CN101287748A - 一种融合蛋白的组成及其分离方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种融合蛋白的组成及利用一种含有新型凝血酶裂解位点的肽接头进行融合蛋白分离的方法。

Description

一种融合蛋白的组成及其分离方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种融合蛋白的组成及其分离方法。
背景技术
[0002]使用融合蛋白的表达系统生产重组蛋白是一种广为接受的技术。在该系统中，融合伴侣有助于所需蛋白的表达和纯化。融合伴侣常用于提供一个可以帮助融合蛋白进行后续纯化的“标签”。然而，为了使所需蛋白恢复其自然形态或药学上可接受的形态，该融合伴侣必须在融合蛋白分离后立即去除。去除融合伴侣最广为使用的方法是使用特异性裂解酶，如凝血酶，Xa因子或肠激酶(Wassenberg等，Protein Sci＜5：1718(1997)；Schlumpberger等，ProteinSci 9：440(2000)；Zaitseva等，Protein Sci 5：1100(1996))。它包括在所需蛋白和融合伴侣之间插入一段能被裂解酶特异性裂解的特定氨基酸序列。所需的蛋白可通过采用裂解酶(如凝血酶)裂解融合蛋白进行恢复。
[0003]凝血酶是一种可以断裂使用丝氨酸的多肽键的胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶。许多研究者研究了凝血酶的特异性。已知的凝血酶裂解位点如下(Chang，Eur.J.Biochem.151：211(1985)；GST genefusion system handbook，Amersham Biosciences，Edition AA，p.88-89)。
1)P4-P3-Pro-Arg/Lys↓P1’-P2’，其中P3和P4是疏水氨基酸，P1’和P2’是非酸性氨基酸。Arg/Lys↓P1’键被断裂。
范例：
  P4   P3   Pro   Arg/Lys   P1’   P2’
  A   Leu   Val   Pro   Arg   Gly   Ser
  B   Met   Tyr   Pro   Arg   Gly   Asn
  C   Ile   Arg   Pro   Lys   Leu   Lys
(SEQ ID NOS：1-3)
2)P2-Arg/Lys↓P1′，其中P2或P1’是Gly。Arg/Lys↓P1’键被断裂。
范例：
  P2   Arg/Lys   P1’
  A   Ala   Arg   Gly
  B   Gly   Lys   Ala
[0004]最常用的凝血酶裂解序列是由牛因子XIII(Takagi等，Biochemistry13：750(1974))的序列衍生的Leu-Val-Pro-Arg-Gly(SEQID NO：4)或者Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQ ID NO：1)。断裂发生在精氨酸残基处，从而使目标蛋白在氨基酸末端以Gly或Gly-Ser扩展。凝血酶裂解序列还被用于一些商用表达质粒，包括pGEX系列(Amersham Biosciences)和pET系列(Novagen)。
[0005]最近，Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQ ID NO：1)序列被进一步修饰，在凝血酶裂解位点Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQ IDNO：1)前面或后面紧接插入了包含序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO：5)的富含精氨酸的接头(Guan等，Anal.Biochem.192：262(1991)；Hakes et al，Anal.Biochem.202：293(1992))。
[0006]虽然凝血酶对已知接头序列区域的裂解具有相当的特异性，但这并非绝对。尽管凝血酶是一种相当特异性的酶，但它可以使用一系列不同的氨基酸序列作为裂解位点。如果目标蛋白包含多个凝血酶裂解位点，则在这些位点均能发生裂解，从而得到内部裂解的蛋白产品，而非所需的全长蛋白。
[0007]例如，当一个包含内部凝血酶裂解序列的盐生盐杆菌(Halobacterium halobium)L11蛋白作为一个GST融合蛋白表达，且该融合蛋白在GST标签和L11之间具有Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQ ID NO：1)凝血酶裂解位点时，以凝血酶进行处理将导致目标蛋白L11内部的裂解，而非在L11和GST标签之间的裂解(Porse et al，J.MoI.Biol.276：391(1998))。酿酒酵母的Cdc14p蛋白同样具有一个内部凝血酶裂解序列。当Cdc14p蛋白作为含有Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQ ID NO：6)凝血酶断裂位点的GST融合蛋白进行表达时，融合蛋白同时在Cdc14p内部位点和凝血酶裂解接头处断裂(Taylor et al，J.Biol.Chem.272：24054(1997))。
[0008]本发明提供了一种比已知序列更具特异性的可用凝血酶裂解的新型接头序列。
发明内容
[0009]本发明提供了一种包含新型凝血酶裂解位点的肽接头，该接头可用于包含目标蛋白的融合蛋白的重组生产以及从融合蛋白中分离目标蛋白。在一个实施例中，该肽接头包含以下序列：
X1-X2-Ser-Pro-X3-X4-X5
其中：
X1是两个或两个以上彼此相同或不同的氨基酸残基；
X2是疏水氨基酸；
X3是精氨酸或赖氨酸；
X4是丙氨酸或甘氨酸；以及
X5是一种非酸性氨基酸。
[0010]本发明提供了一种融合蛋白，其包括目标蛋白、融合伴侣以及插在两者之间的本发明所述的肽接头。本发明还提供一种从融合蛋白分离目标蛋白的方法，包括使融合蛋白与足够量的凝血酶接触从而引起肽接头的裂解。当裂解反应发生后，由融合蛋白产生得到目标蛋白。目标蛋白可采用本领域中公知的简单技术进行恢复。
[0011]本发明可用于纯化在宿主细胞中以重组DNA技术表达的原核或真核蛋白。这些重组蛋白产品包括通过蛋白工程技术或合成蛋白生产的细胞因子，趋化因子，激素，受体，酶，贮藏蛋白，血液蛋白，突变体蛋白。
[0012]此外，本发明还涉及编码肽接头的多聚核苷酸，编码融合蛋白的多聚核苷酸，包含相同多聚核苷酸的载体，以及包含该载体的宿主细胞。
[0013]本发明进一步提供了一种编码融合蛋白的多聚核苷酸的制备方法，一种融合蛋白的生产方法以及一种目标蛋白的生产方法。
[0014]本发明还提供了包含本发明的多聚核苷酸和载体的试剂盒。
附图说明
[0015]图1是编码包含本发明肽接头的融合蛋白的pGEX4T-hIL11(A)的图示(SEQ ID NO：8)。
[0016]图2A显示GST-IL11(A)的凝血酶裂解。
[0017]图2B显示GST-IL11(A)的凝血酶裂解。
[0018]图3显示IL-11(A)的MALDI-TOF分析。
[0019]图4是编码包含本发明肽接头(SEQ ID NO：8)的融合蛋白的pGEX-胸腺肽β4的图示。
[0020]图5是GST-胸腺肽β4的凝血酶裂解。
[0021]图6显示了胸腺肽β4的MALDI-TOF分析。
[0022]图7是编码包含本发明肽接头(SEQ ID NO：8)的融合蛋白的pGEX-IL6的图示。
[0023]图8显示GST-IL6的凝血酶裂解。
[0024]图9是编码包含本发明肽接头(SEQ ID NO：8)的融合蛋白的pGEX-PAR4的图示。
[0025]图10是编码包含本发明肽接头(SEQ ID NO：7)的融合蛋白的pGEX-IL11(LV-)的图示。
[0026]图11显示GST-IL11(LV-)的凝血酶裂解。
[0027]图12是编码包含本发明肽接头(SEQ ID NO：7)的融合蛋白的pMAL-c2-IL11的图示。
[0028]图13显示MBP-IL11的凝血酶裂解。
[0029]图14是编码包含本发明肽接头(SEQ ID NO：7)的融合蛋白的pET19b-IL11的图示。
[0030]图15显示His-IL11的凝血酶裂解。
发明详述
[0031]本发明提供了一种包含可被凝血酶及其类似物裂解的凝血酶裂解位点的肽接头。在一个实施例中，该肽接头包含以下序列：
X1-X2-Ser-Pro-X3-X4-X5
其中：
X1是两个或两个以上彼此相同或不同的氨基酸残基；
X2是疏水氨基酸；
X3是精氨酸或赖氨酸；
X4是丙氨酸或甘氨酸；以及
X5是一种非酸性氨基酸。
[0032]在一个实施例中，X1是4个或4个以上彼此相同或不同的氨基酸残基。在另一实施例中，X1为不超过10个氨基酸残基，例如不超过8个氨基酸残基，例如不超过6个氨基酸残基。例如，在不同的实施例中X1可以是2-6，2-8，2-10，4-6，4-8，或4-10个氨基酸残基。
[0033]当采用凝血酶处理肽接头时，X3和X4之间的键发生断裂。对于裂解位点，当X1是两个氨基酸残基时X1占据位点5和6(P5-P6)，或当X1是4个氨基酸残基时X1占据位点5到9(P5-P8)。X2，Ser，Pro，X3，X4和X5分别占据位点4，3，2，1，1’和2’，和T(P4，P3，P2，P1，P1’，P2’)。在一个实施例中，X1包含Pro和Arg。在一个实施例中，X3可以是Arg或Lys。当Arg或Lys在羧基前时凝血酶断裂多肽键。在另一实施例中，X4可以是Ala或Gly。Ala和Gly的性质非常相似，都是小分子非极性氨基酸。在一个实施例中，X2可以是选自由Gly，Ala，Pro，VaI，Leu，Ile，Met，Phe，Tyr和Trp所组成的群的疏水氨基酸。在一个特殊的实施例中，X2为Gly。在一个更进一步的实施例中，X5可以是选自由Ser，Ala，Asn，Val，Leu，Ile，Lys，Phe，Tyr和Trp所组成的群的非酸性氨基酸。在一个特殊的实施例中，X5是Ser。在一个实施例中，X1可以是2个或更多的任何氨基酸。在另一个实施例中，X1可以是4个或更多的任何氨基酸。X1的确切氨基酸序列对凝血酶裂解没有明显的影响。
[0034]在一个实施例中，肽接头包含序列Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓Ala-Ser(SEQ ID NO：7)。在一个更进一步的实施例中，肽接头包含序列Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓Ala-Ser(SEQ ID NO：8)。当一个包含该裂解位点的融合蛋白以凝血酶处理时，裂解位点中的Arg↓Ala键断裂。在一个实施例中，肽接头包含一个与Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓Ala-Ser(SEQ ID NO：7)不同的序列。在另一个实施例中，肽接头包含一个与Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓Ala-Ser(SEQ ID NO：8)不同的序列。
