CN1802437A - 通过微生物发酵提取胶原蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新型的胶原蛋白生产方法，其中通过发酵过程从含胶原蛋白的组织中提取胶原蛋白。该发酵过程使用微生物，其包括但不限于细菌和酵母。本发明也涉及通过发酵过程产生的含这种胶原蛋白的胶原蛋白产物。

Description

通过微生物发酵提取胶原蛋白的方法
发明领域
[001]本发明涉及一种新型的胶原蛋白生产方法，更具体地说，涉及通过发酵过程从含胶原蛋白的组织中提取胶原蛋白的方法，并涉及所生产的胶原蛋白产物。
发明背景
[002]胶原蛋白是胞外基质中的基本蛋白成分。在哺乳动物中，有时胶原蛋白可占总蛋白的60％。它包含在大部分皮肤、腱、骨骼和牙齿的有机物质中，并在多数其它身体结构中作为纤维包含体存在。胶原蛋白也是鱼类皮肤的基本组成。
[003]存在多种类型的胶原蛋白，它们各不相同，以满足各种组织的需要。目前，已发现动物胶原蛋白类型I到XIX，其中胶原蛋白类型I到V广泛用作医学和化妆品材料及食品添加剂。特别地，I型胶原蛋白最广泛地用作胞外基质。这些胶原蛋白通过酸溶法、碱溶法、中性溶解法和或酶溶法从动物，如牛、猪，鸟类，袋鼠等的各种器官如皮肤、骨骼、软骨、腱和内脏中提取和纯化。
[004]在碱溶法中，使用盐溶液可提取一小部分交联程度最小的胶原蛋白的盐溶部分。
[005]稀释的酸溶液也用于从早期快速生长的组织中提取胶原蛋白。酸溶部分略大于盐溶部分。但由于提取溶液的酸性pH，因此有时操作起来更危险(Gross et al.，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，41，pp 1-7(1955)andDavison et al，Conn.Tiss.Res.，1，pp 205-216(1972))
[006]酶溶法例如使用胃蛋白酶，也可用于溶解胶原蛋白的另一部分。在多种情况下酶提取法是优选的，因为该方法可提高产量，并可得到纯度更高的胶原蛋白。但酶提取法的一个缺点是会产生部分降解的胶原蛋白，换言之，提取用的酶可在含内部成胶型交联连接的非螺旋区的末端切割胶原蛋白分子。已发现通过常用于酶法提取胶原蛋白的酶——胃蛋白酶提取的胶原蛋白生产的活性组织等价物在某些用途，例如参与组织等价物的实质性机械操作方面比较脆弱。
[007]因此，需要改善胶原蛋白的成分及制备这种成分的方法。
发明概述
[008]本发明通过提供一种新型的胶原蛋白生产方法来解决上述问题，即通过发酵过程从含胶原蛋白的组织中提取胶原蛋白。发酵是微生物对有机化合物，例如葡萄糖的厌氧生物氧化过程，从而产生ATP和细胞生物合成或同化作用所需的更简单的有机化合物(Samuel，B.et al.，MedicalMicrobiology 4th Ed.Section 1(1996))。微生物可产生多种组合的分子作为发酵的终点。含胶原蛋白的组织可通过不同的微生物进行发酵，包括但不限定于那些认为是公认安全级的微生物。经过发酵反应的含胶原蛋白的组织可得到更高质量的胶原蛋白及更高的提取产量。发酵过程的应用也减少对有害于环境和工作人员的化学和有机溶剂的使用。
[009]因此，通过发酵提取胶原蛋白具有多个优势。通过发酵提取的胶原蛋白纯度更高，含有大量易于保存的胶原蛋白单体，而通过先前技术中的方法提取的胶原蛋白则具有较多的胶原蛋白聚合物和小分子量的蛋白杂质。而且，胶原蛋白的产量也是先前技术中的方法得到的产量的5到10倍。另外，使用发酵过程可减少在提取过程中对化学和有机溶剂的使用。实际上，不同于先前技术的方法中要使用大量碱性溶剂，在本发明中，不用碱性溶剂处理含胶原蛋白的组织。因此，本发明也是考虑环境保护的一个更好的选择。
[010]所有胶原蛋白类型均可通过发酵进行提取，根据其在不同离子强度和pH的溶液中的溶解度差异而对不同类型的胶原蛋白进行分离的方法已有很好的文献进行描述。已建立对胶原蛋白类型I，II和III在提取后基于其离子强度的差异而进行分离的方法。可通过本领域中熟练人员周知的不连续电泳(Skyes，B.，et al，Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 72(4)：1472-1480(1976))进行I型和III型胶原蛋白的分离。I型胶原蛋白主要存在于真皮层和腱中。II型胶原蛋白主要发现于软骨中。而III型胶原蛋白也发现于真皮层。
