TW201920664A - 艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶之接合物 - Google Patents
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Abstract
本案提供一種接合物,其中免疫球蛋白Fc區通過非肽聚合物鏈接基部分與艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶鏈接。此外,本案提供接合物、該接合物之製備方法,以及包含該接合物的組成物,其中非肽聚合物鏈接基部分與免疫球蛋白Fc特異性鏈接。
Description
本發明涉及治療酶的接合物,其中免疫球蛋白Fc區通過非肽聚合物鏈接基部分與治療酶鏈接、製備該接合物的方法和包含該接合物的組成物。
諸如治療酶的蛋白質通常由於低穩定性而容易變性,並被血液中的蛋白酶降解,需經常投予患者以維持其血液濃度和效力。然而,對於主要以注射劑形式投予患者的蛋白質藥物,其頻繁注射以維持活性多肽的血液含量對患者造成巨大的痛苦。為了解決這些問題,已經努力增加治療酶的血液穩定性,並長時間保持血液中的藥物濃度以最大化藥物的功效。這些治療酶的長效製劑不僅應增加其穩定性,還應該保持該藥物本身足夠的高效力且不會在患者中引起免疫反應。
特別地,韓特氏症候群(Hunter syndrome)(或韓特氏病(Hunter disease)),也稱為第二型黏多醣症(mucopolysaccharidosis,MPS II),係一種胞溶體貯積症(lysosomal storage disease,LSD)。韓特氏症候群係由特定酶的遺傳缺陷引起且導致死亡的致命疾病,缺陷酶的補充 療法是必需的(Frances M.Platt等人,J Cell Biol.2012 Nov 26;(5):723-34)。
酶補充療法是胞溶體貯積症的標準療法,可藉由補充缺乏的酶來緩解現有症狀或減緩疾病進展。然而,患者及其家人的日常生活可能受限於每1至2週靜脈內持續投予2至6小時的需要。
此外,用於治療韓特氏症候群的重組酶由於在人體內有10分鐘至不到3小時的短半衰期短而持續時間非常短,給終身需要投予酶的患者帶來不便,因此,延長半衰期是非常必要的。
此外,還存在一個問題,即用於治療韓特氏症候群的酶在活體內的累積位置彼此不同,並且治療酶不能到達骨髓,因此發展韓特氏症候群的治療劑變得越來越必要。
本發明的目的是提供一種包含艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶的酶接合物。
本發明的另一個目的是提供用於預防或治療胞溶體貯積症的包括酶接合物的醫藥組成物。
本發明的另一個目的是提供一種製備酶接合物的方法。
本發明的一態樣提供了酶接合物,其中免 疫球蛋白Fc區通過非肽聚合物鏈接基部分與艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶鏈接。
在一特定具體實施例中,艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶可以治療第二型黏多醣症(MPS II)。
在另一特定具體實施例中,相較於與未鏈接免疫球蛋白Fc區的艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶,酶接合物具有增加胞吞轉送(transcytosis)和生體可用率(BA)。
在另一特定具體實施例中,胞吞轉送是由免疫球蛋白Fc區與新生兒Fc受體(FcRn)結合所造成。
在另一特定具體實施例中,相較於未鏈接免疫球蛋白Fc區的艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶,酶接合物具有增加的組織分佈。
在又一個特定具體實施例中,相較於未鏈接免疫球蛋白Fc區的艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶,酶接合物具有增加的骨髓靶向性。
在又一個特定具體實施例中,該免疫球蛋白Fc區係無醣基化的。
在又一個特定具體實施例中,該免疫球蛋白Fc區由選自CH1,CH2,CH3和CH4結構域所成群組的1至4個結構域構成。
在又一個特定具體實施例中,該免疫球蛋白Fc區還包括鉸鏈區。
在又一個特定具體實施例中,該免疫球蛋白Fc區是衍生自IgG,IgA,IgD,IgE或IgM的免疫球蛋 白Fc片段。
在又一個特定具體實施例中,該免疫球蛋白Fc區的每個結構域是具有不同來源的結構域的雜合體,該結構域衍生自選自由IgG,IgA,IgD,IgE和IgM所成群組的免疫球蛋白。
在又一個特定具體實施例中,免疫球蛋白Fc區是由相同來源的結構域組成的單鏈免疫球蛋白組成的二聚體或多聚體。
在又一個特定具體實施例中,該免疫球蛋白Fc區是IgG4 Fc片段。
在又一個特定具體實施例中,該免疫球蛋白Fc區是人類無醣基化的IgG4 Fc片段。
在另一個特定具體實施例中,在該酶接合物中,非肽聚合物鏈接基部分與艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶或其衍生物的N端鏈接。
本發明的另一態樣提供了用於預防或治療第二型黏多醣症(MPS II)的醫藥組成物,其包括艾接糖酸酸鹽-2-硫酸酯酶的酶接合物。
在一特定具體實施例中,醫藥組成物增加了胞吞轉送,生體可用率,組織分佈和骨髓靶向。
本發明的又一態樣提供了製備化學式1所示的酶接合物的方法,包括:(a)使非肽聚合物的任一反應性官能基與游離的艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶進行反應,其中該相同或不同的反應性官能基位於兩端,以獲得一其中 非肽聚合物通過末端與艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶共價鏈接之鏈接材料;和(b)將該鏈接材料未反應端的反應性官能基與能夠增加活體內半衰期的生物相容物質反應,使該生物相容物質與該鏈接材料共價鏈接。
在一特定具體實施例中,由該方法製備的酶接合物可以由下面的化學式1表示。
[化學式1]X-La-F
本文中,X為艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶;L為非肽聚合物鏈接基;A為0或自然數,但當a是2或更大時,每個L彼此獨立;和F為能夠增加X的活體內半衰期的物質。
在一特定具體實施例中,F可以選自由聚合物,脂肪酸,膽固醇,白蛋白及其片段,白蛋白結合物質,特定胺基酸序列的重複單元的聚合物,抗體,抗體片段,FcRn結合物質,活體內結締組織,核苷酸,纖網蛋白,運鐵蛋白,醣,肝素和彈性蛋白所成群組。
在一更具體的實施例中,該FcRn結合物質係免疫球蛋白Fc區。
在另一特定實施例中,該艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶可治療第二型黏多醣症(MPS II)。
在又一個特定具體實施例中,該非肽聚合 物選自由聚乙二醇,聚丙二醇,乙二醇-丙二醇共聚物,聚氧乙烯化多元醇,聚乙烯醇,多醣,葡聚醣,聚乙烯基乙醚,可生物降解的聚合物,脂質聚合物,幾丁質,玻尿酸及其組合所成群組。
在另一具體實施例中,該非肽聚合物為聚乙二醇。
在又一個特定具體實施例中,步驟(a)的非肽聚合物的反應基選自由醛基,順丁烯二醯亞胺基和丁二醯亞胺衍生物所成群組。
在又一個特定具體實施例中,該醛基為丙醛基或丁醛基。
在又一個特定具體實施例中,該丁二醯亞胺衍生物選自由丁二醯亞胺基羧甲基,戊酸丁二醯亞胺酯,丁酸丁二醯亞胺基甲酯(succinimidyl methyl butanoate),丙酸丁二醯亞胺基甲酯(succinimidyl methyl propionate),丁酸丁二醯亞胺酯,丙酸丁二醯亞胺酯,N-羥基丁二醯亞胺或碳酸丁二醯亞胺酯所成群組。
