肠溃疡以及胃癌的一个主要原因。幽门螺杆菌(H.pylori)不是唯一一种能在人的胃黏膜上集落化的螺杆菌。已经在约0.96％的人的胃活组织切片中发现了“海尔曼螺杆菌”(Helicobacter heilmannii，建议名)(Heilmann和Borchard(1991)Gut 32，137-140)。这一生物体与胃炎密切相关，但也与消化器官溃疡、胃腺癌以及黏膜相关淋巴组织淋巴瘤相关。近期的证据显示，海尔曼螺杆菌(H.heilmannii)不是单一的物种，而是代表了具有相似的螺旋形形态的不同细菌种类，其中大部分可能具有人畜共患性起源。在16S rRNA基因序列的基础上分为1型海尔曼螺杆菌和2型海尔曼螺杆菌(Solnick等，(1993)J.Infect.Dis.168，379-385)。50％以上的人类海尔曼螺杆菌感染是由1型海尔曼螺杆菌引起的(Trebesius等，(2001)J.Clin.Microbiol.39，1510-1516)。1型海尔曼螺杆菌已被证实等同于“暂定猪螺杆菌”(Candidatus H.suis)(O’Rourke等，(2004)Int.J.Syst.Evol.Microbiol.54，2203-2211)，后者是一种在60％以上屠宰的猪的胃中集落化的迄今无法培养的螺旋形细菌。暂定猪螺杆菌在猪的胃病中的实际作用仍不清楚，但已经指出，这一细菌与食管部()胃溃疡以及慢性幽门胃炎相关。使用小鼠接种将这一细菌从受感染的猪胃黏膜中分离出来(Dick等，(1989)J.Med.Microbiol.29，55-62)。Hellemans等人[(2005)Antimicrob.agents chemother.49，4530-4535]改进了现有的暂定猪螺杆菌感染的体内小鼠模型，用于评价这一生物体的抗生素易感性。仍未实现暂定猪螺杆菌的体外培养。

发明概述

本发明是建立在开发能够分离和培养螺杆菌、尤其是暂定猪螺杆菌()的培养体系的基础上的，暂定猪螺杆菌在这之前未被证明能以体外分离株的形式培养。

本发明的第一个方面涉及一种用于分离螺杆菌的培养体系的应用，更具体地说，涉及一种包含固体成分的培养体系(即固体培养基)的应用，所述固体培养基包含至少7.5％血液或10％血清，其pH调节至5.0至6.0之间。

在一具体实施方式中，所述固体成分包含用于苛求生物体生长的营养素。更具体地说，这些营养素选自布氏、马-欣二氏或心脑浸液培养基。

在进一步的具体实施方式中，存在于所述固体成分中的血清是浓度至少12.5％的血清。在另一具体实施方式中，存在于所述固体成分中的血液浓度至少为10％。

更具体地说，本发明涉及在“暂定猪螺杆菌”的分离中使用上述培养体系。

在第二个方面，本发明提供了用于从含有相同螺杆菌的样品中分离螺杆菌、尤其是暂定猪螺杆菌的方法，所述方法包括在含有pH 5.0到6.0之间、补充了至少10％血清或至少7.0％血液的培养基的培养体系中培养所述含螺杆菌的样品的步骤。

在这些方法的具体实施方式中，所使用的培养基包含用于苛求菌生长的营养素。更具体地说，所述用于苛求菌生长的营养素选自布氏、马-欣二氏或心脑浸液营养素。此外或或者，在具体实施方式中，所述培养基包含至少一种抑制不同于所培养的螺杆菌的真菌和/或革兰氏阳性和/或革兰氏阴性微生物生长的选择性物质。在进一步的具体实施方式中，所述至少一种选择性物质选自下组：万古霉素、乳酸甲氧苄啶、多粘菌素B、头孢磺啶、黏菌素、两性霉素B、结晶紫、制霉菌素和乳链菌肽。

在本发明所述方法的具体实施方式中，含至少10％血清的所述培养基含有12.5和25％之间的血清。另外，含至少7.0％血液的所述培养基含有7.5和15％、尤其是10和15％之间的血液。

可选地，本发明所述方法中使用的培养基进一步包含从维生素B12、L-谷氨酰胺、腺嘌呤、鸟嘌呤、对氨基苯甲酸、L-胱氨酸、NAD(辅酶1)、辅羧酶、硝酸铁、硫胺和盐酸半胱氨酸中选择的一种或多种生长因子。

在本发明所述方法的具体实施方式中，使用了包含一种固体成分和一种液体成分的培养体系，其中至少所述固体成分含有如上所述的培养基。在进一步的实施方式中，固体和/或液体成分都含有用于苛求菌生长的营养素。更具体地说，这些营养素选自布氏、马-欣二氏或心脑浸液营养素。

在本发明所述方法的一种进一步具体的实施方式中，培养体系的固体和/或液体成分包含至少一种抑制不同于所培养的螺杆菌的真菌和/或革兰氏阳性和/或革兰氏阴性微生物生长的选择性物质。更具体地说，所述至少一种选择性物质选自下组：万古霉素、乳酸甲氧苄啶、多粘菌素B、头孢磺啶、黏菌素、两性霉素B、结晶紫、制霉菌素和乳链菌肽。

本发明所述方法的进一步具体的实施方式使用含有一种固体和一种液体成分的培养体系，其中所述固体成分包含12.5和15％之间的血清或7.5和15％、尤其是10和15％之间的血液。

本发明所述进一步具体的实施方式使用如上所述含有一种固体和一种液体成分的培养体系，其中所述固体和/或液体成分进一步包含从维生素B12、L-谷氨酰胺、腺嘌呤、鸟嘌呤、对氨基苯甲酸、L-胱氨酸、NAD(辅酶1)、辅羧酶、硝酸铁、硫胺和盐酸半胱氨酸中选择的一种或多种生长因子。

本发明的方法尤其适于“暂定猪螺杆菌”的分离。事实上，本发明首次提供了获得“暂定猪螺杆菌”分离株的方法。

因此，本发明的第二个方面提供了螺杆菌的分离株、尤其是“暂定猪螺杆菌”的分离株。在这里首次展示的这种分离株是通过本发明的方法获得的。

本发明的第三个方面提供了用于培养螺杆菌分离株的方法，所述方法包括在包含pH在4.0和7.0之间的补充了至少10％血清或至少7.5％血液的培养基的培养体系中应用所述螺杆菌分离株、以及在其中培育所述分离株的步骤。

如本发明这一方面所述方法的具体实施方式中，所使用的培养体系包含一种固体和一种液体成分，并且至少该培养体系的所述固体成分含有以上所述培养基。

在本发明所提供的这些培养方法的进一步具体实施方式中，所述固体和液体成分含有用于苛求菌生长的营养素。

在具体实施方式中，本发明培养方法中所使用的所述培养体系的至少所述固体成分pH缓冲在4.7和7.0之间。

本发明的另一个方面提供了含有一种用于分离和/或培养螺杆菌的固体培养基的培养容器，所述固体培养基包含：用于苛求生物生长的营养素、浓度在7.5至15％之间的血液或浓度在12.5至25％之间的血清、以及至少一种抑制不同于所培养的螺杆菌的真菌和/或革兰氏阳性和/或革兰氏阴性微生物生长的选择性物质，所述培养容器的特征在于，其中所包含的固体培养基的pH介于5.0至6.0之间。更具体地说，所述至少一种选择性物质选自下组：万古霉素、乳酸甲氧苄啶、多粘菌素B、头孢磺啶、黏菌素、两性霉素B、结晶紫、制霉菌素和乳链菌肽。

在本发明所述培养容器的具体实施方式中，所述固体培养基含琼脂。

本发明的另一个方面提供了含有“暂定猪螺杆菌”分离株抗原制剂的疫苗。事实上，本发明提供了用于生产“暂定猪螺杆菌”的抗原制剂的方法，所述方法包括按照上述方法分离并可选地培养“暂定猪螺杆菌”以及由所获得的“暂定猪螺杆菌”分离株生产抗原制剂。

此外，本发明提供了含有活的减毒的“暂定猪螺杆菌”和/或完全灭活的“暂定猪螺杆菌”的疫苗以及用于制备这样的疫苗的方法，所述方法包括上述的分离和可选地培养方法。

本发明的另一个方面提供了针对“暂定猪螺杆菌”感染对动物进行疫苗接种的方法，所述方法包括将含有“暂定猪螺杆菌”分离株、活的减毒“暂定猪螺杆菌”和/或完整的“暂定猪螺杆菌”中的一种或多种抗原制剂的疫苗对动物给药。

类似地，本发明设想了针对用于预防和/或治疗螺杆菌感染的疫苗生产，使用能通过这里所述的方法分离和/或培养的螺杆菌分离株、尤其是“暂定猪螺杆菌”分离株，或使用由“暂定猪螺杆菌”获得的抗原制剂。更具体地说，设想了使用螺杆菌制剂、尤其是“暂定猪螺杆菌”用于生产预防和/或治疗螺杆菌感染、尤其是用于针对“暂定猪螺杆菌”进行免疫的疫苗。

