CN114163514A - Il-10突变体及其应用 - Google Patents

Il-10突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于蛋白质工程技术领域，具体涉及一种IL‑10突变体及其应用，IL‑10突变体的氨基酸序列如SEQ ID No:5所示，IL‑10突变体作为抗原应用在制备IL‑10抗体方面。本发明提供的IL‑10突变体蛋白构象的改变，降低了其与抗体的亲和性，由该IL‑10突变体制备的亲和层析柱在纯化特异性的IL‑10抗体时，在二者结合率变化不大的前提下，变得更容易洗脱分离，纯化的抗体纯度高，回收率大大提升。

Description

IL-10突变体及其应用
技术领域
本发明属于蛋白质工程技术领域，具体涉及一种IL-10突变体及其应用。
背景技术
IL-10是一种被广泛表达的单链糖蛋白多效细胞因子，既可以由适应性免疫细胞产生也可以由固有免疫细胞产生。IL-10的特异性受体是复合物，由IL-10R1和IL-10R2两个亚单位构成，主要通过JAK-STAT通路发挥生物学功能。
IL-10在免疫调节和炎症方面具有多重、多效性，作为一种关键的抗炎细胞因子，IL-10在免疫调节中发挥重要作用，通过降低树突状细胞、巨噬细胞表面MHC2类分子的表达，削弱抗原提呈细胞的功能，还能抑制T细胞的增殖，能够有效抑制细胞介导的免疫反应。此外IL-10还可以通过降低促炎细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、IL-12以及IFN-γ等的表达，减轻炎症反应.还有研究证实，IL-10有促进B淋巴细胞，肥大细胞，自然杀伤细胞的活化和分化的作用。此外还有研究表明IL-10对肿瘤的免疫监督功能有着重要作用.总而言之IL-10有着重要生物学功能，在免疫调节中发挥多种作用。
人体中IL-10的检测需要制备高亲和力和高纯度的单克隆抗体。目前国内外针对IL-10单克隆抗体的纯化主要采用偶联IL-10抗原的亲和层析柱、ProteinA柱、Protein G柱等。Protein A柱、Protein G柱纯化收率和相对纯度较低，偶联IL-10抗原的亲和层析柱纯化的单抗虽然特异性好，纯度相对较高，但是由于IL-10抗原亲和柱与抗体结合力强，对抗体的洗脱非常困难，导致收率较低。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中存在的上述问题，提出了一种IL-10突变体及其应用，IL-10突变体的蛋白结构发生改变，从而降低了与IL-10单克隆抗体的亲和力，利用这个特点，本发明还制备了IL-10单克隆抗体纯化使用的亲和层析柱，以sepharose 4b为载体，偶联IL-10突变体，可以快速、高效的得到高纯度IL-10单克隆抗体。
本发明的技术方案是：
通过对IL-10蛋白突变，并经过大量筛选，确定了C端的L26R突变位点能引起IL-10抗原与抗体亲和力的减弱，从而促成发明。
本发明提供了一种IL-10突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No：5所示，即SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDRRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN。该突变体蛋白的突变位点为L26R。
本发明还提供了编码所述的IL-10突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQID No:6所示，即AGCCCAGGCCAGGGCACCCAGTCTGAGAACAGCTGCACCCACTTCCCAGGCAACCTGCCTAACATGCTTCGAGATCGCCGAGATGCCTTCAGCAGAGTGAAGACTTTCTTTCAAATGAAGGATCAGCTGGACAACTTGTTGTTAAAGGAGTCCTTGCTGGAGGACTTTAAGGGTTACCTGGGTTGCCAAGCCTTGTCTGAGATGATCCAGTTTTACCTGGAGGAGGTGATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCAGACATCAAGGCGCATGTGAACTCCCTGGGGGAGAACCTGAAGACCCTCAGGCTGAGGCTACGGCGCTGTCATCGATTTCTTCCCTGTGAAAACAAGAGCAAGGCCGTGGAGCAGGTGAAGAATGCCTTTAATAAGCTCCAAGAGAAAGGCATCTACAAAGCCATGAGTGAGTTTGACATCTTCATCAACTACATAGAAGCCTACATGACAATGAAGATACGAAACTGA。
进一步的，用于构建所述IL-10突变体的引物对，其上游引物的核苷酸序列如SEQID No：3所示，即：5’-GGAATTCGGATCCAGCCCAGGCCAGGGCACCCAG-3’，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示，即：5’-ACGCCTCGAGTCAGTTTCGTATCTTCATTG-3’。