[011]本发明涉及通过发酵过程获得胶原蛋白的方法。
[012]本发明涉及利用微生物例如细菌或酵母通过发酵过程获得的胶原蛋白。
[013]选择性地，本发明提供在发酵后将发酵的组织溶解在酸性溶液中的方法。在另一个实施例中，在酸性溶液中溶解后，加入盐使胶原蛋白沉淀。
[014]本发明也涉及由发酵过程产生的胶原蛋白和所产生的胶原蛋白。
[015]用于图解本发明的几个实施例，整合并构成本发明一部分的附图和描述一起用于解释本发明的原理。
附图的简要描述
[016]图1是细菌菌株TW-S-7-1的革兰氏染色的照片。
[017]图2是通过细菌发酵提取的鸟类胶原蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。
[018]图3是通过细菌发酵提取的猪胶原蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，以商品化牛胶原蛋白作为对照。
[019]图4是通过细菌发酵提取的鲨鱼皮胶原蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。
[020]图5是通过酵母发酵提取的鸟类胶原蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。
[021]图6是从鸟类软骨提取的胶原蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。
发明的详细描述
[022]本发明涉及一种产生胶原蛋白的新方法，其中胶原蛋白是通过微生物参与的发酵过程获得的。另外，本发明进一步提供对发酵的组织进行酸溶解方法，及随后通过加入盐沉淀提取的胶原蛋白的方法。本发明也提供通过发酵过程产生的胶原蛋白和含这种胶原蛋白的胶原蛋白产物。
定义
[023]此处所用术语“胶原蛋白”是指具有高伸缩强度并在多数多细胞生物中发现的结缔组织中的主要蛋白。胶原蛋白是一种主要的纤维性蛋白，它在基底膜中也是一种非纤维性蛋白。它含有大量甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸和羟赖氨酸。目前，已鉴定出胶原蛋白类型I-XIX，它们在alpha链中的氨基酸结构不同。此处所用的术语“胶原蛋白”可理解为是指所有的胶原蛋白类型及任何形式的胶原蛋白，端胶原蛋白、不溶性胶原蛋白、胶原蛋白纤维、溶解性胶原蛋白及酸溶性胶原蛋白，无论天然与否。
[024]此处所用术语“含胶原蛋白的组织”是指任何含胶原蛋白的组织，包括但不限定于腱、皮肤、角膜、骨骼、软骨、牙齿、椎间盘、胎儿皮肤、心血管系统、基底膜、胎盘及在任何上皮细胞下锚定的纤维。
[025]此处所用术语“胶原蛋白产物”是指任何至少含有一种胶原蛋白及任何衍生物，包括水解产物的产物。水解产物可通过本领域熟练人员已知的化学法或酶法获得。其中的胶原蛋白或衍生物不管其形式如何，可占次要或主要部分。
[026]此处所用术语“水解的”是指经过水解过程，即一种用水降解化合物的化学过程；通过破坏化合物的共价键并在该键处插入水分子来实现。
[027]此处所用术语“发酵的”和“发酵过程”是指微生物例如细菌、酵母及其他微生物代谢一种或多种物质以产生该微生物存活和繁殖所需的能量和化合物的厌氧过程。该化学反应过程可产生某种形式的副产物。微生物可产生多种组合的分子作为发酵的终点。例如，二氧化碳和乙醇是酵母酿造中产生的副产物，而丙酮酸在乳酸发酵中转化成乳酸。发酵过程是产生ATP的过程，其中有机化合物作为电子供体和受体，可以在无氧的情况下发生(Berg，M.Jeremy et al.Biochemistry chap.16(2002))。
[028]此处所用术语“微生物”是指非常小的，裸眼看不到的活的生物，包括细菌、真菌、原生生物、藻类和病毒。
