CN111148764A - 用于乳腺癌的ErbB-2/ErbB-3双特异性抗体与内分泌治疗的组合 - Google Patents
用于乳腺癌的ErbB-2/ErbB-3双特异性抗体与内分泌治疗的组合 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及治疗患有乳腺癌或处于患有所述癌症之风险中的对象的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的ErbB‑2/ErbB‑3双特异性抗体与治疗有效量的内分泌治疗药物的组合，其中所述双特异性抗体具有可结合ErbB‑2的胞外部分的抗原结合位点和可结合ErbB‑3的胞外部分的抗原结合位点；以及用于所述方法的装置。
Description
本申请要求于2017年5月17日提交的US申请No.62/507,675的优先权，其内容通过引用在此并入。
本发明涉及抗体领域。具体地，其涉及用于治疗涉及异常细胞的疾病的治疗性(人)抗体领域。更具体地，其涉及可结合ErbB-2和ErbB-3的抗体，以及用这些抗体与内分泌治疗药物组合来治疗患有乳腺癌的对象。
某些类型的乳腺癌会受血液中激素的影响。雌激素受体(Estrogen receptor，ER)阳性和孕酮受体(progesterone receptor，PR)阳性乳腺癌细胞具有附着于激素的受体，其有助于所述癌细胞的生长。大约三分之二的乳腺癌是激素受体阳性的。其细胞具有附着于雌激素(ER阳性癌症)和/或孕酮激素(PR阳性癌症)的受体。对于这些癌症，高雌激素水平有助于癌细胞生长和扩散。
存在干扰这种机制的多种药物。
阻断雌激素受体的药物
这些药物通过阻止雌激素影响乳腺癌细胞而发挥作用。这样的药物的一个实例是他莫昔芬(Tamoxifen)。该药物阻断乳腺癌细胞中的雌激素受体。其阻止了雌激素与癌细胞结合并阻止其命令癌细胞生长和分裂。尽管他莫昔芬在乳腺细胞中充当抗雌激素，但其在其他组织(例如子宫和骨)中充当雌激素。因此，其被称为选择性雌激素受体调节剂(selective estrogen receptor modulator，SERM)。他莫昔芬是最著名的SERM之一。其他已批准用于医学用途的SERM包括巴多昔芬(bazedoxifene，Duavee)、溴帕雌烯(broparestrol，Acnestrol)、氯米芬(clomifene，Clomid)、环芬尼(cyclofenil，Sexovid)、拉索昔芬(lasofoxifene，Fablyn)、奥美昔芬(ormeloxifene，Centron、Novex、Novex-DS、Sevista)、奥培米芬(ospemifene，Osphena)、雷洛昔芬(raloxifene，Evista)、他莫昔芬(Nolvadex)和托瑞米芬(toremifene，Fareston)，其中一些已被批准用于治疗激素受体阳性乳腺癌。更多的SERM还(尚)未被批准，但其也是功能性的。
他莫昔芬可在手术之后(辅助治疗)或手术之前(新辅助治疗)开始，并且其通常服用5至10年。绝经之后，可使用芳香酶抑制剂。
在处于乳腺癌之高风险中的女性中，他莫昔芬可用于帮助降低发生乳腺癌的风险。
托瑞米芬(Fareston)是目前被批准用于治疗转移性乳腺癌的另一种SERM。这些药物大多数是经口服用的，最经常是作为丸剂服用。
氟维司群(Faslodex)
氟维司群是阻断雌激素受体并且还暂时消除所述雌激素受体的药物。氟维司群是选择性雌激素受体降解剂(selective estrogen receptor degrader，SERD)。其他SERD包括Brilanestrant和Elacestrant。氟维司群用于治疗转移性乳腺癌，包括在其他激素药物(例如他莫昔芬和通常芳香酶抑制剂)已经停止发挥作用之后使用。
其可通过肌内注射施用。氟维司群目前被批准用于绝经后女性。
芳香酶抑制剂(aromatase inhibitor，AI)
芳香酶抑制剂(AI)是阻止雌激素产生的药物。绝经之前，大多数雌激素是由卵巢制造的。但是对于由于绝经或医学治疗而使其卵巢不再发挥作用的女性来说，脂肪组织、乳房或皮肤中的酶(被称为芳香酶)仍然会制造少量的雌激素。可以理解，AI通过阻断芳香酶制造雌激素而发挥作用。
这些药物用于绝经后女性，但其如果与卵巢切除去势术(ovarian ablation)组合也可用于绝经前女性。
存在多种AI。示例性的AI包括：来曲唑(Letrozole，Femara)；阿那曲唑(Anastrozole，Arimidex)和依西美坦(Exemestane，Aromasin)。
这些药物是可每天服用的丸剂。
对于其癌症是激素受体阳性的绝经后女性，医生可建议在辅助治疗期间服用AI。
促黄体素释放素(Luteinizing hormone-releasing hormone，LHRH)类似物：这些药物比卵巢切除术更常用。可以理解，其阻止身体发送至卵巢以产生雌激素的信号，从而导致暂时绝经。常见的LHRH药物包括戈舍瑞林(Goserelin，Zoladex)和亮丙瑞林(Leuprolide，Lupron)。其可单独使用或者与其他激素药物(他莫昔芬、芳香酶抑制剂、氟维司群)一起使用作为绝经前女性中的激素治疗。
化学治疗药物：一些化学治疗药物可损害绝经前女性的卵巢，因此使其不再制造雌激素。对于一些女性，卵巢功能会在数月或数年之后恢复，但是在另一些女性中，对卵巢的损害是永久性的，并导致绝经。
以上提及的药物被统称为乳腺癌的内分泌治疗药物。最近，Lumachi等(Lumachi，F.，等，“Endocrine therapy of breast cancer.”Current medicinal chemistry 18.4(2011)：513-522)已经对内分泌治疗及伴随药物进行了综述。在本发明的上下文中，内分泌治疗药物是指用于乳腺癌的内分泌治疗的药物。
在本文中描述的本发明的上下文中，术语内分泌治疗包括干扰激素(通常是癌细胞中的雌激素或孕酮激素)的作用的治疗药物。这可直接通过药物在癌细胞中的作用，或间接通过例如降低可到达癌细胞的雌激素的量，包括通过直接或间接干扰雌激素对肿瘤的作用来进行。
发明内容
本发明提供了治疗患有乳腺癌或处于患有所述癌症之风险中的对象的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的ErbB-2/ErbB-3双特异性抗体和治疗有效量的内分泌治疗药物的组合，其中双特异性抗体具有可结合ErbB-2的胞外部分的抗原结合位点和可结合ErbB-3的胞外部分的抗原结合位点。
本发明提供了ErbB-2/ErbB-3双特异性抗体和内分泌治疗药物的组合，其用于治疗患有乳腺癌或处于患有所述癌症之风险中的对象，其中双特异性抗体具有可结合ErbB-2的胞外部分的抗原结合位点和可结合ErbB-3的胞外部分的抗原结合位点。
本发明还提供了ErbB-2/ErbB-3双特异性抗体和内分泌治疗药物在制备用于治疗患有乳腺癌或处于患有所述癌症之风险中的对象的药物中的用途，其中双特异性抗体具有可结合ErbB-2的胞外部分的抗原结合位点和可结合ErbB-3的胞外部分的抗原结合位点。
还提供了包含ErbB-2/ErbB-3双特异性抗体和内分泌治疗药物的产品，所述ErbB-2/ErbB-3双特异性抗体和内分泌治疗药物同时、单独或顺序地用于治疗患有乳腺癌或处于患有所述癌症之风险中的对象，其中双特异性抗体具有可结合ErbB-2的胞外部分的抗原结合位点和可结合ErbB-3的胞外部分的抗原结合位点。
本发明还提供了治疗患有乳腺癌或处于患有所述癌症之风险中的对象的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的抗体，该抗体可结合ErbB-2的胞外部分并抑制癌细胞上的ErbB-2/ErbB-3二聚化，其中癌症是激素受体阳性癌症。
还提供了可结合ErbB-2的胞外部分并抑制癌细胞上的ErbB-2/ErbB-3二聚化的抗体，其用于治疗患有乳腺癌或处于患有所述癌症之风险中的对象，其中所述癌症是激素受体阳性癌症。
还提供了ErbB-2和/或ErbB-3抗体与内分泌治疗药物的组合，其用于治疗患有乳腺癌或处于患有所述癌症之风险中的对象，其中乳腺癌是激素受体阳性乳腺癌，并且其中抗体抑制ErbB-2、ErbB-3二聚化。
本发明还提供了ErbB-2和/或ErbB-3抗体和内分泌治疗药物在制备用于治疗患有乳腺癌或处于患有所述癌症之风险中的对象的药物中的用途，其中乳腺癌是激素受体阳性乳腺癌，并且其中抗体抑制ErbB-2、ErbB-3二聚化。
还提供了包含ErbB-2和/或ErbB-3抗体和内分泌治疗药物的产品，所述ErbB-2和/或ErbB-3抗体和内分泌治疗药物同时、单独或顺序地用于治疗患有乳腺癌或处于患有所述癌症之风险中的对象，其中癌症是激素受体阳性癌症，并且其中抗体抑制ErbB-2、ErbB-3二聚化。
抗体优选为双特异性抗体，其具有可结合ErbB-2的胞外部分的抗原结合位点和可结合ErbB-3的胞外部分的抗原结合位点。在一个实施方案中，所述方法还包括向有此需要的对象施用治疗有效量的内分泌治疗药物。
所述抗体可以是MCLA-128。
内分泌治疗药物优选是干扰雌激素或孕酮激素在癌细胞中的作用的药物。内分泌治疗药物优选包含芳香酶抑制剂；选择性雌激素受体调节剂(SERM)；或选择性雌激素受体下调剂(selective estrogen receptor downregulator，SERD)。内分泌治疗药物可包含选自他莫昔芬(Nolvadex)、溴帕雌烯(Acnestrol)、环芬尼(Sexovid)、雷洛昔芬(Evista)和托瑞米芬(Fareston)的选择性雌激素受体调节剂(SERM)。内分泌治疗药物优选包含他莫昔芬、氟维司群或其等同物。在一个实施方案中，内分泌治疗药物包含来曲唑或其等同物。
在一个实施方案中，癌症是免疫组织化学ErbB-2+的癌症或免疫组织化学ErbB-2++而没有ErbB-2基因扩增的癌症。
在一个实施方案中，乳腺癌是IHC 1+或IHC 2+与阴性FISH组合的ER阳性的、具有低HER2表达的转移性乳腺癌MBC。
在一个实施方案中，所述方法还包括向患者施用细胞周期蛋白依赖性激酶4/6抑制剂。细胞周期蛋白依赖性激酶4/6抑制剂可以是例如帕博西尼(Palbociclib)、瑞博西尼(Ribociclib)或玻玛西尼(Abemaciclib)。
在一个实施方案中，患有乳腺癌或处于患有所述癌症之风险中的对象(包括处于复发之风险中的对象)是在开始用本文中所述的ErbB-2/ErbB-3双特异性抗体进行治疗之前已经接受了1种，优选2种内分泌疗法治疗的对象。对象优选接受了这些先前的治疗以治疗转移。另外，对象优选在开始用本文中所述的ErbB-2/ErbB-3双特异性抗体进行治疗之前已经接受了细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。
发明详述
ErbB-2/ErbB-3双特异性抗体描述于公开为WO2015/130173的PCT/NL2015/050125中。该申请通过引用并入本文。特别涉及了核酸分子、氨基酸分子和编码这样的双特异性抗体或其恒定或可变部分的序列。还特别涉及了用于产生这样的双特异性抗体(和其中的参考文献)。
EP17164292；EP17164382和US 15/476,260也描述了ErbB-2/ErbB-3双特异性抗体及其用途。EP17164292；EP17164382和US 15/476,260通过引用并入本文。
在一个实施方案中，乳腺癌是激素受体阳性乳腺癌。在一个实施方案中，激素阳性乳腺癌是雌激素受体阳性乳腺癌。在一个实施方案中，激素阳性乳腺癌是孕酮受体阳性乳腺癌。常规测试乳腺癌是否存在上述激素受体，并且技术人员可使用公认的分类和测试。参考Hammond等(2010：J.of Clinical Oncology Vol 28：pp 2784-2794)，其描述了合适的测试并因此提供了指导。例如，适合于根据本发明的治疗的患者是这样的患者：其中如通过免疫组织化学所确定的，例如在肿瘤活检中至少1％的肿瘤核具有免疫反应性；对雌激素受体和/或孕酮受体呈阳性。
此外，基于对最近肿瘤活检的局部分析，用于根据本发明进行治疗的合适患者的另一个实例是这样的患者：其患有具有通过局部标准的经证明的激素受体阳性状态(雌激素受体阳性[ER+]和/或孕酮受体阳性[PR+])的癌症，所述状态包含≥1％的阳性染色细胞。
此外，用于根据本发明进行治疗的合适患者的另一个实例是这样的患者：其患有具有由如通过对肿瘤活检进行免疫组织化学确定的≥1％的阳性细胞的经证明的激素受体阳性状态(雌激素受体阳性[ER+]和/或孕酮受体阳性[PR+])的癌症。
乳腺癌可以是ErbB-2阴性或ErbB-2阳性的。Wolff等(2013：J.of ClinicalOncology Vol 31：pp 3997-4013)描述了这样的测试并提供了建议。基于ErbB-2表达的公认的乳腺癌分层是：ErbB-2-；ErbB-2+；ErbB-2++而无ErbB-2基因扩增；ErbB-2++且有ErbB-2基因扩增以及ErbB-2+++。在一个实施方案中，乳腺癌是ErbB-2+或ErbB-2++而无ErbB-2基因扩增的乳腺癌，其包括不存在检测水平上的基因扩增。荧光原位杂交(fluorescence insitu hVbridization，FISH)可用于确定基因扩增的存在与否。因此，适合于根据本发明的治疗的患者可以是患有根据FISH分析显示没有ErbB-2基因扩增的癌症的患者，本领域普通技术人员将其理解为FISH阴性。
用于根据本发明的治疗的合适患者可以是这样的患者，其是免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)1+或IHC 2+与阴性荧光原位杂交(FISH)组合的ER阳性的、具有低HER2表达的转移性乳腺癌(metastatic breast cancer，MBC)。
在一个实施方案中，乳腺癌是ErbB-3阳性乳腺癌。
在一个实施方案中，双特异性抗体可降低ErbB-2和ErbB-3阳性细胞上的ErbB-3的配体诱导的受体功能。
本文中使用的术语“抗原结合位点”是指来源于并优选存在于能够与抗原结合的抗体上的位点。未经修饰的抗原结合位点通常由抗体的可变结构域形成并存在于其中。可变结构域包含所述抗原结合位点。结合抗原的可变结构域是包含结合抗原之抗原结合位点的可变结构域。
在一个实施方案中，本发明的抗体可变结构域包含重链可变区(heavy chainvariable region，VH)和轻链可变区(light chain variable region，VL)。抗原结合位点可存在于组合的VH/VL可变结构域中，或可仅存在于VH区中或仅存在于VL区中。当抗原结合位点仅存在于可变结构域的两个区中的一个时，对应的可变区可促进结合可变区的折叠和/或稳定性，但不会显著促进抗原本身的结合。
本文中使用的抗原结合是指抗体与其抗原的典型结合能力。包含与ErbB-3结合的抗原结合位点的抗体与ErbB-3结合，并且在其他条件相同的情况下，不与同一物种的同源受体ErbB-1和ErbB-4结合。考虑到ErbB家族是一种细胞表面受体家族，故所述结合通常在表达该受体的细胞上进行评估。本发明的抗体优选结合人ErbB-2、人ErbB-3，或其组合。
与抗体的随机、非特异性黏着(sticking)相反，抗原被抗体结合通常通过抗体的互补区域以及抗原和可变结构域两者的特定三维结构来介导，从而允许这两个结构精确地结合在一起(类似于锁和钥匙的相互作用)。由于抗体通常识别抗原的表位，并且由于这些表位也可能存在于其他化合物中，所以如果这样的其他化合物包含相同表位，则根据本发明的结合ErbB-2或ErbB-3的抗体也可以识别其他蛋白质。因此，术语“结合”不排除抗体与包含相同表位的其他蛋白质的结合。这样的其他蛋白质优选不是人蛋白质。如本发明中所定义的ErbB-2抗原结合位点和ErbB-3抗原结合位点通常不与在出生后的(优选成年的)人中的细胞膜上的其他蛋白质结合。如下文更详细概述的，根据本发明的双特异性抗体通常能够以至少1×10e-6M的结合亲和力结合ErbB-2或ErbB-3。
本文中使用的术语“干扰结合”意指抗体针对ErbB-3上的表位，并且抗体与配体竞争与ErbB-3的结合。抗体可减少配体结合、当配体已经与ErbB-3结合时取代配体，或者其可(例如通过空间位阻)至少部分地阻止该配体与ErbB-3结合。
本文中使用的术语“抗体”意指优选属于蛋白质的免疫球蛋白类的蛋白质分子，其包含结合抗原上的表位的一个或更多个可变结构域，其中这样的结构域来源于抗体的可变结构域或者与其共享序列同源性。用于治疗用途的抗体优选尽可能接近待治疗对象的天然抗体(例如用于人对象的人抗体)。抗体结合可用特异性和亲和力来表示。特异性决定了何种抗原或其表位被结合结构域特异性结合。亲和力是与特定抗原或表位结合的强度的量度。特异性结合被定义为以至少1×10e-6M，更优选1×10e-7M，更优选高于1×10e-9M的亲和力(KD)结合。通常来说，用于治疗应用的抗体的亲和力为高至1×10e-10M或更高。抗体(例如本发明的双特异性抗体)可包含天然抗体的恒定结构域(Fc部分)。本发明的抗体通常是双特异性全长抗体，优选是人IgG亚类。优选地，本发明的抗体是人IgG1亚类。本发明的这样的抗体具有良好的ADCC特性，在体内施用于人时具有有利的半衰期，并且存在CH3改造技术，该技术可提供在克隆细胞中共表达时优先于同二聚体而形成异二聚体的经修饰的重链。
本发明的抗体优选是“全长”抗体。根据本发明的术语“全长”被定义为包含基本上完整的抗体，然而所述抗体不一定具有完整抗体的全部功能。为了避免疑义，全长抗体包含两条重链和两条轻链。每条链包含恒定(C)区和可变(V)区，其可分解成称为CH1、CH2、CH3、VH和CL、VL的结构域。抗体通过Fab部分中包含的可变结构域与抗原结合，并且在结合之后可通过恒定结构域(主要通过Fc部分)与免疫系统的分子和细胞相互作用。术语“可变结构域”、“VH/VL对”、“VH/VL”在本文中可互换使用。根据本发明的全长抗体包括其中可存在提供期望特性的突变的抗体。这样的突变不应是任何区域的实质部分的缺失。然而，其中一个或数个氨基酸残基缺失而没有从本质上改变所得抗体的结合特性的抗体包含在术语“全长抗体”内。例如，IgG抗体可在恒定区中具有1至20个氨基酸残基的插入、缺失，或其组合。例如，当抗体本身具有低ADCC活性时，可通过稍微修饰抗体的恒定区来改善抗体的ADCC活性(Junttila，T.T.，K.Parsons，等(2010).“Superior In vivo Efficacy of AfucosylatedTrastuzumab in the Treatment of HER2-Arnplified Breast Cancer.”CancerResearch 70(11)：4481-4489)。
因为全长IgG抗体有利的半衰期以及出于免疫原性的原因对于保持接近完全自体(人)分子的需要，其是优选的。本发明的抗体优选为双特异性IgG抗体，优选双特异性全长IgG1抗体。基于IgG1在人中的长循环半衰期，其是有利的。为了预防在人中的任何免疫原性，优选根据本发明的双特异性IgG抗体是人IgG1。