在又一個特定具體實施例中,該反應性官能基為位於二端的醛基。
在又一個特定具體實施例中,該非肽聚合物在各端有一個醛基和一個順丁烯二醯亞胺基作為反應性官能基。
在又一個特定具體實施例中,該非肽聚合物在各端有一個醛基和一個丁二醯亞胺胺基作為反應性官 能基。
本發明的艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶的酶接合物是一種具有改善的胞吞轉送、生物可用率、組織分佈和骨髓靶向,以及改善的活體內持續時間的酶接合物,且製備的酶接合物可以有效地用於治療第二型黏多醣症(MPS II)。
第1圖顯示艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶的長效接合物的PK實驗結果。
第2圖顯示艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶的長效接合物於體外的酶活性。
第3圖顯示艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶的長效接合物於體外的細胞內吸收活性的圖。
第4圖顯示將艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶的長效接合物與未形成長效接合物的酶艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶於ICR小鼠的組織分佈進行比較和驗證的結果的圖(對比艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶為*p<0.05,**p<0.01,***p<0.0005,非配對t-檢驗)。
以下將描述用於實現本發明的詳細內容。同時,本申請中描述的每個描述和示例性特定具體實施例可以應用於其他描述和示例性特定具體實施例。意即,本 申請中描述的各種元件的所有組合都屬於本發明的範疇。此外,本發明的範疇不限於以下所描述的詳細內容。
為實現目的,本發明的一態樣提供了一種酶接合物,其中免疫球蛋白Fc區通過非肽聚合物鏈接基部分與艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶鏈接。
在本發明的一特定具體實施例中,酶接合物是通過兩端具有反應性官能基的非肽聚合物與游離Fc區和游離的艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶進行反應而形成共價鍵而得,此時,非肽聚合物與非肽聚合物鏈接基部分的重複單元和位置的類型和數目相同。用於游離Fc區和游離酶的反應的非肽聚合物可以是具有末端反應性官能基的物質,該反應性官能基具有與重複單元的各端的重複單元不同的化學結構。在製備這種酶接合物的過程中,游離酶和游離免疫球蛋白Fc區與非肽聚合物的各末端反應性官能基發生化學反應。經由當末端反應性官能基各自經由化學反應轉化時而產生的共價鍵,非肽聚合物的重複單元與酶和Fc區鏈接以獲得酶接合物。即,在本發明的特定具體實施例中,藉由該製備過程將非肽聚合物轉化為酶接合物中的非肽聚合物鏈接基部分。
本發明的術語“治療酶”或“酶”是指用於治療由於酶的缺乏,不足,功能障礙等所引起的疾病的酶,並且是指以酶替代療法治療、投予等治療患有該疾病的個體的酶。具體地,該治療酶可以是用於治療因特定酶的不足或缺乏所引起的第二型黏多醣症(MPS II)的酶,更具體 地,可以是艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶,但本發明不限於此。
本發明中的術語“黏多醣貯積症(MPS)”也稱為“黏多醣症”,是遺傳性的黏多醣裂解酶缺陷。黏多醣貯積症是由胞溶體酶缺乏引起的胞溶體貯積症,已知原因為醣苷酶,硫酸酯酶或乙醯基轉移酶的缺乏等。黏多醣症也被稱為怪面症(gargoylism)。主要症狀是尿液中黏多醣的過量排泄。黏多醣症目前分為六種疾病類型,其中第一型包括賀勒氏(Hurler)症候群和施艾氏(Scheie)症候群,第二型包括韓特氏症候群,第三型包括聖菲利柏氏(Sanfilippo)症候群A,B,C和D型,第四型包括莫奎歐氏(Morquio)症候群類型A型和B型,第六型包括馬洛托-拉米氏(Maroteaux-Lamy)症候群,第七型包括史萊氏(Sly)症候群。
本發明的術語“韓特氏症(韓特氏病)”是指由艾杜醣醛酸二硫酸酯酶(IDS)缺乏引起的性染色體隱性遺傳病症,並且已知硫酸乙醯肝素和硫酸皮膚素由於酶缺乏而累積。韓特氏症具有如功能障礙,漸進性聽力喪失,色素性視網膜變性,視乳頭水腫和腦積水等症狀。在本發明中,術語“第二型黏多醣症”和“韓特氏症”可互換使用。
本發明的術語“艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶的接合物”或“酶接合物”是指具有治療韓特氏症的效果的艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶,係通過非肽聚合物鏈接基部份與免疫球蛋白Fc區鏈接以獲得其預防或治療韓特氏病的 效果之事實。
本發明的酶接合物可以具有藉由鏈接能夠增加艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶半衰期的物質與酶而增加持續時間的效果。因此,本發明的術語“酶接合物”可與“長效接合物”互換使用。
此外,本發明的酶接合物可用作酶替代療法(ERT)的藥物。酶替代療法可以藉由補充因不足或缺乏而導致疾病的酶而恢復降解的酶功能來預防或治療疾病。
將本發明的包含接合物的艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶投予患有缺乏艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶的韓特氏症患者,以緩解或治療韓特氏症患者症狀。另外,由於本發明的接合物具有增長的持續時間和高胞吞轉送和生物可用率的效果,因此可以小劑量表現預防,改善或治療韓特氏症的效果。
具體地,相較於未鏈接有Fc區的酶,本發明的鏈接至Fc區的酶接合物,具有Fc區與FcRn結合以增加Fc區的胞吞轉送的效果。
雖然酶與Fc區鏈接而形成大分子,由FcRn介導的增加的胞吞轉送不僅有助於維持細胞內攝取速率並發揮酶本身的功能,因為治療酶被吸收至體內的同時長期維持酶活性,因而能夠治療韓特氏症。
同時,治療酶,特別是用於治療韓特氏症的艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶,具有的缺點在於低生物可用率(BA)而需要靜脈注射,每次均須至醫院靜脈注射為患者 帶來不便。另外,這種靜脈注射引起過敏型的過敏反應,導致與藥物相關的高頻率輸注反應。
本發明的酶接合物由於FcRn結合位點引起的胞吞轉送而增強生體可用率,因此能夠進行皮下注射而不是靜脈內註射,並且該投予方法的改變使患者能夠自行注射而增加其便利性並減少輸液反應,將副作用最小化。
此外,治療酶,特別是用於韓特氏症的酶替代療法(enzymatic replacement therapy,ERT)的酶,需要去除在特定組織中積累的廢物,因此均勻分佈到每個組織是非常重要的。然而,目前使用的ERT酶主要分佈在肝臟中,需要開發能夠在各種器官中分佈的藥物。
本發明包含艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶的酶接合物在血液中具有增加的半衰期,以及在肝臟以外的各種組織中具有高體內濃度的優異分佈,特別是在由FcRn結合位點的胞吞轉送導致的骨髓,脾和腎中,而使治療效率最大化。特別地,本發明的酶接合物表現出高骨髓靶向性。骨髓組織是骨內的柔性結構且增加對骨髓組織的靶向,因而可以預期由於ERT而在骨髓中藥理作用的額外效果,因此能有效治療韓特氏症。