[0035]肽接头序列Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓Ala-Ser(SEQ IDNO：7)和Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓Ala-Ser(SEQ ID NO：8)不同于以往已知的凝血酶裂解位点，因为P3氨基酸Ser为非疏水性。根据以往的研究，最佳凝血酶裂解位点在P3位点含有疏水氨基酸(Chang，Eur.J.Biochem.151：211(1985))。已知P3位点的非疏水性氨基酸会延长凝血酶裂解的时间。Raftery等人报导了在鼠MPR14蛋白中发现的氨基酸序列Asn-Asn-Pro-Arg-Gly-His(SEQ ID NO：9)可作为凝血酶的底物，但它是一种比Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQ IDNO：1)差的底物(Raftery等，Protein Expr.Purif.15：228(1999))。对凝血酶的天然底物纤维蛋白原，Gly位于纤维蛋白肽A(Gly-Gly-Val-Arg↓Gly-Pro)(SEQ ID NO：10)的P3位点，而Ser位于纤维蛋白肽B(Phe-Ser-Ala-Arg↓Gly-His)(SEQ ID NO：11)的P3位点。纤维蛋白肽A可以比纤维蛋白肽B更迅速地被凝血酶裂解(Binnie等，Blood.57：3186(1993))。
[0036]本发明提供了一种融合蛋白，其包含目标蛋白，融合伴侣以及插在两者之间的本发明的肽接头。
[0037]此处所用的术语“融合蛋白”和“嵌合蛋白”可进行互换，指包含目标蛋白，融合伴侣以及插在两者之间带有凝血酶裂解位点的接头肽的多肽和蛋白质。在一个实施例中，目标蛋白连接至肽接头的N末端，融合伴侣连接至肽接头的C末端。在另一实施例中，目标蛋白连接至肽接头的C末端，融合伴侣连接至肽接头的N末端。在一个更进一步的实施例中，融合蛋白可能包含分别用肽接头分隔的超过一个的目标蛋白和/或超过一个的融合伴侣。在这些实施例中，多个目标蛋白可以相同或不同，多个融合伴侣可以相同或不同，且多个肽接头可以相同或不同。
[0038]此处所用的术语“目标蛋白”，“所需多肽”，“所需蛋白”或“靶蛋白”可进行互换，并指任何其产物有用的蛋白或肽。在一个实施例中，蛋白或肽具有生物活性。目标蛋白的例子包括但不仅限于白介素(IL)-11，胸腺肽β4，胸腺肽α1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-10，IL-13，IL-15，IL-18，蛋白酶激活受体1(PAR1)，PAR3，PAR4，RANTES，基质细胞衍生因子-1α，单核细胞趋化蛋白，干细胞因子，FLT-3L，甲状旁腺激素，血小板生成素，表皮细胞生长因子，碱性成纤维细胞生长因子，胰岛素样生长因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，粒细胞集落刺激因子，巨噬细胞集落刺激因子，血小板源生长因子，转化生长因子(TGF)-β1，肿瘤坏死因子(TNF)-α，干扰素(IFN)-α，IFN-β，IFN-γ，肝细胞生长因子，血管内皮生长因子以及免疫球蛋白重链。在一个实施例中，目标蛋白选自由人IL11，胸腺肽β4，IL-6和PAR4所组成的群。在另一实施例中，目标蛋白为人IL11。
[0039]此处所用的术语“融合伴侣”指任何期望包含在融合蛋白中的蛋白或肽。在一个实施例中，融合伴侣为融合蛋白赋予了改善的特性，如更易纯化，更具稳定性，可溶性等等。在一个实施例中，融合伴侣为一种亲和肽。亲和肽的例子包括但不仅限于谷胱甘肽s转移酶(GST)，麦芽糖结合蛋白(MBP)，六聚组氨酸，T7多肽，泛素，Flag多肽，c-myc多肽，聚精氨酸，聚半胱氨酸，聚苯丙氨酸，BTag，半乳糖结合域，纤维素结合域(CBD)，硫氧还蛋白，葡萄球菌蛋白A，链球菌蛋白G，钙调蛋白，β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶，S-多肽，链霉亲和素，His-标签和Strep-标签。
[0040]此处所用的术语“肽接头”指包含可被凝血酶识别和裂解的凝血酶裂解位点的特定氨基酸序列。
[0041]此处所用的术语“凝血酶”指任何形式的可裂解本发明肽接头的凝血酶。凝血酶可包括天然凝血酶，重组凝血酶，凝血酶片段以及凝血酶类似物，只要蛋白中保留了一定水平的裂解活性。在一个实施例中，凝血酶可以是人凝血酶或牛凝血酶，包括天然凝血酶，重组凝血酶，或是由人或牛序列中衍生得到的凝血酶片段和类似物。
[0042]本发明提供了一种从包括所述目标蛋白，融合伴侣和插在两者中间的肽接头的融合蛋白中分离目标蛋白的方法，所述方法包括将融合蛋白与足够量的凝血酶接触从而引起多肽接头的裂解。在一个实施例中，融合蛋白由肽接头的X3和X4中间断裂。本方法可进一步包括将目标蛋白从融合蛋白的其他部分中分离，如通过亲和纯化或尺寸分离。
[0043]在一个实施例中，凝血酶为人凝血酶，融合蛋白与约0.1USP单位至约1.0USP单位的凝血酶接触，如约0.2单位至约0.7单位的凝血酶，如约0.2单位至约0.5单位的凝血酶，如约0.2单位至约0.3单位的凝血酶。在另一实施例中，凝血酶为人凝血酶，融合蛋白与凝血酶接触时间为约5分钟至约1.5小时，如约8分钟至约1.2小时，如约10分钟至约1.0小时。在一个更进一步的实施例中，凝血酶为人凝血酶，并且融合蛋白与约0.25单位的凝血酶接触约30分钟。
[0044]在一个实施例中，凝血酶为牛凝血酶，融合蛋白与约0.1单位至约1.0单位的凝血酶，如约0.2单位至约0.7单位的凝血酶接触。在另一实施例中，凝血酶为牛凝血酶，融合蛋白与凝血酶接触时间为约5分钟至约1.5小时，如约8分钟至约1.2小时，如约10分钟至约1.0小时。在一个更进一步的实施例中，凝血酶为牛凝血酶，且融合蛋白与约0.5单位的凝血酶接触约1.0小时。
[0045]本发明提供了一种编码本发明中的肽接头的多聚核苷酸。该多聚核苷酸可通过化学合成或克隆进行制备。
[0046]本发明提供了一种编码本发明中的融合蛋白的多聚核苷酸。按照本方明，一个编码目标蛋白的多聚核苷酸序列被分离，合成或以其他方式获得并被连接至一个编码肽接头的多聚核苷酸序列上。该种包含了连接至编码肽接头的多聚核苷酸序列的所需蛋白的基因的杂交多聚核苷酸被称作嵌合多聚核苷酸。在一个实施例中，嵌合多聚核苷酸使用整合了编码肽接头的多聚核苷酸序列的引物通过聚合酶链式反应等方法进行扩增制备，因此扩增产品中编码肽序列的多聚核苷酸可操作地连接至编码目标蛋白的多聚核苷酸。在其他的实施例中，多聚核苷酸通过一种连接酶连接在一起。嵌合多聚核苷酸随后被可操作地与编码融合伴侣的多聚核苷酸连接从而得到编码融合蛋白的多聚核苷酸。在其他实施例中，编码融合伴侣的多聚核苷酸被可操作地连接至编码肽接头的多聚核苷酸以获得嵌合多聚核苷酸，该嵌合多聚核苷酸随后被连接至编码目标蛋白的多聚核苷酸从而得到编码融合蛋白的多聚核苷酸。
[0047]此处所用的术语“可操作地连接”指两个编码蛋白或肽的多聚核苷酸以一定的方式进行连接，通过该方式可获得跨越两个多聚核苷酸的连续开放阅读框架。从调节元件来说，术语“可操作地连接”指一个调节元件以一定方式连接至一个编码蛋白或肽的多聚核苷酸，通过该方式连接后的调节元件可以对多聚核苷酸的转录和/或翻译产生影响。
[0048]本发明提供了一种包含编码肽接头的多聚核苷酸的载体(如：质粒，病毒，或是噬菌体载体)。在一个实施例中，该载体是表达载体。该载体优选可在宿主细胞中自主复制以及优选带有耐药基因(如氨苄西林或四环素)或营养缺陷型补充基因等可选择标志。在一个实施例中，该载体进一步包含可操作地连接至(如：在同一阅读框架的上游或下游)编码肽接头的多聚核苷酸的编码融合伴侣的多聚核苷酸。在另一个实施例中，该载体进一步包含可操作地连接至(如：在同一阅读框架的上游或下游)编码肽接头的多聚核苷酸的编码目标蛋白的多聚核苷酸。在另一实施例中，该载体包含编码融合蛋白的多聚核苷酸，该融合蛋白包含目标蛋白，融合伴侣以及插在两者之间的肽接头。在一个实施例中，该含有编码肽接头的多聚核苷酸的载体在编码肽接头的多聚核苷酸的上游和/或下游进一步包含一个或多个如限制性内切酶识别位点等的克隆位点，以帮助编码目标蛋白或融合伴侣的多聚核苷酸被克隆到载体中并与肽接头同框。
[0049]该载体提供了必要的调节序列(如转录和翻译元件)以控制融合蛋白在合适的宿主细胞中的表达。该调节序列可包括一个或多个启动子区，增强子区，转录终止位点，核糖体结合位点，起始密码子，剪切信号，内含子，多聚腺苷酸化信号，Shine/Dalgarno翻译序列以及Kozak一致序列。调节序列的选择依据生产融合蛋白的宿主细胞而定。合适的细菌启动子包括但不仅限于噬菌体λpL或pR，T6，T7，T7/lacO，lac，recA，gal，trp，ara，hut以及trp-lac。合适的真核启动子包括但不仅限于PRBI，GAPDH，金属硫蛋白，胸苷激酶，病毒LTR，巨细胞病毒，SV40，或是组织特异性或肿瘤特异性的启动子如甲胎蛋白，淀粉酶，组织蛋白酶E，M1毒蕈碱受体或γ-谷氨酰转移酶。
[0050]从宿主细胞分泌到培养基或宿主细胞周质的融合蛋白也可能带有信号序列。信号序列可能为融合伴侣或其他序列。编码信号序列的多聚核苷酸可以被可操作地连接至编码融合蛋白的多聚核苷酸的5’末端。此外，可以在信号序列和融合蛋白剩余部分之间插入额外的肽接头，从而使信号序列可以通过凝血酶裂解从融合蛋白去除。合适的信号序列已在本领域公知且包括如来自E.coli的MBP，GST，TRX，DsbA，和LamB以及来自酵母的α-因子。
[0051]合适表达载体的额外例子可在美国专利US5,814,503中找到，此处引入作为参考。
[0052]本发明提供了一种制备编码融合蛋白的多聚核苷酸的方法，包括在载体的克隆位点插入编码目标蛋白的多聚核苷酸，从而使该多聚核苷酸在编码肽接头的多聚核苷酸的上游或下游并与其同框。在一个更进一步的实施例中，编码目标蛋白的多聚核苷酸被插入载体的克隆位点，所述载体包含可操作地连接至编码融合伴侣的多聚核苷酸的编码肽接头的多聚核苷酸，从而使该编码目标蛋白的多聚核苷酸在编码肽接头的多聚核苷酸的上游或下游并与其同框。