术语“双特异性”(bispecific，bs)意指抗体(如上定义)的一部分与抗原上的一个表位结合，而第二部分与不同的表位结合。不同的表位通常存在于不同的抗原上。根据本发明，所述第一和第二抗原实际上是两种不同的蛋白质。一种优选的双特异性抗体是包含两种不同单克隆抗体的部分并因此与两种不同类型的抗原结合的抗体。双特异性抗体的一个臂通常包含一种抗体的可变结构域，而另一个臂包含另一种抗体的可变结构域。本发明的双特异性抗体的重链可变区通常彼此不同，而在本发明的双特异性抗体中，轻链可变区优选是相同的。其中不同的重链可变区与相同或共同的轻链缔合的双特异性抗体也被称为具有共同轻链的双特异性抗体。因此，还提供了根据本发明的双特异性抗体，其中两个臂包含共同轻链。
优选的双特异性抗体可通过在单一细胞中共表达两条不同的重链和共同的轻链而获得。当使用野生型CH3结构域时，两条不同的重链和共同的轻链的共表达将导致三个不同的种类：AA、AB和BB。为了提高期望的双特异性产物(AB)的百分比，可使用CH3改造，或者换句话说，可使用具有如下文所定义的相容的异二聚化结构域的重链。
本文中使用的术语“相容的异二聚化结构域”是指这样的蛋白质结构域，其是经改造的以使得经改造的结构域A’将优先与经改造的结构域B’形成异二聚体，并且反之亦然，而A’-A’与B’-B’之间的同二聚化减少。
根据本发明的术语“共同轻链”是指可以是相同的或具有一些氨基酸序列差异而不会影响全长抗体的结合特异性的轻链。例如，在本文中使用的共同轻链的定义范围内，例如可通过引入并测试保守氨基酸变化、在与重链配对时不促进或仅部分地促进结合特异性的区域中氨基酸的变化等来制备或发现不相同但仍在功能上等同的轻链。在添加或不添加术语“重排”的情况下，术语‘共同轻链’、‘共同VL’、‘单一轻链’、‘单一VL’在本文中均可互换使用。本发明的一个方面是使用可与不同的重链组合以形成具有功能性抗原结合结构域之抗体的人轻链作为共同轻链(WO2004/009618、WO2009/157771、Merchant等，1998和Nissim等，1994)。优选地，共同轻链具有种系序列。一个优选的种系序列是在入库(humanrepertoire)中经常使用的轻链可变区，并且其具有良好的热力学稳定性、产量和溶解性。一个优选的种系轻链是O12，优选重排的种系人κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或其片段或功能等同物(即，相同的IgVκ1-39基因区段，但不同的IGJκ基因区段)(根据IMGT数据库万维网imgt.org的命名)。因此，还提供了根据本发明的双特异性抗体，其中所述共同轻链是种系轻链，优选包含IgVK1-39基因区段的重排的种系人κ轻链，最优选重排的种系人κ轻链IgVK1-39*01/IGJK1*01。术语重排的种系人κ轻链IgVκ1-39*01/IGJκ1*01、IGKV1-39/IGKJ1、huVκ1-39轻链或简写的huVκ1-39在整个申请中可互换使用。显然，本领域技术人员将认识到“共同的”还指氨基酸序列不相同的轻链的功能等同物。存在所述轻链的许多变体，其中存在不实质上影响功能性结合区的形成的突变(缺失、替换、添加)。本发明的轻链也可以是如上所述的轻链，其具有1至5个氨基酸的插入、缺失、替换，或其组合。
还考虑了这样的抗体，其中VH能够特异性识别第一抗原，并且与免疫球蛋白可变结构域中的VH配对的VL能够特异性识别第二抗原。所得的VH/VL对将结合抗原1或抗原2。这样的所谓的“二合一抗体”例如在WO 2008/027236、WO 2010/108127和Schaefer等(CancerCell 20，472-486，2011年10月)中描述，其不同于本发明的双特异性抗体，并且还被称为“二合一”抗体。
本文中使用的术语“ErbB-2”是指在人中由ERBB-2基因编码的蛋白质。基因或蛋白质的替代名称包括：CD340；HER-2；HER-2/neu；MLN 19；NEU；NGL；TKR1。ERBB-2基因经常被称为HER2(来自人表皮生长因子受体2)。在本文中提及ErbB-2时，该提及是指人ErbB-2。包含结合ErbB-2的抗原结合位点的抗体结合人ErbB-2。由于人和其他哺乳动物直系同源物之间的序列和三级结构相似性，ErbB-2抗原结合位点也可结合这样的直系同源物，但不一定如此。人ErbB-2蛋白及其编码基因的数据库登录号是(NP_001005862.1；NP_004439.2；NC_000017.10；NT_010783.15；NC_018928.2)。主要给出登录号以提供将ErbB-2鉴定为靶标的另外的方法，结合抗体的ErbB-2蛋白的实际序列可变化，例如由于编码基因中的突变而变化，例如在一些癌症等中发生的那些。ErbB-2抗原结合位点结合ErbB-2及其多种变体，例如由一些ErbB-2阳性肿瘤细胞表达的那些。
本文中使用的术语“ErbB-3”是指在人中由ERBB-3基因编码的蛋白质。该基因或蛋白质的替代名称为：HER3；LCCS2；MDA-BF-1；c-ErbB-3；c-erbb-3；erbb-3-S；p180-Erbb-3；p45-sErbb-3；以及p85-sErbb-3。在本文中提及ErbB-3时，该提及是指人ErbB-3。包含结合ErbB-3的抗原结合位点的抗体结合人ErbB-3。由于人和其他哺乳动物直系同源物之间的序列和三级结构相似性，ErbB-3抗原结合位点也可结合这样的直系同源物，但不一定如此。人ErbB-3蛋白及其编码基因的数据库登录号是(NP_001005915.1；NP_001973.2；NC_000012.11；NC_018923.2；NT_029419.12)。主要给出登录号以提供将ErbB-3鉴定为靶标的另外的方法，由抗体结合的ErbB-3蛋白的实际序列可变化，例如由于编码基因中的突变，例如在一些癌症等中发生的那些。ErbB-3抗原结合位点结合ErbB-3及其多种变体，例如由一些ErbB-2阳性肿瘤细胞表达的那些。
包含结合ErbB-2的第一抗原结合位点和结合ErbB-3的第二抗原结合位点的本发明的双特异性抗体可降低ErbB-2和ErbB-3阳性细胞上的ErbB-3的配体诱导的受体功能。在过量的ErbB-2存在下，在异二聚体中不存在可检出的ErbB-3链的配体的情况下，ErbB-2/ErbB-3异二聚体可向表达细胞提供生长信号。该ErbB-3受体功能在本文中被称为ErbB-3的配体非依赖性受体功能。在存在ErbB-3配体的情况下，ErbB-2/ErbB-3异二聚体也向表达细胞提供生长信号。该ErbB-3受体功能在本文中被称为ErbB-3的配体诱导的受体功能。
本文中使用的术语“ErbB-3配体”是指结合并活化ErbB-3的多肽。ErbB-3配体的一些实例包括但不限于：神经调节蛋白(neuregulin，NRG)1和神经调节蛋白2、乙胞素(betacellulin)、肝素结合表皮生长因子以及上皮调节蛋白(epiregulin)。该术语包括天然存在的多肽的生物活性片段和/或变体。
在本发明的一个优选的实施方案中，ErbB-3的配体诱导的受体功能是ErbB-2和ErbB-3阳性细胞的ErbB-3配体诱导的生长。在一个优选的实施方案中，所述细胞是MCF-7细胞(
HTB-22TM)；SKBR3(
HTB-30TM)细胞；NCI-87(
CRL-5822TM)细胞；BxPC-3-luc2细胞(Perkin Elmer 125058)、BT-474细胞(
HTB-20TM)或JIMT1细胞(DSMZ no.：ACC 589)。
在一个优选的实施方案中，ErbB-2和ErbB-3阳性细胞在细胞表面上包含至少50,000个ErbB-2受体。在一个优选的实施方案中，至少100,000个ErbB-2受体。在一个优选的实施方案中，ErbB-2和ErbB-3阳性细胞在细胞表面上包含至少1,000,000个ErbB-2受体。在另一个优选的实施方案中，ErbB-2和ErbB-3阳性细胞在细胞表面上包含不超过1,000,000个ErbB-2受体。目前使用的治疗，例如曲妥珠单抗(trastuzumab)(赫赛汀(Herceptin))和帕妥珠单抗(pertuzumab)仅针对具有在其细胞表面上具有多于1,000,000个ErbB-2受体的恶性ErbB-2阳性细胞的患者开具处方，以获得临床应答。具有其细胞表面上具有多于1,000,000个ErbB-2受体的ErbB-2阳性肿瘤细胞的患者通常被分类为ErbB-2[+++]。例如，使用由Dako Denmark A/S销售的HercepTestTM和/或HER2 FISH(pharm DxTM)，和/或使用由Monogram Biosciences销售的
测定对患者进行分类。曲妥珠单抗和帕妥珠单抗仅针对ErbB-2[+++]患者开具处方，因为当用曲妥珠单抗和帕妥珠单抗进行治疗时具有较低ErbB-2浓度的患者通常不会表现出足够的临床应答。然而，本发明提供了与曲妥珠单抗相比对具有较低ErbB-2受体浓度的细胞也具有改善的结合亲和力的双特异性抗体。如实施例中所示，具有较低ErbB2表达的这样的细胞的增殖被根据本发明的抗体有效地抵消。这样的较低ErbB-2受体浓度存在于被分类为ErbB-2[++]或ErbB-2[+]的患者的恶性细胞中。同样，复发的ErbB-2阳性肿瘤的ErbB-2受体浓度通常低于1,000,000个受体/细胞。因此，优选用根据本发明的双特异性抗体治疗这样的ErbB-2[++]或ErbB-2[+]患者以及患有复发的ErbB-2阳性肿瘤的患者。因此，还提供了双特异性抗体，其包含结合ErbB-2的第一抗原结合位点和结合ErbB-3的第二抗原结合位点，其中所述抗体可降低具有少于1,000,000个ErbB-2细胞表面受体的ErbB-2和ErbB-3阳性细胞的配体诱导的生长。还提供了用于治疗患有ErbB-2、ErbB-3或ErbB-2/ErbB-3阳性肿瘤或处于患有所述肿瘤之风险中的对象的方法，其中所述肿瘤具有少于1,000,000个ErbB-2细胞表面受体/细胞，该方法包括向对象施用根据本发明的双特异性抗体或药物组合物。本文还提供了根据本发明的双特异性抗体，其用于治疗患有ErbB-2、ErbB-3或ErbB-2/ErbB-3阳性肿瘤或处于患有ErbB-2、ErbB-3或ErbB-2/ErbB-3阳性肿瘤之风险中的对象，其中所述肿瘤具有少于1,000,000个ErbB-2细胞表面受体/细胞。根据本发明的所述抗体通常能够降低ErbB-2和ErbB-3阳性细胞上的ErbB-3的配体诱导的受体功能，优选是配体诱导的生长。根据本发明的所述抗体优选包含结合ErbB-2的结构域I的第一抗原结合位点和结合ErbB-3的结构域III的第二抗原结合位点。在一个优选的实施方案中，如下文中更详细地解释的，所述第二抗原结合位点对ErbB-3阳性细胞的亲和力等于或高于所述第一抗原结合位点对ErbB-2阳性细胞的亲和力。所述第二抗原结合位点对ErbB-3阳性细胞的亲和力优选低于或等于2.0nM，更优选低于或等于1.39nM，更优选低于或等于0.99nM。所述第一抗原结合位点对ErbB-2阳性细胞的亲和力优选低于或等于5.0nM，优选低于或等于4.5nM，优选低于或等于4.0nM。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的所述抗体包含抗原结合位点，其结合选自T144、T164、R166、P172、G179、S180和R181的ErbB-2的结构域I的至少一个氨基酸，以及位于距T144、T164、R166、P172、G179、S180或R181约5个氨基酸位置内的表面暴露的氨基酸残基。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的所述抗体优选包含抗原结合位点，其结合选自R426的ErbB-3的结构域III的至少一个氨基酸，以及位于距天然ErbB-3蛋白中的R426
内的表面暴露的氨基酸残基。
为了确定肿瘤是否为ErbB-3阳性，技术人员可例如以免疫组织化学的方式确定ErbB-3基因扩增和/或染色。活检中至少10％的肿瘤细胞应呈阳性。活检还可包含20％、30％、40％、50％、60％、70％或更多阳性细胞。
本文中使用的配体诱导的受体功能降低了至少20％，优选至少30％、40％、50％、60％或至少70％。在一个特别优选的实施方案中，配体诱导的受体功能降低了80％，更优选降低了90％。优选通过确定在本发明的双特异性抗体存在下的配体诱导的受体功能，并且在其他条件相同的条件下将其与在不存在该抗体的情况下的相同功能进行比较，来确定降低。所述条件包含至少存在ErbB-3配体。存在的配体的量优选是诱导ErbB-2和ErbB-3阳性细胞系最大生长的一半的量。用于该测试的ErbB-2和ErbB-3阳性细胞系优选是MCF-7细胞系(
HTB-22TM)、SKBR3细胞系(
HTB-30TM)细胞、JIMT 1细胞系(DSMZ ACC589)或NCI-87细胞系(
CRL-5822TM)。用于确定ErbB-3配体诱导的受体功能的测试和/或配体优选是如实施例中所指定的用于ErbB-3配体诱导的生长降低的测试。
ErbB-2蛋白包含数个结构域(参见Landgraf，R Breast Cancer Res.2007；9(1)：202-的图1作为参考)。胞外结构域被称为结构域I至IV。已经映射出与本文中所述抗体的抗原结合位点的相应结构域结合的位置(参见实施例)。具有结合ErbB-2的结构域I或结构域IV(第一抗原结合位点)的抗原结合位点(第一抗原结合位点)的本发明的双特异性抗体包含当与多种轻链组合时维持对ErbB-2的显著结合特异性和亲和力的重链可变区。发现当与包含与ErbB-2的其他胞外结构域结合的抗原结合位点(第一抗原结合位点)的双特异性抗体相比时，具有结合ErbB-2的结构域I或结构域IV(第一抗原结合位点)的抗原结合位点(第一抗原结合位点)和对于ErbB-3的抗原结合位点(第二抗原结合位点)的双特异性抗体在降低ErbB-3的配体诱导的受体功能方面更有效。包含结合ErbB-2的抗原结合位点(第一抗原结合位点)的双特异性抗体，其中所述抗原结合位点与ErbB-2的结构域I或结构域IV结合是优选的。优选地，所述抗原结合位点与ErbB-2的结构域IV结合。发现具有结合ErbB-2的抗原结合位点(第一抗原结合位点)并且还包含ADCC的双特异性抗体比不具有显著ADCC活性的其他ErbB-2结合抗体更有效，特别是在体内。因此表现出ADCC的根据本发明的双特异性抗体是优选的。发现其中所述第一抗原结合位点与ErbB-2的结构域IV结合的抗体具有固有的ADCC活性。具有低的固有的ADCC活性的结合结构域I的ErbB-2结合抗体可经改造以增强ADCC活性，Fc区通过与免疫效应细胞(例如巨噬细胞、自然杀伤细胞、B细胞和嗜中性粒细胞)上的不同受体结合来介导抗体功能。这些受体中的一些(例如CD16A(FcγRIIIA)和CD32A(FcγRIIA))活化细胞以建立针对抗原的应答。另一些受体(例如CD32B)抑制免疫细胞的活化。通过对Fc区进行改造(通过引入氨基酸替换)使得以更高的选择性与活化受体结合，可产生具有更高的介导对于抗癌Mab所期望的细胞毒活性的抗体。
用于增强抗体的ADCC的一种技术是无岩藻糖基化(afucosylation)。(参见例如Junttila，T.T.，K.Parsons，等(2010).“Superior In vivo Efficacy of AfucosylatedTrastuzumab in the Treatment of HER2-Amplified Breast Cancer.”Cancer Research70(11)：4481-4489)。因此，还提供了无岩藻糖基化的根据本发明的双特异性抗体。替代地或另外地，可使用多种其他策略来实现ADCC增强，例如包括糖工程(Kyowa Hakko/Biowa，GlycArt(Roche)和Eureka Therapeutics)和诱变(Xencor和Macrogenics)，这些所有均寻求改善Fc与低亲和力活化FcγRIIIa结合，和/或降低与低亲和力抑制性FcγRIIb的结合。
存在数种用于确定抗体或效应细胞在引发ADCC中的效力的体外方法。其中包括铬51[Cr51]释放测定、铕[Eu]释放测定和硫35[S35]释放测定。通常来说，将表达某种表面暴露的抗原的经标记靶细胞系用对该抗原具有特异性的抗体孵育。洗涤之后，通常将表达Fc受体CD16的效应细胞与经抗体标记的靶细胞共孵育。随后通常通过胞内标记的释放(例如通过闪烁计数器或分光光度法)来测量靶细胞裂解。实施例中详细描述了一种优选的测试。
本发明的一个优点是以下事实：根据本发明的抗体(例如如PB4188)与ErbB-2和ErbB-3阳性细胞的结合导致与曲妥珠单抗相比程度相同的内化。如果使用曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合，则这些抗体的内化会增强。但是，这种增强的内化导致ADCC降低。因此，与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合相比，导致与曲妥珠单抗相比程度基本相同的内化的根据本发明的抗体是优选的，因为使用这样的抗体更好地维持了ADCC活性。
本发明的包含结合ErbB-3的抗原结合位点的抗体干扰ErbB-3配体与ErbB-3的结合。这样的抗体在降低ErbB-2和ErbB-3阳性细胞系上的ErbB-3的配体诱导的受体功能方面更有效，特别是在双特异性抗体的情况下，该双特异性抗体还包含结合ErbB-2的抗原结合位点。
本发明的一些优选实施方案提供了双特异性抗体，其包含结合ErbB-2的第一抗原结合位点和结合ErbB-3的第二抗原结合位点，其中所述第一抗原结合位点结合ErbB-2的结构域I。如实施例中所示，具有这些特征的双特异性抗体能够很好地结合ErbB-2和ErbB-3阳性细胞并抵消其活性(例如ErbB-3的配体诱导的受体功能以及ErbB-2和ErbB-3阳性细胞的配体诱导的生长)。此外，包含结合ErbB-2的结构域I的第一抗原结合位点的根据本发明的双特异性抗体特别适合于与现有的抗ErbB-2治疗(例如曲妥珠单抗和帕妥珠单抗)组合使用，因为曲妥珠单抗和帕妥珠单抗结合ErbB-2的不同结构域。曲妥珠单抗结合ErbB-2的结构域IV并且帕妥珠单抗结合ErbB-2的结构域II。因此，由于结合ErbB-2的结构域I的根据本发明的双特异性抗体不与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗竞争相同的表位，所以其是优选的。
另一个优选的实施方案提供了双特异性抗体，其包含结合ErbB-2的第一抗原结合位点和结合ErbB-3的第二抗原结合位点，其中所述第二抗原结合位点结合ErbB-3的结构域III。根据本发明的这样的抗体特别适合于与目前使用的不结合ErbB-3的结构域III的抗ErbB-3结合分子(例如结合ErbB-3的结构域I的MM-121(Merrimack Pharmaceuticals；也被称为#Ab6)和RG7116(Roche))组合治疗，因为这样不同的结合分子就不会彼此竞争相同的表位。
优选地，提供了双特异性抗体，其包含结合ErbB-2的第一抗原结合位点和结合ErbB-3的第二抗原结合位点，其中所述第一抗原结合位点结合ErbB-2的结构域I并且所述第二抗原结合位点结合ErbB-3的结构域III。这样的抗体特别适合于与不结合ErbB-2的结构域I的抗ErbB-2结合分子(例如曲妥珠单抗和帕妥珠单抗)以及与不结合ErbB-3的结构域III的抗ErbB-3结合分子(例如MM-121(#Ab6)和RG7116)组合治疗。