特別地,骨髓中的疾病引起各種副作用,例如骨的異常症狀或抑制骨形成、通過抑制紅血球生成激素和血小板生成激素產生(其必然在骨髓中產生)而造成的貧血,但是在目前商業化的酶治療劑中,由於骨髓的分佈非常低,經常發生上述副作用。於此方面,本發明包含艾 杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶的酶接合物具有高骨髓靶向性,並且可以用作優異的酶替代療法的治療劑。
因此,相較於未結合免疫球蛋白Fc區的酶,本發明的酶接合物因其免疫球蛋白Fc區與FcRn的結合,而可增加胞吞轉送,生物可用率,組織分佈和骨髓靶向。
本發明的術語“艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶”是與韓特氏症(MPS-II)有關的硫酸酯酶,和胞溶體裂解硫酸乙醯肝素和硫酸皮膚素所需的酶。在本發明的一特定具體實施例中,“艾杜硫酶(idursulfase)”是人類艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶的一種形式,可用作艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶。艾杜硫酶可以是例如艾杜硫酶α或艾杜硫酶β,但不限於此。
艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶可以藉由發明所屬技術領域已知的方法製備或製造。具體地,艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶可以藉由培養其中插入動物細胞表達載體的動物細胞並從培養基中純化,及購買市售酶而獲得,但是本發明不限於此。
在本發明的一個具體實施例中,製備了其中免疫球蛋白Fc區和非肽聚合物與艾杜醣醛酸酐-2-硫酸酯酶鏈接的接合物(實施例3),並且確認了該酶接合物的體外和體內活性(實施例4至6)。
結果證實,酶接合物的艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶雖與Fc結合,在保持酶活性的同時增加了半衰期,生體可用率和組織分佈。
本發明的酶接合物中可包括的艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶可以是天然形式,並且可以是天然型的全長或由其一部分組成的片段。或者,艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶可以是酶類似物,該類似物中的變異選自發生在天然型序列的一些胺基酸中的取代,添加,缺失,修飾所成群組及其組合。艾杜醣醛酸酐2-硫酸酯酶的類似物不限於本發明,只要該類似物的活性具有高於天然型所具者,並且相較於自然型具有至少顯著水平的活性。
酶類似物可包括相應酶的生物相似性藥品和改良性生物藥品。例如,關於生物相似性藥品,考慮到已知酶和表現該酶的宿主之間的差異,醣基化特徵的差異及其程度,以及根據標準序列的取代度不是100%取代之相應酶的特定胺基酸殘基中取代度的差異其中,它們屬於生物相似性藥酶。酶可以藉由動物細胞,大腸桿菌,酵母,昆蟲細胞,植物細胞和活體動物等中的遺傳重組來產生,並且製備方法不限於此,且酶可以是市售的酶。
另外,酶可包括的胺基酸序列具有上述酶或其類似物至少80%,更具體地90%,甚至更具體地91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%或更高的同源性,酶可藉由重組技術從微生物或由市售獲得,但不限於此。
如本文所用,術語“同源性”表示與野生型蛋白質的胺基酸序列或編碼胺基酸的核苷酸序列的相似程度,並且包括彼等與本發明的胺基酸序列或核苷酸序列具有上 述百分比的相同序列的序列。同源性可藉由肉眼比較兩個特定序列而決定,或者可以使用生物資訊演算法決定,該演算法藉由排列主題序列來分析同源性進行比較。兩個特定的胺基酸序列之間的同源性可以表示為百分比。有用的自動化演算法可在威斯康辛遺傳軟體套組(Wisconsin Genetics Software Package)(Genetics Computer Group,Madison,WI,USA)中的GAP,BESTFIT,FASTA和TFASTA電腦軟體模組中供使用。在上述模組中提供的自動化排列算法包括Needleman & Wunsch,Pearson & Lipman和Smith & Waterman的序列排列算法。其他序列排列和同源性測定的有用演算法在包括FASTP,BLAST,BLAST2,PSIBLAST和CLUSTAL W的軟體中自動化。
編碼該酶及其類似物等的胺基酸序列和核苷酸序列可以從已知的資料庫例如NCBI的GenBank獲得,但不限於此。
如本文所用,術語“免疫球蛋白Fc區”是指免疫球蛋白分子的區域,除了免疫球蛋白重鏈和輕鏈的可變區,重鏈恆定區1(CH1)和輕鏈恆定區1(CL1)。免疫球蛋白Fc區還可包括重鏈恆定區的鉸鏈區。特別地,本發明的免疫球蛋白Fc區可以是包含Fc區的一部分或全部的片段,並且在本發明中,免疫球蛋白Fc區可以與免疫球蛋白片段互換使用。
天然Fc在重鏈恆定區1的Asn297位置具有糖鏈,但是源自大腸桿菌的重組Fc係表達為無醣基化形 式。自Fc去除糖鏈導致Fc gamma受體1、2和3以及補體(c1q)與重鏈恆定區1的結合親和力降低,導致抗體依賴性細胞介導毒性或補體依賴性細胞毒性的減少或喪失。
如本文所用,術語“免疫球蛋白恆定區”可以指除了免疫球蛋白的重鏈和輕鏈可變區、重鏈恆定區1(CH1)和輕鏈恆定區(CL)外,包含重鏈恆定區2(CH2)和重鏈恆定區3(CH3)(或含有重鏈恆定區4(CH4))的Fc片段,且還可包括重鏈恆定區的鉸鏈區。此外,只要具有與天然蛋白實質上相似或更好的生理功能,本發明的免疫球蛋白恆定區可以是擴張的免疫球蛋白恆定區,其包括包含重鏈恆定區1(CH1)和/或輕鏈恆定區(CL)的Fc區的一部分或全部,除了免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的可變區以外。而且,該免疫球蛋白恆定區可以是在CH2和/或CH3的胺基酸序列的相對長的部分中具有缺失的區域。即,本發明的免疫球蛋白恆定區可包括(1)CH1結構域,CH2結構域,CH3結構域和CH4結構域,(2)CH1結構域和CH2結構域,(3)CH1結構域和CH3結構域,(4)CH2結構域和CH3結構域,(5)恆定區的一個或多個結構域和免疫球蛋白鉸鏈區(或鉸鏈區的一部分)的組合,和(6)重鏈恆定區和輕鏈恆定區的各結構域的二聚體。包含免疫球蛋白Fc片段的免疫球蛋白恆定區是可在活體內代謝的可生物降解的多肽,因此可安全地用作藥物載體。另外,免疫球蛋白Fc片段因其相對低的分子量,而在複合物的產生,純化和產率方面比完整的免疫球蛋白分子更有利。此外,由於缺乏Fab,該免疫球 蛋白Fc片段表現出抗體間因胺基酸序列中的差異所造成的高度非同質性,因而預期可顯著增強同質性並降低誘導血液抗原性的可能性。
同時,免疫球蛋白恆定區可以源自人類或動物,例如牛,山羊,豬,小鼠,兔,倉鼠,大鼠,豚鼠等,並且較佳地可以是源自於人類。此外,免疫球蛋白恆定區可以選自由IgG,IgA,IgD,IgE,IgM所衍生的恆定區或其組合或雜合體所成群組,特別是衍生自在人類血液中最豐富的IgG或IgM的恆定區,以及最具體地,衍生自已知可改善配體結合蛋白的半衰期之IgG。在本發明中,免疫球蛋白Fc區可以是由相同來源的結構域組成的單鏈免疫球蛋白組成的二聚體或多聚體。
如本文所用,術語“組合”是指編碼相同來源的單鏈免疫球蛋白恆定區(特別是Fc區)的多肽與不同來源的單鏈多肽鏈接以形成二聚體或多聚體。即,二聚體或多聚體可以由選自由IgG Fc,IgA Fc,IgM Fc,IgD Fc和IgE Fc的Fc片段所成群組的兩個或更多個片段製備。