发明详述

本发明将参照某些实施方式进行描述，但本发明不限于这些实施方式而仅受权利要求的限制。

这里所使用的术语“暂定猪螺杆菌”(或猪螺杆菌(H.suis))是指以前认为是1型海尔曼螺杆菌()的细菌(Trebesius等，(2001)J.Clin.Microbiol.39，1510-1516)。现在认为，1型海尔曼螺杆菌等同于暂定猪螺杆菌(O’Rourke等(2004)Int.J.Syst.Evol.Microbiol.54，2203-2211；De Groote等(1999)Int.J.Syst.Bacteriol.49，1769-1777)，它是一种在60％以上屠宰的猪的胃中集落化的螺旋状细菌。暂定猪螺杆菌在分子水平上也被定义为具有Genbank登录号AF 127028(De Groote等(1999)，前文引用)和AF506788-92(O’Rourke等(2004)，前文引用)的16SrRNA序列和Genbank登录号AF508013-AF508014(O’Rourke等，(2004)Int.J.Syst.Evol.Microbiol.54，2203-2211)中所述尿素酶基因序列的螺杆菌。

这里所使用的术语“分离株”是纯的、匀质的微生物体外培养物。它可以通过其体外培养从异质的微生物野生群落得到。

本发明上下文中所使用的术语“培养容器”涉及适于培养微生物的容器，诸如但不限于皮氏培养皿、培养瓶、滚瓶以及细胞工厂。

本发明上下文中所使用的术语“抗原制剂”涉及包含至少一种对动物给药时激发免疫应答(因此称为“抗原”)的蛋白质或其片段的组合物。

这里所使用的术语“疫苗”是指如前文所述抗原制剂的组合物，用于对动物或人给药以刺激所述动物或人体内针对一种引发疾病的生物体的免疫应答，从而为所述动物或人针对所述生物体引起的疾病或病症提供保护。疫苗可以包含完整的引起疾病的生物体(灭活的或弱化的)或这些生物体的部分、或对应于这些生物体的整体或部分的合成分子。术语疫苗包括针对预防应用的组合物(即在感染前对动物或人给药以防止最初的(和/或再次发生的)感染)以及针对治疗应用的组合物(即在感染后对动物或人给药以降低或阻止由所述生物体引起的疾病进程)。

通过疫苗接种过程用来自一个物种的抗原为由另一个物种所引起的疾病提供保护被称为“交叉疫苗接种”或“异源疫苗接种”。

这里所使用的术语“胃的材料”是指直接或间接从人或其他动物的胃肠道中获得的任何材料。这样的材料包括例如胃上皮细胞、胃黏膜以及消化液。

这里所使用的术语“培养基”是指适合于微生物生长的液体、固体或半固体组合物。

术语“苛求生物体”在这里按照其在细菌学中的常规含义使用，即是指具有复杂营养要求的细菌[Stedmans医学词典]。

本发明的第一个方面提供了用于分离和/或培养螺杆菌、尤其是“暂定猪螺杆菌”的体外方法。暂定猪螺杆菌的体外分离迄今还未报道。本发明提供了能使螺杆菌、尤其是暂定猪螺杆菌选择性生长的方法。

通过高浓度血液或血清以及提供最优化pH条件的组合已经实现了用于暂定猪螺杆菌的选择性生长条件。有利于螺杆菌生长的pH条件同时对于大量非螺杆菌和真菌是有害的。通过使用低pH，降低了污染，使得暂定猪螺杆菌得以放大。

在本发明的分离方法中，含有螺杆菌的样品在一种培养基中培养，该培养基的pH调节为约5.0至约6.0之间。这一pH调节可以通过向培养基营养素中添加浓酸进行，所述培养基营养素通过作为两性离子的氨基酸的存在提供了足够的缓冲能力。另外，在培养基中加入在pH 5.0至5.5附近具有高缓冲能力的生物相容性缓冲液(例如醋酸盐、磷酸盐)。惊讶地发现，在pH值5.0至6.0之间，暂定猪螺杆菌的分离形成螺旋状运动的细菌，而在此pH区间以外，暂定猪螺杆菌表现为球菌状不运动形式。如稍后在实施例中详细解释的，pH对暂定猪螺杆菌的作用随着连续的传代在某种程度上有所改变。而在pH 5.0至6.0之间成功分离了暂定猪螺杆菌。

按照一种实施方式，本发明的方法包括将含有螺杆菌、尤其是暂定猪螺杆菌的样品应用于一种培养体系，所述培养体系是一种双组分培养体系，包含一种固体组分和一种液体(或半液体)组分，所述样品位于液体组分中。所述固体组分通常包含琼脂，所述液体组分是至少含有营养素的肉汤。已经观察到，在这样的培养体系中，螺杆菌分离株保留在液体组分中并可以通过转移至另一种固体组分加以亚培养。在本发明的分离方法中使用双组分体系的情况下，至少固体组分的pH介于5.0至6.0之间。

本发明分离方法中的培养基包含高浓度血液(7.5至25％之间)或诸如血清的血液成分(12.5至30％之间)。除非另有说明，培养基中的血清和血液浓度是体积百分比(v/v)。在具体实施方式中，培养基中的血清浓度介于12.5至25％之间，这包括诸如12.5、15、17.5、20和25％的浓度。在其他具体实施方式中，培养基中的血液浓度介于7.5至25％之间、更具体介于8至20％之间、尤其介于9至15％之间，这包括诸如9.5、10和12.5％的浓度。在使用双组分培养体系的情况下，所述培养体系的至少固体组分、但可选地以及液体组分应当含有具体的血清或血液浓度。

本发明上下文中所使用的培养基中的血清可以是不同动物的胎儿、新生儿或成年个体的血清(所述动物例如但不限于牛、马、绵羊、山羊或猪)、尤其是马血清、或其组合。通常，除了其他成分以外，血清还包含诸如白蛋白和转铁蛋白等为螺杆菌提供铁的铁结合蛋白。也可以使用含有这样的基础成分的适当的血清或血液替代物。

诸如但不限于牛、马、绵羊、山羊或猪的血液等不同种类的血液适用于本发明的方法。在具体实施方式中，培养基中的血液浓度介于7.5至15％之间，这包括例如10％和12.5％的血液浓度。

根据具体实施方式，本发明的最初分离方法中使用的培养基还含有抗菌剂以进一步确保螺杆菌的选择性生长。这样的抗菌剂包括抗细菌物质和抗真菌物质，它们限制或抑制所述样品中潜在的非螺杆菌的细菌或酵母的生长。在使用双组分体系的情况下，这些抗菌剂至少存在于固体组分中，并且可选地也存在于液体或半液体组分中。

在具体实施方式中，本发明的培养基包含一种或多种抑制不同于所培养的螺杆菌的真菌和/或革兰氏阳性和/或革兰氏阴性微生物生长的抗生素。这样的抗生素的例子有万古霉素、乳酸甲氧苄啶、多粘菌素B、头孢磺啶、黏菌素、两性霉素B、结晶紫、制霉菌素和乳链菌肽。例如，Skirrow补充物(奥氏公司(Oxoid))是适合于本发明所述方法的一种商品化抗生素组合物，其在培养基中的终浓度为10mg/mL万古霉素、5mg/L乳酸甲氧苄啶和2500IU/L多粘菌素B。其他的抗生素混合物例如是抗真菌混合物，诸如两性霉素B(两性霉素B(fungizone))。

一旦已经获得了诸如暂定猪螺杆菌的螺杆菌分离株，可以使用前文所述用于本发明的分离方法的培养条件对其进一步培养。然而，已经观察到，已分离的培养物可以在更宽的pH范围内(4.0到7.0之间)培养。pH在分离过程中更为关键，因为在pH 6.0以上的条件下，新分离的胃部样品中存在的污染物(其他细菌和真菌)比样品中的螺杆菌长得快，这对分离是不利的。然而已经观察到，对于含有较少污染物的暂定猪螺杆菌分离株而言，可以在pH 7.0以下生长。因此，本发明进一步提供了如上所述用于螺杆菌分离株、尤其是暂定猪螺杆菌的培养方法，其中培养基的pH介于约4.0至约7.0之间，尤其介于(并包括)约4.7至约6.0之间。

在样品中存在不同的细菌和真菌情况下的分离过程中，尤其适用上述抗生素和抗真菌剂。然而，在获得了纯分离株的情况下，可以在含有较少或不含抗生素或抗真菌剂的培养基中实现培养。

在本发明的分离和/或培养方法的具体实施方式中，培养基还包含额外的生长因子。例如，商品名为Vitox(奥氏公司)的是一种商品化的生长因子混合物。这一商品化组合物的生长因子在生长培养基(琼脂或肉汤)中的终浓度为维生素B12(0.5mg/L)、L-谷氨酰胺(50.0mg/L)、腺嘌呤(5.0mg/L)、鸟嘌呤(0.15mg/L)、对氨基苯甲酸(0.65mg/L)、L-胱氨酸(5.5mg/L)、NAD辅酶-1(1.25mg/L)、辅羧酶(0.5mg/L)、硝酸铁(0.1mg/L)、硫胺(0.015mg/L)和盐酸半胱氨酸(130.0mg/L)。在使用双组分体系的情况下，所述生长因子可以存在于固体组分中或液体组分中或双组分中。根据一具体实施方式，在固体组分中添加所述生长因子。

通常，本发明的分离和/或培养方法中使用的培养基包含用于苛求生物体生长的营养素。这些营养素通常通过添加诸如但不限于布氏培养基、马-欣二氏培养基、牛和猪脑心浸液等培养基以及诸如但不限于哥伦比亚琼脂、胰蛋白大豆琼脂酯类等效培养基提供。布氏培养基通常在1L培养基中包含10g酪蛋白胰酶消化物、10g动物组织胃蛋白酶消化物、1g葡糖、2g酵母提取物、5g氯化钠和0.1g亚硫酸氢钠。其中蛋白胨提供有机氮。酵母提取物是B族维生素的有力来源。葡糖用作能量来源。马-欣二氏培养基通常在1L培养基中包含2g肉浸液、17.5g酪蛋白水解物和1.5g淀粉。这样的培养基可以从例如戴氏公司(Difco)和奥氏公司等公司购得。