一个优选的实施方案提供了双特异性抗体，其包含结合ErbB-2的第一抗原结合位点和结合ErbB-3的第二抗原结合位点，其中所述第一抗原结合位点结合ErbB-2的结构域I并且所述第二抗原结合位点结合ErbB-3的结构域III，并且其中抗体可降低ErbB-2和ErbB-3阳性细胞上的ErbB-3的配体诱导的受体功能。所述抗体可优选降低ErbB-2和ErbB-3阳性细胞的配体诱导的生长。
本发明的另一些实施方案提供了双特异性抗体，其包含结合ErbB-2的第一抗原结合位点和结合ErbB-3的第二抗原结合位点，其中所述第二抗原结合位点对ErbB-3阳性细胞的亲和力(KD)等于或高于所述第一抗原结合位点对ErbB-2阳性细胞的亲和力。与对ErbB-2的亲和力高于对ErbB-3的双特异性化合物(例如如来自Merrimack Pharmaceuticals的MM111)相反，本发明提供了具有ErbB-3特异性臂的双特异性抗体，所述ErbB-3特异性臂对细胞上的ErbB-3的亲和力高于ErbB-2特异性臂对细胞上的ErbB-2的亲和力。尽管ErbB-3的细胞表面浓度低，但这样的双特异性抗体仍能够更好地结合ErbB-3。这提供了与现有技术的化合物相比增强了针对ErbB-3的功能活性的优点，其意味着根据本发明的这些双特异性抗体能够更好地抵消ErbB-3活性(例如配体诱导的生长)。
本文中使用的术语“亲和力”是指KD值。
所述第二抗原结合位点对ErbB-3阳性细胞的亲和力(KD)优选低于或等于2.0nM，更优选低于或等于1.5nM，更优选低于或等于1.39nM，更优选低于或等于0.99nM。在一个优选的实施方案中，所述第二抗原结合位点对SK BR 3细胞上的ErbB-3的亲和力低于或等于2.0nM，更优选低于或等于1.5nM，更优选低于或等于1.39nM，优选低于或等于0.99nM。在一个实施方案中，所述亲和力在1.39至0.59nM的范围内。在一个优选的实施方案中，所述第二抗原结合位点对BT 474细胞上的ErbB-3的亲和力低于或等于2.0nM，更优选低于或等于1.5nM，更优选低于或等于1.0nM，更优选低于0.5nM，更优选低于或等于0.31nM，更优选低于或等于0.23nM。在一个实施方案中，所述亲和力在0.31至0.15nM的范围内。上述亲和力优选如使用稳态细胞亲和力测量所测量的，其中使用放射性标记的抗体在4℃下孵育细胞，然后如实施例中所述测量细胞结合的放射性。
所述第一抗原结合位点对ErbB-2阳性细胞的亲和力(KD)优选低于或等于5.0nM，更优选低于或等于4.5nM，更优选低于或等于3.9nM。在一个优选的实施方案中，所述第一抗原结合位点对SK BR 3细胞上的ErbB-2的亲和力低于或等于5.0nM，优选低于或等于4.5nM，更优选低于或等于4.0nM，更优选低于或等于3.5nM，更优选低于或等于3.0nM，更优选低于或等于2.3nM。在一个实施方案中，所述亲和力在3.0至1.6nM的范围内。在一个优选的实施方案中，所述第一抗原结合位点对BT 474细胞上的ErbB-2的亲和力低于或等于5.0nM，优选低于或等于4.5nM，更优选低于或等于3.9nM。在一个实施方案中，所述亲和力在4.5至3.3nM的范围内。上述亲和力优选如使用稳态细胞亲和力测量所测量的，其中使用经放射性标记的抗体在4℃下孵育细胞，然后如实施例中所述测量细胞结合的放射性。
在一个优选的实施方案中，提供了根据本发明的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体对BT 474细胞的亲和力(KD)低于或等于5.0nM，优选低于或等于4.5nM，更优选低于或等于4.0nM，更优选低于或等于3.5nM，更优选低于或等于3.7nM，优选低于或等于3.2nM。在一个实施方案中，所述亲和力在3.7至2.7nM的范围内。在一个优选的实施方案中，提供了根据本发明的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体对SK BR 3细胞的亲和力低于或等于5.0nM，优选低于或等于4.5nM，更优选低于或等于4.0nM，更优选低于或等于3.5nM，更优选低于或等于3.0nM，优选低于或等于2.5nM，更优选低于或等于2.0nM。在一个实施方案中，所述亲和力在2.4至1.6nM的范围内。同样，上述亲和力优选如使用稳态细胞亲和力测量所测量的，其中使用放射性标记的抗体在4℃下孵育细胞，然后如实施例中所述测量细胞结合的放射性。
本发明的另一些优选实施方案提供了双特异性抗体，其包含结合ErbB-2的第一抗原结合位点和结合ErbB-3的第二抗原结合位点，其中所述第二抗原结合位点对ErbB-3阳性细胞的亲和力(KD)等于或高于所述第一抗原结合位点对ErbB-2阳性细胞的亲和力，并且其中抗体可降低ErbB-2和ErbB-3阳性细胞上的ErbB-3的配体诱导的受体功能。所述抗体可优选降低ErbB-2和ErbB-3阳性细胞的配体诱导的生长。
对ErbB-3具有高亲和力的根据本发明的上述抗体优选结合ErbB2的结构域I和/或ErbB-3的结构域III。因此，还提供了根据本发明的双特异性抗体，其包含结合ErbB-2的结构域I的第一抗原结合位点和结合ErbB-3的第二抗原结合位点，其中所述第二抗原结合位点对ErbB-3阳性细胞的亲和力(KD)等于或高于所述第一抗原结合位点对ErbB-2阳性细胞的亲和力。还提供了根据本发明的双特异性抗体，其包含结合ErbB-2的第一抗原结合位点和结合ErbB-3的结构域III的第二抗原结合位点，其中所述第二抗原结合位点对ErbB-3阳性细胞的亲和力等于或高于所述第一抗原结合位点对ErbB-2阳性细胞的亲和力。在一个特别优选的实施方案中，提供了根据本发明的双特异性抗体，其包含结合ErbB-2的结构域I的第一抗原结合位点和结合ErbB-3的结构域III的第二抗原结合位点，其中所述第二抗原结合位点对ErbB-3阳性细胞的亲和力等于或高于所述第一抗原结合位点对ErbB-2阳性细胞的亲和力。
所述第二抗原结合位点优选结合ErbB-3的结构域III，并且其对ErbB-3阳性细胞的亲和力(KD)低于或等于2.0nM，更优选低于或等于1.5nM，优选低于或等于1.39nM，更优选低于或等于0.99nM。在一个优选的实施方案中，所述第二抗原结合位点结合ErbB-3的结构域III，并且其对SK BR 3细胞上的ErbB-3的亲和力低于或等于2.0nM，更优选低于或等于1.5nM，优选低于或等于1.39nM，更优选低于或等于0.99nM。在一个实施方案中，所述亲和力在1.39至0.59nM的范围内。在一个优选的实施方案中，所述第二抗原结合位点结合ErbB-3的结构域III，并且对BT 474细胞上的ErbB-3的亲和力低于或等于2.0nM，更优选低于或等于1.5nM，更优选低于或等于1.0nM，更优选低于或等于0.5nM，更优选低于或等于0.31nM，更优选低于或等于0.23nM。在一个实施方案中，所述亲和力在0.31至0.15nM的范围内。
所述第一抗原结合位点优选结合ErbB-2的结构域I，并且对ErbB-2阳性细胞的亲和力(KD)低于或等于5.0nM，更优选低于或等于4.5nM，更优选低于或等于3.9nM。在一个优选的实施方案中，所述第一抗原结合位点结合ErbB-2的结构域I并且对SK BR 3细胞上的ErbB-2的亲和力低于或等于5.0nM，更优选低于或等于4.5nM，更优选低于或等于4.0nM，更优选低于或等于3.5nM，更优选低于或等于3.0nM，更优选低于或等于2.5nM，更优选低于或等于2.3nM。在一个实施方案中，所述亲和力在3.0至1.6nM的范围内。所述双特异性抗体对SK BR 3细胞的亲和力优选低于或等于5.0nM，更优选低于或等于4.5nM，更优选低于或等于4.0nM，更优选低于或等于3.5nM，更优选低于或等于3.0nM，更优选低于或等于2.5nM，更优选低于或等于2.4nM，更优选低于或等于2.0nM。在一个实施方案中，所述亲和力在2.4至1.6nM的范围内。
在一个优选的实施方案中，所述第一抗原结合位点结合ErbB-2的结构域I，并且对BT 474细胞上的ErbB-2的亲和力(KD)低于或等于5.0nM，更优选低于或等于4.5nM，优选低于或等于3.9nM。在一个实施方案中，所述亲和力在4.5至3.3nM的范围内。所述双特异性抗体对BT 474细胞的亲和力优选低于或等于5.0nM，更优选低于或等于4.5nM，更优选低于或等于4.0nM，更优选低于或等于3.7nM，更优选低于或等于3.2nM。在一个实施方案中，所述亲和力在3.7至2.7nM的范围内。
同样，上述亲和力优选如使用稳态细胞亲和力测量所测量的，其中使用放射性标记的抗体在4℃下孵育细胞，然后如实施例中所述测量细胞结合的放射性。
另一个优选的实施方案提供了根据本发明的双特异性抗体，其包含结合ErbB-2的第一抗原结合位点和结合ErbB-3的第二抗原结合位点，其中所述抗体可降低ErbB-2和ErbB-3阳性细胞上的ErbB-3的配体诱导的受体功能，其中所述双特异性抗体不显著影响心肌细胞的存活。心脏毒性是ErbB-2靶向治疗中的已知风险因素，并且当曲妥珠单抗与蒽环类药物组合使用时，并发症的频率提高，从而诱导心脏应激。例如，多西环素(doxycycline，DOX)与曲妥珠单抗的组合诱导了严重的心脏副作用。临床研究估计，5％至10％的在乳腺癌辅助设置中接受曲妥珠单抗的患者发生了心脏功能障碍(Guarneri等，J Clin Oncol.，1985，3：818-26；Ewer MS等，Nat Rev Cardiol 2010；7：564-75)。然而，一项回顾性研究中表明，当曲妥珠单抗与DOX一起用于辅助设置中时，发生无症状心脏功能障碍的风险实际上高至约25％(Wadhwa等，Breast Cancer Res Treat 2009；117：357-64)。如实施例中所示，本发明提供了靶向ErbB-2的抗体，并且与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗相比，其不影响或在显著较小的程度上影响心肌细胞的存活。由于降低了心脏毒性，因此其提供了重要的优点。对于未患有心脏功能受损的人来说，这已经是有利的，并且对于确实患有心脏功能受损或处于其风险中的人(例如如患有充血性心力衰竭(congestive heart failure，CHF)、左心室功能不全(left ventricular dysfunction，LVD)和/或左心室射血分数(LeftVentricular Ejection Fraction，LVEF)降低≥10％的对象，和/或患有心肌梗塞的对象)来说，甚至更是如此。因此，优选不显著影响心肌细胞存活的根据本发明的抗体。在体外，例如通过确定心肌细胞的活力、通过确定BNP(B型利尿钠肽(B-type natriuretic peptide)，其是心脏生物标志物)、通过确定QT延长和/或通过确定线粒体膜电位来测量心肌细胞的功能。
根据本发明的所述抗体优选包含结合ErbB-2的结构域I的第一抗原结合位点和结合ErbB-3的结构域III的第二抗原结合位点。一个实施方案提供了不显著影响心肌细胞存活的根据本发明的抗体，其包含结合ErbB-2的第一抗原结合位点和结合ErbB-3的第二抗原结合位点，其中所述第二抗原结合位点对ErbB-3阳性细胞的亲和力等于或高于所述第一抗原结合位点对ErbB-2阳性细胞的亲和力。所述第二抗原结合位点对ErbB-3阳性细胞的亲和力优选低于或等于2.0nM，更优选低于或等于1.39nM，更优选低于或等于0.99nM。所述第一抗原结合位点对ErbB-2阳性细胞的亲和力优选低于或等于5.0nM，优选低于或等于4.5nM，优选低于或等于4.0nM。
在一个优选的实施方案中，不显著影响心肌细胞存活的所述抗体包含：
-选自以下的ErbB-2特异性重链可变区的至少CDR3序列(优选至少CDR1、CDR2和CDR3序列)或至少重链可变区序列：如图10A或图10E中所示的MF2926、MF2930、MF1849；MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003和MF1898，或者与所述重链可变区序列在至多15个氨基酸，优选至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，更优选至多1、2、3、4或5个氨基酸处不同的重链可变区序列；和/或-选自以下的ErbB-3特异性重链可变区的至少CDR3序列(优选至少CDR1、CDR2和CDR3序列)或至少重链可变区序列：如图10B或图10E或图11中所示的MF3178；MF3176；MF3163；MF3099；MF3307；MF6055；MF6056；MF6057；MF6058；MF6059；MF6060；MF6061；MF6062；MF6063；MF6064；MF6065；MF6066；MF6067；MF6068；MF6069；MF6070；MF6071；MF6072；MF6073和MF6074，或者与所述重链可变区序列在至多15个氨基酸，优选至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸，更优选至多1、2、3、4或5个氨基酸处不同的重链可变区序列。在一个优选的实施方案中，所述抗体是PB4188。
本发明的另一方面提供了根据本发明的抗体，其包含结合ErbB-2的第一抗原结合位点和结合ErbB-3的第二抗原结合位点，其中所述抗体包含这样的抗原结合位点，其结合选自T144、T164、R166、P172、G179、S180和R181的ErbB-2结构域I的至少一个氨基酸残基，和位于距T144、T164、R166、P172、G179、S180或R181约5个氨基酸位置内的表面暴露的氨基酸残基。氨基酸残基编号为蛋白质数据库(Protein Data Bank，PDB)ID#1S78的编号。如实施例中所示，结合ErbB-2的结构域I的该区域的抗体表现出特别良好的结合特征，并且其能够抵消ErbB-2阳性细胞的活性(例如ErbB-2和ErbB-3阳性细胞上的ErbB-3的配体诱导的受体功能，和/或这样的细胞的配体诱导的生长)。此外，这样的抗体特别适合于与目前已知的抗ErbB-2单克隆抗体(例如曲妥珠单抗(其结合ErbB-2的结构域IV)和帕妥珠单抗(其结合ErbB-2的结构域II))组合治疗，因为其结合ErbB-2的不同结构域。因此，可在不竞争相同表位的情况下同时使用这些抗体。术语“位于距T144、T164、R166、P172、G179、S180或R181约5个氨基酸位置的表面暴露的氨基酸残基”是指这样的氨基酸残基，其在位于与所述残基相邻的约前五个氨基酸残基内的一级氨基酸序列中，并且至少部分地暴露于蛋白质的外部，以使得其可被抗体结合(参见例如WO2015/130173的图21B)。优选地，位于距T144、T164、R166、P172、G179、S180或R181约5个氨基酸位置内的所述氨基酸残基选自L139、C140、Y141、Q142、D143、I145、L146、W147、K148、D149、L159、T160、L161、I162、D163、N165、S167、R168、A169、C170、H171、C173、S174、P175、M176、C177、K178、C182、W183、G184、E185和S186。优选地，所述抗体包含这样的抗原结合位点，其结合选自T144、T164、R166、P172、G179、S180和R181的ErbB-2的结构域I的至少2个或至少3个氨基酸残基，和位于距T144、T164、R166、P172、G179、S180或R181 5个氨基酸位置内的表面暴露的氨基酸残基。
在一个优选的实施方案中，提供了根据本发明的双特异性抗体，其中所述抗体包含结合ErbB-2的结构域I的至少T144、R166和R181的抗原结合位点。另一个实施方案提供了根据本发明的双特异性抗体，其中所述抗体包含结合ErbB-2的结构域I的至少T144、R166、P172、G179和R181的抗原结合位点。另一个实施方案提供了根据本发明的双特异性抗体，其中所述抗体包含结合ErbB-2的结构域I的至少T144、T164、R166、P172、G179、S180和R181的抗原结合位点。
本发明的另一方面提供了抗体，其包含结合ErbB-2的第一抗原结合位点和结合ErbB-3的第二抗原结合位点，其中所述抗体包含这样的抗原结合位点，其结合选自R426的ErbB-3的结构域III的至少一个氨基酸和位于距天然ErbB-3蛋白中的R426
内的表面暴露的氨基酸残基。氨基酸残基编号为蛋白质数据库(PDB)ID#4P59的编号。如实施例中所示，结合ErbB-3的结构域III的该区域的抗体表现出特别良好的结合特征，并且其能够抵消ErbB-3阳性细胞的活性(例如ErbB-2和ErbB-3阳性细胞上的ErbB-3的配体诱导的受体功能，和/或这样的细胞的配体诱导的生长)。术语“位于距天然ErbB-3蛋白中的R426
内的表面暴露的氨基酸残基”是指这样的氨基酸残基，其在空间上位于距R426
内的ErbB-3蛋白的三级结构中，并且至少部分地暴露于蛋白质的外部，以使得其可被抗体结合。优选地，所述位于距天然ErbB-3蛋白中的R426
内的氨基酸残基选自L423、Y424、N425、G427、G452、R453、Y455、E480、R481、L482、D483和K485(参见例如WO2015/130173的图21C和表15)。在一个优选的实施方案中，提供了根据本发明的双特异性抗体，其中所述抗体包含结合ErbB-3的结构域III的至少R426的抗原结合位点。优选地，所述抗体包含结合ErbB-3的结构域III的至少R426的抗原结合位点。
本发明的双特异性抗体优选进行无岩藻糖基化以增强ADCC活性。当与正常CHO细胞中产生的同一抗体相比，本发明的双特异性抗体优选在Fc区中包含减少量的岩藻糖基化的N连接的碳水化合物结构。
本发明的双特异性抗体优选用于人。为此，本发明的双特异性抗体优选是人抗体或人源化抗体。
人对多肽的耐受性由许多不同方面控制。无论是T细胞介导的、B细胞介导的或其他的免疫，其均是人对多肽的耐受性中所涵盖的变量之一。本发明的双特异性抗体的恒定区优选是人恒定区。所述恒定区可包含相对于天然存在的人抗体的恒定区的一个或更多个，优选不超过10个，优选不超过5个氨基酸差异。优选恒定部分完全来源于天然存在的人抗体。本文中产生的多种抗体来源于人抗体可变结构域文库。因此，这些可变结构域是人的。独特的CDR区可来源于人、可以是合成的、或来源于其他生物体。当可变区具有与天然存在的人抗体的可变区的氨基酸序列相同的氨基酸序列时，其被认为是人可变区，但针对CDR区。本发明抗体中的结合ErbB-2的VH、结合ErbB-3的VH或轻链的可变区可包含相较于天然存在的人抗体的可变区的一个或更多个，优选不超过10个，优选不超过5个氨基酸差异，而未对CDR区的氨基酸序列中的可能差异进行计算。在体细胞超突变的情况下，这样的突变也在自然中发生。
至少关于重链可变区，抗体可来源于多种动物物种。使例如如鼠重链可变区人源化是常见的实践。存在多种可实现其的方法，其中包括：将CDR接枝到具有与鼠重链可变区的3D结构相匹配的3D结构的人重链可变区中；对鼠重链可变区进行去免疫，优选通过从鼠重链可变区去除已知或怀疑的T或B细胞表位来进行。去除通常是通过将表位中的一个或更多个氨基酸替换为其他(通常是保守的)氨基酸，以使得表位的序列被修饰，使得其不再是T细胞表位或B细胞表位。