如本文所用,術語“雜合體”是指編碼兩個或更多個不同來源的免疫球蛋白恆定區的序列存在於免疫球蛋白恆定區(較佳為Fc區)的單鏈中。在本發明中,各種雜合體形式均有可能。也就是說,該雜合體結構域可以由選自由IgG Fc,IgM Fc,IgA Fc,IgE Fc和IgD Fc的CH1,CH2,CH3和CH4所成群組的一至四個結構域組成,並且可以進一步包括鉸鏈區域。
IgG可以分為IgG1,IgG2,IgG3和IgG4亞型,並且本發明可以包括其組合或雜合體,具體地,IgG2和IgG4亞型,更具體地,IgG4的Fc區,其很少具有諸如補體依賴性細胞毒性(CDC)的效應器功能。
免疫球蛋白恆定區可以具有與天然形式相同或更多或更少程度的醣基化形式,或者可以是無醣基化形式。免疫球蛋白恆定區的醣基化或去醣基化的增加或減少可以藉由常規方法實現,例如化學方法,酶促方法或使用微生物的基因工程方法。本文中,當去醣基化時,與免疫球蛋白恆定區結合的補體(C1q)變得顯著降低,並且抗體依賴性細胞毒性或補體依賴性細胞毒性降低或被除去,因而不會在體內誘導不必要的免疫反應。在這方面,去醣基化或無醣基化的免疫球蛋白恆定區更符合藥物載體的目的。因此,免疫球蛋白Fc區可以更具體地是衍生自人類IgG4的無醣基化Fc區,即衍生自人類IgG4的無醣基化Fc區。人源性Fc區比非人源性Fc區更佳,非人源性Fc區可能在人體中作為抗原並引起不期望的免疫反應,例如產生針對抗原的新抗體。
此外,本發明的免疫球蛋白恆定區不僅包括天然的胺基酸序列,還包括其序列衍生物(突變體)。胺基酸序列衍生物是指因缺失,插入,保守或非保守地取代一個或多個胺基酸殘基或其組合而具有與野生型胺基酸序列不同的胺基酸序列。例如,已知對鏈接很重要的IgG Fc中位置214至238,297至299,318至222或327至331 的胺基殘基可用作適於修飾的位點。可以使用各種衍生物,例如藉由去除能形成二硫鍵的位點,而從天然Fc去除幾個N端胺基酸,或將甲硫胺酸加到天然Fc的N端而製備的衍生物。另外,可以去除補體固定位點,例如C1q固定位點或ADCC位點,以去除該效用功能。製備免疫球蛋白恆定區的序列衍生物的技術在國際專利公開號WO 97/34631和WO 96/32478等中揭露。
蛋白質或肽分子中不改變分子活性的胺基酸取代是發明所屬技術領域熟知的(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最常見的取代發生在胺基酸殘基Ala/Ser,Val/Ile,Asp/Glu,Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,Ser/Asn,Ala/Val,Ser/Gly,Thr/Phe,Ala/Pro,Lys/Arg,Asp/Asn,Leu/Ile,Leu/Val,Ala/Glu和Asp/Gly之間,該取代為雙向的。視需要地,胺基酸可以藉由磷酸化,硫酸化,丙烯酸化,醣基化,甲基化,法尼酯化,乙醯化,醯胺化等來修飾。
上述免疫球蛋白恆定區衍生物可以是具有與本發明的免疫球蛋白恆定區相同的生物活性的衍生物,但對熱,pH等具有增加的免疫球蛋白恆定區的結構穩定性。此外,免疫球蛋白恆定區可以自人類或動物的天然型單離而獲得,例如牛,山羊,豬,小鼠,兔,倉鼠,大鼠,豚鼠等,或是它們的重組體,或從轉化的動物細胞或微生物獲得的衍生物。本文中,它們可以從人類或動物單離整個免疫球蛋白並以蛋白酶處理,而從天然免疫球蛋白獲得。 木瓜蛋白酶將天然免疫球蛋白分解成Fab和Fc區,並且胃蛋白酶處理導致pF'c和F(ab)2片段的產生。可以對這些片段進行粒徑篩析層析法以單離Fc或pF'c。
較佳地,人源免疫球蛋白恆定區可以是從微生物獲得的重組免疫球蛋白恆定區。
如本文所用,術語“非肽聚合物”包括與至少兩個重複單元鏈接的生物相容性聚合物,並且可與“非肽鏈接基”互換使用。重複單元通過隨機的共價鍵而不是肽鍵鏈接在一起。在本發明中,非肽聚合物藉由在其末端包含反應基而可以通過與構成接合物的其他元素反應形成接合物。
本發明的術語“非肽聚合物鏈接基部分”是指藉由在兩端具有反應性官能基的非肽聚合物通過各反應性官能基與免疫球蛋白Fc區和艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶結合而形成的接合物中的組分。
在一特定具體實施例中,酶接合物可以包括免疫球蛋白Fc區和艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶,其通過在兩端包含能與免疫球蛋白Fc區和艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶結合的反應性官能基的非肽聚合物彼此共價鏈接。
具體地,儘管不特別限於此,該非肽聚合物可以是選自由聚乙二醇,聚丙二醇,乙二醇-丙二醇共聚物,聚氧乙烯化多元醇,聚乙烯醇,多醣,葡聚醣,聚乙烯基乙醚,例如聚乳酸(PLA)和聚乳酸-乙醇酸(PLGA)的可生物降解的聚合物,脂質聚合物,幾丁質,玻尿酸,寡核 苷酸所成群組中的一種及其組合。在更特定的具體實施例中,該非肽聚合物可以是聚乙二醇,但不限於此。另外,發明所屬技術領域已知的上述材料的衍生物和以發明所屬技術領域技術程度上易於產生的衍生物也屬於本發明的範疇。
非肽聚合物的分子量可以在大於0kDa至200kDa的範圍內,具體地,1kDa至100kDa,更具體地,1kDa至50kDa,甚至更具體地,1kDa至20kDa,甚至更具體地,3.4kDa至10kDa,甚至更具體地,約3.4kDa,但不限於此。
本發明的術語“大約”包括在±0.5,±0.4,±0.3,±0.2,±0.1等全部的範圍內,並且包括與術語“大約”後描述的值相同或相似的所有值,但本發明不限於此。
在本發明的一個特定具體實施例中,非肽聚合物的各端可具有反應性官能基。該反應性官能基包括免疫球蛋白Fc區的官能基,例如胺基或巰基,以及艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶的官能基,例如,反應性官能基,其可經由與胺基或硫醇基反應而形成共價鍵。這些反應性官能基在兩末端可以彼此相同或不同。
更具體地,非肽聚合物可以包括能夠在兩端結合免疫球蛋白Fc和艾杜醣醛酸酐-2-硫酸酯酶的反應基,特別是能夠結合位於N端或離胺酸的胺基的反應基,或能夠結合艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶或免疫球蛋白Fc區的半胱氨酸的硫醇基的反應基,但本發明不限於此。
更具體地,非肽聚合物的反應性官能基可選自由醛基,順丁烯二醯亞胺基和丁二醯亞胺衍生物所成群組,但不限於此。
在上文中,醛基可包括例如丙醛基或丁醛基,但不限於此。
例如,在本發明的一個具體實施例中使用的非肽聚合物具有在兩端具有醛(-CHO)基之以聚乙二醇為主鏈的線型聚合物。非肽聚合物的大小係由構成主鏈的重複單元的數量決定,並且作為非肽聚合物的反應基的醛可以共價結合到酶的胺基,具體地,離胺酸殘基的-NH2或N端的-NH2。非肽聚合物的醛基在特定的反應條件下與酶的N端的-NH2特異性地反應,並且可以通過反應後的純化獲得與酶共價結合的非肽聚合物鏈接材料。
在上文中,丁二醯亞胺衍生物可以使用丁二醯亞胺基羧甲基,戊酸丁二醯亞胺酯,丁酸丁二醯亞胺基甲酯,丙酸丁二醯亞胺基甲酯,丁酸丁二醯亞胺酯,丙酸丁二醯亞胺酯,N-羥基琥珀醯亞胺或碳酸丁二醯亞胺酯,但不限於此。
非肽聚合物可通過反應基與免疫球蛋白Fc和艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶鏈接,以轉化為非肽聚合物鏈接基部分。
此外,經由醛鍵還原胺化產生的最終產物比通過醯胺鍵鏈接的最終產物安定得多。醛反應性基在低pH選擇性地與N端反應,並且可以在高pH(例如,pH9.0) 與離胺酸殘基形成共價鍵。