[029]此处所用术语“GRAS”是指本领域熟练人员已知的公认安全级微生物，包括但不限定于芽胞杆菌属、乳杆菌属、假单胞菌属及酵母。
[030]此处所用术语“营养培养基”是指含有微生物生长和维持活性必需的物质的培养基。
[031]此处所用术语“鸟的”是指鸟的、与鸟有关的及由鸟衍生的。
[032]此处所用术语“水生生物”是指生活在水中，进行空气呼吸或非空气呼吸的生物，包括但不限定于鱼类、水母、甲壳动物例如螃蟹、及头足类动物例如鱿鱼和章鱼。
[033]此处所用术语“猪的”是指猪的、与猪有关的及由猪衍生的。
[034]此处所用术语“酸性溶液”是指具有一个或多个以下特征的溶液：酸味，使石蕊纸由蓝变红，含有与金属结合形成盐的化合物。该溶液的pH值低于7。酸性溶液的例子包括但不限定于醋酸、柠檬酸、蚁酸、盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、丙酸和乳酸等溶液。
[035]此处所用术语“盐”是指任何用金属或行为类似金属的基团替换酸中的部分或全部酸性氢而得到的各种化合物，包括但不限定于氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、硫酸胺、硫酸钠、醋酸钾和醋酸钠等。
[036]此处所用术语“过滤”是指过滤过程或任何具有过滤效果的过程，例如离心、蒸馏、透析，或任何其他具有分离悬浮液中的物质的作用的过程。通过发酵过程生产胶原蛋白
[037]本发明涉及一种生产胶原蛋白的方法，包括提供含胶原蛋白的组织，提供微生物，及使微生物发酵含胶原蛋白的组织。发酵是一种厌氧过程，其中微生物例如细菌、酵母及其他微生物代谢一种或多种物质，以产生生长和繁殖所需的能量和化学物质，其中会产生某些形式的副产物。含胶原蛋白的组织可从哺乳动物、水生生物或鸟类获得。当含胶原蛋白的组织进行发酵过程后，则可提取与先前技术中的方法相较之更高产量的含有大量胶原蛋白单体的胶原蛋白组分。
[038]通过微生物进行含胶原蛋白的组织的发酵过程。在一个特定实施例中，微生物包括细菌。在本发明一个更特定的实施例中，所用的细菌是革兰氏阳性的。在本发明另一个更特定的实施例中，使用的细菌属于芽胞杆菌属。选择性地，发酵过程可用包括酵母的微生物进行。在另一个实施例中，发酵过程是用包含GRAS微生物的微生物进行的。
在一个更特定的实施例中，发酵过程是用GRAS革兰氏阳性微生物进行的。
[039]在本发明的另一个实施例中，含胶原蛋白的组织是从哺乳动物、水生生物或鸟类获得的。
[040]在另一个实施例中，本发明进一步包括通过将发酵的组织溶解在上述酸性溶液中来提取胶原蛋白，在一个更特定的实施例中，提取胶原蛋白进一步包括通过过滤将不溶性组织从酸性溶液中除去。在进一步的实施例中，提取胶原蛋白进一步包括加入上述的盐以从含发酵组织的酸性溶液中沉淀胶原蛋白。在一个更特定的实施例中，沉淀的胶原蛋白通过过滤进行收集。另一个实施例进一步提供水解提取的胶原蛋白的方法。可通过本领域中熟练人员已知的各种方法，例如酸处理、碱处理、热变性，然后进行蛋白酶切割，超声法及胶原蛋白酶处理而进行水解。
[041]本发明的一个更特定的实施例涉及一种生产胶原蛋白的方法，包括以下步骤。首先，提供一个或多个哺乳动物、鸟类或水生生物来源的含胶原蛋白的组织。然后提供属于芽胞杆菌属的革兰氏阳性菌。然后将含胶原蛋白的组织在发酵罐中以10％w/v的量，与约160ul细菌和营养培养基一起进行发酵。随后，将发酵的组织溶解在含0.5M醋酸，pH约3.0，并含约1％w/v胃蛋白酶的水溶液中。然后通过过滤或上述任何具有与过滤同样作用的过程除去不溶性组织。然后向含有发酵组织的醋酸溶液中加入盐，并静置过夜以沉淀胶原蛋白。
[042]本发明的另一个实施例涉及产生胶原蛋白的方法，包括以下步骤。首先，提供一个或多个哺乳动物、鸟类或水生生物来源的含胶原蛋白的组织。然后提供属于芽胞杆菌属的革兰氏阳性菌。然后将含胶原蛋白的组织在发酵罐中以10％到40％w/v的量，与约10ul细菌和营养培养基一起进行发酵。随后，将发酵的组织溶解在含0.5M醋酸，pH约3.0，并含约0.4％到2％w/v胃蛋白酶的水溶液中。