[0053]本发明提供了一种包含本发明载体的宿主细胞。该宿主细胞可以是适合融合蛋白表达的任何细胞，包括原核(如细菌)和真核(如真菌，酵母，动物，昆虫，植物)细胞。合适的原核宿主细胞包括但不仅限于E.coli(如DH5，HB1O1，JM109或W3110菌株)，芽胞杆菌(Bacillus)，链霉菌(Streptomyces)，沙门氏菌(Salmonella)，沙雷氏菌(Serratia)和假单胞菌(Pseudomonas)种属。合适的真核宿主细胞包括但不仅限于COS，CHO，HepG-2，CV-I，LLC-MK2，3T3，HeLa，RPMI8226，293，BHK-21，Sf9，酵母(Saccharomyces)，毕赤酵母(Pichia)，汉逊酵母(Hansenula)，克鲁维酵母(Kluyveromyces)，曲霉菌(Aspergillus)或木霉菌(Trichoderma)种属.
[0054]制备重组载体和转化宿主细胞使用相同的方法和材料，对于载体在宿主细胞中复制以及具有生物活性的外源多肽和蛋白表达的描述见Old等人，Principles of Gene Manipulation，2ndedition，(1981)；Sambrook等人，Molecular Cloning，3rd edition，ColdSpring Harbor Laboratory，2001以及Ausubel等人，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York 3rd edition，(2000)以上内容均引入作为参考。载体可以通过任何本领域的已知技术导入宿主细胞，这些方法包括但不仅限于转化，磷酸钙沉淀，电转化，脂质体，显微注射以及病毒感染。
[0055]本发明提供了一种生产融合蛋白的方法，包括制备一个包含编码本发明融合蛋白的多聚核苷酸的载体，将载体转入一个宿主细胞，在融合蛋白表达的条件下培养宿主细胞，然后分离融合蛋白。本方法可进一步包括将融合蛋白与凝血酶接触以裂解该融合蛋白，并且分离目标蛋白。
[0056]本发明进一步提供了一种生产目标蛋白的方法，包括制备包含编码本发明融合蛋白的多聚核苷酸的载体，将载体转入宿主细胞，在融合蛋白表达的条件下培养宿主细胞，分离融合蛋白，将分离得到的融合蛋白与凝血酶接触以裂解该融合蛋白，并且分离目标蛋白。
[0057]融合蛋白可通过任何本领域的已知技术从宿主细胞分离。如果融合蛋白从宿主细胞分泌，则可收集含有融合蛋白的培养基。如果融合蛋白未从宿主细胞分泌，则可溶解细胞以释放融合蛋白。例如，可采用高压(如使用高压匀浆机)或超声溶解细菌细胞。
[0058]融合蛋白优选通过基于融合伴侣的亲和纯化进行分离。例如，含有GST的融合蛋白可通过含谷胱甘肽的层析柱进行分离，含有六聚组氨酸标签的融合蛋白可通过含金属的层析柱进行分离。
[0059]尽管亲和纯化法是分离融合蛋白的优选方法，任何已知的蛋白分离技术都可以用于替代或补充亲和纯化，这些技术包括溶剂萃取，超滤，硫酸铵沉淀，HPLC，凝胶过滤层析，离子交换层析，疏水作用层析，电泳以及等电聚焦。
[0060]在一个实施例中，可将分离得到的融合蛋白与凝血酶接触，裂解后的蛋白通过亲和层析进行分离，其中融合伴侣被层析柱结合，目标蛋白通过层析柱后被收集。在另一个实施例中，可将融合蛋白通过亲和层析进行分离，然后将从亲和介质洗脱的融合蛋白与凝血酶接触。在一个更进一步的实施例中，融合蛋白在与亲和介质结合的阶段与溶血酶进行接触，从而释放目标蛋白。凝血酶的浓度范围为从约0.1至约100USP单位/毫升，如约1至约50单位/毫升，如约10单位/毫升。流速可通过关闭泵调整为0毫升/分钟，然后维持约5至约60分钟，如约10至约15分钟。
[0061]通过凝血酶裂解融合蛋白的条件已为本领域公知，典型条件如下：约pH7至约pH9，约4℃至约37℃，底物∶酶的比例为约5∶1至约125∶1(摩尔比)，时间为约1小时至约24小时。
[0062]上述蛋白纯化技术也可以用于凝血酶裂解融合蛋白后目标蛋白的分离。在一个实施例中，目标蛋白采用阳离子交换层析(如CM SEPHAROSE)和/或阴离子交换层析(如Q SEPHAROSE)。在一个实施例中，目标蛋白首先采用阳离子交换层析，随后采用阴离子交换层析。
[0063]例如，由亲和层析分离得到的重组IL-11蛋白可以首先采用阳离子交换柱，如CM Sepharose Fast Flow介质。使用该介质填充的层析柱可采用含有25mM Tris-HCl的缓冲液B进行平衡。可将含有IL-11蛋白的样品采用缓冲液B稀释约4倍，然后上柱。洗柱时，先采用缓冲液B，然后采用含有0.15M Gly-NaOH，pH9.5的缓冲液E。靶蛋白可采用含有0.15M Gly-NaOH，pH 9.5和0.15MNaCl的缓冲液F进行洗脱。本步骤的所有过程均可在约4℃下进行。缓冲液B的pH值范围为约7.5至约8.5。缓冲液E和缓冲液F的pH范围为约9.2至约9.7。
[0064]从阳离子交换柱洗脱的重组IL-11蛋白可以采用阴离子交换柱如Q Sepharose Fast Flow介质进行进一步纯化。使用该介质填充的层析柱可采用含有1M Gly-NaOH，pH 9.5的缓冲液G进行平衡。使用含有40mM Gly-NaOH，pH9.5的缓冲液H对柱进行再平衡。可将前一步骤获得的样品用水稀释约4倍，然后上柱。收集含有靶蛋白的流出液。使用含有40mM Gly-NaOH，pH 9.5的缓冲液H过柱，收集流出液。本步骤地pH值范围为约9.2至约9.7或约9.5。阴离子交换层析的所有步骤均可在室温左右进行。通过这些步骤可以有效去除内毒素。
[0065]本发明提供了一种包含编码一种肽接头的多聚核苷酸的试剂盒。在一个实施例中，该试剂盒包含了一种带有编码肽接头的多聚核苷酸的载体。在另一实施例中，该载体是表达载体。在一个实施例中，该载体进一步包含可操作地连接至(如：在同一阅读框架的上游或下游)编码肽接头的多聚核苷酸的编码融合伴侣的多聚核苷酸。在另一个实施例中，该载体进一步包含可操作地连接至(如：在同一阅读框架的上游或下游)编码肽接头的多聚核苷酸的编码目标蛋白的多聚核苷酸。在另一实施例中，该载体包含编码融合蛋白的多聚核苷酸，该融合蛋白包含目标蛋白，融合伴侣以及插在两者之间的肽接头。在一个实施例中，该含有编码肽接头的多聚核苷酸的载体在编码肽接头的多聚核苷酸的上游和/或下游进一步包含一个或多个如限制性内切酶识别位点等的克隆位点，以帮助编码目标蛋白或融合伴侣的多聚核苷酸被克隆到载体中并与肽接头同框。在一个附加的实施例中，该载体包含可操作地连接至编码融合伴侣的多聚核苷酸的编码肽接头的多聚核苷酸，并在编码肽接头的多聚核苷酸上游或下游进一步包含了一个或多个克隆位点。在一个实施例中，多聚核苷酸的顺序为融合伴侣，肽接头，克隆位点。在另一个替代实施例中，多聚核苷酸的顺序为克隆位点，肽接头，融合伴侣。在一个实施例中，试剂盒中包含了多个载体，每一个载体包含编码肽接头的多聚核苷酸和相对肽接头处于不同阅读框架内的多个克隆位点，这样编码目标蛋白的多聚核苷酸可以插入到其中一个载体上并与肽接头同框。
[0066]该试剂盒可进一步包含与载体使用相关的试剂，如：缓冲液，限制性内切酶，连接酶，磷酸化酶类，宿主细胞等等。试剂盒还可以包括载体的使用说明，如插入编码目标蛋白的多聚核苷酸或生产融合蛋白的说明。
[0067]下述实施例有助于理解但不限制本发明的方法。其他对药物治疗和药物科学中常见的各种条件和参数所作的在本领域中显而易见的适当修改在本发明的精神和范围之内。
具体实施方式
实施例1.GST-IL11(A)
[0068]本实施例中制备了GST-IL11(A)融合蛋白。GST-IL11(A)融合蛋白由谷胱甘肽s转移酶(GST)和人IL-11以及插入在两者之间的凝血酶裂解位点组成。GST-IL11(A)的凝血酶裂解位点为Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓Ala-Ser(SEQ ID NO：8)。
[0069]为生产GST-IL11(A)，构建了一个F.coli表达质粒pGEX4T-hIL11(A)(图1)。编码人IL11(A)的DNA序列可通过PCR和定点突变从人IL11cDNA获得。下列引物对被用于PCR。
5′：GGA TCC CCG CGA GCT TCC CCA GAC CCT(SEQ IDNO：12)BamHI
3′：GTC GAC CCC TTA TCA CAG CCG AGT CTT CAG(SEQID NO：13)SalI
[0070]下列引物对被用于定点突变。
5′DN：CCA GCC ACC CCC GAA CCC GCC GGC GCC(SEQ IDNO：14)
3′DN：GGC GCC GGC GGG TTC GGG GGT GGC TGG(SEQID NO：15)
[0071]PCR的5’引物可编码Pro-Arg-AIa-Ser残基(SEQ IDNO：16)。经BamHI/SalI处理的DNA片段被克隆至pGEX4T-1质粒上的BamHI/SalI位点，并得到pGEX4T-hIL11(A)。pGEX4T-1质粒自身在GST标签之后带有凝血酶裂解位点Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQ ED NO：1)。这样，pGEX4T-hIL11(A)在谷胱甘肽s转移酶和人IL11序列之间具有了新的凝血酶裂解位点Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓Ala-Ser(SEQ ID NO：8)。
[0072]进行定点突变的目的在于将野生型IL-11(NCBI序列号：AAA59132)的Asp155变为Asn。
[0073]含有凝血酶裂解位点的hIL11(A)的氨基酸序列如下：Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓-Ala-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-Asp-Ser-Thr-Val-Leu-Leu-Thr-Arg-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Arg-Gln-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Arg-Asp-Lys-Phe-Pro-Ala-Asp-Gly-Asp-His-Asn-Leu-Asp-Ser-Leu-Pro-Thr-Leu-Ala-Met-Ser-Ala-Gly-Ala-Leu-Gly-Ala-Leu-Gln-Leu-Pro-Gly-Val-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Ala-Asp-Leu-Leu-Ser-Tyr-Leu-Arg-His-Val-Gln-Trp-Leu-Arg-Arg-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-Leu-Lys-Thr-Leu-Glu-Pro-Glu-Leu-Gly-Thr-Leu-Gln-Ala-Arg-Leu-Asp-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Gln-Leu-Leu-Met-Ser-Arg-Leu-Ala-Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Pro-Asn-Pro-Pro-Ala-Pro-Pro-Leu-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Ala-Try-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-His-Ala-Ile-Leu-Gly-Gly-Leu-His-Leu-Thr-Leu-Asp-Trp-Ala-Val-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Thr-Arg-Leu(SEQ ID NO：17)