本发明提供了用于螺杆菌分离和/或培养的方法，所述方法能够对真正的螺杆菌分离株、尤其是“暂定猪螺杆菌”分离株进行分离和培养。然而应当理解，存在影响螺杆菌富集的其他因素。这样的因素包括获得含螺杆菌的样品的方式，特别是在取得胃的材料时对胃和胃壁进行处理以使其他生物污染最小化的方式。

因此，本发明所述分离方法的具体实施方式进一步包括在特定条件下提供含有螺杆菌的胃的材料的样品的第一个步骤。在一种实施方式中，胃壁的一部分在杀灭大量酸不稳定微生物的酸性条件下培育。在另一种具体实施方式中，通过只分离胃的表面粘液对胃壁进行处理。

可选地，在本发明的培养和/或分离方法中使用的培养基包含一种或多种额外成分。

在本发明所述方法的具体实施方式中，培养基进一步包含活性炭。在使用双组分体系的情况下，活性炭至少存在于固体组分中。

在本发明所述方法的具体实施方式中，培养基进一步包含在pH 5.5至6.0之间变色的生物相容性pH指示剂。例如，可以使用pH 6.6以下显黄色并在pH8以上显红色的苯酚红。这样的指示剂在含血清的平板中尤其有用。通常，在双组分体系中，这样的pH指示剂存在于固体组分中。

在具体实施方式中，本发明所述的分离和/或培养方法包括将含有螺杆菌的样品应用于双组分体系，其中固体组分含营养素、生长因子和抗生素，并调节pH至4.7和7.0之间(更具体为5.0和6.0之间)，而液体组分只包含营养素而不进行pH调节。可选地，液体组分的pH调节至4.7和7.0之间(或更具体地，5.0和6.0之间)，并且/或液体组分也含有生长因子和抗生素。

可以考虑用于实现本发明所述方法的具体实际结构。通常，在培养瓶或皮氏培养皿(平板)中进行分离和培养。在具体实施方式中，所述方法包括一种双组分体系，其中固体组分覆盖了培养容器的整个底部(厚度通常为1mm至5mm之间)，液体或半液体组分在固体组分的全部或部分表面上展开。

在一种非常具体的实施方式中，在直径为10cm的含有5到15mL具有前文所述成分的固体琼脂的皮氏培养皿类容器中进行分离。在琼脂顶部加入约500至约1000μL作为液体组分的液体肉汤。

在另一具体实施方式中，所述双组分体系包含没有添加营养素、血清或其它添加剂的底层琼脂，但包含pH5的缓冲剂。在这一底层琼脂的顶部，涂布了含有暂定猪螺杆菌培养所需的所有成分的顶层琼脂。通过使用这一缓冲剂使用了最少量的昂贵的成分，而通过下面底层琼脂的存在，所述顶层琼脂的pH保持稳定。

本发明所述的方法可以用于螺杆菌、尤其是暂定猪螺杆菌的分离和/或培养。通常，在本发明所述方法中，根据微生物污染和培养基的营养利用程度，胃的材料的样品在培养体系中培育1至15天。在使用固体培养基的情况下，培养基耗尽的标志通常是在固体培养基中出现透明区域。此外或另外，可以评价液体培养基中螺杆菌的活动性，其中降低的活动性是培养基耗尽的指标。此外或另外，当培养基(或固体和/或液体组分)的pH提高到pH 6.0或更高时，可以将细菌分离株转移至新鲜平板。

通常，本发明的方法涉及将含有螺杆菌或螺杆菌分离株的样本在37℃培育。发现螺杆菌在25℃以下或40℃以上不生长。通常，含螺杆菌的平板在微氧条件下生长，即2到8％之间的氧气、特别是约4-5％的氧气。然而，螺杆菌在完全厌氧条件下不生长。

用于从样品中分离螺杆菌的方法的一种具体实施方式包括以下步骤：

a)将样品应用于含一种固体和一种液体组分的培养体系，

-其中至少所述固体组分缓冲在pH 5.0至6.0之间，以及

-其中所述固体组分包含至少10％血清或至少7.5％血液，以及

-其中所述固体和液体组分包含用于苛求菌生长的营养素，以及

-其中所述固体和/或液体组分包含至少一种抑制不同于所培养的螺杆菌的真菌和/或革兰氏阳性和/或革兰氏阴性微生物生长的选择性物质，

所述方法进一步包括以下步骤

b)将所述样品在微氧条件下在这一体系中培育。

使用上述用于螺杆菌分离和培养的方法，可以从胃的材料的样品中获得真正的螺杆菌、尤其是暂定猪螺杆菌的分离株。此外，本发明的方法使大批量体外培养成为可能。具体地说，可以获得能够传代的、更优选传代至少一次、更优选传代至少两次、或至少5到10次，并且/或能在培养物中(即体外)保持至少24小时、更优选至少2天、最优选至少10到25天的培养物。已经证实，通过使用本发明的方法，涂布在10cm细菌平板上的约1mL胃粘液在3天内产生约10⁶到10⁹细菌/mL之间的培养物。传代时可以将培养物1到5倍稀释。因此，即便使用小规模体系，也可以达到高产率。然而在大规模生产中，产率可以进一步提高。

本发明的方法首次使得大量真实的螺杆菌分离株、尤其是暂定猪螺杆菌的产生成为可能。因为使用所分离的暂定猪螺杆菌或由此获得的抗原制剂可以进行疫苗生产，这是重要的。

因此，本发明的另一个方面涉及将通过这里所描述的方法获得的暂定猪螺杆菌用于可作为疫苗使用的抗原性制剂的生产。事实上，本发明首次使得基于纯粹的暂定猪螺杆菌分离株的疫苗生产成为可能。

本发明的上下文中所设计的暂定猪螺杆菌分离株的抗原制剂包括全细胞细菌制剂和暂定猪螺杆菌的组分的制剂。这样的抗原制剂可以包含完全杀死的(灭活)细菌、活的减毒(弱化的)细菌或经加工和/或人造细菌制剂或其组合。经加工的细菌制剂包括部分或完全纯化和/或预处理的细菌蛋白质制剂。这些制剂可以单独或与人造抗原制剂(例如部分或完全通过合成或重组方法获得的蛋白制剂)组合使用。

根据一种具体实施方式，本发明所提供的抗原制剂包括从暂定猪螺杆菌分离株获得的一种或多种抗原。使用从分离株获得的抗原制剂的优点是纯度，这降低了被其他生物或细菌的抗原性混合物污染的机会，当注射于人体或其他动物时，这样的污染会增加抗原性制剂产生有害副作用的风险。

根据一种具体实施方式，所述抗原制剂是暂定猪螺杆菌的一种细胞溶解物，即细菌细胞溶解获得的混合物。细菌细胞溶解物的一个具体例子是超声破碎的细菌培养物的可溶组分(例如过滤后所获得的)。另外或此外，可以使用高压匀质机(例如Avestin的EmulsiFlexC5型号)破碎细菌。

可选地，通过各种已知方法之一，超声破碎前或之后进一步灭活细胞溶解物，这些方法例如但不限于用福尔马林、二乙烯亚胺(BEI)、β-丙内酯(BPL)、戊二醛、放射线或热处理。通常溶菌物中不是所有的蛋白质会激发免疫应答。另外，本发明所述的抗原制剂是通过对溶菌物或细菌培养基中的一种或多种蛋白质进行分级和/或纯化以获得富集的或纯化的抗原的组合物而获得的。适用于本发明上下文中的分离或纯化的细菌蛋白质的例子是热休克蛋白质和/或脲酶蛋白质、cagA和vacA。

因此，本发明的另一个方面提供了含有如上所述从暂定猪螺杆菌中获得的抗原制剂的疫苗。本发明含有暂定猪螺杆菌分离株的抗原制剂的疫苗可以用于对螺杆菌、尤其是暂定猪螺杆菌引起的感染获得预防性或治疗性免疫。

本发明的疫苗可选地仅含有本发明所述的抗原制剂。另外，除了本发明的抗原制剂，所述疫苗还可以包含适当的佐剂。例如，本发明所述疫苗中的抗原制剂可以在脂质体、优选中性或阴离子脂质体、微球体、免疫刺激复合物(ISCOM)或类病毒颗粒(VLP)中进行配方或与之配伍，以促进对蛋白质或多肽的屏蔽保护或增强免疫应答。精通本领域的人员可以毫无困难地获得这些复合物；例如参见《脂质体：实践方法》(Liposomes：A Practical Approach).RRC新编，IRL出版社(1990))。

也可以使用不同于脂质体的佐剂。大量佐剂对于精通本领域的人员而言是已知的。根据抗原制剂的类型和所使用的给药途径，佐剂的种类会有所不同。根据本发明的一种具体实施方式，抗原制剂是一种与作为佐剂的霍乱毒素(CT)一同鼻内给药的或与作为佐剂的皂角苷一同皮下给药的超声破碎的抗原溶液。疫苗组合物中可以使用本领域内已知的任何佐剂，这包括诸如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂的油基佐剂、基于霉菌酸酯的佐剂(例如海藻糖二霉菌酸酯)、细菌脂多糖(LPS)、肽聚糖(即胞壁质、黏肽或诸如N-Opaca的糖蛋白、胞壁酰二肽(MDP)或MDP类似物)、蛋白聚糖(例如从克雷伯氏肺炎菌(Klebsiellapneumoniae)中提取的)、链球菌制剂(例如OK432)、Biostim^TM(例如01K2)、EP109 942、EP 180 564和EP 231 039中的免疫刺激复合物(ISCOM)、氢氧化铝、皂角苷、DEAE-葡聚糖、中性油(如米格莱科(miglyol))、植物油(如花生油)、脂质体、