胶原蛋白和胶原蛋白产物
[043]本发明也涉及包含通过发酵从含胶原蛋白的组织中获得的胶原蛋白单体的胶原蛋白产物。胶原蛋白产物可以是任何一种包含至少一种胶原蛋白，及任何衍生产物包括水解产物的产物。水解产物可通过本领域熟练人员已知的化学或酶学方法获得。其中的胶原蛋白或衍生物可占次要或主要部分，而不考虑其形式。在一个更特定的实施例中，通过包含细菌的微生物进行发酵。在一个更特定的实施例中，发酵过程所用的细菌是革兰氏阳性的。选择性地，所用的细菌属于芽胞杆菌属。在另一个实施例中，发酵过程所用的微生物包括酵母。另外，发酵过程所用的微生物包括GRAS微生物。在一个更特定的实施例中，含胶原蛋白的组织从哺乳动物、水生生物或鸟类获得。
[044]在另一个实施例中，本发明涉及包含胶原蛋白单体的胶原蛋白产物。在一个实施例中，胶原蛋白产物包含至少占胶原蛋白产物总重量约10％的胶原蛋白单体。在一个更特定的实施例中，至少是约50％，在另一个特定实施例中，至少是80％。
[045]胶原蛋白产物具有多种应用，例如作为医学材料、应用于药物、化妆品及食品方面等。
[046]在各种作为医学材料的材料中，胶原蛋白具有生物兼容性。胶原蛋白的优势包括以下一个或多个特点：极好的生物亲和性和组织兼容性；低抗原性(由于胶原蛋白的三股螺旋结构部分掩盖了潜在的抗原决定簇，因此它是一种相对较弱的免疫原)；由于其螺旋结构而对蛋白酶水解具有高抗性；可促进宿主细胞的分化和生长；止血作用；细胞附着的天然基质及粘液-骨骼系统主要的伸缩性承重组分；可被完全降解并被机体吸收。因此，胶原蛋白具有特别适于作为医学材料的各种特征。由于这些特征，胶原蛋白已用于制作植入性假体，制备活性组织等价物，制备细胞生长基质，制备用于烧伤或创伤的敷料剂及用于修复损伤的腱的覆盖物等。
[047]在所有应用中，特别需要的是高质量的胶原蛋白。具有很少量杂质的高精制胶原蛋白不仅适于作为食品原料，也可用于各种工业用途，例如作为医学材料、化妆品材料及感光胶卷的乳化剂。在先前技术的方法中经常发生胶原蛋白的变性和降解，从而限制了胶原蛋白在食品和工业领域的应用。但通过本发明所述的发酵过程进行的胶原蛋白提取方法可得到易于保存的胶原蛋白单体，它可作为有价值的胶原蛋白原料用于商业和医学领域。
[048]从考虑说明书和实际操作所述发明来说，本发明中的其它实施例对本领域中熟练人员是显而易见的。说明书和实施例仅用于举例说明，本发明真正的范围和主旨如下面的权利要求所述。
[049]除非特别定义，所有此处所用的技术和科学术语均是本发明所属技术领域中的普通技术人员通常理解的含义。本领域的普通人员也可以借鉴任何与此处所述的方法相同或等价的方法和材料来实践或检测本发明。另外，所有此处提及的文献均通过参考进行整合。
[050]关于数值的范围，本发明包括在范围的上限和下限之间的每个中间值到至少下限单元的十分之一之间，除非特别注明。另外，本发明包括任何其它规定的中间值。而且本发明也包括在范围的上限和下限之外的范围，除非特别排除规定的范围。
[051]另外，所有说明书及权利要求中所用的表示成分数量、反应条件、％纯度、多肽或多聚核苷酸长度等的数字均用术语“约”进行修饰，除非特别说明。因此，说明书和权利要求中设定的数字参数均是近似值，可以根据本发明所需的特征而改变。每个数字参数并不用于限制在权利要求范围内的等价物的应用，而应该至少被解释为根据普通技术已报道的重要数字。但在特定实施例中设定的数字是尽量准确的。但任何数值都含有偏离其实验测定的标准偏差一定的误差。
[052]应注意，此处和所附权利要求中所用的单数形式“a”“或”和“the”包括复数形式，除非特别说明。因此，例如“一个受试多肽”包括大量的这种多肽，而“该试剂”包括一个或多个本领域中熟练人员所知的试剂及等价物，等等。
[053]以下实施例进一步说明本发明。它们仅用于说明本发明，并阐述本发明特定实施例的各种优点。以下实施例不用于限定本发明。
实施例
[054]除非特别说明，本发明的操作是本领域人员所知的常规细胞生物学、细胞培养和发酵等技术。这些技术在文献中有详细说明。
实施例1鉴定通过细菌培养物发酵提取的胶原蛋白的细菌菌株