[0074]表达质粒pGEX4T-hIL11(A)随后被转化进入E.coliBL21。将转化株接种至添加了氨苄西林(最终浓度50μg/ml)的LB培养基中，在37℃下培养至OD600达到0.5。然后添加异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.4mM以诱导蛋白表达，继续在37℃下培养细胞3小时。GST-IL11的表达通过SDS-PAGE进行确认。离心收集细胞，再悬浮于50mM，pH8.0的Tris-HCl缓冲液中并采用超声溶解。添加硫酸铵至终浓度为5.6％，同时采用Tris粉末将pH维持在8.0。硫酸铵的添加在4℃下进行。含有靶蛋白的上清液加至以pH8.0，25mM Tris-HCl缓冲液进行预平衡的谷胱甘肽Sepharose 4 Fast Flow(Amersham Biosciences)亲和柱。多次洗涤后，以含有150mM NaCl和10mM还原性谷胱甘肽的pH8.0的25mM Tris-HCl缓冲液洗脱结合的融合蛋白。
[0075]以凝血酶消化纯化后的融合蛋白。100微克的蛋白样品可采用0.1单位，0.25单位或0.5单位的牛或人凝血酶在含有150mMNaCl，pH8的25mM Tris-HCl缓冲液中于20℃下进行裂解。在不同的时间点(反应开始后10分钟，30分钟，1小时，2小时以及5小时)从反应中取出等量的样品，通过煮沸5分钟进行热灭活终止反应。以SDS-PAGE分析结果，并用考马斯亮蓝着色显示。随反应进行，融合蛋白GST-hIL11(A)逐渐分裂成两个主要的产物，GST融合伴侣(26kDa)和IL-11(18.2kDa)(图2A和2B)，且未发现IL-11的内部裂解。GST融合伴侣可被牛和人凝血酶在试验中的浓度范围和时间点有效地裂解(图2A and 2B)。
[0076]以凝血酶裂解后，重新使用谷胱甘肽Sepharose 4 FastFlow对IL-11进行再层析以去除融合蛋白的GST部分。使用Procise491A HT蛋白测序仪(Applied Biosystems，USA)分析IL-11的N末端氨基酸序列。经确认分离后的IL11(A)在其N末端具有序列Ala-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-Asp-Ser-Thr-Val-Leu-Leu(SEQ ID NO：18)。
[0077]备选地，融合蛋白的GST部分还可以在融合蛋白结合在层析柱时进行去除，其中该层析柱包含了结合容量约为10毫克每毫升的谷胱甘肽Sepharose 4 Fast Flow介质。该柱以谷胱甘肽Sepharose 4 Fast Flow介质进行填充后，用约5倍柱体积(CV)的含有25mM Tris-HCl，pH8.0的缓冲液B进行平衡。将细菌溶解得到的上清液上样后，以约20CV的缓冲液B洗柱，然后以约5CV的含有pH8.0，25mM Tris-HCl和0.15M NaCl的缓冲液C进行平衡。然后使用溶解在缓冲液C的凝血酶，其浓度为约10单位每毫升介质(或约1单位每毫克介质结合容量)。随后使用约3CV的缓冲液C过柱，收集从融合伴侣上分离的IL11(A)。所有的过程均在约20-25℃的室温下进行。
[0078]为检查IL-11是否存在任何内部裂解，可将IL-11先后采用阳离子交换层析和阴离子交换层析进行进一步的纯化，再使用基体辅助激光解吸电离质谱仪(MALDI-TOF/MS)(Proteomics SolutionI(Voyager-DE STR)，Applied Biosystems)进行分析。根据计算PI/MW工具(可由au.expasy.org/tools/pi_tool.html获取)得到的IL-11的预期分子量为18.26kDa，实际观察到了一个18264Da的峰(图3)。从这一结果可确定在凝血酶裂解GST-IL11(A)后得到了完整的IL-11蛋白。
[0079]更具体的说，通过亲和层析分离得到的重组IL-11蛋白首先采用CM Sepharose Fast Flow介质进行纯化。层析柱以该介质填充后用缓冲液B进行平衡。含有IL-11蛋白的样品以缓冲液B稀释约4倍后加载到层析柱上。洗柱时，先采用缓冲液B，然后采用含有0.15M Gly-NaOH，pH9.5的缓冲液E。靶蛋白可采用含有0.15M Gly-NaOH，pH 9.5和0.15M NaCl的缓冲液F进行洗脱。本步骤的所有过程均在约4℃下进行。
[0080]然后使用Q Sepharose Fast Flow介质对从阳离子交换柱洗脱的重组IL-11蛋白进一步纯化。采用含有1M Gly-NaOH，pH 9.5的缓冲液G对填充该介质的层析柱进行平衡。使用含有40mMGly-NaOH，pH9.5的缓冲液H对柱进行再平衡。将前一步骤获得的样品用水稀释约4倍，然后上柱。收集含有靶蛋白的流出液。使用含有40mM Gly-NaOH，pH 9.5的缓冲液H过柱，收集流出液。本步骤中的pH值约为9.5。阴离子交换层析的所有步骤均在室温左右进行。通过这些步骤有效去除了内毒素。
[0081]GST-IL11(A)融合蛋白含有新的凝血酶裂解序列Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQ ID NO：8)。尽管Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQ ID NO：8)序列包含了已知的Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQ ID NO：1)序列，凝血酶裂解并非发生在Arg↓Gly，而是在Arg↓Ala。这证明了凝血酶优选Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQ ID NO：8)而非Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQ ID NO：1)。
实施例2.GST-胸腺肽β4
[0082]GST-胸腺肽β4表达质粒pGEX-胸腺肽β4可通过在pGEX4T-1-Kan中插入胸腺肽β4的cDNA进行构建(图4)。编码人胸腺肽β4的cDNA可通过反转录(RT)-聚合酶链式反应(PCR)从由K562细胞获得的总RNA中克隆得到。用于PCR的寡聚核苷酸序列如下：
5′：GGATCCCCTCGAGCTTCTGACAAACCCGATATG(SEQID NO：18)BamHI
3′：GTCGACTTACGATTCGCCTGCTTGCTTCTC(SEQ ID NO：19)SalI
[0083]所设计的5’引物含有Gly-Ser-Pro-Arg↓Ala-Ser(SEQ IDNO：20)的编码序列，这样当PCR产物克隆进入pGEX4T-1表达质粒时可生成Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓Ala-Ser(SEQ ID NO：8)序列。
[0084]通过PCR可得到一个135bp的cDNA产物。将扩增产物克隆入pGEM-T Easy质粒(Promega，WI，USA)，获得pGEM-胸腺肽β4。经过序列确证后，pGEM-胸腺肽β4的BamHI/SalI片段被克隆入pGEX4T-1-Kan载体的相应位点，该载体可通过将pGEX4T-1中的氨苄西林耐药基因替换为卡那霉素耐药基因制备得到。
[0085]含有凝血酶裂解位点的胸腺肽β4的氨基酸序列如下：
Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓-Ala-Ser-Asp-Lys-Pro-Asp-Met-Ala-Glu-Ile-Glu-Lys-Phe-Asp-Lys-Ser-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Gln-Glu-Lys-Asn-Pro-Leu-Pro-Ser-Lys-Glu-Thr-Ile-Glu-Gln-Glu-Lys-Gln-Ala-Gly-Glu-Ser(SEQ ID NO：21)
[0086]该表达质粒被被转化进入E.coli DH5α。将转化株接种至LB培养基，在37℃下培养至OD600达到0.5，然后添加IPTG至终浓度为0.4mM。继续培养3小时，然后离心收集细胞。GST-胸腺肽β4的表达通过SDS-PAGE进行确认。将细胞再悬浮于50mM，pH8.0的Tris-HCl缓冲液中并采用超声溶解。采用谷胱甘肽Sepharose 4 Fast Flow从可溶组分中纯化GST-胸腺肽β4。
[0087]经纯化的融合蛋白以凝血酶进行消化，并以使用15％tricine分离凝胶的SDA-PAGE进行分析。100微克的蛋白样品可采用0.5单位的凝血酶在含有150mM NaCl和10mM还原型谷胱甘肽的pH8，25mM Tris-HCl的缓冲液中于20℃下进行裂解。在不同的时间点(反应开始后10分钟，30分钟，1小时以及3小时)从反应中取出等量的样品，通过煮沸5分钟进行热灭活终止反应。随反应时间的增加，融合蛋白GST-胸腺肽β4(31kDa)逐渐消失，而胸腺肽β4(5kDa)的数量逐渐增加(图5)。
[0088]以凝血酶裂解后，重新使用谷胱甘肽Sepharose 4 FastFlow对胸腺肽β4进行层析以去除融合蛋白的GST部分。使用Procise 491A HT蛋白测序仪(Applied Biosystems，USA)分析胸腺肽β4的N末端氨基酸序列。经确证分离后的胸腺肽β4在N末端具有序列Ala-Ser-Asp-Lys-Pro-Asp-Met-Ala-Glu-Ile(SEQ IDNO：22)。
[0089]为检查胸腺肽β4是否存在任何内部裂解，可将胸腺肽β4先后采用阳离子交换层析和阴离子交换层析进行进一步的纯化，再使用MALDI-TOF/MS(Proteomics Solution I(Voyager-DESTR)，Applied Biosystems)进行分析。根据计算PI/MW工具(可由au.expasy.org/tools/pi_tool.html获取)得到的胸腺肽β4的预期分子量为5.02kDa，实际观察到了一个4992Da的峰(图6)。从这一结果可确定在凝血酶裂解GST-胸腺肽β4后得到了完整的胸腺肽β4蛋白。