聚醇。佐剂包括但不限于RIBI佐剂系统(瑞比公司(Ribi Inc.))、明矾、氢氧化铝凝胶、胆固醇、水包油乳剂、油包水乳剂(如完全和不完全弗氏佐剂)、嵌段共聚物(佐治亚州亚特兰大的赛特莱公司(CytRx，Atlanta GA))、SAF-M(加州艾默维尔的希龙公司(Chiron，Emeryville CA))、

佐剂、皂角苷、Quil A、QS-21(马萨诸塞州剑桥的剑桥生物科技公司(CambridgeBiotech Inc.，Cambridge MA))、GPI-0100(阿拉巴马州伯明翰的格林制药公司(Galenica Pharmaceuticals，Inc.，Birmingham，AL))或其他皂角苷分馏物、单磷酰脂质A、阿夫立定脂质-胺(Avridine lipid-amine)佐剂、大肠杆菌热不稳定内毒素(重组的或其他形式的)、霍乱毒素、或胞壁酰二肽及其他。根据一种具体实施方式，在注射动物之前，在抗原制剂中添加大肠杆菌热不稳定毒素的重组突变体。

对于非肠道给药，可以添加诸如氢氧化铝、磷酸铝和氢氧化磷酸铝等具体成分。所述抗原制剂的一种或多种抗原可以按照常规方法吸附或沉积在一种铝化合物上。可以用于非肠道给药的其他佐剂包括例如聚膦腈(WO 95/2415)、DC-chol(3-β-[N-(N′，N′-二甲氨基甲烷)氨甲酰基-胆固醇)(](美国专利No.5,283,185和WO 96/14831)、QS-21(WO 88/9336)以及RIBI。

本发明所述疫苗的成分可以按照常规生产。例如，本发明所述组合物中所包含的一种多肽、一种混合物或一种DNA分子与例如水或诸如磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)的一种盐溶液的制药上允许的稀释剂或载体组合使用。通常，所述稀释剂或载体在给药模式和途径以及标准的制药实践的基础上加以选择。雷明顿制药科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)中描述了制药上允许的稀释剂和载体及其在药物配方中使用所必需的所有内容。

本发明的疫苗可以是固体或液体形式的，例如药片、胶囊、粉末、溶液、悬液或乳剂。

固体单位剂量形式可以是常规类型的。固体形式可以是胶囊，例如包含本发明的蛋白质或肽以及载体(例如润滑剂和诸如乳糖、蔗糖或玉米淀粉的惰性填充物)的普通明胶类型。在另一种实施方式中，通过诸如乳糖、蔗糖或玉米淀粉的常规药片基材与诸如阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶的粘合剂、诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉或褐藻酸的崩解剂以及如硬脂酸或硬脂酸镁的润滑剂的组合使用，将这些化合物制成片剂。

通过将这些材料的溶液或悬液置于含有药物载体的生理学上允许的稀释剂中，本发明的疫苗也可以以注射剂量形式给药。这样的载体包括诸如添加了或没有添加表面活性剂和其他制药上允许的佐剂的水或油的无菌液体。例如，所述的油可以是石油、动物、植物或合成来源的油，诸如花生油、大豆油或矿物油。通常，水、盐溶液、葡萄糖水溶液和相关的糖溶液、以及诸如丙二醇或聚乙二醇的二元醇是优选的液体载体，尤其对于注射用溶液而言。

对于作为气雾剂使用，含有位于溶液或悬液中的抗原制剂的本发明的疫苗可以与适当的压缩气体(例如碳氢化合物压缩气体，如含常规佐剂的丙烷、丁烷或异丁烷。)共同包装在增压气雾剂容器中。本发明的材料也可以以非增压形式(如雾化器或喷雾器中)给药。

含有暂定猪螺杆菌抗原制剂的疫苗可以用于自体疫苗接种或异源疫苗接种。在使用本发明的疫苗进行自体疫苗接种时，目的是对暂定猪螺杆菌引起的感染提供保护。在异源疫苗接种时，目的是通过注射含暂定猪螺杆菌的抗原性制剂，对一种或多种其他的螺杆菌引起的感染提供保护。

因此，本发明进一步的一个方面提供了使用本发明的疫苗对人或其他动物进行疫苗接种的方法。使用本发明所述获得自暂定猪螺杆菌的疫苗的接种方案的目标包括在动物中获得了针对螺杆菌、尤其是针对暂定猪螺杆菌的完全保护(灭菌免疫性)，但也包括与接种前相比，以及/或与没有接受本发明的疫苗并遭受/已遭受相同感染性物质感染的动物相比，将螺杆菌、尤其是暂定猪螺杆菌的细菌负荷降低至少25、40、60、80％。最具体地，本发明涉及在延长的时间段内(例如至少4、6、10、12周或12周以上)确保保护作用或降低的细菌负荷的疫苗和接种策略。

本发明疫苗的给药可以是单次剂量的或在某一时间段后重复一次或几次的剂量。合适的剂量随各种参数而有所变化，正如精通本领域的人员能够确定的，这些参数包括例如所治疗的个体(成人或儿童)；疫苗抗原本身性质；给药模式和频率；是否存在佐剂；以及如果存在佐剂，佐剂的类型和所需的效果(例如保护或治疗)。例如，在使用含有灭活的完整“暂定猪螺杆菌”的抗原制剂的情况下，适当的剂量包括但不限于10μg、50μg、100μg、250μg、500μg和1mg抗原制剂。另外，剂量可以用CFU表示，100μg对应约10⁷CFU。粗抗原制剂(即含有微量培养基等)可能比部分纯化或纯化的制剂需要更高的剂量以产生效果。

疫苗接种方法可以包括在将含本发明所述的暂定猪螺杆菌的疫苗给药前或给药后(口服)给予人或动物一种或多种组合物。这样的组合物包括降低胃中酸产生的化合物(例如西咪替丁(

比利时加弗的葛兰素史克公司(GlaxoSmithKline；Genval，Belgium)))。

可以用多种方法进行动物中感染和/或细菌负荷的鉴定和量化。传统上这通过确定体液、尿液或粪便样本中感染性物质、或其一种蛋白质或DNA序列的存在来进行。另外，可以检测免疫系统的反应，例如存在针对感染性物质的抗体。根据本发明的一种具体实施方式，通过例如采用本领域中所述的PCR(Fox和Lee(1997)Lab.Anim.Sci.47，222-255)鉴定暂定猪螺杆菌DNA实现对螺杆菌的精确诊断和定量。另外，一种定量的脲酶检测被用于暂定猪螺杆菌定量。简而言之，将黏膜组织样品(约0.5cm²)浸入1000μl CUTest溶液(德国马尔堡的戴姆勒制药公司(Temmler Pharma；Marburg，Germany))并37℃培育约3小时(如Corthésy-Theulaz等，(1995)，Gastroenterology 109，115-121所述)。离心后将上清液在550nm的光密度(OD)处进行分光光度定量。针对每个胃部区域计算用于区分是否感染的临界点并等于平均值加上由未攻击的对照动物的胃组织切片样本获得的吸光值的两倍标准差(SD)。大于这一临界点的值作为暂定猪螺杆菌集落化生长的证据。

如上所详细描述的，设计了本发明所述疫苗在自体接种和异源接种方案中的应用。根据一种实施方式，提供了用于治疗和/或预防人和/或其他动物的由一种或多种不同螺杆菌(可选地包括暂定猪螺杆菌)引起的感染的方法。本发明的具体实施方式涉及使用得自暂定猪螺杆菌分离株的疫苗以获得对其他螺杆菌(例如但不限于幽门螺杆菌(H.pyloris)、H.bizzozeronii、猫螺杆菌(H.felis)和H.salomonii)的预防性或治疗性免疫性。其他适当的螺杆菌有胆汁螺杆菌(H.bilis)、芬纳儿螺杆菌(H.fenelliae)、帕美特螺杆菌(H.pametensis)、猕猴螺杆菌(H.nemestrinae)、猕猴螺杆菌(H.nemestrinae)、帕美特螺杆菌(H.pametensis)、猎豹螺杆菌(H.acinonychis)、幼禽螺杆菌(H.pullorum)、鼬鼠螺杆菌(H.mustelae)、肝螺杆菌(H.hepaticus)、同性恋螺杆菌(H.cinaedi)和犬螺杆菌(H.canis)。

根据一种具体实施方式，本发明提供了针对暂定猪螺杆菌感染的预防性和/或治疗性保护的方法，所述方法包括给予得自暂定猪螺杆菌分离株的本发明所述的疫苗。更具体地说，提供了在预防性接种中使用的抗原制剂，它确保提供针对螺杆菌、尤其是针对暂定猪螺杆菌的保护，这种保护不是暂时性的。

当所述微生物已经将宿主免疫应答调整至对它们有利的方向的情况下，本发明的具体实施方式也提供了用于治疗性免疫的方法。

本发明的免疫方法包括通过任何适当途径给予疫苗的方法，例如通过黏膜(鼻内)、非肠道或肌内给药、口服、皮内、腹膜内、静脉内、透皮或皮下给药。适当的接种途径也包括组合给药(例如口服/肌内给药)。根据本发明的具体实施方式，通过本发明所述疫苗或抗原制剂的非肠道给药进行治疗性免疫。非肠道给药可以调动还未在螺杆菌感染所引起的一个特定方向上启动的全身来源的细胞(Guy等，(1999)Vaccine 17，1130-1135)。根据本发明的另一种具体实施方式，肌内给药用于有效接种。