本發明的非肽聚合物末端的反應性官能基可以彼此相同或不同。非肽聚合物可以在兩端具有作為反應性官能基的醛基,並且非肽聚合物兩端可以具有醛基和順丁烯二醯亞胺基作為反應性官能基,或者可以在兩端具有醛基和丁二醯亞胺基作為反應性官能基,但本發明不限於此。
例如,非肽聚合物可以在一端具有順丁烯二亞醯胺基,並且在另一端具有醛基,丙醛基或丁醛基作為每個反應性官能基。作為另一個例子,非肽聚合物可以在一端具有丁二醯亞胺基,在另一端具有丙醛基或丁二醛基。
當在丙酸側端具有羥基的聚合物(乙二醇)用作非肽聚合物時,本發明的酶接合物可以藉由已知的化學反應將羥基活化為各種反應性官能基來製備,或使用具有市售經修飾的反應性官能基的聚合物(乙二醇)。
在一特定具體實施例中,非肽聚合物的反應性官能基可以與半胱胺酸殘基鏈接,特別是艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶的-SH基,但不限於此。
在使用順丁烯二亞醯胺-PEG-醛的情況下,順丁烯二醯亞胺基可經由硫醚鍵鏈接至艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶的-SH基,醛基可藉由還原胺化反應鏈接至免疫球蛋白Fc的-NH2基,但本發明不限於此,此係對應於一個實例。
在本發明的一特定具體實施例中,其中在 一端具有醛反應性官能基的聚乙二醇係作為非肽聚合物,位在PEG端的氧原子上具有-CH2CH2-結構的鏈接基官能團藉由還原胺化形成非肽聚合物鏈接基部分。也就是說,在該特定具體實施例的酶接合物中,艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯經由具有如PEG-CH2NH-或NHCH2CH2CH2-PEG-化學結構的非肽聚合物鏈接基部分與免疫球蛋白Fc鏈接。
在本發明的另一特定具體實施例中,其中在一端具有順丁烯二醯亞胺反應性官能基的聚乙二醇係作為非肽聚合物,順丁烯二醯亞胺側端通過硫醚鍵形成非肽聚合物鏈接基部分鏈接至半胱胺酸(例如,艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶的半胱胺酸)的硫原子。上述硫醚鍵可包括的結構。
然而,本發明不特別限於上述例子,並且此係對應於一個例子。
另外,在接合物中,非肽聚合物的反應性官能基可以與位於免疫球蛋白Fc區或艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶的N端的-NH2鏈接,此係對應於一個例子。具體地,本發明的艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶可以通過N端與具有反應性官能基的非肽聚合物鏈接,但不限於此。
本發明的術語“N端”是指肽的胺基端,並且是指為了本發明的目的能夠與非肽聚合物結合的位置。作為一個例子,本發明不限於此,但N端可以包括N端最末 端的胺基殘基和N端周圍的胺基酸殘基,特別是從最末端可包括第1至第20個胺基酸殘基。
此外,在接合物中,非肽聚合物的反應性官能基可以與除免疫球蛋白Fc區或艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶的N端以外的另一殘基的胺基鏈接,但此係對應於一個示例。具體地,該殘基可以是艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶或免疫球蛋白Fc區的離胺酸殘基,但不限於此。
也就是說,在本發明的酶接合物中,非肽聚合物的反應性官能基與艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶或免疫球蛋白Fc區的胺基共價鏈接。但是本發明不限於此。
本發明的酶接合物可以表現出依非肽聚合物的結合位置而不同的活性差異。也就是說,活體內的半衰期或活性可以通過非肽聚合物和酶之間的特異性位置的結合來改善。
本發明的另一態樣提供了用於預防或治療第二型黏多醣症(MPS II)的醫藥組成物,其包括艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶的接合物。
於艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶的接合物中,艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶和免疫球蛋白Fc區可通過非肽聚合物鏈接基部分相互鏈接。
本發明的術語“免疫球蛋白Fc區”,“非肽聚合物鏈接基部分”,“酶接合物”和“第二型黏多醣症”係如上所述。
本發明的術語“預防”是指藉由投予艾杜醣 醛酸鹽-2-硫酸酯酶或包含艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶的組成物治療第二型黏多醣症或韓特氏症候群來抑制或延遲疾病發作的所有作用。術語“治療”是指藉由投予酶或包含酶的組成物以減輕或有利於第二型黏多醣症或韓特氏症候群之症狀的所有作用。
在本發明中,術語“投予”是指藉由某種適合的方法將預定物質引入患者體內。組成物的投予途徑不特別限於此,但可以藉由可到達活體內目標的任何一般途徑投予組成物。例如,一般途徑可包括腹膜內,靜脈內,肌肉內,皮下,皮內,口服,局部,鼻內,肺內或直腸內投予。
本發明的用於預防或治療第二型黏多醣症的醫藥組成物可具有治療第二型黏多醣症的效果,其係藉由投予患有該疾病的個體第二型黏多醣症所不足或缺乏的酶以恢復該不足或缺乏的酶的功能。
本發明的一個特定具體實施例提供了一種醫藥組成物,其增加了胞吞轉送,生物可用率,組織分佈和骨髓靶向。
在本發明的醫藥組成物中,其中艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶與Fc區鏈接的酶接合物可以通過與FcRn受體的本質鍵(intrinsic bond)而輕易地通過細胞膜,並且在血管中更有效地到達組織。
因此,醫藥組成物可以具有增加的胞吞轉送,生體可用率,組織分佈和骨髓靶向的作用,並且表現 出優越的第二型黏多醣症的治療效果。
本發明的醫藥組成物還可含有醫藥上可接受的載體,賦形劑或稀釋劑。醫藥上可接受的載體,賦形劑或稀釋劑可以是非天然存在的。對於口服投予,醫藥上可接受的載體可包括黏合劑,助流劑,崩解劑,賦形劑,增溶劑,分散劑,安定劑,懸浮劑,著色劑,調味劑等;對於注射劑,可以是緩衝劑,防腐劑,鎮痛劑,增溶劑,等滲劑,安定劑等,其可以組合使用;對於局部投予,可以使用鹼,賦形劑,潤滑劑,防腐劑等,但不限於此。
如本文所用,術語“醫藥上可接受的”是指具有足以表現出治療效果並且不引起副作用的量的特性,並且發明所屬技術領域技術人員可以基於以下醫療領域中周知的因素容易地決定,例如疾病的種類,年齡,體重,健康狀況,性別,患者的藥物敏感性,投予途徑,投予方法,投予頻率,治療持續時間,混合或同時投予的藥物等。
本發明組成物的各式製劑類型可以藉由與上述醫藥上可接受的載體組合製備。例如,對於口服投予,可將組成物配製成錠劑,片劑,膠囊,酏劑,懸浮劑,糖漿,粉片等。對於注射劑,可將組成物配製成單位劑量安瓿或多劑量容器。該組成物還可以配製成溶液,懸浮液,錠劑,膠囊,緩釋製劑等。
同時,適合的載體,賦形劑和稀釋劑的實例可包括乳糖,右旋糖,蔗糖,山梨糖醇,甘露醇,木糖醇,赤蘚糖醇,麥芽糖醇,澱粉,阿拉伯膠,海藻酸鹽, 明膠,磷酸鈣,矽酸鈣,纖維素,甲基纖維素,微晶纖維素,聚乙烯吡咯烷酮,水,羥基苯甲酸甲酯,羥基苯甲酸丙酯,滑石,硬脂酸鎂,礦物油等。此外,該組成物還可含有填料,抗凝劑,潤滑劑,保濕劑,調味劑,防腐劑等。
另外,本發明的醫藥組成物可以以任何製劑類型製備,該製劑類型係選自錠劑,丸劑,粉劑,粒劑,膠囊,懸浮劑,內用液體藥物,乳劑,糖漿,無菌水溶液,非水溶劑,凍乾製劑和栓劑。
另外,該組成物可以配製成適合於患者身體的單位劑型,並且根據醫藥領域中的典型方法特別配製成可用於蛋白質藥物的製劑,以便通過口服或腸胃外途徑投予,例如皮內,靜脈內,肌肉內,動脈內,髓內,鞘內,心室內,肺內,經皮,皮下,腹膜內,鼻內,胃內,局部,舌下,陰道或直腸,但投予途徑不限於此。