[055]收集细菌，并用于从上述含胶原蛋白的组织中通过发酵提取胶原蛋白。
这些细菌被鉴定为细菌菌株TW-S-7-1。在制备用于鉴定的细菌培养物时，将细菌菌株挑到营养琼脂平板上。然后将平板在37℃放置16小时。然后将5个细菌单克隆接种到5个不同的含5ml新鲜营养肉汤的“L”型试管中。将试管置于37℃，振荡(50-200rpm)培养16-24小时。另一个不接种任何细菌的含5ml新鲜营养肉汤的试管作为阴性对照。对照试管在37℃振荡培养(50-200rpm)。
[056]测定5个接种细菌的试管的浊度，从而表明微生物的增殖过程。在阴性对照试管中没有生长迹象。
革兰氏染色
[057]对TW-S-7-1细菌进行革兰氏染色。首先将一滴新鲜的培养细菌滴到干净的载玻片上，并使其均匀扩散。将涂片在火焰上加热10秒，使其固定。然后将固定在载玻片上的涂片用1％结晶紫覆盖60秒。将多余的染料甩掉，并将载玻片在自来水中轻轻洗涤。用吸水纸将载玻片上的水吸走。此时用裸眼观察时，样品为蓝紫色。
[058]随后，将涂片用革兰氏碘液洗涤60秒。然后向涂片上加入更多的革兰氏碘液，并保持60秒。然后用自来水洗涤涂片，并用吸水纸吸水。
[059]随后，将涂片用95％乙醇洗涤30秒，并用自来水洗涤，从而终止脱色反应。将0.25％番红花红加到载玻片上，保持30秒进行复染色。然后用自来水洗涤载玻片，并用吸水纸吸水，在油浸视野下进行观察。
[060]对细胞形态、相对大小及染色模式进行总结，参见图1。可容易地看到大量杆状结构。所有杆状结构都是深蓝色的，因此它们是革兰氏阳性的。结构的长度估计约为1-1.5um。杆状结构中折射出的卵状或椭圆状细小结构是细菌的内生孢子。
触酶实验
[061]将30ul新鲜的TW-S-7-1细菌培养物涂布在载玻片上，干燥3分钟。仔细滴加一份过氧化氢(H2O2)溶液(30％v/v)，将涂片完全盖住，然后将涂片在室温下放置5分钟。
气泡的形成表明细菌产生触酶。
[062]当加入H2O2溶液(3％v/v)时，立即产生气泡。细胞产生触酶以从细胞中除去H2O2，使其变为水和氧。
结果
[063]被测的细菌菌株TW-S-7-1保持革兰氏染色的紫色，因此是革兰氏阳性的。细胞长1-1.5um。菌株在触酶实验中可产生触酶。因此，菌株TW-S-7-1被鉴定为芽胞杆菌属。
实施例2通过细菌发酵从鸟类组织中产生胶原蛋白
[064]用自来水洗涤约800克鸡爪。从这些材料中收集约400克软组织，包括肉、皮肤和腱(通称为组织)，并切成小块(长宽为0.5cm)。将这些组织用70％乙醇浸泡15分钟，然后在生物安全柜中空气干燥0.5-2小时。
[065]用一种属于芽胞杆菌属的革兰氏阳性细菌菌株进行发酵过程，以从组织中提取胶原蛋白。该微生物在营养培养基中37℃，150rpm振荡培养24小时。将1环(约10pl)新鲜细菌培养物分别接种到4个含25mi营养培养基的125moi hinton的锥形瓶中，并在250rpm振荡培养24小时。将每个锥形瓶中的含量成比例扩大到100ml，再另外培养24小时。在发酵前，将所有4个锥形瓶中的细菌培养物转移到含4升营养培养基的6升发酵罐中，并在37℃培养24小时。对于细菌生长条件，搅拌和通气速度分别设定为450rpm和3vvm。
[066]然后向发酵罐中加入上述制备的鸟类组织(10％w/v)。除了将搅拌速度调整350rpm，其它生长条件保持不变。
发酵过程进行24小时。当发酵完成后，将发酵的鸟类组织从培养液中仔细地分离出来，并用双蒸水进行彻底洗涤。
[067]将发酵的组织溶解在含0.5M醋酸(pH3.0)及1％胃蛋白酶(w/w)的水溶液(3％w/v)中，4℃轻轻振荡48小时，从而可很容易地将鸟类胶原蛋白，特别是I型胶原蛋白提取出来。
[068]通过在4℃进行30pm切线式过滤可除去收集的酸性溶液中溶解发酵的组织后留下的不溶性组织和大颗粒。然后将过滤的溶液进行脱脂作用，即将酸性溶液在4℃通过活性炭颗粒进行过滤而实现。包括炭颗粒的不溶性物质通过5000Xg离心50分钟而除去。
[069]向上述得到的冷的酸性溶液中缓慢加入560克盐，并轻轻搅拌使其完全溶解。溶液在4℃静置过夜，以使胶原蛋白缓慢沉淀出来。沉淀的胶原蛋白通过在4℃，2000Xg离心混合物50分钟而进行浓缩。仔细除去上清，将乳色的含胶原蛋白的沉淀重溶在新鲜制备的含0.5M醋酸的酸性水溶液中，并在4℃轻轻搅拌。