通过但不限于以下详细描述的实施例对本发明的不同方面进行举例说明。

实施例

实施例1：暂定猪螺杆菌的体外分离和培养

在这一实施例中，使用一种双组分体系分离“暂定猪螺杆菌”，其中固体组分是布氏琼脂平板。

布氏琼脂平板(比利时BD公司(Becton-Dickinson，Erembodegem，Belgium))中补充了Vitox补充物(英国奥氏公司(Oxoid，Basingstoke，UK))、Skirrow补充物(奥氏公司)、20％胎牛血清(FCS；英国QB公司(QB Perbio Tattenhall，UK))、0.1％活性炭GR(AC；德国默克公司(Merck，Darmstadt，Germany))、0.00001％结晶紫(英国CT公司(Clin-Tech Ltd，Essex，UK))和0.001％乳链菌肽(Nisin)(美国密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma-Aldrich，St-Louis，Mo，USA))。高压灭菌后但在琼脂凝胶化之前，在500mL布氏琼脂中加入0、0.2、0.5和0.7mLHCl溶液(最少37％；德国RH公司(Riedel-de

，Seelze，Germany))，这分别形成7.0、6.3、5.5和5.0的pH值。除非另有说明，含血清的布氏平板含20％血清。

在这一实施例中，双组分体系中的液体组分是没有添加其他补充物、血清和没有调节pH的布氏肉汤。

第0天

从屠宰场(比利时则勒的PMNV工厂(Porc Meat N.V.，Zele，Belgium))收集了5个猪胃(A到E)并在进一步使用前+4℃保存。将其在胃大弯处剖开并用自来水冲洗。胃的一半进行酸处理(在1％的HCl浴中浸泡1小时)。随后，通过用玻片刮胃仅收集表面粘液。所述粘液收集在无菌试管中。猪胃粘液的显微镜检查显示，所有胃为暂定猪螺杆菌阳性。

用含有20％血清的布氏肉汤(体积约5mL以下)轻微液化所述粘液并接种在补充了血清的pH为5.0、5.5、6.3和7的4块布氏琼脂平板上。所述样品接种在平板中间，并随后在粘液样品的中间滴加3滴布氏肉汤(约150μL)。

每只猪的总共4块平板在微氧空气中37℃培育过夜。通过抽出80％正常空气并导入8％ CO₂、8％ H₂和84％ N₂的混合气体建立所述微氧环境。

第1天

对5个胃样品中的4个成功进行了运动的螺旋形细菌(说明存在螺杆菌)的初步分离。对于胃D，在第1天生长不充分。干燥的平板用含血清的布氏肉汤轻微湿润。

第2天

对于所有的胃观察到，其中琼脂的pH为7和6.3的平板被其他细菌污染。对来自这些平板的肉汤进行过滤(使用0.65μm孔径的滤器)并在相同pH的新的琼脂平板上传代。

只有一些pH 5.5或5.0的平板受污染，在这种情况下也对肉汤进行过滤并在新的平板上传代。在没有发现污染的情况下，将平板进一步培育。这是pH 5.0的胃样品D和E的情况。

在0.65μm孔径滤器的孔径太小导致培养基堵塞滤器的情况下，使用0.80μm滤器进行过滤。这是pH 7、6.3和5.5的胃样品E的受污染平板的情况。

第3天

那些用在第2天经过滤的培养基接种的平板，污染菌的生长大部分是阴性的。

对来自胃E的最初没有受污染、未过滤的pH 5.0的平板进行了显微镜分析，并显示出大量具有显著运动性的暂定猪螺杆菌，估计其数量约为10⁸或10⁹/mL。所述肉汤培养基(约500μL)转移至新的pH 5的琼脂培养基上。

第4天

胃E的最初pH 5.0平板及其传代平板长满了污染物。使用0.65μm孔径滤器将来自这些平板的肉汤转移至新的琼脂平板上。

其他胃的许多平板也受到了污染并废弃。来自胃A的两个过滤-传代平板细菌污染为阴性并进一步培育。来自胃B、C和E的一个过滤-传代平板为阴性并进一步培育。

来自胃D的pH 5.0平板的污染细菌生长仍为阴性并进一步培育。

第5天

所有在第4天暂定猪螺杆菌阴性的过滤-传代平板仍为螺杆菌阴性，并进一步培育。一些平板显示出污染细菌。

第7天

来自胃D的pH 5.0平板顶部的肉汤显示出有活力的、运动的暂定猪螺杆菌，估计其数量为10⁶/mL。没有看到粘液受其他细菌污染。这一平板进一步培育。

第8天

来自胃D的pH 5.0的最初平板显示出暂定猪螺杆菌菌体的进一步生长。将所述肉汤转移至新的pH 7的平板。在原始平板上添加500μL含血清的布氏肉汤。

第11天

样品D在第8天在pH 7的平板上的传代为螺杆菌生长阴性。pH 5.0的原始平板仍然显示出暂定猪螺杆菌的活力培养物(估计为10⁸细菌/mL)。将此肉汤转移至pH 5.0平板，并添加等量的含血清布氏肉汤。

在原始平板上添加500μL含血清布氏肉汤。

第13天

第11天在pH 5.0平板上的传代成功获得源自样品D的分离株。肉汤含运动的螺杆菌(估计为10⁸细菌/mL)。将肉汤再次转移至pH 5.0平板，而首次传代的平板用1mL含血清的布氏肉汤湿润。样品D的原始平板上的肉汤也含有活力培养物，将其中约200μL在等量LYM(1/4 BHI肉汤+3/4马血清+7.5％(重量体积比)葡萄糖)中-70℃冻存。进一步培育前再次加入500μL含血清布氏肉汤。

在第4天在pH 5平板上过滤传代的胃B和C的样品显示为暂定猪螺杆菌弱阳性。

第14天

将第13天冷冻的培养物D解冻并涂布于pH 5的补给性布氏琼脂平板，并在微氧空气中培育。

第15天

样品D的第二次传代培养物为暂定猪螺杆菌阳性(估计10⁸细菌/mL)。将这一平板的肉汤(约500μL)以及原始样品D pH 5.0平板的肉汤加入等体积的布氏肉汤、3体积的FCS和7.5％(重量体积比)葡萄糖中并-70℃冷冻。

第一次传代培养物含有更多的肉汤(约1mL)并在两块pH 5的新鲜的琼脂平板上传代。添加等量的含血清的布氏肉汤。

样品B的过滤传代培养物仍为螺杆菌弱阳性，而C的过滤传代培养物含有约10⁶细菌/mL。这些平板用含血清的布氏肉汤稍加湿润。

第17天

样品D的原始pH 5.0平板再次为螺杆菌阳性，但其活动性较低。由于琼脂培养基或许耗尽了，再次将肉汤转移至新鲜的含培养基的琼脂平板(pH 5)并废弃原始平板。

样品D的第二次传代培养物是阳性的并将肉汤再次转移至新的琼脂平板，并且用补给性布氏肉汤再次湿润平板并进一步培育。

将B和C的过滤传代平板的肉汤转移至新的pH 5的琼脂平板。在原始平板上添加含血清的布氏肉汤。

第19天

从源自胃D(分离株HS1)、C(分离株HS2)和B(分离株HS3)的培养物中取样。使用DNeasy Tissue kit(恰根公司(Qiagen))试剂盒从细菌中抽提DNA。使用暂定猪螺杆菌特异性引物(De Groote等，1999 Bacteriology 49，1769-1777；2000 J.Clin.Microbiol.38，1131-1135)进行PCR。琼脂糖凝胶电泳显示，所有三种分离株具有433bp长的PCR片段。小鼠体内传代的暂定猪螺杆菌培养物的DNA用作阳性对照。

在第14天用解冻的HS1材料接种的平板为暂定猪螺杆菌阳性。将肉汤转移至两块新的平板(第二次传代)。

HS1的第二次传代培养物与等量的1体积布氏肉汤、3体积FCS、7.5％(重量体积比)葡萄糖混合并-70℃冷冻。

来自HS1的第三次传代培养物的肉汤是阳性的并将其转移至新的平板。

第20天

对于HS2和HS3，来自第二次传代培养物的肉汤与等量的1体积布氏肉汤、3体积FCS、7.5％(重量体积比)葡萄糖混合并-70℃冷冻。

第22天

在用HS1的解冻材料接种的平板上，暂定猪螺杆菌没有更进一步生长。然而，这一分离株第19天的传代培养物显示出更多的螺杆菌。

来自原始培养物的第19天的第四次传代培养物没有显示出具有很多细菌。

源自C和D的培养物在第17天的第二次传代培养物显示具有许多暂定猪螺杆菌。样品C(HS2)的肉汤转移至两块新的平板，并加入等体积的补给性布氏肉汤。样品B(HS3)的肉汤转移至一块新的平板，并加入等体积的补给性布氏肉汤。

第25天

对于HS1，第15天的第二次传代培养物显示出极少的暂定猪螺杆菌。所有肉汤转移至新鲜琼脂平板(pH 5.0)并废弃老的平板。

第17天的第三次传代培养物和第19天的第四次传代培养物是阴性的，将其废弃。

在第14天用HS1的解冻材料接种的平板显示出暂定猪螺杆菌培养物的生长，将此肉汤接种在两块新的含布氏肉汤(含血清的)的平板上。这一分离株在第19天的第二次传代培养物也各自接种在两块新的平板上。