这样的去免疫的鼠重链可变区在人中的免疫原性低于原始鼠重链可变区的免疫原性。优选地，本发明的可变区或结构域是进一步人源化的，例如如经饰面(venner)的。通过使用饰面技术，免疫系统容易遇到的外部残基被选择性地替代为人残基，以提供包含弱免疫原性或基本上非免疫原性的饰面表面的杂交分子。用于本发明的动物优选是哺乳动物，更优选灵长类动物，最优选人。
根据本发明的双特异性抗体优选包含人抗体的恒定区。根据其重链恒定结构域中的差异，抗体可分为五个类别或同种型：IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。这些类别或同种型包含至少一个以相应的希腊字母命名的所述重链。在一个优选的实施方案中，本发明提供了根据本发明的抗体，其中所述恒定区选自IgG、IgA、IgM、IgD和IgE恒定区，更优选地，所述恒定区包含IgG恒定区，更优选IgG1恒定区，优选突变的IgG1恒定区。IgG1恒定区中的一些变异天然发生，例如如同种异型G1m1、17和G1m3，并且/或者在不改变所得抗体的免疫学特性的情况下其是允许的。通常在恒定区中允许约1至10个氨基酸之间的插入、缺失、替换或其组合。
在一个实施方案中，本发明提供了包含结合ErbB-2的可变结构域的抗体，其中所述抗体包含选自以下的ErbB-2特异性重链可变区的至少CDR3序列：如图10A或图10E中所示的MF2926、MF2930、MF1849；MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003和MF1898，或者其中所述抗体包含与选自以下的VH的CDR3序列在至多三个、优选至多两个、优选不超过一个氨基酸处不同的重链CDR3序列：如图10A或图10E中所示的MF2926、MF2930、MF1849；MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003和MF1898。所述抗体优选包含MF1849、MF2971、MF3958、MF3004或MF3991的至少CDR3序列，最优选MF3958的至少CDR3序列。
所述抗体优选包含选自以下的ErbB-2特异性重链可变区的至少CDR1、CDR2和CDR3序列：如图10A或图10E中所示的MF2926、MF2930、MF1849；MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003和MF1898，或者与MF2926、MF2930、MF1849；MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003或MF1898的CDR1、CDR2和CDR3序列在至多三个，优选至多两个，优选至多一个氨基酸处不同的重链CDR1、CDR2和CDR3序列。所述抗体优选包含MF1849、MF2971、MF3958、MF3004或MF3991的至少CDR1、CDR2和CDR3序列，最优选MF3958的至少CDR1、CDR2和CDR3序列。
本发明还提供了包含结合ErbB-3的可变结构域的抗体，其中所述抗体包含选自以下的ErbB-3特异性重链可变区的至少CDR3序列：如图10B或图10E或图11中所示的MF3178；MF3176；MF3163；MF3099；MF3307；MF6055；MF6056；MF6057；MF6058；MF6059；MF6060；MF6061；MF6062；MF6063；MF6064；MF6065；MF6066；MF6067；MF6068；MF6069；MF6070；MF6071；MF6072；MF6073和MF6074，或者其中所述抗体包含与选自以下的VH的CDR3序列在至多三个，优选至多两个，优选不超过一个氨基酸处不同的重链CDR3序列：如图10B或图10E或图11中所不的MF3178；MF3176；MF3163；MF3099；MF3307；MF6055；MF6056；MF6057；MF6058；MF6059；MF6060；MF6061；MF6062；MF6063；MF6064；MF6065；MF6066；MF6067；MF6068；MF6069；MF6070；MF6071；MF6072；MF6073和MF6074。所述抗体优选包含MF3178、MF3176、MF3163、MF6058、MF6061或MF6065的至少CDR3序列，最优选MF3178的至少CDR3序列。
所述抗体优选包含选自以下的ErbB-3特异性重链可变区的至少CDR1、CDR2和CDR3序列：如图10B或图10E或图11中所示的MF3178；MF3176；MF3163；MF3099；MF3307；MF6055；MF6056；MF6057；MF6058；MF6059；MF6060；MF6061；MF6062；MF6063；MF6064；MF6065；MF6066；MF6067；MF6068；MF6069；MF6070；MF6071；MF6072；MF6073和MF6074，或者与以下的CDR1、CDR2和CDR3序列在至多三个，优选至多两个，优选至多一个氨基酸处不同的重链CDR1、CDR2和CDR3序列：MF3178；MF3176；MF3163；MF3099；MF3307；MF6055；MF6056；MF6057；MF6058；MF6059；MF6060；MF6061；MF6062；MF6063；MF6064；MF6065；MF6066；MF6067；MF6068；MF6069；MF6070；MF6071；MF6072；MF6073或MF6074。所述抗体优选包含MF3178、MF3176、MF3163、MF6058、MF6061或MF6065的至少CDR1、CDR2和CDR3序列，最优选MF3178的至少CDR1、CDR2和CDR3序列。
在一个实施方案中本发明提供了双特异性抗体，其包含结合ErbB-2的第一抗原结合位点和结合ErbB-3的第二抗原结合位点，其中所述第一抗原结合位点包含选自以下的ErbB-2特异性重链可变区的至少CDR3序列：如图10A或图10E中所示的MF2926、MF2930、MF1849；MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003和MF1898，或者与选自以下的VH的CDR3序列在至多三个，优选至多两个，优选不超过一个氨基酸处不同的重链CDR3序列：如图10A或图10E中所示的MF2926、MF2930、MF1849；MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003和MF1898，并且其中所述第二抗原结合位点包含选自以下的ErbB-3特异性重链可变区的至少CDR3序列：如图10B或图10E或图11中所示的MF3178；MF3176；MF3163；MF3099；MF3307；MF6055；MF6056；MF6057；MF6058；MF6059；MF6060；MF6061；MF6062；MF6063；MF6064；MF6065；MF6066；MF6067；MF6068；MF6069；MF6070；MF6071；MF6072；MF6073和MF6074，或者与选自以下的VH的CDR3序列在至多三个，优选至多两个，优选不超过一个氨基酸处不同的重链CDR3序列：如图10B或图10E或图11中所示的MF3178；MF3176；MF3163；MF3099；MF3307；MF6055；MF6056；MF6057；MF6058；MF6059；MF6060；MF6061；MF6062；MF6063；MF6064；MF6065；MF6066；MF6067；MF6068；MF6069；MF6070；MF6071；MF6072；MF6073和MF6074。所述第一抗原结合位点优选包含MF1849、MF2971、MF3958、MF3004或MF3991的至少CDR3序列，最优选MF3958的至少CDR3序列，并且所述第二抗原结合位点优选包含MF3178、MF3176、MF3163、MF6058、MF6061或MF6065的至少CDR3序列，最优选MF3178的至少CDR3序列。
所述第一抗原结合位点优选包含选自以下的ErbB-2特异性重链可变区的至少CDR1、CDR2和CDR3序列：如图10A或图10E中所示的MF2926、MF2930、MF1849；MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003和MF1898，或者与以下的CDR1、CDR2和CDR3序列在至多三个，优选至多两个，优选至多一个氨基酸处不同的重链CDR1、CDR2和CDR3序列：MF2926、MF2930、MF1849；MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003或MF1898，并且所述第二抗原结合位点优选包含选自以下的ErbB-3特异性重链可变区的至少CDR1、CDR2和CDR3序列：如图10B或图10E或图11中所示的MF3178；MF3176；MF3163；MF3099；MF3307；MF6055；MF6056；MF6057；MF6058；MF6059；MF6060；MF6061；MF6062；MF6063；MF6064；MF6065；MF6066；MF6067；MF6068；MF6069；MF6070；MF6071；MF6072；MF6073和MF6074，或者与以下的CDR1、CDR2和CDR3序列在至多三个，优选至多两个，优选至多一个氨基酸处不同的重链CDR1、CDR2和CDR序列：如图10B或图10E或图11中所示的MF3178；MF3176；MF3163；MF3099；MF3307；MF6055；MF6056；MF6057；MF6058；MF6059；MF6060；MF6061；MF6062；MF6063；MF6064；MF6065；MF6066；MF6067；MF6068；MF6069；MF6070；MF6071；MF6072；MF6073或MF6074。所述第一抗原结合位点优选包含MF1849、MF2971、MF3958、MF3004或MF3991的至少CDR1、CDR2和CDR3序列，最优选MF3958的至少CDR1、CDR2和CDR3序列，并且所述第二抗原结合位点优选包含MF3178、MF3176、MF3163、MF6058、MF6061或MF6065的至少CDR1、CDR2和CDR3序列，最优选MF3178的至少CDR1、CDR2和CDR3序列。
一个优选的实施方案提供了双特异性抗体，其包含结合ErbB-2的第一抗原结合位点和结合ErbB-3的第二抗原结合位点，其中所述第一抗原结合位点包含MF3958的至少CDR3序列，或者与MF3958的CDR3序列在至多三个，优选至多两个，优选不超过一个氨基酸处不同的CDR3序列，并且其中所述第二抗原结合位点包含MF3178的至少CDR3序列，或者与MF3178的CDR3序列在至多三个，优选至多两个，优选不超过一个氨基酸处不同的CDR3序列。
在一个实施方案中本发明提供了双特异性抗体，其包含结合ErbB-2的第一抗原结合位点和结合ErbB-3的第二抗原结合位点，其中所述第一抗原结合位点包含MF3958的至少CDR1、CDR2和CDR3序列，或者与MF3958的CDR1、CDR2和CDR3序列在至多三个，优选至多两个，优选最多一个氨基酸处不同的CDR1、CDR2和CDR3序列，并且其中所述第二抗原结合位点包含MF3178的至少CDR1、CDR2和CDR3序列，或者与MF3178的CDR1、CDR2和CDR3序列在至多三个，优选至多两个，优选地至多一个氨基酸处不同的CDR1、CDR2和CDR3序列。
在一个实施方案中本发明提供了双特异性抗体，其包含结合ErbB-2的第一抗原结合位点和结合ErbB-3的第二抗原结合位点，其中所述第一抗原结合位点包含MF3958的至少CDR3序列并且其中所述第二抗原结合位点包含MF3178的至少CDR3序列。
在一个实施方案中本发明提供了双特异性抗体，其包含结合ErbB-2的第一抗原结合位点和结合ErbB-3的第二抗原结合位点，其中所述第一抗原结合位点包含MF3958的至少CDR1、CDR2和CDR3序列，并且其中所述第二抗原结合位点包含MF3178的至少CDR1、CDR2和CDR3序列。
例如，为了优化目的而改变CDR序列，优选为了提高抗体的结合效力或稳定性。例如，通过诱变程序进行优化，然后优选测试所得抗体的稳定性和/或结合亲和力，并优选选择改进的ErbB-2或ErbB-3特异性CDR序列。技术人员能够很好地产生包含根据本发明的至少一个改变的CDR序列的抗体变体。例如，应用保守的氨基酸替换。保守氨基酸替换的一些实例包括用一个疏水残基(例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸)替换另一个疏水残基，以及用一个极性残基替换另一个极性残基，例如用精氨酸替换赖氨酸、用谷氨酸替换天冬氨酸，或用谷氨酰胺替换天冬酰胺。
在一个实施方案中本发明提供了抗体，其包含结合ErbB-2的可变结构域，其中所述可变结构域的VH链包含以下的VH链的氨基酸序列：如图10A或图10E中所示的MF2926；MF2930；MF1849；MF2973；MF3004；MF3958(其是人源化的MF2971)；MF2971；MF3025；MF2916；MF3991(其是人源化的MF3004)；MF3031；MF2889；MF2913；MF1847；MF3001、MF3003或MF1898；或包含相对于图10A或图10E的上述VH链序列，具有至多15个，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个，更优选至多1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、替换或其组合的以下的VH链的氨基酸序列：如图10A或图10E中所示的MF2926；MF2930；MF1849；MF2973；MF3004；MF3958(其是人源化的MF2971)；MF2971；MF3025；MF2916；MF3991(其是人源化的MF3004)；MF3031；MF2889；MF2913；MF1847；MF3001、MF3003或MF1898。结合ErbB-2的可变结构域的VH链优选包含以下氨基酸序列：
-如图10A中所示的MF1849；或者
-MF2971或其人源化形式，其中所述人源化形式优选包含MF3958的氨基酸序列；或者
-MF3004或其人源化形式，其中所述人源化形式优选包含MF3991的氨基酸序列。在一个实施方案中，结合ErbB-2的可变结构域的VH链包含以下的VH链的氨基酸序列：MF1849；或者MF2971或其人源化形式，其中所述人源化形式优选包含以下的氨基酸序列：MF3958；或者MF3004或其人源化形式，其中所述人源化形式优选包含MF3991的氨基酸序列，其中所述VH序列相对于图10A中示出的对应序列具有至多15个，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个，更优选至多1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、替换或其组合。在一个优选的实施方案中，结合ErbB-2的可变结构域的VH链包含MF3958的氨基酸序列；或包含相对于VH链序列具有至多15个，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个，更优选至多1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、替换或其组合的图10A中所示的MF3958的氨基酸序列。包含结合ErbB-2的可变结构域的抗体优选是双特异性抗体，其优选还包含结合ErbB-3的可变结构域。结合Erb-B3的可变结构域的VH链优选包含以下的VH链的氨基酸序列：如图10B或图10E或图11中所示的MF3178；MF3176；MF3163；MF3099；MF3307；MF6055；MF6056；MF6057；MF6058；MF6059；MF6060；MF6061；MF6062；MF6063；MF6064；MF6065；MF6066；MF6067；MF6068；MF6069；MF6070；MF6071；MF6072；MF6073或MF6074；或包含相对于图10B或图10E或图11的VH链序列具有至多15个，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个，更优选至多1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、替换或其组合的以下的VH链的氨基酸序列：如图10B或图10E或图11中所示的MF3178；MF3176；MF3163；MF3099；MF3307；MF6055；MF6056；MF6057；MF6058；MF6059；MF6060；MF6061；MF6062；MF6063；MF6064；MF6065；MF6066；MF6067；MF6068；MF6069；MF6070；MF6071；MF6072；MF6073或MF6074。结合Erb-B3的可变结构域的VH链优选包含MF3178、MF3176、MF3163、MF6058、MF6061或MF6065的氨基酸序列；或包含相对于图10B或图11的相应VH链序列具有至多15个，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个，更优选至多1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、替换或其组合的MF3178、MF3176、MF3163、MF6058、MF6061或MF6065的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，结合ErbB-3的可变结构域的VH链包含MF3178的氨基酸序列；或包含相对于VH链序列具有至多15个，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个，更优选至多1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、替换或其组合的图10B中所示的MF3178的氨基酸序列。优选地，上述氨基酸插入、缺失和替换不存在于CDR3区中。上述氨基酸插入、缺失和替换还优选不存在于CDR1和CDR2区中。上述氨基酸插入、缺失和替换还优选不存在于FR4区中。