[070]将含鸟类I型胶原蛋白的粗溶液通过cm孔大小的过滤膜进行过滤，从而进行进一步纯化。流出液用0.2jn.M孔大小的螺旋式卡盒(spiralwound cartridge)通过反向透析过滤而进行纯化。为了富集鸟类I型胶原蛋白，用截留50千道尔顿的螺旋式卡盒再次进行反向透析过滤而进行浓缩。重复过滤步骤，从而进行富集并最大程度除去分子量小于50千道尔顿的小肽或其它污染物。
[071]在该步骤中，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析从鸟类组织中制备的含胶原蛋白的溶液的组成和纯度，图2所示的是提取的α和β形式的胶原蛋白及其各自的质量。α型是胶原蛋白单体，分子量为95-100kDa。β型是多聚物，分子量约为200kDa。提取的胶原蛋白是约100到200kDa的易于保存的胶原蛋白单体。结果表明有更多的胶原蛋白单体被提取出来。
[072]过滤后，将含胶原蛋白的溶液冻存在-80℃，然后冻干，从而产生鸟类I型胶原蛋白粉末。将粉末仔细称重，则回收的鸟类I型胶原蛋白的重量估计是最初所用组织的30％。这几乎是美国专利No.5,106,949所述的制备方法所获得的胶原蛋白的10倍，该方法中胶原蛋白产量至多是精细分割的腱的湿重的4％。美国专利No.5,436,135描述了一种提取过程，可从35.7千克胎盘组织为起始材料提取180克含IV型胶原蛋白的终产物。
实施例3通过细菌发酵从猪组织中提取胶原蛋白
[073]首先用双蒸水洗涤新鲜宰杀的猪的皮肤，然后进行第二次洗涤过程以除去杂质。该洗涤过程用0.2N NaOH和0.01-0.2％次氯酸盐水溶液进行联合处理。每种处理的温育时间从15分钟到40分钟。温育后，将处理的猪皮切成小片(长宽约0.5cm)，然后用热水进行两次连续的彻底洗涤，并进行空气干燥。
[074]使用属于芽胞杆菌属的革兰氏阳性细菌菌株进行发酵，以从猪皮中提取胶原蛋白。细菌培养物在25mi营养肉汤中，37℃，在150rpm的摇床中培养24小时。然后按比例扩大到100ml，并转移到发酵罐中培养24小时。
搅拌和通气速率分别设定为450rpm和3wm。
[075]然后，向发酵罐中加入10％到40％(w/v)的组织进行发酵。在发酵过程中将搅拌速率调整为350rpm，持续发酵18-48小时。发酵后，回收组织，并用热水进行两次连续洗涤。
[076]将发酵的组织溶解在含0.5M醋酸(pH3.0)和0.4％-2％胃蛋白酶(w/v)的水溶液(3％w/v)，并进行轻轻搅拌不超过48小时，优选地是36小时，从而提取猪胶原蛋白。溶解后，将含胶原蛋白的水溶液通过活性炭进行过滤，然后5000xg离心50分钟，然后通过SDS-PAGE分析酸溶部分的胶原蛋白含量。图3所示的是提取的胶原蛋白的α、β和γ形式及其各自的分子量。提取的胶原蛋白单体——α型，和多聚物——β型的分子量分别约为100和250kDa(以纯的Fluka牛胶原蛋白作为对照)。
实施例4通过细菌发酵从水生生物中提取胶原蛋白
[077]用水洗涤约10克鲨鱼皮，并空气干燥30分钟。将属于芽胞杆菌属的革兰氏阳性细菌菌株在营养培养基中，37℃，150rpm振荡培养24小时。将10ul新鲜细菌培养物接种到含5ml营养培养基的125ml hinton锥形瓶中。然后250rpm振荡培养24小时。将锥形瓶中的含量成比例扩大到100ml，再培养24小时。
对于细菌生长，将搅拌和通气速率分别设定为450rpm和3vvm。
[078]将10克鲨鱼皮加到含细菌的锥形瓶中。生长条件保持不变。发酵过程在37℃进行24小时。
[079]然后回收发酵的组织，并与含0.5M醋酸(pH3.0)和1％胃蛋白酶的酸溶液(3％w/v)混合。将其4℃放置16小时。
[080]随后5000Xg离心50分钟除去不溶性组织和杂质。除去上清，并与5M1\1aCl轻轻混合，4℃静置过夜。
将沉淀的胶原蛋白5000Xg离心50分钟进行浓缩。除去得到的上清，将回收的沉淀进行SDS-PAGE，参见图4。图4表明提取的胶原蛋白的分子量约为作为胶原蛋白单体特征的100kDa。