实施例3.GST-IL6
[0090]GST-IL6表达质粒pGEX-IL6可通过在pGEX4T-1中插入一个鼠IL-6的cDNA进行构建(图7)。编码鼠IL-6的cDNA可通过RT-PCR从由鼠树突细胞获得的总RNA中克隆得到。用于PCR的寡聚核苷酸序列如下：
5’：GGA TCC CCT CGA GCT TCT TTC CCT ACT TCA(SEQID NO：23)BamHI
3’：GTC GAC CTA GGT TTG CCG AGT AGA TCT(SEQ IDNO：24)SalI
[0091]所设计的5’引物含有Gly-Ser-Pro-Arg↓Ala-Ser(SEQ IDNO：20)的编码序列，这样当PCR产物克隆进入pGEX4T-1表达质粒时可生成Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓Ala-Ser(SEQ ID NO：8)序列。
[0092]通过PCR可得到588bp的cDNA。将扩增产物克隆入pGEM-T Easy质粒，获得pGEM-IL6。经过序列确证后，pGEM-IL6的BamHI/SalI片段被克隆入pGEX4T-1载体的相应位点。
[0093]含有凝血酶裂解位点的IL6的氨基酸序列如下：
Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓-Ala-Ser-Phe-Pro-Thr-Ser-Gln-VaI-Arg-Arg-Gly-Asp-Phe-Thr-Glu-Asp-Thr-Thr-Pro-Asn-Arg-Pro-Val-Tyr-Thr-Thr-Ser-Gln-Val-Gly-Gly-Leu-Ilu-Thr-His-Val-Leu-Trp-Glu-Ilu-Val-Glu-Met-Arg-Lys-Glu-Leu-Cys-Asn-Gly-Asn-Ser-Asp-Cys-Met-Asn-Asn-Asp-Asp-Ala-Leu-Ala-Glu-Asn-Asn-Leu-Lys-Leu-Pro-Glu-Ilu-Gln-Arg-Asn-Asp-Gly-Cys-Tyr-Gln-Thr-Gly-Tyr-Asn-Gln-Glu-Ilu-Cys-Leu-Leu-Lys-Ilu-Ser-Ser-Gly-Leu-Leu-Glu-Tyr-His-Ser-Tyr-Leu-Glu-Tyr-Met-Lys-Asn-Asn-Leu-Lys-Asp-Asn-Lys-Lys-Asp-Lys-Ala-Arg-Val-Leu-Gln-Arg-Asp-Thr-Glu-Thr-Leu-Ilu-His-Ilu-Phe-Asn-Gln-Glu-Val-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Ilu-Val-Leu-Pro-Thr-Pro-Ilu-Ser-Asn-Ala-Leu-Leu-Thr-Asp-Lys-Leu-Glu-Ser-Gln-Lys-Glu-Trp-Leu-Arg-Thr-Lys-Thr-Ilu-Gln-Phe-Ilu-Leu-Lys-Ser-Leu-Glu-Glu-Phe-Leu-Lys-Val-Thr-Leu-Arg-Ser-Thr-Arg-Gln-Thr(SEQ ID NO：25)
[0094]表达质粒随后被转化进入E.coli BL21。将转化株接种至添加了氨苄西林(最终浓度50μg/ml)的LB培养基中，在37℃下培养至OD600达到0.5，然后添加IPTG至终浓度为0.4mM。继续培养3小时，然后离心收集细胞。GST-IL6的表达通过SDS-PAGE进行确认。将细胞再悬浮于50mM，pH8.0的Tris-HCl缓冲液中并采用超声溶解。采用谷胱甘肽Sepharose 4 Fast Flow从可溶组分中纯化GST-IL6。
[0095]以凝血酶消化纯化后的融合蛋白并以SDS-PAGE进行分析。100微克的蛋白样品可采用0.5单位的凝血酶在含有150mMNaCl和10mM还原型谷胱甘肽的pH8，25mM Tris-HCl的缓冲液中于20℃下进行裂解在不同的时间点(反应开始后10分钟，30分钟，1小时，2小时以及3小时)从反应中取出等量的样品，通过煮沸5分钟进行热灭活终止反应。随反应时间的增加，融合蛋白GST-IL6(46kDa)逐渐消失，而IL6(22kDa)的数量逐渐增加(图8)。
[0096]欲检查凝血酶处理后是否发生裂解，可将含IL-6蛋白的蛋白条带进行氨基酸测序。首先，将纯化后的GST-IL6蛋白以凝血酶处理3小时，并用SDS-PAGE进行分离。然后将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上。在鉴别含有IL-6蛋白的条带后，将其从PVDF膜上切下，然后进行氨基酸测序。经确证IL-6在N末端具有序列Ala-Ser-Phe-Pro-Thr-Ser-Gln-Val-Arg-Arg(SEQ IDNO：26)。
实施例4.GST-PAR4
[0097]已知蛋白酶激活受体(PARs)可被N末端exodomain的蛋白水解激活(Kahn等，J.Clin.Invest.103：879(1999))。构成这一蛋白家族共有4个PARs(PAR1-4)，其中PAR1，3和4可被凝血酶激活(Coughlin，Proc.Natl.Acad.Sd.USA 96：11023(1999)).PAR4上的凝血酶裂解位点的氨基酸序列为Leu43-Pro-Ala-Pro-Arg↓-Gly-Tyr(SEQ ID NO：27)。我们生产了以Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓-Ala-Ser(SEQ ID NO：8)序列作为另一凝血酶裂解位点的GST-PAR4蛋白，以测试凝血酶优选哪一个位点。
[0098]GST-PAR4表达质粒pGEX-PAR4可通过在pGEX4T-1-Kan中插入人PAR4的cDNA进行构建(图9)。编码人PAR4的cDNA可通过RT-PCR从由K562细胞获得的总RNA中克隆得到用于PCR的寡聚核苷酸，序列如下：
5’：GGATCC CCT CGA GCT TCT ATG TGG GGG CGA(SEQID NO：28)BamHI
3’：GTCGAC TCA GTG CAC CAG GGC CAG GTA(SEQ IDNO：29)SalI
[0099]所设计的5’引物含有Gly-Ser-Pro-Arg↓Ala-Ser(SEQ IDNO：20)的编码序列，这样当PCR产物克隆进入pGEX4T-1-Kan质粒时可生成Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓Ala-Ser(SEQ ID NO：8)。
[0100]通过PCR可得到540bp的cDNA。将扩增产物克隆入pGEM-T Easy质粒，获得pGEM-PAR4。经过序列确证后，pGEM-PAR4的BamHI/SalI片段被克隆入pGEX4T-1-Kan载体的相应位点。
[0101]含有凝血酶裂解位点的PAR4的氨基酸序列如下：
Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓-Ala-Ser-Met-Trp-Gly-Arg-Leu-Leu-Leu-Trp-Pro-Leu-Val-Leu-Gly-Phe-Ser-Leu-Ser-Gly-Gly-Thr-Gln-Thr-Pro-Ser-Val-Tyr-Asp-Glu-Ser-Gly-Ser-Thr-Gly-Gly-Gly-Asp-Asp-Ser-Thr-Pro-Ser-Ile-Leu-Pro-Ala-Pro-Arg-Gly-Tyr-Pro-Gly-Gln-Val-Cys-Ala-Asn-Asp-Ser-Asp-Thr-Leu-Glu-Leu-Pro-Asp-Ser-Ser-Arg-Ala-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr-Val-Pro-Thr-Arg-Leu-Val-Pro-Ala-Leu-Tyr-Gly-Leu-Val-Leu-Val-Val-Gly-Leu-Pro-Ala-Asn-Gly-Leu-Ala-Leu-Trp-Val-Leu-Ala-Thr-Gln-Ala-Pro-Arg-Leu-Pro-Ser-Thr-Met-Leu-Leu-Met-Asn-Leu-Ala-Thr-Ala-Asp-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Ala-Leu-Pro-Pro-Arg-Ile-Ala-Tyr-His-Leu-Arg-Gly-Gln-Arg-Tyr-Pro-Phe-Gly-Glu-Ala-Ala-Cys-Arg-Leu-Ala-Thr-Ala-Ala-Leu-Tyr-Gly-His-Met-Tyr-Gly-Ser-Val-Leu-Leu-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Leu-Asp-Arg-Tyr-Leu-Ala-Leu-Val-His(SEQ ID NO：30)
下划线部分为内部凝血酶裂解位点。
[0102]表达质粒随后被转化进入E.coli BL21。将转化株接种至添加了卡那霉素(最终浓度50μg/ml)的LB培养基中，在37℃下培养至OD600达到0.5，然后添加IPTG至终浓度为0.4mM。继续培养3小时，然后离心收集细胞。GST-P AR4的表达通过SDS-PAGE进行确认。将细胞再悬浮于50mM，pH8.0的Tris-HCl缓冲液中并采用超声溶解。采用谷胱甘肽Sepharose 4 Fast Flow从可溶组分中纯化GST-PAR4。
[0103]经纯化的融合蛋白以凝血酶进行消化，并以SDA-PAGE进行分析。100微克的蛋白样品可采用0.5单位的凝血酶在含有150mM NaCl和10mM还原型谷胱甘肽的pH8，25mM Tris-HCl的缓冲液中于20℃下进行裂解。在不同的时间点(反应开始后10分钟，30分钟，1小时，2小时以及3小时)从反应中取出等量的样品，通过煮沸5分钟进行热灭活终止反应。
实施例5.GST-ILIl(LV-)