本发明还提供了包含结合ErbB-3的可变结构域的抗体，其中所述可变区的VH链包含以下的VH链的氨基酸序列：如图10B或图10E或图11中所示的MF3178；MF3176；MF3163；MF3099；MF3307；MF6055；MF6056；MF6057；MF6058；MF6059；MF6060；MF6061；MF6062；MF6063；MF6064；MF6065；MF6066；MF6067；MF6068；MF6069；MF6070；MF6071；MF6072；MF6073或MF6074，或者包含相对于所述VH链序列具有至多15个，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个，更优选至多1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、替换或其组合的以下的VH链的氨基酸序列：如图10B或图10E或图11中所示的MF3178；MF3176；MF3163；MF3099；MF3307；MF6055；MF6056；MF6057；MF6058；MF6059；MF6060；MF6061；MF6062；MF6063；MF6064；MF6065；MF6066；MF6067；MF6068；MF6069；MF6070；MF6071；MF6072；MF6073或MF6074。结合ErbB3的可变结构域的VH链优选包含以下的VH链的氨基酸序列：MF3178、MF3176、MF3163、MF6058、MF6061或MF6065；或者包含相对于所述VH链序列具有至多15个，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个，更优选至多1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、替换或其组合的MF3178、MF3176、MF3163、MF6058、MF6061或MF6065的VH链的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，结合ErbB-3的可变结构域的VH链包含图10B中所示的VH链MF3178的氨基酸序列；或者包含相对于VH链序列具有至多15个，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个，更优选至多1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、替换或其组合的图10B中所示的VH链MF3178的氨基酸序列。包含结合ErbB-3的可变结构域的抗体优选是双特异性抗体，其优选还包含结合ErbB-2的可变结构域。结合ErbB-2的可变结构域的VH链优选包含图10A或图10E的VH链的氨基酸序列。结合ErbB-2的可变结构域的VH链优选包含以下的氨基酸序列：MF1849；或者MF2971或其入源化形式，其中所述人源化形式优选包含以下的氨基酸序列：MF3958；或者MF3004或其人源化形式，其中所述人源化形式优选包含如图10A中所示的MF3991的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述结合Erb-B2的VH序列相对于图10A中所述的相应序列具有至多15个，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个，更优选至多1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、替换或其组合。在一个优选的实施方案中，图10A的所述结合ErbB-2的VH链包含MF3958的氨基酸序列；或者包含相对于VH链序列具有至多15个，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个，更优选至多1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、替换或其组合的MF3958的氨基酸序列。优选地，上述氨基酸插入、缺失和替换不存在于CDR3区中。上述氨基酸插入、缺失和替换还优选不存在于CDR1和CDR2区中。上述氨基酸插入、缺失和替换还优选不存在于FR4区中。
还提供了根据本发明的抗体，其中所述抗体包含选自以下的ErbB-2特异性重链可变区序列：如图10A或图10E中所示的MF2926、MF2930、MF1849；MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003和MF1898的重链可变区序列，或者其中所述抗体包含与MF2926、MF2930、MF1849；MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003或MF1898的重链可变区序列在至多15个，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个，更优选至多1、2、3、4或5个氨基酸处不同的重链可变区序列。
还提供了根据本发明的抗体，其中所述抗体包含选自以下的ErbB-3特异性重链可变区序列：如图10B或图10E或图11中所示的MF3178；MF3176；MF3163；MF3099；MF3307；MF6055；MF6056；MF6057；MF6058；MF6059；MF6060；MF6061；MF6062；MF6063；MF6064；MF6065；MF6066；MF6067；MF6068；MF6069；MF6070；MF6071；MF6072；MF6073和MF6074的重链可变区序列，或者其中所述抗体包含与MF3178；MF3176；MF3163；MF3099；MF3307；MF6055；MF6056；MF6057；MF6058；MF6059；MF6060；MF6061；MF6062；MF6063；MF6064；MF6065；MF6066；MF6067；MF6068；MF6069；MF6070；MF6071；MF6072；MF6073或MF6074的重链可变区序列在至多15个，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个，更优选至多1、2、3、4或5个氨基酸处不同的重链可变区序列。
在一个实施方案中，本发明提供了包含结合ErbB-2的两个抗原结合位点的抗体，其中至少一个所述抗原结合位点结合ErbB-2的结构域I。优选地，这两个抗原结合位点均结合ErbB-2的结构域I。根据本发明的这样的抗体特别适合于与目前使用的不结合ErbB-2的结构域I的抗Erbb-2结合分子(例如结合ErbB-2的结构域IV的曲妥珠单抗和结合ErbB-2的结构域II的帕妥珠单抗)组合治疗，因为这样不同的结合分子不会彼此竞争相同的表位。
还提供了包含结合ErbB-2的两个抗原结合位点的抗体，其中至少一个所述抗原结合位点结合ErbB-2的结构域I，并且其中所述至少一个抗原结合位点对ErbB-2阳性细胞的亲和力(KD)低于或等于5.0nM，优选低于或等于4.5nM，更优选低于或等于3.9nM。优选地，这两个抗原结合位点均结合ErbB-2的结构域I。在一个优选的实施方案中，所述至少一个抗原结合位点对SK BR 3细胞上的ErbB-2的亲和力低于或等于5.0nM，优选低于或等于4.5nM，更优选低于或等于4.0nM，更优选低于或等于3.5nM，更优选低于或等于3.0nM，更优选低于或等于2.3nM。在一个实施方案中，所述亲和力在3.0至1.6nM的范围内。在一个优选的实施方案中，所述至少一个抗原结合位点对BT 474细胞上的ErbB-2的亲和力低于或等于5.0nM，优选低于或等于4.5nM，更优选低于或等于3.9nM。在一个实施方案中，所述亲和力在4.5至3.3nM的范围内。
上述亲和力优选如使用稳态细胞亲和力测量所测量的，其中使用放射性标记的抗体在4℃下孵育细胞，然后如实施例中所述测量细胞结合的放射性。
本发明还提供了包含结合ErbB-2的两个可变结构域的抗体，其中所述可变结构域的VH链包含以下的VH链的氨基酸序列：如图10A或图10E中所示的MF2926；MF2930；MF1849；MF2973；MF3004；MF3958(其是人源化的MF2971)；MF2971；MF3025；MF2916；MF3991(其是人源化的MF3004)；MF3031；MF2889；MF2913；MF1847；MF3001、MF3003或MF1898；或者相对于图10A或图10E中所示的相应序列具有至多15个，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个，更优选至多1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、替换或其组合的以下的VH链的氨基酸序列：如图10A或图10E中所示的MF2926；MF2930；MF1849；MF2973；MF3004；MF3958(其是人源化的MF2971)；MF2971；MF3025；MF2916；MF3991(其是人源化的MF3004)；MF3031；MF2889；MF2913；MF1847；MF3001、MF3003或MF1898的VH链。所述VH优选包含以下的VH链的氨基酸序列：MF1849；或者MF2971或其人源化形式，其中所述人源化形式优选包含以下的氨基酸序列：MF3958；或者MF3004或其人源化形式，其中所述人源化形式优选包含如图10A中所示的MF3991的氨基酸序列；或者包含以下的VH链的氨基酸序列：MF1849；或者MF2971或其人源化形式，其中所述人源化形式优选包含以下的氨基酸序列：MF3958；或者MF3004或其人源化形式，其中所述人源化形式优选包含相对于图10A中所示的相应序列具有至多15个，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个，更优选至多1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、替换或其组合的如图10A中所示的MF3991的氨基酸序列。抗体的可变结构域优选包含相同的VH链，优选具有如图10A或图10E中所示的序列。有具有相同VH链的可变结构域的抗体不是双特异性抗体。如果VH链包含如图10A或图10E或图11中所示的相同的VH链序列，或相对于图10A或图10E或图11所示的相应序列具有1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、替换或其组合的相同的VH链序列，则对于本发明而言它们是相同的。
在一个实施方案中，本发明提供了包含结合ErbB-3的两个抗原结合位点的抗体，其中至少一个所述抗原结合位点结合ErbB-3的结构域III。优选地，这两个抗原结合位点均结合ErbB-3的结构域III。根据本发明的这样的抗体特别适合于与目前使用的不结合ErbB-3的结构域III的抗ErbB-3结合分子(例如结合ErbB-3的结构域I的MM-121(#Ab6)和RG7116)组合治疗，因为这样不同的结合分子不会彼此竞争相同的表位。
还提供了包含结合ErbB-3的两个抗原结合位点的抗体，其中至少一个所述抗原结合位点结合ErbB-3的结构域III，并且其中所述至少一个抗原结合位点对ErbB-3阳性细胞的亲和力(KD)低于或等于2.0nM，优选低于或等于1.5nM，更优选低于或等于1.39nM，更优选低于或等于0.99nM。优选地，这两个抗原结合位点均结合ErbB-3的结构域III。在一个优选的实施方案中，所述至少一个抗原结合位点对SK BR 3细胞上的ErbB-3的亲和力低于或等于2.0nM，优选低于或等于1.5nM，更优选低于或等于1.39nM，更优选低于或等于0.99nM。在一个实施方案中，所述亲和力在1.39至0.59nM的范围内。在一个优选的实施方案中，所述至少一个抗原结合位点对BT 474细胞上的ErbB-3的亲和力低于或等于2.0nM，更优选低于或等于1.5nM，更优选低于或等于1.0nM，更优选低于或等于0.5nM，更优选低于或等于0.31nM，更优选低于或等于0.23nM。在一个实施方案中，所述亲和力在0.31至0.15nM的范围内。
同样，上述亲和力优选如使用稳态细胞亲和力测量所测量的，其中使用放射性标记的抗体在4℃下孵育细胞，然后如实施例中所述测量细胞结合的放射性。
本发明还提供了抗体，其包含两个可变结构域，每个可变结构域均结合ErbB3，其中可变结构域的VH包含以下的VH链的氨基酸序列：如图10B或图10E或图11中所示的MF3178；MF3176；MF3163；MF3099；MF3307；MF6055；MF6056；MF6057；MF6058；MF6059；MF6060；MF6061；MF6062；MF6063；MF6064；MF6065；MF6066；MF6067；MF6068；MF6069；MF6070；MF6071；MF6072；MF6073或MF6074；或者包含相对于任何所述VH链序列具有至多15个，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个，更优选至多1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、替换或其组合的以下的VH链的氨基酸序列：MF3178；MF3176；MF3163；MF3099；MF3307；MF6055；MF6056；MF6057；MF6058；MF6059；MF6060；MF6061；MF6062；MF6063；MF6064；MF6065；MF6066；MF6067；MF6068；MF6069；MF6070；MF6071；MF6072；MF6073或MF6074。所述VH优选包含VH链MF3178、MF3176、MF3163、MF6058、MF6061或MF6065的氨基酸序列；或者包含相对于任何所述VH链序列具有至多15个，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个，更优选至多1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、替换或其组合的VH链MF3178、MF3176、MF3163、MF6058、MF6061或MF6065的氨基酸序列。所述VH优选包含VH链MF3178的氨基酸序列；或包含相对于MF3178的VH链序列具有至多15个，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个，更优选至多1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、替换或其组合的图10B中所示的VH链MF3178的氨基酸序列。抗体的可变结构域优选包含相同的VH链，其优选具有如图10B或图10E或图11中所示的序列。有具有相同VH链的可变结构域的抗体不是双特异性抗体。如果VH链包含如图10B或图10E或图11中所示的相同的VH链序列，或相对于图10B或图10E或图11的VH链序列有1、2、3、4或5个氨基酸插入、缺失、替换或其组合的相同的VH链序列，则它们是相同的。
本文中公开的ErbB-2/ErbB-3特异性抗体优选是双特异性抗体。抗体优选包含具有重链可变区的可变结构域，所述重链可变区包含如图10中所示的MF3958的ErbB-2特异性重链可变区的至少CDR1、CDR2和CDR3序列，或者与MF3958的CDR1、CDR2和CDR3序列在至多3个氨基酸、优选至多2个氨基酸，优选至多1个氨基酸处不同的CDR序列，以及具有重链可变区的可变结构域，所述重链可变区包含如图10中所示的MF3178的ErbB-3特异性重链可变区的至少CDR1、CDR2和CDR3序列，或者与MF3178的CDR1、CDR2和CDR3序列在至多3个氨基酸，优选至多2个氨基酸，优选至多1个氨基酸处不同的CDR序列。
ErbB-2/ErbB-3特异性抗体优选包含：具有重链可变区的ErbB-2特异性可变结构域，所述重链可变区包含具有0至10个，优选为0至5个，优选0、1或2个氨基酸替换的如图10中所示的MF3958的重链可变区的氨基酸序列；以及具有重链可变区的ErbB-3特异性可变结构域，所述重链可变区包含具有0至10个，优选0至5个，优选0、1或2个氨基酸替换的如图10中所示的MF3178的重链可变区的氨基酸序列。这些抗体中的轻链优选是图10C的轻链。
治疗患有乳腺癌或处于患有乳腺癌之风险中的对象的方法优选还包括确定雌激素受体、ErbB-2、ErbB-3、或其组合在所述癌症的细胞上的表达水平。
患有乳腺癌或处于患有乳腺癌之风险中的对象优选是人。如果一个人过去曾患有乳腺癌，但其处于缓解状态使得不能通过常规检查发现癌症，则该人处于患有乳腺癌之风险中。可认为这样的人已经治愈，但是当与同年龄的正常健康个体相比，该人患有乳腺癌的风险更高。乳腺癌可以是在处于缓解状态的原发癌位置处的复发癌或通常是在与原发癌部位的位置不同的位置处的乳腺癌的转移。
本发明还提供了治疗患有乳腺癌或处于患有所述癌症之风险中的对象的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的抗体，所述抗体可结合ErbB-2的胞外部分并抑制癌细胞上的ErbB-2/ErbB-3二聚化，其中癌症是激素受体阳性癌症。抗体优选是双特异性抗体，其具有可结合ErbB-2的胞外部分的抗原结合位点和可结合ErbB-3的胞外部分的抗原结合位点。抗体优选是本文中公开的双特异性ErbB-2/ErbB-3特异性抗体。该方法优选还包括向有此需要的对象施用治疗有效量的内分泌治疗药物。癌症优选是免疫组织化学ErbB-2+的癌症或免疫组织化学ErbB-2++而无ErbB-2基因扩增的癌症。
通常，在治疗过程中，将重复施用双特异性抗体和内分泌治疗。例如，在某些实施方案中，向需要治疗的对象施用多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)剂量的内分泌治疗和多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)剂量的双特异性抗体。
在一些实施方案中，可每日、每周数日、每周、每两周、每3或4周或以更长的间隔给予内分泌治疗的施用，并且可每周、每两周、每3或4周或以更长的间隔给予双特异性抗体的施用。双特异性抗体和内分泌治疗可以但不一定根据相同的施用方案施用。因此，内分泌治疗和双特异性抗体可在同一天或在不同的天中以不同的顺序(第一内分泌，第二双特异性，或反之亦然)给予。内分泌治疗可在双特异性抗体之前或之后1天或更多天施用，或反之亦然。
在一些实施方案中，双特异性抗体和/或内分泌治疗的剂量随时间变化。在整个治疗过程中，内分泌治疗和/或双特异性治疗的剂量可相同。替代地，内分泌治疗和/或双特异性治疗的剂量可在开始时较高，例如加载较高的剂量(其可以是唯一剂量或数个剂量)，随后是维持剂量。替代地，内分泌治疗和/或双特异性治疗的剂量可在开始时较低(其可以是唯一剂量或数个剂量)，随后是维持剂量。另外地或替代地，从每周一次的方案开始的药剂的内分泌治疗或二者的初始施用方案可改为每两周一次的方案或其他。临床医生可使用通过所治疗患者的状况所确保的优选的剂量和/或剂量方案。
用内分泌治疗进行治疗可以以小于化合物最佳剂量的较小剂量开始。此后，可以少量提高剂量，直到在这种情况下达到最佳效果为止。为了方便起见，如果需要，可将每日总剂量分开并在一天中分批施用。也可使用间歇治疗(例如，三周治疗一周或四周治疗三周)。
在某些实施方案中，双特异性抗体以约750mg的平坦剂量(flat dose)每3周施用，但是替代地，其可在每周、每两周、每3周、每4周或更长间隔的施用方案中以300mg至900mg的平坦剂量的剂量范围给予。
在本文中给出的范围介于数字1和2之间时，该范围包括数字1和2。例如，介于2至5之间的范围包括数字2和5。