对于HS2和HS3，第17天的第二次传代培养物显示出较低运动性的螺杆菌。平板显示出透明区域，可能是耗尽了培养基。所有肉汤转移至新的平板，并废弃老的平板。第三次传代培养物显示出生长良好的培养物，将每种分离株的这些培养物转移至两块新的平板。

第27天及以后

来自HS1第三次和第四次传代培养物的肉汤在等体积的1体积布氏肉汤、3体积FCS和7.5％(重量体积比)葡萄糖中冷冻。第22天的第二次传代培养物的肉汤接种在新的琼脂平板上。

对于HS2和HS3，将第三次和第四次传代培养物接种在新的琼脂平板上。将培养物每2或3天连续传代，并将肉汤培养物如上所述定期冷冻。

使用与保守端互补的引物扩增HS1、HS2和HS3分离株的16S rRNA。如先前所述(Baele等(2001)J.Appl.Microbiol.91，488-491)，使用共有引物αβ-NOT(5’-tcaaactaggaccgagtc-3′)[SEQ ID NO：1]和ωMB(5’-taccttgttacttcacccca-3′)[SEQ ID NO：2]。按照Coenye等所述(Coenye等，(1999)Int.J.Syst.Evol.Microbiol.49，405-413)，使用引物pD(5’-cagcagccgcggtaatac-3′)[SEQ ID NO：3]、γ*(5’-ctcctacgggaggcagcagt-3′)[SEQ ID NO：4]、3(5’-gttgcgctcgttgcgggact-3′)[SEQ ID NO：5]和O*(5’-aactcaaaggaattgacgg-3′)[SEQ ID NO：6]对这一PCR反应中所扩增的1500bp扩增子进行测序。使用ABI Prism^TM3100遗传分析仪(比利时应用生物系统公司(Applied Biosystems，Lennik，Belgium))进行序列分析，并使用BLAST工具将序列与Genbank比对。该序列与GenBank中的暂定猪螺杆菌序列(AF127028)具有99％的相似性。

在如上所述的实验设置中，在含有较低pH值(5.0或5.5)的培养基的平板上，初步分离最为成功。在这些条件下，减少了污染细菌的生长。

从胃E中分离暂定猪螺杆菌是成功的。在接种后第3天，在显微镜下看到了约10⁸或10⁹/mL的纯培养物。在将肉汤转移至新的琼脂平板时，在粘液上生长的污染物与含螺杆菌的肉汤相混合是不可避免的。

获得了来自胃B、C和D的暂定猪螺杆菌纯培养物。种特异性PCR扩增的16S rDNA片段证实了对种的鉴定。完整16S rDNA基因的测序显示了与GenBank中暂定猪螺杆菌序列99％的相似性。

对于源自样品D的分离株HS1，培育7天后获得了对暂定猪螺杆菌的纯肉汤培养物的初步分离。将肉汤转移至含相同培养基的pH 7的平板上导致不生长。传代至pH 5.0的平板是成功的。具有活力和运动性螺杆菌的肉汤分成等体积的两份并转移至两块新鲜的琼脂平板上。补充等量的布氏肉汤(含20％FCS)导致细菌的良好生长。

可以将暂定猪螺杆菌细胞在等量的1体积布氏肉汤、3体积FCS和7.5％(重量体积比)葡萄糖中于-70℃冷冻。将冷冻的小瓶解冻后，暂定猪螺杆菌成功地在相同培养基上再次生长。

对于分别源自胃B和C的分离株HS2和HS3，pH 5.0的培养基上的初始培养物受到了其他细菌的轻度污染。随后将肉汤经0.65μm孔径滤器过滤并接种在新的pH 5的琼脂平板上。培育11天后，这些平板显示为螺杆菌生长阳性。再培育4天后，肉汤包含了足以进行菌株传代的螺杆菌。培育后5和3天分别获得了第二次和第三次传代培养物。

实施例2：温度和环境对暂定猪螺杆菌生长的影响

在这一实验及所有以后的实验中，考察了对暂定猪螺杆菌分离株HS1、HS2和HS3的培养基和生长条件的最优化。这些菌株的分离的详情见实施例1。

将分离株HS1和HS3各自接种在六块如先前实施例中所述的布氏琼脂平板(即含20％ FCS并调节至pH 5.0)上。用添加了Vitox补充物、两性霉素B、20％ FSC和每500mL肉汤0.7mL HCl(导致pH为5)的布氏肉汤覆盖平板。

将三块平板在使用Campygen^TM 2.5L(奥氏公司)系统在广口瓶中所建立的微氧环境中分别在37℃、25℃和42℃培育。

其他三块平板分别在37℃的有氧、无氧和补充了5％ CO₂的空气中培育。

培育6天后，通过显微镜检测考查上层肉汤中的细菌生长。

在补充了5％ CO₂的环境和有氧空气中没有实现生长。在无氧环境中，只看到了很少的细菌。在微氧条件下，在37℃时观察到良好的生长，而25℃或42℃时没有生长。

实施例3：活性炭和生长因子对暂定猪螺杆菌生长的影响

在补充了Vitox补充物、Skirrow补充物、两性霉素B和20％胎牛血清、pH调节为5.0的马-欣二氏琼脂平板上接种分离株HS1和HS3。

向这些平板添加以下成分。一种平板(MH1)额外含Vitox补充物但不含活性炭。另一种平板(MH2)额外含活性炭但不含Vitox补充物，而第三种平板(MH3)含Vitox补充物和活性炭。

在闭合回路中微氧条件下37℃培育3天和7天后，通过显微镜检测考查上层肉汤的细菌生长，其中微氧条件是通过抽出80％正常空气并导入8％ CO₂、8％ H₂和84％ N₂的混合气体建立的。

培养基MH1和MH3显示出分离株HS1和HS3的良好生长。在MH2上，没有观察到任何一种分离株的生长。

在使用马-欣二氏培养基的情况下，Vitox生长补充物的省略阻碍细菌生长，而活性肽的存在与否没有作用或作用很小。

实施例4：其他营养素组合物对暂定猪螺杆菌生长的影响

在本实验中，马-欣二氏琼脂或布氏琼脂被另一种称为牛脑心浸液(BHI)琼脂平板的用于苛求菌的培养基所替代。这些平板补充了Vitox补充物、Skirrow补充物、两性霉素B和20％胎牛血清，并用浓盐酸调至pH 5。

平板用补充了20％胎牛血清的BHI肉汤覆盖。这些分离株HS1和HS2的平板在37℃的微氧环境中培育4天后，通过对上层肉汤的显微镜检测证实了细菌生长。

实施例5：平板中血清对暂定猪螺杆菌生长的影响

在a)补充了Skirrow补充物、两性霉素B、用浓盐酸调节至pH 5.0的马-欣二氏琼脂平板和b)与a)中相同但额外包含了20％ FCS和vitox培养物的平板上接种分离株HS1。

用补充了Vitox补充物、Skirrow补充物、两性霉素B、20％ FCS、并用浓盐酸调节至pH 5.0的马-欣二氏肉汤覆盖平板。

在平板a)或b)上37℃微氧环境培育3天后，通过肉汤的显微镜检测考察细菌生长。仅在琼脂中不含血清的平板上观察到菌球形式(a)。在含常规量20％FCS的平板上实现了HS1的良好生长(b)。

随后将分离株HS1接种在c)补充了Skirrow补充物、两性霉素B、用浓盐酸调节至pH 5.0的马-欣二氏琼脂平板上，并用补充了Vitox补充物、Skirrow补充物、两性霉素B、40％ FCS并用浓盐酸调节至pH 5.0的马-欣二氏肉汤覆盖。

在平板c)上37℃微氧环境培育4天后，通过肉汤的显微镜检测考察细菌生长。再次只观察到菌球形式。

实施例6：血液对暂定猪螺杆菌生长的影响

通过用10％绵羊血或10％马血替代平板中的20％血清评估了代替血清的血液的应用。平板的pH用浓盐酸调节至pH 5.0。

用马-欣二氏肉汤覆盖平板。

在微氧环境中37℃培育4天后，通过对上层肉汤的显微镜检测考察细菌生长。

无论所使用的血液来源，实现了两种分离株的非常良好的生长，这说明血液可以代替血清在培养基中添加。

实施例7：血液浓度对暂定猪螺杆菌的影响

在补充了Vitox补充物、Skirrow补充物、两性霉素B和不同量马血(2.5％、5％、7％、10％和15％(体积比))的马-欣二氏琼脂平板上接种分离株HS1。用浓盐酸将平板pH调节为pH 5.0。

用不含其它补充物的马-欣二氏肉汤覆盖平板。

在微氧环境中37℃培育3天后，通过肉汤的显微镜检测考察细菌生长。在含2.5％、5％或7％马血的平板上，只看到了菌球形式。在含10％或15％马血的平板上观察到了暂定猪螺杆菌的生长。随后，通过接种1mL培养物并添加1mL新鲜肉汤，将含10％和15％血液的平板的肉汤在含有2.5至15％之间血液浓度、含相同培养基的新的琼脂平板上亚培养。平板在相同条件下再培育3天。再次只在含10％或15％马血的平板上观察到了有活力的培养物。