[0104]为测试进行有效的凝血酶裂解是否需要完整的Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQ ID NO：8)序列，构建了编码Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQ ID NO：7)作为凝血酶裂解位点的表达质粒。首先参照实施例1的方法从pGEX4T-IL11(A)中获取含有IL-11(A)的BamHI/SalI片段。然后将其插入pGEX6P-2的BamHI/SalI位点，获得pGEX6P-IL11。质粒pGEX6P-2在BamHI位点的上游含有“Pro-Leu”序列。因此，由于含有IL-11(A)的BamHI/SalI片段以Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQ ID NO：20)序列起始，所以pGEX6P-IL 11可以具有Pro-Leu-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQ ID NO：31)。通过定点突变将第二个氨基酸Leu该为Arg，以得到Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQ ID NO：7)序列。下述寡聚核苷酸序列被用于定点突变：
5’：CAG GGG CCC CGG GGA TCC CCT CGA GCT(SEQIDNO：32)
3’：AGC TCG AGG GGA TCC CCG GGG CTG(SEQIDNO：33)
[0105]所得的质粒被命名为pGEX-IL11(LV-)(图10)，用于GST-IL11(LV-)的生产。
[0106]含有凝血酶裂解位点的IL-11(LV-)的氨基酸序列如下：
Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓-AIa-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-Asp-Ser-Thr-Val-Leu-Leu-Thr-Arg-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Arg-Gln-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Arg-Asp-Lys-Phe-Pro-Ala-Asp-Gly-Asp-His-Asn-Leu-Asp-Ser-Leu-Pro-Thr-Leu-Ala-Met-Ser-Ala-Gly-Ala-Leu-Gly-Ala-Leu-Gln-Leu-Pro-Gly-Val-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Ala-Asp-Leu-Leu-Ser-Tyr-Leu-Arg-His-VaI-Gln-Trp-Leu-Arg-Arg-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-Leu-Lys-Thr-Leu-Glu-Pro-Glu-Leu-Gly-Thr-Leu-Gln-Ala-Arg-Leu-Asp-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Gln-Leu-Leu-Met-Ser-Arg-Leu-Ala-Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Pro-Asn-Pro-Pro-Ala-Pro-Pro-Leu-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Ala-Try-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-His-Ala-Ile-Leu-Gly-Gly-Leu-His-Leu-Thr-Leu-Asp-Trp-Ala-Val-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Thr-Arg-Leu(SEQ ID NO：34)
[107]表达质粒随后被转化进入E.coli BL21。将转化株接种至添加了氨苄西林(最终浓度50μg/ml)的LB培养基中，在37℃下培养至OD600达到0.5，然后添加IPTG至终浓度为0.4mM。继续培养3小时，然后离心收集细胞。GST-IL11(LV-)的表达通过SDS-PAGE进行确认。将细胞再悬浮于50mM，pH8.0的Tris-HCl缓冲液中并采用超声溶解。采用谷胱甘肽Sepharose 4 Fast Flow从可溶组分中纯化GST-IL11(LV-)。
[0108]经纯化的融合蛋白以凝血酶进行消化，并以SDA-PAGE进行分析.100微克的蛋白样品可采用0.5单位的凝血酶在含有150mM NaCl的pH8，25mM Tris-HCl的缓冲液中于20℃下进行裂解在不同的时间点(反应开始后10分钟，30分钟，1小时，2小时以及3小时)从反应中取出等量的样品，通过煮沸5分钟进行热灭活终止反应。随反应时间的增加，融合蛋白GST-IL11(LV-)(44kDa)逐渐消失，而IL-11(LV-)(18kDa)的数量逐渐增加(图11)。
[0109]欲检查凝血酶处理后是否发生裂解，可将含IL-11(LV-)蛋白的蛋白条带进行氨基酸测序。首先，将纯化后的GST-IL11(LV-)蛋白以凝血酶处理3小时，并用SDS-PAGE进行分离。然后将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上。在鉴别含有IL-11(LV-)蛋白的条带后，将其从PVDF膜上切下，然后进行氨基酸测序。经确证IL-11(LV-)在其N末端具有序列Ala-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-Asp(SEQ ID NO：35)，说明Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQ ID NO：7)已足够进行有效的凝血酶裂解。
实施例6.MBP-IL11
[0110]MBP-IL11表达质粒pMAL-c2-IL11可通过在pMAL-c2中插入人IL-11的cDNA进行构建(图12)。编码人IL-11的cDNA可从pGEX4T-IL11(A)通过PCR获取。用于PCR的寡聚核苷酸序列如下：
5’：GAA TTC CCT CGA GGT TCA CCT CGA GCT TCC(SEQID NO：36)EcoRI
3’：GTC GAC TCA CAG CCG AGT CTT CAG CAG(SEQ IDNO：37)SalI
[0111]所设计的5’引物含有Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓Ala-Ser(SEQ ID NO：7)的编码序列。含有IL-11序列的EcoRI/SalI片段被克隆入pMAL-c2载体的EcoRI/SalI位点，得到pMAL-c2-IL11。因此，pMAL-c2-IL11与pGEX-IL11(LV-)在麦芽糖结合域和人IL-11序列之间具有相同的凝血酶裂解位点。
[0112]在麦芽糖结合域下游含有凝血酶裂解位点的IL-11的氨基酸序列如下：
Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓-Ala-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-Asp-Ser-Thr-Val-Leu-Leu-Thr-Arg-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Arg-Gln-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Arg-Asp-Lys-Phe-Pro-Ala-Asp-Gly-Asp-His-Asn-Leu-Asp-Ser-Leu-Pro-Thr-Leu-Ala-Met-Ser-Ala-Gly-Ala-Leu-Gly-Ala-Leu-Gln-Leu-Pro-Gly-Val-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Ala-Asp-Leu-Leu-Ser-Tyr-Leu-Arg-His-Val-Gln-Trp-Leu-Arg-Arg-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-Leu-Lys-Thr-Leu-Glu-Pro-Glu-Leu-Gly-Thr-Leu-Gln-Ala-Arg-Leu-Asp-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Gln-Leu-Leu-Met-Ser-Arg-Leu-Ala-Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Pro-Asn-Pro-Pro-Ala-Pro-Pro-Leu-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Ala-Try-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-His-Ala-Ile-Leu-Gly-Gly-Leu-His-Leu-Thr-Leu-Asp-Trp-Ala-Val-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Thr-Arg-Leu(SEQ ID NO：34)
[0113]表达质粒随后被转化进入E.coli BL21。将转化株接种至添加了氨苄西林(最终浓度50μg/ml)的LB培养基中，在37℃下培养至OD600达到0.5，然后添加IPTG至终浓度为0.4mM。继续培养3小时，然后离心收集细胞。MBP-IL11的表达通过SDS-PAGE进行确认。将细胞再悬浮于含有200mM NaCl，1mM EDTA和1mM叠氮化钠的20mM，pH8.0的Tris-HCl缓冲液中并采用超声溶解。含有靶蛋白的上清液加至以含有200mM NaCl和1mM EDTA的20mM，pH7.4的Tris-HCl缓冲液进行预平衡的直链淀粉(New EnglandBiolabs)亲和柱。多次洗涤后，用含有200mM NaCl，1mM EDTA和10mM麦芽糖的20mM，pH7.4的Tris-HCl缓冲液洗脱结合的融合蛋白。
[0114]经纯化的融合蛋白以凝血酶进行消化，并以SDA-PAGE进行分析。100微克的蛋白样品可采用0.5单位的凝血酶在含有200mM NaCl，1mM EDTA和10mM麦芽糖的20mM，pH7.4的Tris-HCl的缓冲液中于20℃下进行裂解在不同的时间点(反应开始后10分钟，30分钟，1小时，2小时以及3小时)从反应中取出等量的样品，通过煮沸5分钟进行热灭活终止反应。随反应时间的增加，融合蛋白MBP-IL11(60kDa)逐渐消失，而IL11(18kDa)的数量逐渐增加(图13)。