当在本文中提及高于另一个亲和力的亲和力时，Kd＝低于另一个Kd。为避免疑义，10e-9M的Kd低于10e-8M的Kd。针对靶标Kd为10e-9M的抗体的亲和力高于当Kd为10e-8M时的亲和力。
出于清楚和简明的描述的目的，本文将特征描述为相同或不同的实施方案的一部分，然而，应当理解，本发明的范围可包括具有所述特征的全部或一些的组合的实施方案。
附图简述
图1.人HBCx-34乳腺肿瘤异种移植物中的平均和单个的肿瘤生长变化。在HBCx-34植入之后36天开始治疗。在D0、D3、D7、D10、D14、D17、D21、D24、D28、D31、D35、D38、D42、D45、D49、D52、D56时施用MCLA-128的载剂和25mg/kg的MCLA-128并且每天施用来曲唑的载剂和2.5mg/kg的来曲唑，持续57天。初始组规模：9至10只动物。
图2.人HBCx-34乳腺肿瘤异种移植物中的T/C％。在HBCx-34植入之后36天开始治疗。在D0、D3、D7、D10、D14、D17、D21、D24、D28、D31、D35、D38、D42、D45、D49、D52、D56时施用MCLA-128的载剂和25mg/kg的MCLA-128并且每天施用来曲唑的载剂和2.5mg/kg的来曲唑，持续57天。初始组规模：9至10只动物。
图3.人HBCx-34乳腺肿瘤异种移植物中平均和单个的相对体重变化。在HBCx-34植入之后36天开始治疗。在D0、D3、D7、D10、D14、D17、D21、D24、D28、D31、D35、D38、D42、D45、D49、D52、D56时施用MCLA-128的载剂和25mg/kg的MCLA-128并且每天施用来曲唑的载剂和2.5mg/kg的来曲唑，持续57天。初始组规模：9至10只动物。
图4.HBCx-34 PDX模型的体内生长特征。A：HBCx-34 PDX肿瘤的IHC特征。B：无胸腺裸鼠s.c.移植有HBCx-34肿瘤。补充有雌激素的动物用氟维司群载剂进行治疗并且未接受雌激素的动物用载剂或来曲唑进行治疗。补充雌激素诱导了更快的肿瘤生长，并且来曲唑显著降低了雌激素非依赖性肿瘤的形成。进行T检验以比较用载剂或来曲唑进行治疗的雌激素非依赖性肿瘤的肿瘤体积(*：p＜0.05；**：p＜0.01；***：p＜0.001)。
图5.第25天的MCF-7异种移植小鼠的肿瘤体积。开始治疗
在D0、D1、D4、D8、D11、D15、D22和D25时施用MCLA-128载剂、25mg/kg的MCLA-128，并且隔天(D1、D3、D5等)施用激素治疗载剂和他莫昔芬。氟维司群每周施用一次。对于KruskalWallis Dunn’s检验或Mann-Whimey U检验，与载剂组比较的统计学显著性：ns表示不显著，*表示0.01＜P＜0.05，**表示0.001＜P＜0.01，***表示P＜0.001。TGI＞60％表示潜在的治疗活性。MTV：平均肿瘤体积，G1 MTV：第1组(载剂)MTV，TGI：肿瘤生长抑制。
图6.用MCLA-128、氟维司群或他莫昔芬作为单一药剂或组合治疗进行治疗的MCF-7异种移植小鼠的肿瘤体积。对于每个时间点，统计t检验将氟维司群与氟维司群+MCLA-128以及他莫昔芬与他莫昔芬+MCLA-128进行比较。n.s表示不显著，*表示P＜0.05；**表示P＜0.01。
图7.两个独立的VeraTag测定之间的测定间相关性。将在第1轮和第2轮测定中获得的测定得分绘制在XY图中，并使用x＝y线性回归进行比较。所有测定均显示两个时间点的结果之间有良好的相关性，仅“第7组分析3”样品显示出超过20％的变异系数(CV％)。
图8.8天治疗期之后，MCF-7肿瘤中的总HER2、总HER3和HER2：HER3二聚体水平的调节。将异种移植小鼠用总共3个剂量的MCLA-128或2个剂量的氟维司群或其组合治疗8天。最后一个剂量之后24小时，收获肿瘤，将其处理成FFPE，并进行VeraTag分析用于进行指定的测定。每个治疗组的五个独立的肿瘤用于进行最终分析。统计t检验将所有组进行独立地比较。**表示P＜0.01。
图9.用载剂、MCLA-128、氟维司群、他莫昔芬、MCLA-128+氟维司群或MCLA-128+他莫昔芬进行治疗的MCF-7肿瘤异种移植物中的反相蛋白阵列(Reverse phase proteinarray，RPPA)。在该测定中检测到的蛋白质包括(磷酸化)-Akt和(磷酸化)-HER3(完整数据在附录4中提供)。单因素方差分析(one-way ANOVA)将来源于治疗组的所有肿瘤与来源于PBS组的肿瘤中的水平进行比较。**表示P＜0.01。
图10.本发明抗体的VH链、普通轻链和重链的核酸和氨基酸序列。在该图中指示了前导序列的情况下，所述前导序列不是VH链或抗体的一部分，而是通常在产生蛋白质的细胞中的蛋白质加工期间被切割的。
图11.MF3178变体的氨基酸和核苷酸比对。指示了CDR区。
图12.组合治疗的研究设计：MCLA-128+内分泌治疗。
图13.组合治疗研究的治疗施用：MCLA-128+内分泌治疗-所有周期。
实施例
本文中使用的“MFXXXX”(其中X独立地为数字0至9)是指包含可变结构域的Fab，其中VH具有由4个数字标识的氨基酸序列。除非另外指出，否则可变结构域的轻链可变区通常具有图10C的轻链的可变区的序列。轻链通常是如图10C中所示的轻链。“MFXXXX VH”是指由4个数字标识的VH的氨基酸序列。MF还包含轻链的恒定区和通常与轻链的恒定区相互作用的重链的恒定区。PG是指包含相同重链和轻链的单特异性抗体。PB是指具有两条不同重链的双特异性抗体。重链的VH可变区不同，并且通常CH3区也不同，其中一条重链具有其CH3结构域的KK突变，并且另一条具有其CH3结构域的互补DE突变(参见PCT/NL2013/050294(公开为WO2013/157954)作为参考)。
实施例1
在与芳香酶抑制剂一起的组合治疗的情况下确定了HER2/HER3靶向抗体的抗肿瘤效力。MCLA-128被用作双特异性Her2/Her3靶向抗体的一个优选实例。其作为单一药剂使用和与芳香酶抑制剂来曲唑组合使用。在免疫缺陷小鼠中建立的激素依赖性HBCx-34患者来源的乳腺癌异种移植模型被用作乳腺癌的一个实例。
人肿瘤异种移植模型
在癌症中心治疗的患者的知情同意下，获得了具有多种组织学来源的人肿瘤样品，并将其建立为免疫缺陷小鼠中的可移植异种移植物。移植的样品是治疗之前或治疗之后获得的原发性肿瘤或转移的残留物质。这些患者来源的异种移植物(patient-derivedxenograft，PDX)模型无需事先体外培养即可建立，并已针对组织学、细胞遗传学、遗传和其他生物标志物及针对其对护理标准(standard-of-care，SOC)治疗的响应进行研究。
HBCx-34 PDX模型来源于未经治疗的
原发性乳腺浸润性导管癌。HBCx-34 PDX模型具有突变的ATM(编码涉及双链DNA修复的蛋白质的基因)和wt p53，其是ER+/PR+的，并且其是针对多西他赛(Docetaxel)、卡培他滨(Capecitabine)、他莫昔芬以及阿霉素/环磷酰胺组合的应答者和针对来曲唑的低应答者。
HBCx-34肿瘤模型从植入日开始(同时补充雌激素)需要约35天才能获得60至200mm3范围内的最大肿瘤，并且需要约80天才能达到2000mm3。在携带有HBCx-34的小鼠中，HBCx-34没有明显的恶病特性，但未观察到体重增加。
MCLA-128是靶向HER2：HER3二聚体的ADCC增强的IgG1双特异性抗体。MCLA-128在用高浓度的调蛋白(heregulin，HRG)刺激的细胞中显示出优于其他抗HER2和抗HER3抗体的体外效能，从而克服了目前HER2治疗的耐药机制之一。
从肿瘤植入之日至入选日(date of inclusion)，荷瘤小鼠接受了在饮用水中稀释的雌激素(β-雌二醇，8.5mg/l)。在治疗期间，小鼠不补充雌激素。
动物和维持条件
将重18至25克的远交的无胸腺(nu/nu)雌性小鼠(《HSD：Athymic Nude-Foxn1nu》)(Harlan Laboratories，Gannat，France)分配到动物设施中进行适应，并在操作之前至少6天随意获得食物和水(方案4-1)。
方案4-1动物特征
受试化合物和制剂
MCLA-128载剂随时可用并用于从第0天到第38天的给药并且储存在+4℃下。然后，从第42天至第56天(研究结束)，将0.9％NaCl(CDM Lavoisier批次6F134)用作用于给药和MCLA-128制剂的载剂。从第42天至第56天每周制备0.9％NaCl等分试样(CDM Lavoisier批次6F134)，并将其储存在+4℃下。来曲唑载剂(CDM Lavoisier批次6F134)：0.9％NaCl随时可用。每周制备0.9％NaCl等分试样(CDM Lavoisier批次6F134)，并将其储存在+4℃下。
MCLA-128随时可用并且用于从第0天到第42天的注射。此后，将MCLA-128等分试样在0.9％NaCl中稀释，以获得2.5mg/ml的工作溶液，其在每次注射之前制备。将其用于从第42天至第56天(研究结束)的给药。
在磁力搅拌下将来曲唑片(Letrozole Actavis)溶于0.9％NaCl中，以形成0.25mg/ml的最终溶液。给药溶液可稳定7天，并在+4℃下避光储存。
肿瘤移植模型诱导
将同代的肿瘤皮下移植到6至24只小鼠(供体小鼠，第(n-1)代)上。当这些肿瘤达到1000至2000mm3时，通过颈脱位法处死供体小鼠，无菌切除并解剖肿瘤。去除坏死区域之后，将肿瘤切成测量为约20mm3的片段并在接枝之前转移到培养基中。
用100mg/kg盐酸氯胺酮(批次5D92，有效期：2017/03，Virbac)和10mg/kg赛拉嗪(xylazine)(批次KP0AX9X，有效期：2017/08，Bayer)麻醉95只小鼠，然后用氯已定溶液对皮肤进行灭菌，将其在肩胛间区域水平处切开，并将20mm3的肿瘤片段置于皮下组织中。用夹子封闭皮肤。
来自同一实验的所有小鼠均在同一天进行植入。
治疗阶段
将40只具有皮下生长的62.5至256mm3之间的HBCx-34肿瘤的小鼠根据其肿瘤体积进行分配，以给出每个治疗臂中的同质平均肿瘤体积和中位肿瘤体积。将治疗随机地施加至容纳多至5只小鼠的盒，并且在植入肿瘤之后36天开始治疗(42％的入选率)。治疗开始之后57天，研究终止。
肿瘤测量和动物观察
通过在实验期间每两周用卡尺测量肿瘤直径来评价肿瘤体积。
使用公式TV(mm3)＝[长度(mm)×宽度(mm)2]/2，其中长度和宽度分别是肿瘤的最长和最短直径。
在实验期间，每两周对所有动物称重。
不同治疗的毒性被确定为：体重减轻百分比(％BWL)＝100-(平均BWx/平均BW0×100)，其中BWx是治疗期间任何一天的平均BW，BW0是治疗第一天的平均BW。
如以下方案中所概括的，总共使用了4组。每组最初包含10只小鼠。
在第1组中，MCLA-128的载剂和来曲唑的载剂分别以10ml/kg在D0、D3、D7、D10、D14、D17、D21、D24、D28、D31、D35、D38、D42、D45、D49、D52、D56时i.p.给药和以p.o.，qd×57地给药；
在第2和第4组中，MCLA-128以25mg/kg在D0、D3、D7、D10、D14、D17、D21、D24、D28、D31、D35、D38、D42、D45、D49、D52、D56时i.p.给药；
在第3和第4组中，来曲唑以2.5mg/kg，p.o.，qd×57地给药。
在每次注射时根据体重调整所有治疗剂量。
结果
治疗期间平均体重变化百分比如图3所示。
在第1组中，将MCLA-128载剂在D0、D3、D7、D10、D14、D17、D21、D24、D28、D31、D35、D38、D42、D45、D49、D52、D56时i.p.给予并将来曲唑载剂p.o.，qd×57地给予，二者均以10ml/kg施用，均耐受性良好，第4天的最大平均体重减轻了0.4％并且第49天的最大个体体重减轻了3.7％。
在第2组中，将MCLA-128在D0、D3、D7、D10、D14、D17、D21、D24、D28、D31、D35、D38、D42、D45、D49、D52、D56时以25mg/kg i.p.给予，其以10ml/kg施用，耐受性良好，第25天的最大平均体重减轻了0.4％并且第39天的最大个体体重减轻了8.3％。
在第3组中，将来曲唑以2.5mg/kg p.o.给药，其以10ml/kg，qd×57地施用，耐受性良好，在第4天时无平均体重减轻并且最大个体体重减轻了4.1％。
在第4组中，将MCLA-128在D0、D3、D7、D10、D14、D17、D21、D24、D28、D31、D35、D38、D42、D45、D49、D52、D56时以25mg/kg i.p.给药，并且将来曲唑以2.5rng/kg，p.o.，qd×57地给药，二者均以10ml/kg施用，耐受性良好，第4天的最大平均体重减轻了0.7％，第4天的最大个体体重减轻了4.2％。
肿瘤生长曲线(随时间变化的平均肿瘤体积)示于图1中。每个治疗组的T/C百分比值示于表1中，并在图2中进行说明。部分和完全响应的限定在表2中限定。统计学分析示于表3和表4中。
在这项研究中，在实验期间每两周测量肿瘤。
在第2组中，将MCLA-128在D0、D3、D7、D10、D14、D17、D21、D24、D28、D31、D35、D38、D42、D45、D49、D52、D56时以25mg/kg i.p.给药，其以10ml/kg i.p.施用，未诱导统计学显著的肿瘤生长抑制，第28天的TGDi＝0.93，最佳T/C％＝91.14％；T/C％＝101.56％(对照组结束)并且在对照组结束时最佳TGI％＝31.59％。然而，观察到1/9的肿瘤稳定和1/9的部分肿瘤消退。
在第3组中，将来曲唑以2.5mg/kg给药，其以10ml/kg，p.o.，qd×57地施用，诱导了统计学显著的肿瘤生长抑制(Mann Whitney检验：与载剂组相比，P＜0.001；通过Dunn检验，与对照组相比，p＜0.05)，第56天(对照组结束)的TGDi＞1.1，最佳T/C％＝18.68％，并且第35天的最佳TGI％＝145.70％。此外，观察到7/10的部分肿瘤消退和1/10的完全肿瘤消退。
在第4组中，MCLA-128和来曲唑的组合(其中MCLA-128在D0、D3、D7、D10、D14、D17、D21、D24、D28、D31、D35、D38、D42、D45、D49、D52、D56时以25mg/kg i.p.给药，并且将来曲唑以2.5mg/kg，p.o.，qd×57地给药，二者均以10ml/kg施用)诱导了统计学显著的肿瘤生长抑制(Mann Whitney检验和Dunn检验：与载剂组相比，P＜0.001)，第56天(对照组结束)的TGDi＞1.1，最佳T/C％＝9.64％，并且第32天的TGI％＝169.03％。此外，观察到5/10的部分肿瘤消退和5/10的完全肿瘤消退，在研究结束时有5/10的无肿瘤幸存者。
讨论
基于体重数据和临床观察，在测试的剂量和时间表下，所有作为单一药剂或组合的受试化合物均耐受性良好。
在HBCx-34模型中，单独的MCLA-128不会诱导肿瘤生长抑制，而单独的来曲唑诱导了统计学显著的肿瘤生长抑制。来曲唑与MCLA-128组合诱导了统计学显著的协同肿瘤生长抑制。
乳腺癌患者的治疗选择由三种生物标志物指导：HER2、雌激素(ER)和孕酮(PR)受体。HER2过表达的患者符合HER2靶向治疗，例如曲妥珠单抗和帕妥珠单抗。ER/PR阳性患者将接受抗雌激素治疗或芳香酶抑制剂。抗雌激素药(例如他莫昔芬和氟维司群)调节ER活性，而芳香酶抑制剂(AI，例如来曲唑或依西美坦)抑制雄激素向雌激素的转化，从而耗尽患者中ER刺激的水平。抗雌激素和芳香酶抑制剂用于不同的ER+乳腺癌患者群中，例如AI被用作绝经后患者的一线治疗。在实施例2中，证明了将MCLA-128添加至他莫昔芬或氟维司群增强了抗雌激素治疗的活性。
实施例2
评价MCLA-128作为单一治疗以及与SERM他莫昔芬和SERD氟维司群
组合用于雌激素响应性MCF-7人乳腺癌的裸鼠异种移植模型的效力。该研究设计还包括肿瘤收集用于进行下游分析。
在具有已建立的皮下MCF-7肿瘤的小鼠中在D1时开始治疗。研究终点旨在是1000mm3的肿瘤体积终点或45天，以先来临者为准。研究在D39时结束，并且治疗结果基于肿瘤生长抑制百分比(％TGI)，其被定义为D25时的经治疗小鼠和对照小鼠的中位肿瘤体积(median tumor volume，MTV)之间的差异百分比。选择D25进行分析是因为其是动物因肿瘤进展而退出研究之前的最后一天。
根据对被定义为治疗组和对照组的最终(D25)中位肿瘤体积(MTV)之间的差异百分比的肿瘤生长抑制百分比(％TGI)的分析来确定治疗响应，其中使用Mann-Whitney检验在P≤0.05时组之间的差异被视为是统计学显著的。还考虑了肿瘤消退、平均肿瘤生长和治疗耐受性。
小鼠
雌性无胸腺裸鼠(Crl：NU(NCr)-Foxn1nu，Charles River)为十周龄，并且在研究的D1时体重范围为19.2至30.5克。给动物随意饲喂水(反渗透，1ppm Cl)和由18.0％的粗蛋白、5.0％的粗脂肪和5.0％的粗纤维组成的NIH 31 Modified and Irradiated Lab
在20至22℃(68至72°F)和40至60％湿度下在12小时的光照周期中将小鼠饲养在静态微型隔离器中的经辐照Enrich-o’cobsTM实验室动物垫料上。
肿瘤植入
在肿瘤细胞植入之前三天，使用灭菌套管针将雌激素丸(0.36mg雌二醇，60天释放，Innovative Research of America，Sarasota，FL)皮下植入所有受试动物的肩胛骨之间。
用经培养的MCF-7人乳腺癌细胞开始异种移植。使肿瘤细胞在含有10％胎牛血清、100个单位/mL的青霉素G、100μg/mL的硫酸链霉素、2mM谷氨酰胺、10mM HEPES、0.075％碳酸氢钠和25μg/mL庆大霉素的RPMI-1640培养基中生长至对数中期。在肿瘤细胞植入当天，将细胞胰蛋白酶消化、沉淀并以1×10e8个细胞/mL的浓度重悬于磷酸缓冲盐水(phosphatebuffered saline，PBS)中。每只受试小鼠在右胁(right flank)处接受皮下植入的1×10e7个MCF-7细胞，并自其平均体积接近期望的100至150mm3范围起监测肿瘤生长。
肿瘤细胞植入之后19天，其被指定为研究的D1，将小鼠分为6组，每组15只动物，以及四组，每组6只动物。在D1时，单个肿瘤体积范围为75至196mm3，组平均肿瘤体积为134至137mm3。在1mg相当于1mm3的肿瘤体积的假定下估计肿瘤重量。
治疗剂
将储存在4℃下的MCLA-128以2.5mg/mL预配制来提供，并准备作为10mL/kg剂量体积中的25mg/kg给药，并且在储存和处理期间避光。他莫昔芬(Sigma-Aldrich，批号WXBB5732V)作为粉末接收，并将其在4℃下避光储存。每周在玉米油中制备5mg/mL剂量溶液，并且每只小鼠接受0.2mL，剂量为1mg/只动物。剂量溶液储存在4℃下。氟维司群，商品名
(AstraZeneca，批号LV032、LW466和LX432)作为50mg/mL的储备溶液被接收，并将其储存在4℃下。在每个给药日，将储液在玉米油中稀释至25mg/mL，并且每只小鼠接受0.2mL，剂量为5mg/只动物。