实施例8：pH对暂定猪螺杆菌生长的影响

在补充了Vitox补充物、Skirrow补充物、两性霉素B和20％ FCS、并调节至不同pH值的马-欣二氏琼脂平板上接种分离株HS1。

用补充了Vitox补充物、Skirrow补充物、两性霉素B和20％ FCS、用浓盐酸调节至不同pH值的马-欣二氏肉汤覆盖平板。琼脂和肉汤的具体pH组合见表1。

在微氧环境中37℃培育3天后，通过对肉汤的显微镜检测考察细菌生长。随后，通过接种1mL培养物并添加1mL相同pH值的新鲜肉汤将肉汤在新的琼脂平板上亚培养。培育2天后评估初始培养物和亚培养物。

将第一次的亚培养物再次如上所述转移至新的琼脂平板。分别在培育4天和7天后考察细菌生长。

在pH 5.3和4.8的培养基上的第二次亚培养物转移至新鲜琼脂平板上。pH4.75、4.5、4.4和4的培养基上的第一次的亚培养物也转移至新鲜平板。分别在培育3天和7天后考察细菌生长。

表1.在不同pH值的马-欣二氏培养基上亚培养后猪螺杆菌分离株HS1的生长

ND：未进行；++++：生长非常好；+++：生长良好；++：生长中等；+：生长微弱；+/-很少细菌；-：没有生长

所使用的分离株(HS1)不能在pH低于4(pH 3.5或3.7)的培养基上生长。在pH值介于4到7之间的培养基上获得了原代培养物。在这些平板上的亚培养获得了成功，然而，反复的亚培养仅在pH值介于4.7到6之间的培养基上获得成功。暂定猪螺杆菌可以在pH 4.5到6.0之间的培养基上生长，其最优pH值为4.7和5.5。

总而言之，暂定猪螺杆菌在37℃微氧条件中在双组分体系上具有最佳生长。固体组分包含补充了胎牛血清或血液、生长补充物并调节至pH 5.0的用于苛求微生物的培养基(诸如布氏琼脂、脑心浸液琼脂或马-欣二氏琼脂)。用液体组分覆盖平板，所述液体组分是包括或不包括生长补充物、血清或pH调节的用于苛求微生物的生长培养基肉汤(诸如布氏肉汤、脑心浸液肉汤或马-欣二氏肉汤)。

实施例9：使用从暂定猪螺杆菌分离株获得的暂定猪螺杆菌抗原对猪进行疫苗接种

使用超声破碎滤出液确定暂定猪螺杆菌疫苗的安全性和有效性。暂定猪螺杆菌抗原通过超声破碎灭活并裂解，随后进行无菌过滤并与水包油乳液佐剂配制。在所存在的总蛋白量的基础上确定抗原剂量。

研究设计

通过对屠宰场的猪群的胃进行PCR和脲酶筛选，从优选没有暂定猪螺杆菌感染的猪群中选取母猪。随后将这些母猪的小猪分成三组：盐水对照组、暂定猪螺杆菌疫苗组和第三组(NTX；未治疗的并用正常食物喂养)。本研究是完全随机设计，并且每只动物作为实验单位。断奶后对母猪实施安乐死，并通过PCR对胃中是否存在猪螺杆菌进行分析。任何发现其胃中猪螺杆菌PCR阳性的母猪的小猪从研究中剔除。

表2.研究设计

治疗	疫苗	方案	接种年龄^#	攻击
治疗	疫苗	方案	接种年龄^#	攻击	T01	盐水	IM	1，3，5周	5，6，7，8周
T02	猪螺杆菌	IM	1，3，5周	5，6，7，8周	T01	盐水	IM	1，3，5周	5，6，7，8周
T02	猪螺杆菌	IM	1，3，5周	5，6，7，8周	NTX⁺	NA	NA	NA	NA

^#颈部肌内(IM)注射，左侧(第1周)、右侧(第3周)并随后左侧(第5周)交替进行。所有的猪在第14周龄时实施安乐死。

⁺NTX＝未治疗的；在试验过程中用正常食物喂养的对照。

表3.抗原和研究用兽医产品(IVP)制剂

IVP*	抗原剂量	每剂量佐剂^	每剂量体积
IVP*	抗原剂量	每剂量佐剂^	每剂量体积	盐水(PBS)	NA	1mL	2mL
猪螺杆菌	250μg前两次剂量；500μg第三次剂量	1mL	2mL	盐水(PBS)	NA	1mL	2mL

*IVP＝研究用兽医产品

^佐剂-终浓度5％的Amphigen将与抗原1∶1混合。

疫苗接种和攻击

首次接种前一天和解剖尸体时对每只猪称重。在1、3和5周龄时通过颈部肌内注射对猪进行疫苗接种。对照猪在同一时间用等体积的盐水接种。疫苗接种1天前和两天后并在接种后1小时内观察猪的临床体征。首次接种日、第3次接种后两周、以及尸体解剖前从每只猪收集血样(在血清分离试管中收集约2-10mL)用于暂定猪螺杆菌血清学分析。分离后，将血清置于至少两个低温剂量瓶中。将血清样本-20℃冷冻用于随后的暂定猪螺杆菌特异性抗体ELISA分析。

为了进行猪螺杆菌攻击，使用已经检测为猪螺杆菌阳性(通过脲酶测试)的胃样品腔的上部细胞层刮取物和粘液的匀浆。为了证实用作攻击材料的猪胃匀浆的生命力和剂量，用试样量的每种攻击材料对未受猪螺杆菌感染的5周龄雄性SPF BALB/c小鼠给药。两周后杀死小鼠并通过脲酶和PCR对胃内容物中是否存在猪螺杆菌进行筛选。

攻击后方法和评分

为了确定感染，切开肠道并对食管部的黏膜表面进行显微镜检测。使用Hessing等人(1992，Tijdschrift voor Diergeneeskunde 117，445-450)的方法对损伤进行5分制评分。简而言之，评分记录如下：0＝完整黏膜；1＝轻微的过度角化(＜50％表面积)；2＝严重的过度角化(≥50％表面积)；3＝过度角化及一些小的侵蚀(小于5处并短于2.5cm)；4＝过度角化和广泛的侵蚀(大于5处侵蚀并/或长于2.5cm)；5＝过度角化和很大的侵蚀(大于10处侵蚀或长于5cm)以及/或溃疡。也使用0-100mm的直观类比标度对每个胃进行评分，其中0＝无损伤，100＝穿孔性溃疡。

评分后，通过PCR、定量脲酶测试和组织学对每个胃的腺状黏膜的几个位点(约0.5cm²)进行取样分析。用于暂定猪螺杆菌特异性检测的PCR如De Groote等(2000，见上文)所述进行。通过这里所述的定量脲酶测试检测细菌负荷。对于组织病理检查，将胃黏膜组织在10％磷酸盐缓冲的福尔马林中固定、按常规方法处理、并在石蜡中包埋。如De Groote等(2000)所述，将一个5μm的切片用多克隆羊抗猪螺杆菌抗体(丹麦DC公司(Dakocytomation，Denmark A/S：Glostrup，Denmark))进行免疫组织化学染色。第二个切片用HE染色用于胃炎评分。针对以下四个方面进行评分：1)淋巴细胞扩散-对于固有黏膜中淋巴细胞扩散渗透的评分；2)在固有黏膜中形成淋巴滤泡；3)在表层上皮细胞下形成淋巴滤包；4)在固有黏膜中浆细胞的扩散渗透的组织病理改变。表层上皮细胞下淋巴滤泡的存在和浆细胞的渗透是非常显著和具有特征性的损伤。根据严重性用0-3的记分对它们进行评分。1＝轻微的，2＝中度的，3＝严重的。也使用直观类比标度(0-100mm)对其评分。

结果

接种的猪的胃组织的每个腔、胃底或贲门的平均脲酶值显著(P＜0.10)低于未接种的猪的对应值。相对于经接种-攻击的猪，未经接种-攻击的猪的暂定猪螺杆菌PCR阳性的胃的百分比显著(P＜0.10)较高。根据PCR和脲酶所测定的结果，NTX猪的胃是阴性的。

次级变量是组织学(淋巴细胞深入和表层滤泡形成以及浆细胞数量)和总的胃溃疡评定分。预计在未免疫接种的攻击的猪中的暂定猪螺杆菌的平均损伤评分会显著大于免疫接种的攻击的猪(P≤0.10)。

实施例10：体外培养的猪螺杆菌的超声破碎滤出液抗原的免疫原性

在实验开始前2-3周，将3周龄的雄性SPF BALB/c小鼠(无螺杆菌属)在高压灭菌的具有顶部过滤器的笼子里圈养(每笼5只动物)，随意用商品化饲料喂养并提供水。分组时，将小鼠在单独的笼子里圈养。

使用这里实施例1中所述的方法分离和培养暂定猪螺杆菌培养物。通过超声破碎细菌悬液并经0.22μm孔径滤器过滤制备抗原。通过Lowry法确定蛋白质浓度。猪螺杆菌制剂浓度为1.838mg/mL。

对于每种疫苗剂量，使用了100μg蛋白质。对于抗原的鼻内(IN)给药，每剂量添加5μg霍乱毒素(西格玛(Sigma))。

从屠宰场收集猪胃并匀浆。这些胃匀浆用于感染BALB/c小鼠以体内繁殖猪螺杆菌。使用在LYM(5mL LYM/胃)中匀浆的完整的脲酶阳性小鼠胃每两周在小鼠内进行传代(这一实施例中所使用的LYM包含2体积马血清、1体积脑心浸液肉汤和10％葡萄糖)。PCR证实了每种传代培养物中存在猪螺杆菌。在10只BALB/c小鼠中进行第4次小鼠传代。将这10只小鼠的脲酶阳性胃集中起来并匀浆。匀浆-70℃冷冻。