实施例5通过酵母发酵从鸟类组织中提取胶原蛋白
[081]用水洗涤20克鸡爪，并进行空气干爆将10ul酵母接种到5ml YPD培养基中，室温培养24小时。然后将5ml酵母接种到含25ml营养培养基的125ml hinton锥形瓶中。接种的酵母在120rpm培养24小时。然后将锥形瓶的含量成比例扩大到100ml。
[082]然后向锥形瓶中加入20克鸡爪组织和细菌。生长条件保持不变。发酵过程在37℃进行48小时。
[083]然后回收发酵的组织，并与含0.5M醋酸(pH3.0)和1％胃蛋白酶的酸溶液(5％w/v)混合。将其4℃放置16小时。
[084]随后5000Xg离心50分钟除去不溶性组织和杂质。除去上清，并与5Ml\laCI轻轻混合，4℃静置过夜。
将沉淀的胶原蛋白5000Xg离心50分钟进行浓缩。除去得到的上清，将回收的沉淀进行SDS-PAGE，参见图5。图5表明提取的胶原蛋白单体的分子量约为100kDa。
实施例6从软骨中提取II型胶原蛋白
[085]用自来水洗涤约10克来源于鸡肋骨的软骨，并进行空气干燥。在发酵过程中使用属于芽胞杆菌属的革兰氏阳性细菌菌株。微生物在37℃，150rpm振荡培养24小时。将约10ul新鲜细菌培养物接种到含5ml营养培养基的125ml hinton锥形瓶中，250rpm振荡培养24小时。将锥形瓶的含量成比例扩大到100ml，再培养24小时。
[086]在发酵前，将细菌转移到含营养培养基的发酵罐中。细菌在37℃，搅拌和通气速率分别设为450rpm和3vvm的条件下培养24小时。然后向发酵罐中加入软骨，除了将搅拌速率调整为350rpm外，细菌的生长条件保持不变。
发酵过程进行24小时。
[087]完成发酵后，将发酵的软骨组织从培养液中分离出来，并用双蒸水进行洗涤。然后将发酵的组织溶解在含0.5M醋酸(pH3.0)和1％胃蛋白酶的3％w/v酸溶液中，4℃温育48小时。然后通过离心除去不溶性组织。然后将上清与5M NaCI轻轻混合，4℃静置，使胶原蛋白沉淀。随后除去上清，将回收的沉淀进行SDS-PAGE分析，参见图6。图6所示的是一条作为II型胶原蛋白特征的约100kDa的清晰的单一条带。该特征不同于I型胶原蛋白，它通常为约100kDa的两条单一条带。
参考文献
[088]本发明中讨论的出版物仅仅是因为其公布在本发明申请日之前而提供的。这里所说的不能理解成是承认本发明晚于这些在先发明的公布。另外，所提供的出版的日期可能与实际出版日期不同，实际出版日期可能要另外确认。

Claims (53)

1.一种生产胶原蛋白的方法，包括：提供含胶原蛋白的组织，提供微生物，使微生物发酵含胶原蛋白的组织。
2.权利要求1中的方法，其中微生物包括细菌。
3.权利要求2中的方法，其中细菌是革兰氏阳性菌。
4.权利要求3中的方法，其中细菌属于芽胞杆菌属。
5.权利要求1中的方法，其中微生物包括酵母。
6.权利要求1中的方法，其中微生物包括GRAS微生物。
7.权利要求6中的方法，其中GRAS微生物是革兰氏阳性菌。
8.权利要求1中的方法，其中含胶原蛋白的组织是从哺乳动物获得的。
9.权利要求8中的方法，其中哺乳动物是猪。
10.权利要求1中的方法，其中含胶原蛋白的组织是从水生生物获得的。
11.权利要求10中的方法，其中水生生物是鱼类。
12.权利要求11中的方法，其中鱼类是鲨鱼。
13.权利要求1中的方法，其中含胶原蛋白的组织是从鸟类获得的。
14.权利要求13中的方法，其中鸟类是鸡。
15.权利要求1中的方法，进一步包括从发酵的组织中提取胶原蛋白。
16.权利要求15中的方法，进一步包括在酸性溶液中溶解发酵的组织。
17.权利要求16中的方法，进一步包括通过过滤除去不溶性组织。
18.权利要求17中的方法，进一步包括向含发酵的组织的酸性溶液中加入盐，以沉淀胶原蛋白。
19.权利要求18中的方法，进一步包括通过过滤收集沉淀的胶原蛋白。
20.权利要求15中的方法，其中含胶原蛋白的组织是从哺乳动物获得的。
21.权利要求20中的方法，其中哺乳动物是猪。