治疗
第1和第7组分别充当效力和采样的对照，并在D1、4、8、11、15、18、22、25和29时腹膜内(i.p.)接受MCLA-128载剂，并且每隔一天皮下(s.c.)接受玉米油，持续15个剂量(qod×15)。第2和第8组以与MCLA-128载剂相同的时间表以25mg/kg i.p.施用MCLA-128。第3和第9组以5.0mg/只动物每周一次s.c.施用
持续5周(qwk×5)。第4组以1mg/只动物，s.c.，qod×15地施用他莫昔芬。在上述方案中，第5和第10组接受了MCLA-128和
在上述方案中第6组接受了MCLA-128和他莫昔芬。
MCLA-128以10mL/kg的剂量体积施用，按每只动物的个体体重进行比例调整。
和他莫昔芬以0.2mL的固定体积施用。
结果
图5是显示按组的肿瘤分布的散点图。图6显示了研究中所有组的组中位肿瘤生长曲线。
对照小鼠中MCF-7肿瘤的生长(第1组)
第1组小鼠接受如上所示的MCLA-128载剂和玉米油，并充当对照组用于计算TGI百分比并进行统计学比较。该组中中位肿瘤体积为600mm3，其中在D25时单个肿瘤体积为288至936mm3(图5)。在数据分析时，在D15和D21时记录了两例NTRu死亡，余下了十三只可评估的动物。在D25之后记录了另外的NTRu死亡；在D26时一只，在D35时两只。所有死亡均归因于疑似与雌激素相关的毒性。
对MCLA-128的响应(第2组)
在第2组中，如上所示施用MCLA-128。该治疗导致中位肿瘤体积为600mm3，对应于相对于对照组的非显著的0％TGI(P＞0.05)。在数据分析时，记录了六例NTRu死亡；在D17和D22时各两只，在D19和D20时各一只，余下了九只可评估的动物。D25之后记录了另外的NTRu死亡；在D29和D36时各一只。所有死亡均归因于疑似与雌激素相关的毒性。
对
的响应(第3组)
在第3组中，如上所示施用
该治疗导致中位肿瘤体积为288mm3，对应于相对于对照组的显著的52％TGI(P＜0.001)。在D20和D24时记录了两例NTRu死亡，余下了十三只可评估的动物。所有死亡均归因于疑似与雌激素相关的毒性。
对他莫昔芬的响应(第4组)
在第4组中，如上所示施用他莫昔芬。该治疗导致中位肿瘤体积为184mm3，对应于相对于对照组的显著的69％TGI(P＜0.001)。在数据分析时，在D3、D10和D22时记录了三例NTRu死亡，余下了十二只可评估的动物。在数据分析之后，在D26时还记录了两例死亡。所有死亡均归因于疑似与雌激素相关的毒性。
对与
或他莫昔芬组合的MCLA-128的响应(第5和第6组)
在第5组中，将MCLA-128与
组合，并如上所示进行施用。该处理导致中位肿瘤体积为126mm3，对应于显著的79％TGI。相对于对照组和MCLA-128单一治疗组(P＜0.001)以及
单一治疗(P＜0.05)，该结果是显著的。该组中记录了三例PR。在D17时记录了1例NTRu死亡，余下了十四只可评估的动物。该死亡归因于疑似与雌激素相关的毒性。
在第6组中，将MCLA-128与他莫昔芬组合，并如上所示进行施用。该处理导致中位肿瘤体积为108mm3，对应于显著的82％TGI。相对于对照组和MCLA-128单一治疗(P＜0.001)以及他莫昔芬单一治疗(P＜0.05)，该结果是显著的。该组记录了四例PR。在数据分析时，在D15时记录了一例NTRu死亡，余下了十四只可评估的动物。在数据分析之后，还记录了另外三只死亡；在D30时两只，在D39时一只。该死亡归因于疑似与雌激素相关的毒性。
讨论
该实施例评价了药剂MCA-128与
和他莫昔芬相比以及与
和他莫昔芬组合在雌激素响应性MCF-7人乳腺癌的裸鼠异种移植模型中的效力。每周两次测量肿瘤直至D39，并在D25时进行TGI分析。
在D25时，对照组1的中值肿瘤体积为600mm3，单个肿瘤为288至936mm3。施用MCLA-128、
或他莫昔芬的组导致中位肿瘤体积为600、288和184mm3，对应于TGI为0％、52％和69％TGI。与对照相比，MCLA-128单一治疗的结果不是显著的(P＞0.05)，但与对照相比，他莫昔芬和
的结果是显著的(P＜0.001)。MCLA-128与他莫昔芬或
组合进行治疗导致中位肿瘤体积为126和108mm3，分别对应于79％和82％TGI。与对照和MCLA-128单一治疗(P＜0.001)以及与他莫昔芬或
相应的治疗(P＜0.05)相比，这些结果中的每一个均是显著的。MCLA-128/
组中记录了三例PR并且MCLA-128/他莫昔芬组中记录了四例PR。所有治疗均耐受良好。所有组中的数例死亡均归因于雌激素毒性。总之，与MCF-7裸鼠异种移植模型中的相应的单一治疗相比，MCLA-128与
或他莫昔芬的组合治疗提供了显著性的协同存活益处。所有治疗均为可接受地耐受。
MCLA-128作为单一药剂未显示出抗肿瘤效力，而氟维司群和他莫昔芬均显著降低了肿瘤生长。在第25天趋近于治疗期结束时，在与相应的单一治疗相比时，MCLA-128与氟维司群或他莫昔芬的组合治疗提供了显著性的存活益处(图5)。有趣的是，在无治疗观察期内，组合治疗的有益抗肿瘤作用继续存在(图6)。所有治疗均为可接受地耐受。
实施例3
药效学分析
第1轮VeraTag测定
将来自实施例2的所有经福尔马林固定的肿瘤处理成FFPE块。进行最初的VeraTag测定分析(第1轮)，其中3个肿瘤/每组。
在VeraTag分析之前，将肿瘤切片并用苏木精-伊红染色以确定肿瘤内容物的百分比。微激光捕获被用于大体上去除任何非肿瘤内容物。初始轮分析包括以下五种VeraTag测定：总HER2、总HER3、HER2：HER3二聚体、HER3-PI3K复合体和磷酸化HER3。
相对于载剂，MCLA-128处理在任何测定中均未显示出显著的效果。仅在HER2：HER3测定中观察到组之间的显著性差异，其中用氟维司群进行处理显著上调了HER2∶HER3二聚体的形成，并且与MCLA-128共处理将HER2：HER3二聚体的水平逆转至经载剂处理的肿瘤中的情况。
尽管不是统计学显著的，但在HER2和HER3测定中观察到了类似的趋势。由于数据仅包含三个肿瘤/处理组，因此需要更多数据点以确定该趋势是否表明与HER2：HER3测定所见相似的结果。因此，表5中剩余的肿瘤包括在针对总HER2、总HER3和HER2：HER3二聚体的第二轮VeraTag测定中。由于在磷酸化HER3和HER3-PI3K测定中未观察到氟维司群或与MCLA-128组合的显著性作用，因此这些测定未包括在第2轮中。
第2轮VeraTag测定
在第一轮中分析的其得分接近特定测定的平均值的肿瘤包含在第二轮中，以评估测定间的再现性，并确保来自两个独立实验的数据可进行组合。在两轮中分析的那些肿瘤的结果在测定之间相关性良好，变异系数(CV)低于20％，除肿瘤“第7组分析3”之外，该肿瘤被排除在最终分析之外(图7)。
对来自两轮的数据进行组合，结果证实了与载剂相比，氟维司群显著诱导HER2：HER3二聚化，并且其可通过共施用MCLA-128而逆转(图8)。
另外，氟维司群组中的HER2表达水平显著高于单独的MCLA-128或组合处理组。载剂组在样品之间有一些差异，并且与氟维司群组相比未显示出显著性的差异。最后，尽管相对于所有其他组，氟维司群组中的HER3略有增加，但不同处理组之间的HER3表达没有显著改变。
RPPA分析
当来自第1至6组的肿瘤达到最大耐受体积时，或在第39天实验结束(即最后一剂之后10天)时，收集所述肿瘤。每个处理组六个肿瘤包含在反相蛋白阵列(Reverse phaseprotein array，RPPA)中。进行肿瘤选择，以使得六个试样的平均肿瘤尺寸接近于整个组的平均肿瘤尺寸。如下进行RPPA分析：将肿瘤进行切片并放置在免疫组织化学载玻片上。宏观解剖基质和炎性的内容物以纯化肿瘤细胞。制备蛋白质裂解物并量化蛋白质含量。然后将蛋白质样品以两个不同的浓度一式四份地点在硝化纤维素载玻片上，并且然后用对全部或磷酸化形式的Akt、ERK、HER2和HER3具有特异性的一抗孵育。
使用单因素方差分析对反相蛋白阵列(RPPA)数据进行分析，以检测处理组和载剂组之间的显著性差异。Faslodex组中的总Akt和磷酸化Akt水平提高，在其他组中未观察到显著性差异。仅单一药剂组中的总ERK水平提高，在其他组或磷酸化ERK分析中未测量到差异。他莫昔芬和Faslodex组中的总HER2水平显著提高，但磷酸化HER2水平未显著提高。MCLA-128与激素治疗的共处理阻止了HER2表达的这种诱导。仅Faslodex组中的HER3总水平显著提高，而在与MCLA-128共处理的情况下，HER3总水平则降低。
讨论
药效学分析
VeraTag测定分析的发现是，在来自用氟维司群治疗的小鼠的肿瘤中，HER2表达水平显著更高。根据VeraTag测定的得分与如通过免疫组织化学(IHC)确定的HER2阳性相关：HER2 VeraTag得分低于10.5在IHC中是阴性的，得分为10.5至17.8是可疑的，并且得分高于17.8是阳性的(Huang等，2010 Am J Clin Pathol.134(2)：303-11)。因此，显示氟维司群治疗可将HER2阴性肿瘤的HER2状态(即根据ASCO指南得分为0或1+，Wolff等，2013 J ClinOncol.31(31)：3997-4013)改变成至少是可疑的(通常得分为2+)HER2状态。最重要的是，VeraTag分析显示氟维司群治疗诱导了HER2：HER3二聚体的形成，其可通过向该治疗方案添加MCLA-128来逆转。
生物标志物分析
在这组实验中，其中我们使用RPPA测量了一组生物标志物的水平，发现了在激素治疗处理的肿瘤中Akt、HER2和HER3表达增强。这种激素治疗诱导的提高可通过共施用MCLA-128来逆转的事实表明Akt信号传导通路的激活与HER2：HER3二聚体活性相关，因此其在这些肿瘤中被MCLA-128靶向。这与从VeraTag测定获得的数据一致，并进一步证实了将MCLA-128与激素治疗在体内共施用的有益作用。
一般性注意事项
在MCF-7异种移植物中进行氟维司群治疗之后HER2蛋白表达的提高与已经在患者中观察到的针对激素治疗的抗性机制一致(Osborne和Schiff 2011 Osborne CK，SchiffR.Annu Rev Med.62：233-47)。还已经描述了氟维司群在体外和体内上调MCF-7细胞中的HER3表达(Morrison等，2013 J Clin Invest.123(10)：4329-43)，其是通过RPPA分析而不是VeraTag分析观察到的。这可能是由于肿瘤收获的时机不同(对于VeraTag和RPPA测定，分别在治疗期开始和结束时)。
MCLA-128和氟维司群之间的协同作用可通过在来源于用这种组合进行治疗的小鼠的肿瘤中看到的HER2：HER3二聚体形成增加来解释。在单独用氟维司群进行治疗的小鼠的肿瘤中也观察到Akt的磷酸化提高(RPPA分析)。
实施例4：在雌激素受体阳性和低HER2表达的MBC中的MCLA-128/内分泌治疗的II
期研究
尽管实施例描述了MCLA-128与内分泌治疗组合的施用，但是该实施例并不旨在限制所阐述的特定治疗剂的用途，并且适用于所公开的结合ErbB-2和ErbB-3的双特异性抗体与内分泌治疗组合。
目标：雌激素受体[ER]阳性/低HER2表达MBC)：MCLA-128+内分泌治疗
主要目标：
·基于RECIST 1.1(根据研究者审查)，根据24周时的临床获益率(clinicalbenefit rate，CBR)评价与内分泌治疗组合的MCLA-128在ER阳性和低HER2表达的MBC患者中的效力，所述患者自相同的内分泌治疗起先前已经具有进展。
次要目标：
·基于RECIST 1.1根据中心审查评价24周时的CBR
·评价无进展存活(progression free survival，PFS)(根据研究者和中心审查)
·基于RECIST 1.1(根据研究者和中心审查)评价客观响应率(objectiveresponse rate，ORR)
·基于RECIST 1.1(根据研究者和中心审查)评价从响应(CR或PR)直至由于潜在癌症导致的进展或死亡的时间(DoR)
·评价OS
·评价与内分泌治疗组合的MCLA-128的安全性和耐受性
·表征与内分泌治疗组合的MCLA-128的PK
·表征与内分泌治疗组合的MCLA-128的免疫原性
探索目标：
·评价肿瘤或血液样品中的生物标志物与抗肿瘤活性之间的潜在相关性(包括HER2、HER3、HER2∶HER3二聚体、调蛋白和其他潜在生物标志物)。
研究设计
进行了2期、开放标签、多中心的国际研究，以评价基于MCLA-128的组合在ER阳性/低HER2的转移性乳腺癌(MBC)群中的效力。
患者是ER阳性的，其具有低HER2表达转移性乳腺癌(MBC)(免疫组织化学(IHC)1+或IHC 2+与阴性荧光原位杂交(FISH)组合)，根据RECIST v1.1，其自先前的包含芳香酶抑制剂或氟维司群的内分泌治疗(施用至少12周)的最后步骤(last line)起已经具有进展。
以下患者是合格的：其必须在转移的情况下接受过1或2种先前的内分泌治疗，并且自细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(在任意步骤中)起已经具有进展(根据RECISTv1.1)。
对于纳入，HER2和HR状态以及先前进展的放射学文件均基于医学记录。通过中心实验室观察尽快确认是否符合HER2/HR状态，并通过中心影像观察尽快确定是否符合先前疾病进展。回顾性发现不符合资格的患者不可用于评估主要目标并可被替换。
MCLA-128与相同的先前内分泌治疗组合施用，关于所述治疗在放射学上记录进行性疾病。包括总共多至40位可用于评估效力的患者。
参见图12。
研究群体
纳入标准
患者必须满足以下所有要求才能进入研究：
1.在开始任何研究程序之前签署知情同意书。
2.患有经组织学或细胞学证实的乳腺癌的具有转移性或局部晚期的疾病的证据，不适合任何具有治愈意图的局部治疗的女性：
a.基于最近肿瘤活检的分析，已记录的激素受体阳性状态(雌激素受体阳性[ER+]和/或孕酮受体阳性[PR+])，所述状态包含≥1％的阳性染色细胞。
b.基于对新鲜肿瘤活检或在筛查之前的12个月内收集的存档活检的局部分析，已记录的低水平HER2表达，其被限定为IHC HER2 1+或IHC HER2 2+与阴性FISH组合(优选转移性，否则为原发性)。
c.在治疗至少12周之后，针对转移性疾病的先前内分泌治疗(芳香酶抑制剂或氟维司群)的一个或两个步骤，自最后的步骤开始放射学地记录了疾病进展。
d.细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的进展。
e.针对晚期/转移性疾病，不超过一种先前的化学治疗方案。
注意：如果可接受用促黄体素释放素LHRH激动剂戈舍瑞林进行治疗，则可纳入绝经前/围绝经期女性。这样的患者必须在研究开始(study entry)之前至少4周开始用戈舍瑞林或替代的LHRH激动剂进行治疗，并且在研究开始之前接受替代的LHRH激动剂的患者必须在试验持续期间改用戈舍瑞林。
3.自治疗的最近步骤起或在此之后，可通过放射学方法测量的如通过RECIST 1.1版所限定的疾病。对于群组2，影像必须可供中心审查。
4.在签署知情同意书时年龄≥18岁。
5.东部肿瘤协作组(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)体能状态(performance status)为0或1。
6.根据研究者的预期寿命≥12周。
7.通过超声心动图(echocardiogram，ECHO)或多重门控采集扫描(multiplegated acquisition scan，MUGA)的左心室射血分数(LVEF)≥50％。
8.适当的器官功能：
a.绝对嗜中性粒细胞计数(Absolute neutrophil count，ANC)≥1.5×109/L
b.血红蛋白≥9g/dL
c.血小板≥100×109/L
d.血清钙在正常范围内(或通过补充剂纠正)
e.丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)≤2.5×正常上限(upper limit of normal，ULN)并且总胆红素≤1.5×ULN(在肝受累(liver involvement)的情况下，将允许ALT/AST≤5×ULN并且总胆红素在正常范围内)
f.对于年龄＞65岁的患者，根据Cockroft和Gault公式或肾疾病膳食改良(modification of diet in renal disease，MDRD)公式计算的血清肌酐≤1.5×ULN或肌酐清除率≥60mL/分钟(附录19.2)
g.血清白蛋白＞3.0g/dL
调查治疗和伴随治疗
MCLA-128：2个小时内750mg静脉内平坦剂量，每三周的第1天(q3w)。
对于每次MCLA-128输注，用扑热息痛/对乙酰氨基酚(paracetamol/acetaminophen)、抗组胺剂和皮质类固醇(根据标准实践)进行前驱用药(premedication)是强制性的。
内分泌治疗：患者在研究开始之前接受与在内分泌治疗的最后步骤的情况下施用的相同的剂量和方案，自所述步骤起患者具有进展。
治疗方案
一个周期为3周(包括群组2，其中可包括q4w氟维司群给药)。对于初始MCLA-128施用，在输注开始之后实施6小时观察期，并且对于所有后续施用，实施2小时观察期。
所有患者在q3w的第1天接受MCLA-128施用。对于内分泌治疗，患者在研究开始之前接受与在内分泌治疗的最后步骤的情况下施用的相同的剂量和方案，自所述步骤起患者具有进展。
在第1天、第15天、第29天和以后每28天一次施用氟维司群，或从第1天起每天施用芳香酶抑制剂治疗(来曲唑、阿那曲唑和依西美坦)。
治疗施用(所有周期)
参见图13。对于初始MCLA-128施用，在输注开始之后实施6小时观察期，并且对于所有后续施用，实施2小时观察期。
*在患者在研究开始之前针对相同内分泌治疗具有进展的情况下，相同的内分泌治疗可在MCLA-128输注之前、期间或紧接其后施用。
治疗分配
不需要特定的治疗分配。
治疗适应
·不允许MCLA-128或内分泌治疗剂的剂量降低。
·一旦发生输注相关反应(infusion-related reaction，IRR)，MCLA-128输注将被中断，并且对于严重IRR，必须明确地停止。对于轻度至中度事件，可以50％的输注速率下继续进行并且输注持续时间延长至4小时。
·在输注之间可将MCLA-128施用推迟最多6周，以控制不良事件(adverse event，AE)，特别是对于临床上显著的LVEF降低、充血性心力衰竭体征或持续的2级或3至4级腹泻。
·根据每种药物的产品特征总结(summary of product characteristics，SPC)施用激素治疗药物。
治疗持续时间
施用研究治疗，直至确认进行性疾病(根据RECIST 1.1)、不可接受的毒性、撤回同意、患者不依从、研究者决定(例如临床恶化)，治疗中断＞连续6周、撤回任何研究药物。对患者进行在最后一次研究药物施用之后直至相关毒性的痊愈(recovery)/稳定化为止的至少35±5天的安全性随访，以及持续12个月的对疾病进展和生存状态的随访。
预防性用药和伴随用药
允许