另外,接合物可以藉由與各種核准作為藥物之醫藥上可接受的載體(例如生理鹽水或有機溶劑)混合使用,。為了提高安定性或吸收性,可以使用碳水化合物(如葡萄糖,蔗糖或葡聚醣),抗氧化劑(如抗壞血酸或麩胺基硫),螯合劑,低分子量蛋白質或其它安定劑作為藥物。
本發明的醫藥組成物的投予劑量和頻率由活性成分的類型以及各種因素決定,例如待治療的疾病,投予途徑,患者的年齡,性別和體重,和疾病的嚴重程度。
本發明組成物的總有效劑量可以單劑量投予患者,或者可以根據分次治療方案以多劑量長期投予。 在本發明的醫藥組成物中,活性成分的含量可以根據疾病的嚴重程度而變化。具體地,本發明的接合物的總每日劑量可以是每1kg患者體重約0.0001mg至500mg。然而,除了醫藥組成物的投予途徑和治療頻率之外,還考慮包括患者的年齡,體重,健康狀況,性別,疾病嚴重程度,飲食和排泄率各種因素來決定接合物的有效劑量。於此方面,發明所屬技術領域技術人員可以容易地決定適合本發明的醫藥組成物的特定用途的有效劑量。根據本發明的醫藥組成物不特別限於製劑和投予途徑和方式,只要它顯示出本發明的效果即可。
本發明的又一態樣提供了預防或治療第二型黏多醣症(MPS II)的方法,包含投予有此需要的個體包含艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶的酶接合物的醫藥組成物。
酶接合物,包含該酶接合物的組成物,第二型黏多醣症(MPS II),預防和治療係如上所述。
本發明的術語“個體”是疑似患有第二型黏多醣症的個體,並且該個體是指哺乳動物,例如大鼠和家畜,包括相應疾病於其中進展或待進展的人類,但包括可以藉由本發明的酶接合物或包含該酶接合物的組成物治療的個體沒有限制。
本發明的方法可包括以醫藥有效量投予包含酶接合物的醫藥組成物。合適的每日總劑量可以由醫生以正確的醫學判斷決定,並且施用一次或數次。然而,就本發明的目的而言,特定患者的特定治療有效劑量可以根 據各種因素而變化,包括要達成的反應的種類和程度,是否使用其他藥劑的具體組成物,患者的年齡,體重,健康狀況,性別及飲食,投予時間,投予途徑,組成物的分泌速度,治療期間,與特定組成物合併使用或與其一致的其他藥物等其他醫學領域眾所周知的因素。
本發明的又一態樣提供了一種組成物,其包含用於增加酶的胞吞轉送,生物可用率,組織分佈和骨髓靶向的酶接合物。
特別地,酶接合物可以是其中艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶和免疫球蛋白Fc區通過非肽聚合物鏈接基部分彼此鏈接的酶接合物,但是不限於此。
本發明的又一態樣提供了增加酶的胞吞轉送,生物可用率,組織分佈和骨髓靶向的方法,包含將酶接合物或包含酶接合物的組成物投予有需要的個體。
特別地,酶接合物可以是其中艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶和免疫球蛋白Fc區通過非肽聚合物鏈接基部分彼此鏈接的酶接合物,但是不限於此。
本發明的又一態樣提供了酶接合物用於預防或治療第二型黏多醣症(MPS II)的用途。
特別地,酶接合物可以是其中艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶和免疫球蛋白Fc區通過非肽聚合物鏈接基部分彼此鏈接的酶接合物,但是不限於此。
本發明的再另一態樣提供了酶接合物或包含酶接合物的組成物用於增加酶的胞吞轉送,生物可用率, 組織分佈和骨髓靶向的用途。
特別地,酶接合物可以是其中艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶和免疫球蛋白Fc區通過非肽聚合物鏈接基部分彼此鏈接的酶接合物。
本發明的又一態樣提供了製備化學式1所示的酶接合物的方法,包括:(a)使其中相同或不同的反應性官能基位於兩端之非肽聚合物的任一反應性官能基與游離的艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶進行反應,以獲得其中非肽聚合物通過末端與艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶共價鏈接之鏈接材料;和 (b)將該鏈接材料未反應端的反應性官能基與能夠增加活體內半衰期的生物相容性物質反應,使該生物相容性物質與該鏈接材料共價鏈接。
[化學式1]X-La-F
此處之X為艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶;L為非肽聚合物鏈接基;A為0或自然數,但當a是2或更大時,每個L彼此獨立;和F為能夠增加X的活體內半衰期的物質。
本發明中,F可以選自由聚合物,脂肪酸,膽固醇,白蛋白及其片段,白蛋白結合物質,特定胺基酸序列的重複單元的聚合物,抗體,抗體片段,FcRn結合物質,活體內結締組織,核苷酸,纖網蛋白,運鐵蛋白,醣, 肝素和彈性蛋白所成群組。更具體地,FcRn結合物質可以是免疫球蛋白Fc區,但是本發明不限於此。
F可以藉由共價化學鍵或非共價化學鍵與X鏈接,F和X可以通過L以共價化學鍵、非共價化學鍵或其組合相互鏈接。
特別地,L可以是肽聚合物或非肽聚合物。
當L是肽聚合物時,L可以包括一個或多個胺基,例如,1至1000個胺基,但是本發明不特別限於此。在本發明中,可以使用已知用於鏈接F和X的各種肽鏈接基,例如,[GS]x鏈接基,[GGGS]x鏈接基,[GGGGS]x鏈接基等均包含在內,並且於本文中,x可以是1或更大的自然數。然而,本發明不限於這些實例。
當L是非肽聚合物時,非肽聚合物可以選自由聚乙二醇,聚丙二醇,乙二醇和丙二醇的共聚物,聚氧乙烯化多元醇,聚乙烯醇,多醣,葡聚醣,聚乙烯基乙基醚,可生物降解的聚合物,脂聚合物,幾丁質,玻尿酸及其組合所成群組,更特別為聚乙二醇,但本發明並不特別限於此。
在本發明中,a可以是0或自然數,且當a是0時,本發明的酶接合物不包括非肽聚合物,並且可以是其中艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶通過肽鍵(融合)與免疫球蛋白Fc區鏈接的接合物。
此外,反應性官能基可選自由醛基,順丁烯二醯亞胺基和丁二醯亞胺衍生物所成群組。更具體地, 醛基可以是丙醛基或丁醛基,或丁二醯亞胺衍生物可以是丁二醯亞胺基羧甲基,戊酸丁二醯亞胺酯,丁酸丁二醯亞胺基甲基酯,丙酸丁二醯亞胺基甲酯,丁酸丁二醯亞胺酯,丙酸丁二醯亞胺酯,N-羥基琥珀醯亞胺或碳酸丁二醯亞胺酯,但本發明不限於此。
非肽聚合物在兩端可以具有作為反應性官能基的醛基,在各端具有醛基和順丁烯二醯亞胺基作為反應性官能基,或在各端具有醛基和丁二醯亞胺基作為反應性官能基,但本發明不限於此。
用於製備本發明的酶接合物的方法可包括製備其中艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶和非肽聚合物彼此共價結合的鏈接材料;藉由將鏈接材料與免疫球蛋白Fc區鏈接來製備和獲得接合物,但是本發明不限於此。
本發明的術語“鏈接材料”是指將非肽聚合物與艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶共價結合的中間體,然後可以藉由鏈接材料的非肽聚合物的未反應端的反應性官能基與免疫球蛋白Fc區結合來製備接合物,但本發明不限於此。
此外,本發明的一個特定具體實施例提供了用於製備酶接合物的方法,其進一步包括單離該接合物,其中非肽聚合物鏈接基部分與艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶的N端鏈接。
在藉由本發明的製備方法製備的酶接合物中,由於艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶與Fc區鏈接,酶接合 物可以藉由與Fc區的FcRn受體的本質鍵輕易地通過細胞膜,並且在血管中更有效地到達組織。