22.权利要求15中的方法，其中含胶原蛋白的组织是从水生生物获得的。
23.权利要求22中的方法，其中水生生物是鱼类。
24.权利要求23中的方法，其中鱼类是鲨鱼。
25.权利要求15中的方法，其中含胶原蛋白的组织是从鸟类获得的。
26.权利要求25中的方法，其中鸟类是鸡。
27.权利要求15中的方法，进一步包括水解提取的胶原蛋白的步骤。
28.一种生产胶原蛋白的方法，包括：提供一个或多个哺乳动物、鸟类或水生生物来源的含胶原蛋白的组织；提供属于芽胞杆菌属的革兰氏阳性菌；用该细菌在发酵罐中以约10％ w/v的量发酵含胶原蛋白的组织；用酶在酸性溶液中溶解发酵的组织；通过过滤除去不溶性组织；及向酸性溶液中加入足以沉淀胶原蛋白的盐，并静置过夜，以沉淀胶原蛋白。
29.权利要求28中的方法，其中含胶原蛋白的组织用约160ul细菌进行发酵。
30.权利要求28中的方法，其中酸性溶液是约1％ w/v到约50％w/v的0.5M醋酸(pH 3.0)。
31.权利要求28中的方法，其中酶是胃蛋白酶，浓度约为0.2％到5％w/v。
32.权利要求28中的方法，其中盐约400到600克。
33.一种生产胶原蛋白的方法，包括：提供鸟类来源的含胶原蛋白的组织；提供属于芽胞杆菌属的革兰氏阳性菌；用160ul该细菌和营养培养基在发酵罐中以约10％ w/v的量发酵含胶原蛋白的组织约24小时；用含约0.5M醋酸(pH约3.0)和约1％ w/v胃蛋白酶的酸性溶液以约3％ w/v的量溶解发酵的组织，并搅拌约48小时；通过过滤除去不溶性组织；及向酸性溶液中加入约560克足以沉淀胶原蛋白的盐，并静置过夜，以沉淀胶原蛋白。
34.权利要求33中的方法，其中鸟类是鸡。
35.一种生产胶原蛋白的方法，包括以下步骤：提供一个或多个哺乳动物、鸟类或水生生物来源的含胶原蛋白的组织；提供属于芽胞杆菌属的革兰氏阳性菌；用约10ul该细菌在发酵罐中以约10％到约40％ w/v的量发酵含胶原蛋白的组织；及在含0.5M醋酸(pH约为3.0)和胃蛋白酶的酸性溶液中溶解发酵的组织。
36.权利要求35中的方法，其中含胶原蛋白的组织发酵约18到48小时。
37.权利要求35中的方法，其中发酵的组织约为酸性溶液的1％ w/v到50％ w/v。
38.权利要求35中的方法，其中胃蛋白酶约为0.2％到5％ w/v。
39.一种生产胶原蛋白的方法，包括以下步骤：提供哺乳动物来源的含胶原蛋白的组织；提供属于芽胞杆菌属的革兰氏阳性菌；用约10ul该细菌和营养培养基在发酵罐中发酵含胶原蛋白的组织(约10％到40％ w/v)约18到48小时；在含约0.5M醋酸(pH约为3.0)和约0.4％到2％ w/v胃蛋白酶的水性溶液中溶解发酵的组织(約3％ w/v)，并搅拌不超过48小时。
40.权利要求39中的方法，其中哺乳动物是猪。
41.一种含胶原蛋白单体的胶原蛋白产物。
42.权利要求41中的胶原蛋白产物，其中胶原蛋白单体在胶原蛋白产物中至少占总胶原蛋白重量的10％。
43.权利要求41中的胶原蛋白产物，其中胶原蛋白单体在胶原蛋白产物中至少占总胶原蛋白重量的50％。
44.权利要求41中的胶原蛋白产物，其中胶原蛋白单体在胶原蛋白产物中至少占总胶原蛋白重量的80％。
45.权利要求41、42、43或44中的胶原蛋白产物，其中胶原蛋白单体是通过发酵过程从含胶原蛋白的组织中获得的。
46.权利要求45中的胶原蛋白产物，其中发酵过程是用含细菌的微生物进行的。
47.权利要求45中的胶原蛋白产物，其中发酵过程是用含酵母的微生物进行的。
48.权利要求45中的胶原蛋白产物，其中发酵过程是用含GRAS微生物的微生物进行的。
49.权利要求48中的胶原蛋白产物，其中GRAS微生物是革兰氏阳性微生物。
50.权利要求45中的胶原蛋白产物，其中含胶原蛋白的组织是从哺乳动物获得的。
51.权利要求45中的胶原蛋白产物，其中含胶原蛋白的组织是从水生生物获得的。
52.权利要求51中的胶原蛋白产物，其中水生生物是鱼类。
53.权利要求45中的胶原蛋白产物，其中含胶原蛋白的组织是从鸟类获得的。
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