·伴随着每次MCLA-128施用，扑热息痛/对乙酰氨基酚、抗组胺剂和皮质类固醇的施用是强制性的。一旦发生IRR或超敏反应，则按照临床指示根据当地临床实践对患者进行处理。
·研究者酌情决定给予患者的健康(wellbeing)所需的并且预期不干扰研究药物的评价的所有药物，包括症状和AE的支持治疗或伴随病症的标准治疗。
·在研究开始之前＞4周开始n(LHRH)激动剂的绝经前/围绝经期女性中的戈舍瑞林。
禁止
·伴随的慢性经口皮质类固醇(＞10mg/天的泼尼松(prednisone)当量)、TNF-α抑制剂、抗T细胞抗体(由于存在免疫抑制的风险)。
·在研究期间或在研究治疗的第一剂量之前4周的任何研究药物。
·在研究期间或在研究治疗的第一剂量3周内的全身抗癌治疗(最后的内分泌治疗除外)。
安全性/耐受性评估
·AE(CTCAE 4.03版)、SAE
·实验室参数：血液学、生物化学、凝血、尿液分析、细胞因子
·ECG、MUGA/ECHO
·病史、生命体征、体能状态和身体检查
·伴随用药
·由于毒性的剂量改变(降低、中断、延迟)、停止
效力评估
在治疗开始之后每6周根据RECIST 1.1，基于利用造影剂(contrast)的CT/MRI进行肿瘤评价。在首次观察之后至少4周确认客观响应。所有患者均由独立的放射科医生(radiologist)对成像进行中心审查(筛查和研究中)。在研究中如临床所指示的那样对于患有在基线处的骨转移或者具有疑似病灶的患者进行骨扫描。
在每个周期的第1天评估肿瘤标志物(CA15-3、CEA、CA27-29)。
生物标志物
在肿瘤组织(筛查、任选的12周之后和EOT)和血液(每4个周期的第1天的给药前和治疗结束)中评价候选探索性生物标志物。
肿瘤：HER2；HER3；HER2：HER3二聚化；下游信号传导蛋白(例如PIK3CA)；调蛋白；HER2、HER3以及MAPK和AKT信号传导途径中的蛋白质的磷酸化；抑制剂(例如PTEN)的表达；癌症相关基因(包括HER2和HER3信号传导)中的突变；调蛋白-基因融合物。
血液：Fcγ受体多态性、血浆循环肿瘤DNA突变、探索性血清生物标志物(例如可溶性HER2、调蛋白)。
药动学
收集血液样品以测量血清MCLA-128。未进行针对氟维司群或芳香酶抑制剂的PK采样。
在以下时间点进行PK采样：
·第1周期：第1天：给药前、EOI、以及EOI之后的2、4、22小时时；然后在第8天时的任何时间；
·第2、3、5周期：第1天：给药前、EOI
·此后每4个周期：给药前
免疫原性
对于第1、3、5周期、此后的每四个周期，在第1天给药前以及治疗结束时在所有患者中收集血液样品(5mL)以评估给药前抗MCLA-128抗体的血清效价。
定义
基于通过RECIST 1.1的肿瘤评估限定和分析所有效力终点。
CBR：具有CR、PR的最佳总体响应或SD≥24周的患者的比例。
ORR：具有CR或PR的最佳总体响应的患者的比例。
PFS：从治疗开始直至由于任何原因导致的放射学进展或死亡的时间。
PFS比：先前方案的PFS与研究治疗的PFS的比。
DoR：从响应(CR或PR)直至由于潜在癌症导致的进展或死亡的时间。
OS：从治疗开始直至由于任何原因导致的死亡的时间。
终点
主要
根据第24周时研究者放射学审查的CBR
关键次要
根据中心审查在24周时的CBR，以及根据研究者和中心审查的PFS
其他次要
安全性：AE、实验室异常、SAE的发生率、严重程度和相互关系；ECG和LVEF测量值以及生命体征
耐受性：由于AE引起的停止、由于AE引起的剂量改变、免疫原性和细胞因子评估
其他效力：DoR、PFS比、ORR和OS
药动学：MCLA-128的Cmax、C0h、AUC、CL、Vss、tmax和t1/2。
分析群体
受治疗群体：接受至少一个剂量的MCLA-128的患者。
可评价效力：接受至少2个完整周期(6周)的治疗并经历基线评估和一次研究中肿瘤评估，或由于疾病进展而提前中止的患者。
分析
在受治疗群体中分析患者的性情(disposition)和人口特征(demographics)，将在可评价效力群体中分析效力，并且将在受治疗群体中分析安全性。
定量变量将使用描述性统计进行汇总。连续变量将表示为N、平均值和/或中值、标准差、范围。分类变量将使用频率和百分比表示。
成功主要终点的标准：5个月的中位PFS被假设为相关的，24周时的CBR的活动阈值设置为45％。
总结了CBR和ORR，并附带了90％精确的二项式CI。
对于PFS、OS和DoR，使用Kaplan-Meier乘积极限法(Kaplan-Meier product limitmethod)估计存活函数；在指定的时间点处提供了概率估计和90％CI；还提供了中位持续时间和90％CI。仅对响应者估计DoR。在90％精确CI的情况下，将群组2的PFS比≥1.3的任何患者的数量和比例制成表格。
AE通过监管活动医学词典(Medical Dictionary for Regulatory Activities)
优选术语并根据发病率和严重程度按器官类别制成表格。AE的严重程度基于不良事件通用术语(Common Terminology for Adverse Event，CTCAE)4.03。
对PK、免疫原性和生物标志物进行集中分析并分别报道。
表1.对HBCx-34肿瘤模型中相对体重的Dunn’s多重比较检验分析的总结，效力研究XTS-1521。使用Dunn’s多重比较检验在治疗组和对照组之间进行组比较：ns＝不显著，*＝P＜0.05，**＝P＜0.01，并且***＝P＜0.001。
初始组规模：9至10只动物。
表2. 25mg/kg的MCLA-128、2.5mg/kg的来曲唑在HBCx-34异种移植物中的抗肿瘤活性，效力研究XTS-1521。
XenTech T/C＝经治疗小鼠的平均肿瘤体积/对照小鼠的平均肿瘤体积×100(在对照组的首次伦理处死时计算)；TGD(Tumor Growth Delay，肿瘤生长延迟)＝中位肿瘤体积达到D0肿瘤体积×5所需的时间；TGDI(Tumor Growth Delay Index，肿瘤生长延迟指数)＝来自经治疗小鼠的TGD/来自对照小鼠的TGD；TS(Tumor Stabilization，肿瘤稳定性)＝在至少6次连续测量期间，呈现恒定肿瘤尺寸的小鼠的数目；PR(partial regression，部分消退)＝在至少6次连续测量期间，呈现肿瘤尺寸低于初始肿瘤尺寸的小鼠的数目；CR(complete regression，完全消退)＝在至少3次连续测量期间，呈现肿瘤尺寸为0至14mm3的小鼠的数目；TFS(Tumor Free Survivor，无肿瘤存活者)＝直到组日结束(Group DayEnd)时记录的完全消退数目。植入后36天开始治疗。
表3.对HBCx-34肿瘤模型中肿瘤体积的Mann-Whitney分析的总结，效力研究XTS-1521。
使用Mann-Whitney非参数检验在治疗组和对照组之间进行组比较：ns＝不显著，*＝P＜0.05，**＝P＜0.01，并且***＝P＜0.001。初始组规模：9至10只动物。
表4.对HBCx-34肿瘤模型中肿瘤体积的Dunn’s多重比较检验分析的总结，效力研究XTS-1521。使用Dunn’s多重比较检验在治疗组和对照组之间进行组比较：ns＝不显著，*＝P＜0.05，**＝P＜0.01，并且***＝P＜0.001。初始组规模：9至10只动物。
表5.于Charles River处制备的用于药效学分析的异种移植物MCF-7肿瘤的重量和体积。在第一轮VeraTag分析中包含以红色突出显示的肿瘤。
实施例1中的缩写列表
bid：每日两次
BW：体重
BWL：体重减轻
C：对照小鼠
CR：完全肿瘤消退
inj：注射
i.v.：静脉内的
i.p.：腹膜内的
IVC：单独通风的笼
kg：千克
mg：毫克
ml：毫升
mut：突变的
ns：不显著的
p.o.：经口(per os)，通过口腔(管饲法)
PR：部分肿瘤消退
PSU：聚砜
qd：每日(Que die)，每天
qwk：每周一次
RBW：相对体重
RTV：相对肿瘤体积
S：显著的
s.c.：皮下的
sem：平均值的标准误差
SoC：护理标准
T：经治疗小鼠
TGD：肿瘤生长延迟
TGDI：肿瘤生长延迟指数
TGI：肿瘤生长抑制
TFS：无肿瘤存活者
TS：肿瘤稳定性
％T/C：治疗组相对于对照组的肿瘤体积变化百分比
μL：微升
qd：每日的(quotidian)
实施例2中的缩写列表
BW：体重
CR：完全肿瘤消退
D：研究日
i.p.：腹膜内的(地)
MTD：最大耐受剂量
MTV：中位肿瘤体积
NTR：非治疗相关的
PR：部分肿瘤消退
qod×15：每隔一天给药，持续15个剂量
qwk×5：每周给药，持续5周
s.c.：皮下地
TGI：肿瘤生长抑制
TR：治疗相关的死亡
实施例4中的缩写列表
AEs：不良事件
ALT：丙氨酸氨基转移酶
ANC：绝对嗜中性粒细胞计数
AST：天冬氨酸氨基转移酶
AUC：曲线下面积
CBR：临床获益率
CHF：充血性心力衰竭
CR：完全肿瘤消退
DoR：从响应(CR或PR)直至由于潜在癌症导致的进展或死亡的时间。
ECHO：超声心动图
ER：雌激素受体
FISH：荧光原位杂交
IHC：免疫组织化学
IRR：输注相关反应
MBC：转移性乳腺癌
MDRD：肾疾病膳食改良
MUGA：多重门控采集扫描
LVD：左心室功能不全
LVEF：左心室射血分数
LHRH：促黄体素释放素
PFS：无进展存活
PR：孕酮受体或部分缓解，这取决于上下文
OCOG：东部肿瘤协作组
ORR：客观响应率
OS：从治疗开始直至由于任何原因导致的死亡的时间。
SPC：产品特征总结
ULN：正常上限
Claims (32)
1.治疗患有乳腺癌或处于患有所述癌症之风险中的对象的方法，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的ErbB-2/ErbB-3双特异性抗体与治疗有效量的内分泌治疗药物的组合，其中所述双特异性抗体具有能够结合ErbB-2的胞外部分的抗原结合位点和能够结合ErbB-3的胞外部分的抗原结合位点。
2.权利要求1所述的方法，其中所述内分泌治疗药物包含芳香酶抑制剂、选择性雌激素受体调节剂(SERM)；或选择性雌激素受体下调剂(SERD)。
3.权利要求1所述的方法，其中所述内分泌治疗药物包含选自他莫昔芬(Nolvadex)、溴帕雌烯(Acnestrol)、环芬尼(Sexovid)、雷洛昔芬(Evista)和托瑞米芬(Fareston)的选择性雌激素受体调节剂(SERM)。
4.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述内分泌治疗药物包含他莫昔芬或氟维司群。
5.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述内分泌治疗药物包含来曲唑。
6.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述乳腺癌是激素受体阳性乳腺癌。
7.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述乳腺癌是雌激素受体阳性乳腺癌。
8.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述乳腺癌是孕酮受体阳性乳腺癌。
9.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述乳腺癌是免疫组织化学ErbB-2+的癌症或免疫组织化学ErbB-2++而无ErbB-2基因扩增的癌症。
10.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述乳腺癌是IHC 1+或IHC 2+与阴性FISH组合的ER阳性的、具有低HER2表达的转移性乳腺癌MBC。
11.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述双特异性抗体能够降低在ErbB-2和ErbB-3阳性细胞上的ErbB-3的配体诱导的受体功能。
12.治疗患有乳腺癌的对象的方法，其中所述乳腺癌是激素受体阳性乳腺癌，其包括向有此需要的对象施用治疗有效量的ErbB-2和/或ErbB-3抗体与治疗有效量的内分泌治疗药物的组合，其中所述抗体抑制ErbB-2、ErbB-3二聚化。
13.权利要求12所述的方法，其中所述癌症是免疫组织化学ErbB-2+的癌症或免疫组织化学ErbB-2++而无ErbB-2基因扩增的癌症。
14.权利要求12或13所述的方法，其中所述乳腺癌是IHC 1+或IHC 2+与阴性FISH组合的ER阳性的、具有低HER2表达的转移性乳腺癌MBC。
15.前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括向所述患者施用细胞周期蛋白依赖性激酶4/6抑制剂。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述对象在开始用所述ErbB-2/ErbB-3双特异性抗体和所述治疗有效量的内分泌治疗药物进行治疗之前已经接受了一种或更多种内分泌疗法的治疗。
17.根据前述权利要求中任一项所述的治疗方法，其中所述对象在开始用所述ErbB-2/ErbB-3双特异性抗体和所述治疗有效量的内分泌治疗药物进行治疗之前已经接受了细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。
18.前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括确定雌激素受体、ErbB-2、ErbB-3，或其组合在所述癌症的细胞上的表达水平。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述对象具有如通过对肿瘤活检进行的免疫组织化学确定的≥1％阳性细胞的激素受体阳性状态(雌激素受体阳性[ER+]和/或孕酮受体阳性[PR+])。
20.权利要求12至19中任一项所述的方法，其中所述抗体是ErbB-2/ErbB-3双特异性抗体。
21.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述ErbB-2抗原结合位点能够与ErbB-2的结构域I或结构域IV结合。
22.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述ErbB-3抗原结合位点能够与ErbB-3的结构域III结合。
23.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述ErbB-3抗原结合位点能够干扰ErbB-3配体与ErbB-3的结合。
24.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述ErbB-2抗原结合位点能够结合ErbB-2的结构域I，并且所述ErbB-3抗原结合位点能够结合ErbB-3的结构域III。
25.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体包含选自以下的ErbB-2特异性重链可变区的至少CDR1、CDR2和CDR3序列：如图10中所示的MF2926、MF2930、MF1849；MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003和MF1898，或者其中所述抗体包含与MF2926、MF2930、MF1849；MF2973、MF3004、MF3958、MF2971、MF3025、MF2916、MF3991、MF3031、MF2889、MF2913、MF1847、MF3001、MF3003或MF1898的CDR1、CDR2和CDR3序列在至多3个氨基酸，优选至多2个氨基酸，优选至多1个氨基酸处不同的CDR序列。
26.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体包含选自以下的ErbB-3特异性重链可变区的至少CDR1、CDR2和CDR3序列：如图10或图11中所示的MF3178；MF3176；MF3163；MF3099；MF3307；MF6055；MF6056；MF6057；MF6058；MF6059；MF6060；MF6061；MF6062；MF6063；MF6064；MF6065；MF6066；MF6067；MF6068；MF6069；MF6070；MF6071；MF6072；MF6073和MF6074，或者其中所述抗体包含与MF3178；MF3176；MF3163；MF3099；MF3307；MF6055；MF6056；MF6057；MF6058；MF6059；MF6060；MF6061；MF6062；MF6063；MF6064；MF6065；MF6066；MF6067；MF6068；MF6069；MF6070；MF6071；MF6072；MF6073或MF6074的CDR1、CDR2和CDR3序列在至多3个氨基酸，优选至多2个氨基酸，优选至多1个氨基酸处不同的CDR序列。
27.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体包含：具有重链可变区的可变结构域，所述重链可变区包含如图10中所示的MF3958的ErbB-2特异性重链可变区的至少CDR1、CDR2和CDR3序列，或者与MF3958的CDR1、CDR2和CDR3序列在至多3个氨基酸，优选至多2个氨基酸，优选至多1个氨基酸处不同的CDR序列；以及具有重链可变区的可变结构域，所述重链可变区包含如图10中所示的MF3178的ErbB-3特异性重链可变区的至少CDR1、CDR2和CDR3序列，或者与MF3178的CDR1、CDR2和CDR3序列在至多3个氨基酸，优选至多2个氨基酸，优选至多1个氨基酸处不同的CDR序列。
28.根据前述权利要求中任一项所述的治疗方法，其中所述ErbB-2/ErbB-3双特异性抗体以约300mg至约900mg的静脉内剂量施用，例如每二至四周。
29.ErbB-2/ErbB-3双特异性抗体和治疗有效量的内分泌治疗药物，其用于治疗患有乳腺癌或处于患有所述癌症之风险中的对象的方法中，其中所述双特异性抗体具有能够结合ErbB-2的胞外部分的抗原结合位点和能够结合ErbB-3的胞外部分的抗原结合位点。
30.ErbB-2和/或ErbB-3抗体和治疗有效量的内分泌治疗药物，其用于治疗患有乳腺癌或处于患有所述癌症之风险中的对象的方法中，其中所述乳腺癌是激素受体阳性乳腺癌，并且其中所述抗体抑制ErB-2、ErB-3二聚化。
31.ErbB-2/ErbB-3双特异性抗体和治疗有效量的内分泌治疗药物在制备用于治疗患有乳腺癌或处于患有所述癌症之风险中的对象的方法的药物中的用途，其中所述双特异性抗体具有能够结合ErbB-2的胞外部分的抗原结合位点和能够结合ErbB-3的胞外部分的抗原结合位点。
32.ErbB-2和/或ErbB-3抗体和治疗有效量的内分泌治疗药物在制备用于治疗患有乳腺癌或处于患有所述癌症之风险中的对象的方法的药物中的用途，其中所述乳腺癌是激素受体阳性乳腺癌，并且其中所述抗体抑制ErbB-2、ErbB-3二聚化。
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