酶接合物中所含的所有增加的艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶之胞吞轉送,生體可用率和的組織分佈都在保持體內酶活性的同時,可以幫助酶顯示出有效的韓特氏症候群治療效果。
此外,本發明的酶接合物可以增加酶或其衍生物(類似物)的半衰期。
在下文中,將藉由實施例更詳細地描述本發明。實施例旨為詳細描述本發明,本發明的範疇不限於此。
實施例1:製備艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶
為了製備本發明的艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶的酶接合物,進行以下程序。首先,艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶使用Shire製造的Elaprase。
實施例2:製備酶接合物-1
製備並純化了一種艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶鏈接材料,其中非肽聚合物藉由共價鍵與實施例1的艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶的胺基鏈接。
為了將10kDa的醛-聚乙二醇-醛(NOF(日本),M12N535,10kDa,ALD-PEG-ALD)鏈接基鏈接到艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶的胺基,濃度10mg/mL的艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶和10kDa ALD-PEG-ALD以1:20的莫耳比在4℃至8℃反應約2小時。此時,該反應在pH6.0的100mM磷酸鉀中 進行,於其中加入20mM氰基硼氫化鈉作為還原劑。使用Source 15Q管柱(來自美國GE)以含有pH6.0的10mM磷酸鈉和氯化鈉濃度梯度的緩衝液從單結合的艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶鏈接材料中純化出未反應的艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶,得到反應溶液。
實施例3:製備酶接合物-2
將免疫球蛋白Fc區與實施例2中純化的艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯和非肽聚合物的鏈接材料接合。
純化的艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶鏈接材料和免疫球蛋白Fc片段以1:10的莫耳比,全蛋白濃度為70mg/mL至75mg/mL,在4℃至8℃反應約16小時。此時,反應溶液為pH 6.0的100mM磷酸鉀,於其中加入20mM氰基硼氫化鈉作為還原劑。反應完成後,使用含有pH6.0的10mM磷酸鈉和氯化鈉濃度梯度的緩衝液,將反應溶液施加到Source 15Q(來自美國GE)管柱,再使用pH6.0的20mM磷酸鈉和硫酸銨濃度梯度施加到Source 15Iso(來自美國GE)管柱,最後使用蛋白A(來自美國GE)於pH7.5的20mM Tris,5%(v/v)甘油和pH3.7的100mM單水檸檬酸,150mM氯化鈉和10%甘油緩衝液(GE)的濃度梯度純化接合物,該接合物中之免疫球蛋白Fc與艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶以聚乙二醇鏈接基共價鍵鏈接。
在實施例3中,最終製備的艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶接合物具有的形式為其中艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶單體的N端經由聚乙二醇鏈接基鏈接至具有兩條鏈的免疫球蛋 白Fc的一個側鏈(N端脯胺酸)。
實施例4:長效艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶接合物的藥物動力學實驗
本案發明人研究了上述實施例中製備的艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶接合物的藥物動力特性,以證實接合物的效果。
為此目的,投予每組血液採樣點的三隻ICR小鼠艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶(艾杜硫酶,對照組)和上述實施例中製備的長效艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶接合物,然後比較血液中的安定性和藥物動力學參數。
具體地,對照組靜脈內注射1mg/kg艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶,然後在0、0.25、0.5、1、2、4、8、24、48、72、96、120、144和168小時後收集血液,實驗組皮下注射1mg/kg以艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶為基礎的長效艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶接合物,然後在0,1、2、4、8、24、48、72、96、120、144和168小時後收集血液。使用抗艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶的抗體以ELISA方法測量血清蛋白量。
藥物動力學分析結果如第1圖所示。
具體而言,相較於對照組,確認了長效艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶接合物的血中半衰期和藥物分子的曲線下面積(AUC)均增加。特別是,證實艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶的血液半衰期為4.5小時,而長效艾杜醣醛酸鹽的血液半衰期為30.6小時,比艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶多約7倍, 並且AUC也增加約9倍或更多。
本案發明人試圖如下確認每種酶接合物的體外活性。
實施例5:確認艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶酶接合物活性
實施例5-1:長效艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶接合物體外酶活性
本案發明人進行了體外酶活性的測量,測量長效艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶接合物的製備引起的酶活性變化。
具體而言,將已知為酶受質的4-甲基繖形酮α-L-吡喃艾杜醣醛酸-2-硫酸鈉鹽(4MU-α-IdopyraA-2)與艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶和長效的艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶在37℃反應4小時,然後再與二級反應酶α-艾杜醣醛酸酶在37℃反應24小時。測量最終產生的4-甲基繖形酮(4MU)的熒光來測量相應物質的酶活性。