本发明还提供了上述IL-10突变体在制备IL-10抗体方面的应用。
进一步的，所述IL-10突变体作为抗原。
本发明还提供了一种亲和层析柱，用于IL-10抗体纯化使用，所述亲和层析柱以琼脂糖凝胶颗粒为载体，偶联上述IL-10突变体蛋白。
本发明的有益效果：
本发明提供的IL-10突变体蛋白构象的改变，降低了其与抗体的亲和性，由该IL-10突变体制备的亲和层析柱在纯化特异性的IL-10抗体时，在二者结合率变化不大的前提下，变得更容易洗脱分离，纯化的抗体纯度高，回收率大大提升。
附图说明
图1为本发明提供的IL-10突变体蛋白纯度分析结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例，对本发明优选实施方式中的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所采用的试剂和生物材料等，如无特殊说明，均可以从商业途径获得。
实施例1IL-10基因突变库的构建
IL-10抗原(购自上海友科生物科技有限公司，人工合成)的氨基酸序列如表SEQID No:1所示，即：SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN；其碱基序列如表SEQ ID No:2所示，即：AGCCCAGGCCAGGGCACCCAGTCTGAGAACAGCTGCACCCACTTCCCAGGCAACCTGCCTAACATGCTTCGAGATCTCCGAGATGCCTTCAGCAGAGTGAAGACTTTCTTTCAAATGAAGGATCAGCTGGACAACTTGTTGTTAAAGGAGTCCTTGCTGGAGGACTTTAAGGGTTACCTGGGTTGCCAAGCCTTGTCTGAGATGATCCAGTTTTACCTGGAGGAGGTGATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCAGACATCAAGGCGCATGTGAACTCCCTGGGGGAGAACCTGAAGACCCTCAGGCTGAGGCTACGGCGCTGTCATCGATTTCTTCCCTGTGAAAACAAGAGCAAGGCCGTGGAGCAGGTGAAGAATGCCTTTAATAAGCTCCAAGAGAAAGGCATCTACAAAGCCATGAGTGAGTTTGACATCTTCATCAACTACATAGAAGCCTACATGACAATGAAGATACGAAACTGA。
为了解决IL-10抗原(氨基酸序列如表SEQ ID No:1所示，核苷酸序列如表SEQ IDNo:2所示)抗体的结合力，通过定向进化技术对该蛋白进行了大量突变的筛选，优化并自行设计其中的一对PCR引物：
上游引物如序列表SEQ ID No:3所述，即：5’-GGAATTCGGATCCAGCCCAGGCCAGGGCACCCAG-3’；下游引物如序列表SEQ ID No:4所述，即：5’-ACGCCTCGAGTCAGTTTCGTATCTTCATTG-3’。
实施例2IL-10突变体表达菌株的构建和发酵
(1)以IL-10基因为模板，使用上述引物，加入2×TransStart FastPfu PCRSuperMix扩增整个质粒基因。PCR反应条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸5min，30个循环后，72℃充分延伸10min，4℃保存。PCR结束后加入DMT酶消化体外降解非突变型质粒模板，胶回收目的基因。
(2)将胶回收突变体基因和pET-28a载体用BamHI和XhoI酶切后暴露出相同的末端，T4连接酶室温连接，转化DMT感受态细胞中，涂布LB+Kan平板，37℃过夜培养；次日，筛选得到重组菌株。
(3)从培养平板挑取单克隆菌落接种到10ml LB+Kan培养基中，37℃培养后，提取质粒，送测序公司检测。
(4)检测成功的质粒转化到BL21(DE3)感受态中，涂布LB+Kan平板，37℃过夜培养；挑取单克隆菌落接种到接种到5ml LB+Kan培养基中，37℃培养后接种到500ml LB+Kan培养基中，37℃扩大培养至OD600nm＝0.6～0.8，降温至16℃，加入0.5mM IPTG诱导过夜。
IL-10突变体蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No:5所示，IL-10突变体蛋白的突变位点为L26R，即：
SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDRRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN。