[0115]欲检查凝血酶处理后是否发生裂解，可将含IL-11蛋白的蛋白条带进行氨基酸测序。首先，将纯化后的MBP-IL11蛋白以凝血酶处理3小时，并用SDS-PAGE进行分离。然后将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上。在鉴别含有IL-11蛋白的条带后，将其从PVDF膜上切下，然后进行氨基酸测序。经确证IL-11在其N末端具有序列Ala-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-Asp(SEQ IDNO：38)，说明Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQ ID NO：7)已足够进行有效的凝血酶裂解。
实施例7.HIS-IL 11
[0116]His-IL11表达质粒pET19b-IL11可通过在pET-19b中插入人IL-11的cDNA进行构建(图14)。编码人IL-11的cDNA可从pGEX4T-IL11(A)通过PCR获取。用于PCR的寡聚核苷酸序列如下：
5’：CAT ATG CCT CGA GGT TCA CCT CGA GCT TCC(SEQIDNO：39)Ndel
3’：GGA TCC TCA CAG CCG AGT CTT CAG CAG(SEQ DDNO：40)BamHI
[0117]所设计的5’引物含有Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓Ala-Ser(SEQ ID NO：7)的编码序列。含有IL-11序列的NdeI/BamHI片段被克隆至pET19b载体上的NdeI/BamHI位点，并得到pET19b-IL11。因此，pET19b-IL11与pGEX-IL11(LV-)在His标签和人IL-11序列之间具有相同的凝血酶裂解位点。
[0118]在His标签下游含有凝血酶裂解位点的IL-11的氨基酸序列如下：
Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓-AIa-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-Asp-Ser-Thr-Val-Leu-Leu-Thr-Arg-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Arg-Gln-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Arg-Asp-Lys-Phe-Pro-Ala-Asp-Gly-Asp-His-Asn-Leu-Asp-Ser-Leu-Pro-Thr-Leu-Ala-Met-Ser-Ala-Gly-Ala-Leu-Gly-Ala-Leu-Gln-Leu-Pro-Gly-Val-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Ala-Asp-Leu-Leu-Ser-Tyr-Leu-Arg-His-Val-Gln-Trp-Leu-Arg-Arg-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-Leu-Lys-Thr-Leu-Glu-Pro-Glu-Leu-Gly-Thr-Leu-Gln-Ala-Arg-Leu-Asp-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Gln-Leu-Leu-Met-Ser-Arg-Leu-Ala-Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Pro-Asn-Pro-Pro-Ala-Pro-Pro-Leu-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Ala-Try-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-His-Ala-Ile-Leu-Gly-Gly-Leu-His-Leu-Thr-Leu-Asp-Trp-Ala-Val-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Thr-Arg-Leu(SEQ ID NO：34)
[0119]将表达质粒转化进入E.coli BL21(DE3)。将转化株接种至添加了氨苄西林(最终浓度50μg/ml)的LB培养基中，在37℃下培养至OD600达到0.5，然后添加IPTG至终浓度为0.4mM。继续培养3小时，然后离心收集细胞。His-IL11的表达通过SDS-PAGE进行确认。将细胞再悬浮于含有0.5M NaCl的20mM，pH7.4的Tris-HCl缓冲液中并采用超声溶解。含有靶蛋白的上清液加至以含有0.5mM NaCl和20mM咪唑的20mM，pH7.4的磷酸钠缓冲液进行预平衡的Ni-Sepharose高效(Amersham Biosciences)亲和柱。多次洗涤后，用含有0.5mM NaCl和500mM咪唑的20mM，pH7.4的磷酸钠缓冲液洗脱结合的融合蛋白。
[0120]经纯化的融合蛋白以凝血酶进行消化，并以SDA-PAGE进行分析。100微克的蛋白样品可采用0.5单位的凝血酶在含有0.5mM NaCl和500mM咪唑的20mM，pH7.4的磷酸钠缓冲液中于20℃下进行裂解。在不同的时间点(反应开始后10分钟，30分钟，1小时，2小时以及3小时)从反应中取出等量的样品，通过煮沸5分钟进行热灭活终止反应。随反应时间的增加，融合蛋白His-IL11(22kDa)逐渐消失，而IL11(18kDa)的数量逐渐增加(图15)。
[0121]欲检查凝血酶处理后是否发生裂解，可将含IL-11蛋白的蛋白条带进行氨基酸测序。首先，将纯化后的His-IL11蛋白以凝血酶处理3小时，并用SDS-PAGE进行分离。然后将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上。在鉴别含有IL-11蛋白的条带后，将其从PVDF膜上切下，然后进行氨基酸测序。经确证IL-11在其N末端具有序列Ala-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-Asp(SEQ IDNO：41)，说明Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQ ID NO：7)已足够进行有效的凝血酶裂解。
[0122]现在经过对发明的完整描述，本领域的普通技术人员均能理解在一个宽泛且等效的条件，配方和其他参数范围内可实现同等效果而不影响本发明和其中任意实施例的范围。此处所引用的专利，专利申请以及出版物均在此完整引入作为参考。

Claims (93)

1.一种包含以下序列的肽接头：
X1-X2-Ser-Pro-X3-X4-X5
其中：
X1是两个或两个以上彼此相同或不同的氨基酸残基；
X2是疏水氨基酸残基；
X3是精氨酸或赖氨酸；
X4是丙氨酸或甘氨酸；以及
X5是一种非酸性氨基酸。
2.如权利要求1所述的肽接头，其中X1是4个或4个以上的氨基酸残基。
3.如权利要求1所述的肽接头，其中X1是不超过10个的氨基酸残基。
4.如权利要求1所述的肽接头，其中X1包含脯氨酸和精氨酸。
5.如权利要求1所述的肽接头，其中X2选自由甘氨酸，丙氨酸，脯氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸以及色氨酸所组成的群。
6.如权利要求5所述的肽接头，其中X2是甘氨酸。
7.如权利要求1所述的肽接头，其中X5选自由丝氨酸，丙氨酸，天门冬酰胺，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，赖氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸以及色氨酸所组成的群。
8.如权利要求7所述的肽接头，其中X5是丝氨酸。
9.如权利要求1所述的肽接头，其特征在于，包含序列Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQ ID NO：7)。
10.如权利要求1所述的肽接头，其特征在于，包含序列Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQ ID NO：8)。
11.一种融合蛋白，其包含个目标蛋白，融合伴侣以及插在两者之间的肽接头；所述肽接头包含以下序列：
X1-X2-Ser-Pro-X3-X4-X5
其中：
X1是两个或两个以上彼此相同或不同的氨基酸残基；
X2是疏水氨基酸残基；
X3是精氨酸或赖氨酸；
X4是丙氨酸或甘氨酸；以及
X5是一种非酸性氨基酸。
12.如权利要求11所述的融合蛋白，其中，所述的目标蛋白选自由白介素(IL)-11，胸腺肽β4，胸腺肽α1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-10，IL-13，IL-15，IL-18，蛋白酶激活受体1(PAR1)，PAR3，PAR4，RANTES，基质细胞衍生因子-1α，单核细胞趋化蛋白，干细胞因子，FLT-3L，甲状旁腺激素，血小板生成素，表皮细胞生长因子，碱性成纤维细胞生长因子，胰岛素样生长因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，粒细胞集落刺激因子，巨噬细胞集落刺激因子，血小板源生长因子，转化生长因子(TGF)-β1，肿瘤坏死因子(TNF)-α，干扰素(IFN)-α，IFN-β，IFN-γ，肝细胞生长因子，血管内皮生长因子以及免疫球蛋白重链所组成的群。
13.如权利要求12所述的融合蛋白，其中所述的目标蛋白选自由人IL 11，胸腺肽β4，IL-6和PAR4所组成的群。
14.如权利要求12所述的融合蛋白，其中所述的目标蛋白为人IL 11。
15.如权利要求11所述的融合蛋白，其中所述的融合伴侣是一种亲和肽。
16.如权利要求15所述的融合蛋白，其中所述的融合伴侣选自由谷胱甘肽s转移酶(GST)，麦芽糖结合蛋白(MBP)，六聚组氨酸，T7多肽，泛素，Flag多肽，c-myc多肽，聚精氨酸，聚半胱氨酸，聚苯丙氨酸，BTag，半乳糖结合域，纤维素结合域(CBD)，硫氧还蛋白，匍萄球菌蛋白A，链球菌蛋白G，钙调蛋白，β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶，S-多肽，链霉亲和素，His-标签和Strep-标签所组成的群。
17.如权利要求16所述的融合蛋白，其中所述的融合伴侣是GST。
18.一种从权利从要求11所述的融合蛋白分离目标蛋白的方法，包括使融合蛋白与足够量的凝血酶接触从而引起肽接头的裂解。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述的融合蛋白在肽接头的X3和X4间断裂。