冷冻存储物解冻后测定冷冻存储物的滴度。37℃解冻后15分钟，在LYM中进行匀浆的连续稀释并在小鼠中灌胃接种以测定100％小鼠感染剂量水平。按照表4对5只小鼠的组进行疫苗接种和接种。

表4.疫苗接种实验的研究设计

组	IVP	途径	数量	疫苗接种	攻击	*排泄物样品收集	尸检血样
组	IVP	途径	数量	疫苗接种	攻击	*排泄物样品收集	尸检血样	T01	盐水	IN	5	D21，D42	D70	D88-D91	D119-120
T02	SF猪螺杆菌	IN	5	D21，D42	D70	NA	D119-120	T01	盐水	IN	5	D21，D42	D70	D88-D91	D119-120
T02	SF猪螺杆菌	IN	5	D21，D42	D70	NA	D119-120	T03	SF猪螺杆菌	SC	5	D0，D21，D42	D70	NA	D119-120
T10	NVNC	NA	5	D0，D21，D42	D70	D88-D91	D119-120	T03	SF猪螺杆菌	SC	5	D0，D21，D42	D70	NA	D119-120

IVP＝研究用兽医产品

SF＝超声破碎滤出液制剂

SC＝皮下注射；IN＝鼻内给药

NVNC＝未经疫苗接种的、未攻击的小鼠；

NA＝不适用

小鼠胃中的脲酶活性是螺杆菌集落化生长的指标并通过Corthésy-Theulaz等(1995，前文中引用)的方法进行了评价。胃的一半浸入500μL CUTest(戴姆勒制药公司)中并37℃培育3小时。离心(5分钟，100×g)后将上清液用于OD550nm处的分光光度定量。每个实验中计算了临界点的值并等于平均值加上用未免疫的、未攻击的小鼠的胃样品所获得的吸光值的5倍标准差。

用Dneasy Tissue kit(德国希尔顿的恰根公司(Qiagen，Hilden，Germany))试剂盒抽提了黏膜组织样品的DNA。如上所述进行用于猪螺杆菌特异性检测的PCR(De Groote等，2000，前文中引用)。

将疫苗接种小鼠的每个胃组织的平均脲酶值与未经疫苗接种的小鼠的值比较。比较了未经疫苗接种/攻击的小鼠与疫苗接种-攻击的对照之间猪螺杆菌PCR阳性胃的百分比。未攻击的小鼠的胃是PCR和脲酶阴性的。

尸检时取血样用于血清学分析。

T01组小鼠的排泄物样品在D(天)88-D91都是阳性的。T10小鼠的排泄物在D88-D91都是阴性的。

表5中总结了脲酶和PCR测试结果。

表5.用体外培养的猪螺杆菌抗原疫苗接种并用猪螺杆菌攻击的小鼠的脲酶测试和PCR测试结果

组	IVP	平均脲酶值	PCR腔体#	PCR胃底#
组	IVP	平均脲酶值	PCR腔体#	PCR胃底#	T01	盐水	1.63	5/5	5/5
T02	猪螺杆菌IN SF	0.136	1/5	3/5	T01	盐水	1.63	5/5	5/5
T02	猪螺杆菌IN SF	0.136	1/5	3/5	T03	猪螺杆菌SC SF	0.341	5/5	5/5
T10	NVNC	0.118	0/5	0/5	T03	猪螺杆菌SC SF	0.341	5/5	5/5

#PCR阳性样品数/总样品数

以上结果显示，鼻内和皮下免疫在所有疫苗接种的动物中引起了平均脲酶活性值的降低。鼻内免疫接种的动物中的脲酶活性水平更低。胃样品的PCR测试显示了在鼻内免疫接种的动物中猪螺杆菌DNA的部分清除。小鼠的皮下免疫没有表现出猪螺杆菌PCR检测量的降低。通过使用体外生长的猪螺杆菌实现了所制备的疫苗的保护作用。

序列表

<110>根特大学(Universiteit Gent)

M.巴埃莱(Baele，Margo)

F.黑斯布鲁克(Haesebrouck，Freddy)

<120>螺杆菌的体外培养

<130>R4479-PCT

<150>US 60/865,723

<151>2006-11-14

<160>6

<170>PatentIn版本3.3

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>

tcaaactagg accgagtc 18

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

taccttgtta cttcacccca 20

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

cagcagccgc ggtaatac 18

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

ctcctacggg aggcagcagt 20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5

gttgcgctcg ttgcgggact 20

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

aactcaaagg aattgacgg 19

Claims

1.一种用于从样品中分离螺杆菌的方法，所述方法包括在一种培养体系中培养所述样品的步骤，所述体系包括一种补充了至少10％血清或至少7.5％血液的具有5.0和6.0之间pH的培养基。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基包含用于苛求菌生长的营养素。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述用于苛求菌生长的营养素选自布氏、马-欣二氏或脑心浸液营养素。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述培养基包含至少一种抑制不同于所培养的螺杆菌的真菌和/或革兰氏阳性和/或革兰氏阴性微生物生长的选择性物质。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述至少一种选择性物质选自下组：万古霉素、乳酸甲氧苄啶、多粘菌素B、头孢磺啶、黏菌素、两性霉素B、结晶紫、制霉菌素和乳链菌肽。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述培养基含有12.5％和25％之间的血清。

7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述培养基含有7.5％和15％之间的血液。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述培养基进一步包含从维生素B12、L-谷氨酰胺、腺嘌呤、鸟嘌呤、对氨基苯甲酸、L-胱氨酸、NAD(辅酶1)、辅羧酶、硝酸铁、硫胺和盐酸半胱氨酸中选择的一种或多种生长因子。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述培养体系包含一种固体和一种液体组分，并且其中至少所述固体组分包含所述培养基。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述固体和液体组分都包含用于苛求菌生长的营养素。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述用于苛求菌生长的营养素选自布氏、马-欣二氏或脑心浸液营养素。

12.如权利要求9-11中任一项所述的方法，其特征在于，所述固体和/或液体组分包含至少一种抑制不同于所培养的螺杆菌的真菌和/或革兰氏阳性和/或革兰氏阴性微生物生长的选择性物质。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述至少一种选择性物质选自下组：万古霉素、乳酸甲氧苄啶、多粘菌素B、头孢磺啶、黏菌素、两性霉素B、结晶紫、制霉菌素和乳链菌肽。

14.如权利要求9-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述固体组分包含12.5％和25％之间的血清。

15.如权利要求9-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述固体组分包含7.5％和15％之间的血液。

16.如权利要求9-15中任一项所述的方法，其特征在于，所述固体和/或液体组分进一步包含从维生素B12、L-谷氨酰胺、腺嘌呤、鸟嘌呤、对氨基苯甲酸、L-胱氨酸、NAD(辅酶1)、辅羧酶、硝酸铁、硫胺和盐酸半胱氨酸中选择的一种或多种生长因子。

17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其特征在于，所述螺杆菌是“暂定猪螺杆菌”(Candidatus Helicobacter suis)。

18.一种“暂定猪螺杆菌”分离株，其特征在于，所述分离株可通过权利要求1-17中任一项所述的方法获得。

19.一种用于培养螺杆菌分离株的方法，所述方法包括将所述分离株应用于一种培养体系并在其中培育分离株的步骤，所述体系包含一种补充了至少10％血清或至少7.5％血液的具有4.0和7.0之间的pH的培养基。

20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述培养体系包含一种固体和一种液体组分，并且其中至少所述固体组分包含所述培养基。

21.如权利要求19或20所述的方法，其特征在于，所述固体和液体组分都包含用于苛求菌生长的营养素。

22.如权利要求19-21中任一项所述的方法，其特征在于，至少所述固体组分缓冲在pH 4.7和7.0之间。

23.一种包含用于分离和/或培养螺杆菌的固体培养基的培养容器，所述固体培养基含有浓度在7.5和15％之间的血液或浓度在12.5和25％之间的血清，其中所述固体培养基的pH在5.0和6.0之间。

24.如权利要求23所述的培养容器，其特征在于，进一步包含用于苛求生物体生长的营养素。

25.如权利要求23或24所述的培养容器，其特征在于，进一步包含至少一种抑制不同于所培养的螺杆菌的真菌和/或革兰氏阳性和/或革兰氏阴性微生物生长的选择性物质。

26.如权利要求25所述的培养容器，其特征在于，所述至少一种选择性物质选自下组：万古霉素、乳酸甲氧苄啶、多粘菌素B、头孢磺啶、黏菌素、两性霉素B、结晶紫、制霉菌素和乳链菌肽。

27.如权利要求23-26中任一项所述的培养容器，其特征在于，所述固体培养基包含琼脂。

28.一种包含“暂定猪螺杆菌”分离株的抗原制剂的疫苗。

29.一种用于生产“暂定猪螺杆菌”抗原制剂的方法，所述方法包括按照权利要求1-17中任一项所述的方法分离“暂定猪螺杆菌”以及从所获得的“暂定猪螺杆菌”分离株生产抗原制剂。

30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，进一步包括按照权利要求19-22中任一项所述的方法对所述分离的“暂定猪螺杆菌”进行培养。

31.一种针对“暂定猪螺杆菌”感染对动物进行疫苗接种的方法，所述方法包括将包含以下一种或多种成分的疫苗对所述动物给药：

-来自“暂定猪螺杆菌”分离株的一种或多种抗原制剂，

-“暂定猪螺杆菌”分离株的活的减毒的“暂定猪螺杆菌”，和/或

-“暂定猪螺杆菌”分离株的完全灭活的“暂定猪螺杆菌”。