该IL-10突变体蛋白的编码基因序列如序列表SEQ ID No:6所示，即：AGCCCAGGCCAGGGCACCCAGTCTGAGAACAGCTGCACCCACTTCCCAGGCAACCTGCCTAACATGCTTCGAGATCGCCGAGATGCCTTCAGCAGAGTGAAGACTTTCTTTCAAATGAAGGATCAGCTGGACAACTTGTTGTTAAAGGAGTCCTTGCTGGAGGACTTTAAGGGTTACCTGGGTTGCCAAGCCTTGTCTGAGATGATCCAGTTTTACCTGGAGGAGGTGATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCAGACATCAAGGCGCATGTGAACTCCCTGGGGGAGAACCTGAAGACCCTCAGGCTGAGGCTACGGCGCTGTCATCGATTTCTTCCCTGTGAAAACAAGAGCAAGGCCGTGGAGCAGGTGAAGAATGCCTTTAATAAGCTCCAAGAGAAAGGCATCTACAAAGCCATGAGTGAGTTTGACATCTTCATCAACTACATAGAAGCCTACATGACAATGAAGATACGAAACTGA。
实施例3IL-10突变体纯化
缓冲液A:50mM PBS，500mM NaCl
缓冲液B:50mM PBS，500mM NaCl，500mM imidazole
纯化步骤为：
首先，诱导表达后的菌液8000rpm离心5min，缓冲液A重悬菌体，超声破碎30min后12000rpm离心30min收集上清液；然后将收集的上清液加入到Ni-NTA中结合1h，使用缓冲液A和缓冲液B配制的咪唑浓度为10mM，20mM，50mM，200mM缓冲液分步洗脱目的蛋白；再启动蠕动泵，设置流速30rpm，同时打开蛋白检测仪，用各种梯度的缓冲液冲至检测仪基线至平稳。
收集各种梯度洗脱的蛋白样品，并取少量样品制备SDS-PAGE所需要的样品；收集目的蛋白并浓缩换液，测定蛋白浓度。IL-10抗体及纯化收集的IL-10突变体蛋白纯度分析结果图如图1所示。
实施例4IL-10突变体亲和柱偶联工艺
1)活化sepharose 4b树脂
称取1.00g的sepharose4b树脂于烧杯中，加入50mL的1mM盐酸室温下溶胀5min，转入抽滤瓶抽滤后，直接加50mL的1mM盐酸，室温浸没5min后再抽滤，反复共5次；(少量多次)加入15～20mL的1mM盐酸将树脂吸取转入小三角瓶准备偶联。
2)突变体蛋白准备
将IL-10突变体蛋白换液至100mM NaHCO3，pH8.3，500mM NaCl中，浓度10mg/mL。
3)偶联突变体
上述步骤1)中小三角瓶中让树脂自然沉降后吸取上清，加入前处理过的突变体，补加1mL的NaHCO3缓冲液，25℃下50rpm摇床上振荡1～2h。
4)测定蛋白浓度
偶联体转入离心管中8000rpm 4℃下离心10min后取上清，计量体积和检测蛋白含量；计算偶联率。
5)抗原偶联体清洗处理
用50mL的0.1M碳酸氢钠(pH8.3，含0.5M的氯化钠)冲洗偶联体于抽滤瓶中；抽滤后，再用碳酸氢钠50mL冲洗一遍；抽滤后，加入0.1M的pH8的Tris-HCl缓冲液100mL，将抽滤瓶下端用保鲜膜堵好，使其室温下浸泡封闭2h。
封闭之后用抽滤掉封闭液，用0.1M的pH 4.0的醋酸钠-醋酸缓冲液和0.1M的pH 8的Tris-HCl(含0.5M的氯化钠)缓冲液各50mL轮换冲洗，再抽滤，反复四次；最后加入50mL的0.02M的pH 8.0的PBS洗涤、抽滤，反复3次。
6)装柱
用10mL 0.02M的PBS混匀，取出来装柱；自然沉淀后，拧紧柱子；进0.02M的pH 7.4的PBS冲洗，检查是否遗漏。
装柱前可以取0.1mL偶联体重悬液，进行BCA测定，沉淀中显示较深的蓝色，说明抗原在偶联和封闭、冲洗时均为正常偶联。
试验例1
IL-10抗体纯化方法的比较
人IL-10蛋白刺激小鼠，杂交瘤细胞，收集腹水，纯化抗体等步骤，制备得到IL-10单克隆抗体，根据IL-10抗体的特点，从抗体纯度、回收率、稳定性等为出发点，设计并验证了三套实验方法，并对纯化方案作了相关比较。
方法(1)：protein G亲和层析柱纯化IL-10抗体
方法(2)：IL-10抗原亲和层析柱纯化IL-10抗体
方法(3)：IL-10抗原突变体亲和层析柱纯化IL-10抗体
平衡：用20mL纯水清洗protein G层析柱、IL-10抗原亲和柱、IL-10抗原突变体亲和柱，再用20mL结合缓冲液(0.02M PBS，pH 8.0)以1mL/min的速度冲洗三种层析柱；
上样：样品用结合缓冲液稀释5倍，用0.22um除菌器除菌；用注射器上样，收集穿透液；
洗脱：用结合缓冲液冲洗柱子至蛋白检测仪基线不变，弃流出液；用洗脱缓冲液(0.1Mglycine-HCl，pH为2.8)冲洗柱子至蛋白检测仪基线不变，并收集流出液(即洗脱液)；目的蛋白洗脱液进行SDS-PAGE和Western-Blot，Bandscan扫描分析抗体纯度。如表1所示，经过Bandscan扫描分析软件，IL-10抗原突变体亲和层析柱纯化IL-10抗体纯度大于93％。
(一)单克隆抗体亲和常数测定
亲和常数表示抗体与抗原结合的紧密程度，是确定抗体性质的重要参数之一，同时也是单克隆抗体稳定性的重要指标。三种方法洗脱的目的蛋白经过SDS-PAGE和Western-Blot验证后进行浓度测定。测定结果如表1所示。
(二)非竞争ELISA测定mAb的相对亲和常数
实验步骤如下：
①分别以20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL三种浓度的人源IL-10蛋白包被酶标板，每孔100μL，4℃过夜；
②洗板，PBST 200μL/孔，洗涤3次，5min/次；
③封闭：用3％的BSA作为封闭液，110μL/孔，37℃保温孵育2h；