20.如权利要求18所述的方法，其中所述的凝血酶为人凝血酶。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述的融合蛋白与约0.1单位至约1.0单位的凝血酶接触。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述的融合蛋白与约0.2单位至约0.7单位的凝血酶接触。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述的融合蛋白与约0.2单位至约0.5单位的凝血酶接触。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述的融合蛋白与约0.2单位至约0.3单位的凝血酶接触。
25.如权利要求20所述的方法，其中所述的融合蛋白与凝血酶接触约5分钟至约1.5小时。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述的融合蛋白与凝血酶接触约8分钟至约1.2小时。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述的融合蛋白与凝血酶接触约10分钟至约1.0小时。
28.如权利要求20所述的方法，其中所述的融合蛋白与约0.25单位凝血酶接触约30分钟。
29.如权利要求18所述的方法，其中所述的凝血酶为牛凝血酶。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述的融合蛋白与约0.1单位至约1.0单位的凝血酶接触。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述的融合蛋白与约0.2单位至约0.7单位的凝血酶接触。
32.如权利要求29所述的方法，其中所述的融合蛋白与凝血酶接触约5分钟至约1.5小时。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述的融合蛋白与凝血酶接触约8分钟至约1.2小时。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述的融合蛋白与凝血酶接触约10分钟至约1.0小时。
35.如权利要求29所述的方法，其中所述的融合蛋白与约0.5单位凝血酶接触约1.0小时。
36.一种编码权利要求1所述的肽接头的多聚核苷酸。
37.如权利要求36所述的多聚核苷酸，其中所述肽接头中的X2选自由甘氨酸，丙氨酸，脯氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸以及色氨酸所组成的群。
38.如权利要求37所述的多聚核苷酸，其中所述肽接头中的X2是甘氨酸。
39.如权利要求36所述的多聚核苷酸，其中所述肽接头中的X5选自由丝氨酸，丙氨酸，天门冬酰胺，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，赖氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸以及色氨酸所组成的群。
40.如权利要求39所述的多聚核苷酸，其中所述肽接头中的X5是丝氨酸。
41.如权利要求36所述的多聚核苷酸，其中所述肽接头包含序列Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQ ID NO：7)。
42.如权利要求36所述的多聚核苷酸，其中所述肽接头包含序列Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser(SEQ ID NO：8)。
43.一种编码权利要求11所述融合蛋白的多聚核苷酸。
44.如权利要求43所述的多聚核苷酸，其中所述的目标蛋白选自由白介素(IL)-11，胸腺肽β4，胸腺肽α1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-10，IL-13，IL-15，IL-18，蛋白酶激活受体1(PAR1)，PAR3，PAR4，RANTES，基质细胞衍生因子-1α，单核细胞趋化蛋白，干细胞因子，FLT-3L，甲状旁腺激素，血小板生成素，表皮细胞生长因子，碱性成纤维细胞生长因子，胰岛素样生长因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，粒细胞集落刺激因子，巨噬细胞集落刺激因子，血小板源生长因子，转化生长因子(TGF)-β1，肿瘤坏死因子(TNF)-α，干扰素(IFN)-α，IFN-β，IFN-γ，肝细胞生长因子，血管内皮生长因子以及免疫球蛋白重链所组成的群。
45.如权利要求44所述的多聚核苷酸，其中所述的目标蛋白为人IL11。
46.如权利要求43所述的多聚核苷酸，其中所述的融合伴侣是一种亲和肽。
47.如权利要求46所述的多聚核苷酸，其中所述的融合伴侣选自由谷胱甘肽s转移酶(GST)，麦芽糖结合蛋白(MBP)，六聚组氨酸，T7多肽，泛素，Flag多肽，c-myc多肽，聚精氨酸，聚半胱氨酸，聚苯丙氨酸，BTag，半乳糖结合域，纤维素结合域(CBD)，硫氧还蛋白，葡萄球菌蛋白A，链球菌蛋白G，钙调蛋白，β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶，S-多肽，链霉亲和素，His-标签和Strep-标签所组成的群。
48.如权利要求47所述的多聚核苷酸，其中所述的融合伴侣是GST。
49.一种包含权利要求43所述多聚核苷酸的载体。
50.如权利要求49所述的载体，其进一步包含一个或多个可操作地连接至所述多聚核苷酸的调节序列。
51.一种包含权利要求50所述载体的宿主细胞。
52.如权利要求51所述的宿主细胞，其中所述的宿主细胞为原核细胞。
53.如权利要求51所述的宿主细胞，其中所述的宿主细胞为真核细胞。
54.一种包含权利要求36所述多聚核苷酸的载体。
55.如权利要求54所述的载体，进一步包含一个或多个位于所述多聚核苷酸的上游和/或下游的克隆位点。
56.如权利要求54所述载体，进一步包含一种位于所述多聚核苷酸的上游和/或下游并与该多聚核苷酸同框的编码融合伴侣的多聚核苷酸。
57.如权利要求54所述的载体，其进一步包含一个或多个可操作地连接至所述多聚核苷酸的调节元件。
58.一种包含权利要求54所述载体的宿主细胞。
59.如权利要求58所述的宿主细胞，其中所述的宿主细胞为原核细胞。
60.如权利要求58所述的宿主细胞，其中所述的宿主细胞为真核细胞。
61.一种制备编码融合蛋白的多聚核苷酸的方法，其包括在权利要求55所述的载体的克隆位点插入编码目标蛋白的多聚核苷酸。
62.一种制备融合蛋白的方法，包括：
a)制备包含一种编码融合蛋白的多聚核苷酸的载体，所述融合蛋白包含目标蛋白，融合伴侣以及插在两者之间的如权利要求1所述的肽接头；
b)将所述载体转入宿主细胞；
c)在融合蛋白表达的条件下培养所述的宿主细胞；以及
d)分离所述融合蛋白。
63.一种制备目标蛋白的方法，包括：
a)制备包含一种编码融合蛋白的多聚核苷酸的载体，所述融合蛋白包含目标蛋白，融合伴侣以及插在两者之间的如权利要求1所述的肽接头；
b)将所述载体转入宿主细胞；
c)在融合蛋白表达的条件下培养所述的宿主细胞；
d)分离所述融合蛋白；
e)将所述融合蛋白与凝血酶进行接触以裂解所述融合蛋白；以及
f)分离所述目标蛋白。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述的宿主细胞是真核细胞。
65.如权利要求63所述的方法，其中所述的宿主细胞是原核细胞。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述的宿主细胞是细菌细胞。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述的细菌细胞在步骤(d)中采用高压进行溶解。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述的细菌细胞以高压匀浆机进行溶解。
69.如权利要求63所述的方法，其中对所述融合细胞的所述分离采用亲和柱进行。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述融合蛋白与凝血酶的接触在所述融合蛋白结合在所述亲和柱上时进行。
71.如权利要求69所述的方法，其中所述融合蛋白的所述分离进一步包括对所述目标蛋白进行阳离子交换层析。
72.如权利要求69所述的方法，其中所述融合蛋白的所述分离进一步包括对所述目标蛋白进行阴离子交换层析。
73.如权利要求63所述的方法，其中所述的凝血酶为人凝血酶。
74.如权利要求73所述的方法，其中所述的融合蛋白与约0.1单位至约1.0单位的凝血酶接触。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述的融合蛋白与约0.2单位至约0.7单位的凝血酶接触。
76.如权利要求75所述的方法，其中所述的融合蛋白与约0.2单位至约0.5单位的凝血酶接触。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述的融合蛋白与约0.2单位至约0.3单位的凝血酶接触。
78.如权利要求73所述的方法，其中所述的融合蛋白与凝血酶接触约5分钟至约1.5小时。
79.如权利要求78所述的方法，其中所述的融合蛋白与凝血酶接触约8分钟至约1.2小时。
80.如权利要求79所述的方法，其中所述的融合蛋白与凝血酶接触约10分钟至约1.0小时。
81.如权利要求73所述的方法，其中所述的融合蛋白与约0.25单位凝血酶接触约30分钟。
82.如权利要求81所述的方法，其中所述的凝血酶为牛凝血酶
83.如权利要求82所述的方法，其中所述的融合蛋白与约0.1单位至约1.0单位的凝血酶接触。
84.如权利要求83所述的方法，其中所述的融合蛋白与约0.2单位至约0.7单位的凝血酶接触。
85.如权利要求82所述的方法，其中所述的融合蛋白与凝血酶接触约5分钟至约1.5小时。
86.如权利要求85所述的方法，其中所述的融合蛋白与凝血酶接触约8分钟至约1.2小时。
87.如权利要求86所述的方法，其中所述的融合蛋白与凝血酶接触约10分钟至约1.0小时。
88.如权利要求82所述的方法，其中所述的融合蛋白与约0.5单位凝血酶接触约1.0小时。
89.一种包含权利要求54所述载体的试剂盒。
90.如权利要求89所述的试剂盒，其中所述载体进一步包含一个或多个位于所述多聚核苷酸的上游和/或下游的克隆位点。
91.如权利要求89所述试剂盒，其中所述载体进一步包含一种位于所述多聚核苷酸的上游和/或下游并与该多聚核苷酸同框的编码融合伴侣的多聚核苷酸。
92.如权利要求89所述的试剂盒，其中所述载体进一步包含一个或多个可操作地连接至所述多聚核苷酸的调节元件。
93.如权利要求89所述的试剂盒，进一步包含对所述载体的使用说明。
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