④洗板：同②；
⑤一抗：加入梯度稀释的单克隆抗体，100μL/孔，37℃保温孵育2h；
⑥洗板：同②；
⑦二抗：1：3000稀释酶标二抗，100μL/孔，37℃保温孵育45min；
⑧洗板：同②；
⑨显色：加入底物使用液，100μL/孔，37℃保温避光显色10min；
⑩终止：每孔加入50μL终止液，450nm处测Abs值，测定结果如下表1所示。
(三)单克隆抗体稳定性实验
同样采用间接ELISA测定冻存前和冻存3个月后抗体与抗原的结合力，测定OD450nm处吸光值之差，比较三者的差别。
表1三种抗体纯化方法的比较实验结果
Figure BDA0003407696010000061
Figure BDA0003407696010000071
由上表可知，三种纯化方法均能获得有活性的IL-10抗体，其中，protein G亲和层析纯化的抗体纯度和活性偏低；IL-10抗原亲和层析纯化的抗体回收率低；IL-10抗原突变体亲和层析纯化活性和回收率都高。
上述说明仅为本发明的优选实施例，并非是对本发明的限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改型等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 青岛瑞斯凯尔生物科技有限公司
<120> IL-10突变体及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 160
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
<210> 2
<211> 483
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agcccaggcc agggcaccca gtctgagaac agctgcaccc acttcccagg caacctgcct 60
aacatgcttc gagatctccg agatgccttc agcagagtga agactttctt tcaaatgaag 120
gatcagctgg acaacttgtt gttaaaggag tccttgctgg aggactttaa gggttacctg 180
ggttgccaag ccttgtctga gatgatccag ttttacctgg aggaggtgat gccccaagct 240
gagaaccaag acccagacat caaggcgcat gtgaactccc tgggggagaa cctgaagacc 300
ctcaggctga ggctacggcg ctgtcatcga tttcttccct gtgaaaacaa gagcaaggcc 360
gtggagcagg tgaagaatgc ctttaataag ctccaagaga aaggcatcta caaagccatg 420
agtgagtttg acatcttcat caactacata gaagcctaca tgacaatgaa gatacgaaac 480
tga 483
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
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<400> 3
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<210> 4
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<212> DNA
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gtggagcagg tgaagaatgc ctttaataag ctccaagaga aaggcatcta caaagccatg 420
agtgagtttg acatcttcat caactacata gaagcctaca tgacaatgaa gatacgaaac 480
tga 483

Claims (7)

1.一种IL-10突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No:5所示。
2.编码权利要求1所述的IL-10突变体的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No:6所示。
4.根据权利要求1所述的IL-10突变体，其特征在于，构建所述IL-10突变体的引物对，其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No:4所示。
5.权利要求1至4任一项所述的IL-10突变体在制备IL-10抗体方面的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述IL-10突变体作为抗原。
7.一种亲和层析柱，用于IL-10抗体纯化使用，其特征在于，所述亲和层析柱以琼脂糖凝胶颗粒为载体，偶联如权利要求1至4任一项所述的IL-10突变体。
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