結果證實,艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶和長效艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶接觸物的酶活性分別為21.6±3.63nmol/min/μg和18.5±3.12nmol/min/μg。總之,相較於艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶,長效艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶接合物的酶活性為85.7%,而此酶活性降低可以藉由長效接合物的接合而改善的PK來補償(第2圖)。
實施例5-2:長效艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶接合物細胞內吸收活性
由於艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶是經磷酸甘露糖6受體(M6PR)被細胞吸收後發揮作用,製備的長效艾杜醣醛酸鹽 -2-硫酸酯酶接合物是否影響該酶的細胞內吸收活性,確認如下。
首先,使用已知表達M6PR的HepG2細胞(人類肝癌)以艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶和長效艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶接合物處理,然後在37℃誘導細胞內吸收。24小時後,以ELISA分析存在細胞中的艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶和長效的艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶接合物。
結果,相較於艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶的細胞內吸收活性(V最大值=9.50nM),長效艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶接合物的細胞內吸收活性(V最大值=10.83ng/mL)約為81.4%。此M6PR結合和細胞內吸收活性的降低(相對於艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶)可以藉由因長效接合物位阻效應而改善的PK來補償(第3圖)。
實施例5-3:長效艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶接合物與M6PR的結合親和力確認
為了證實艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶和長效艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶接合物對磷酸甘露糖6受體(M6PR)的結合親和力,使用表面電漿子共振(BIACORE T200,GE Healthcare)進行分析。
具體地,以胺偶合將M6PR固定在CM5晶片上。然後,以HBS-EP緩衝液將艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶稀釋至200nM至12.5nM,接合至固定有M6PR的晶片10分鐘,並解離6分鐘,以BIAevaluation軟體計算結合親和力。定量長效艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯接合物相對於艾杜醣醛 酸鹽-2-硫酸酯酶結合親和力。
結果證實,相較於艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯,長效艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶接合物具有約88%的受體結合親和力(表1)。長效的艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶接合物與M6PR相對低的結合親和力的原因,似乎是與當生理活性多肽與Fc區形成融合蛋白時,通常顯示對其受體結合親和力降低為相同原因。儘管不欲為本發明操作原理任何特定的理論所約束,僅為了便於理解本發明,當免疫球蛋白Fc和艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶共價鍵合時,顯示艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶位點受到空間位阻,對受體的結合力降低。
上述實施例中證實的長效艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶接合物活性的結果總結於下表2中。
實施例6:確認長效艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶接合物的組織分佈
在每組每個血液採樣點的三隻ICR小鼠中,比較艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶(對照組)和如上述製備的長效艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶接合物的組織和器官分佈。
具體地,於對照組靜脈內注射1.0mg/kg的艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶,然後在1,8,48小時和144小時取出器官。在實驗組中,以艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶為基礎,以1.0mg/kg皮下注射長效艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶接合物,然後在1、8、48和144小時取出器官,之後,經由ELISA方法測量組織(血清,腎,肝,脾,心臟,骨髓和肺)中的各物質濃度並進行比較。
結果,相較於對照組的艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶,長效的艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶接合物在所有組織中均同時顯示出高組織分佈(第4圖)。
上述結果表明,本發明的酶接合物在AUC 和組織分佈方面優於其他常規治療酶,因此酶接合物可作為胞溶體貯積症的劃時代治療劑。
彼等發明所屬領域的技術人員將能夠理解,本發明可以以其他詳細形式實現而不改變技術精神或基本特徵。因此,上述具體實施例僅為範例,在所有方面均不應被解釋為具限制性的。本發明的範疇係由以下所述的申請專利範圍而不是由詳細說明內容表示,並且應理解申請專利範圍的含義和範疇以及衍生自其等同物的所有變化或修改形式均屬本發明範疇內。
Claims (29)
- 一種酶接合物,其中免疫球蛋白Fc區通過非肽聚合物鏈接基部分與艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶鏈接。
- 如申請專利範圍第1項所述之酶接合物,其中艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶能夠治療第二型黏多醣症(MPS II)。
- 如申請專利範圍第1項所述之酶接合物,其中該酶接合物相較於未鏈接該免疫球蛋白Fc區的艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶,具有增加的胞吞轉送和生物可用率(BA)。
- 如申請專利範圍第3項所述之酶接合物,其中該胞吞轉送是由免疫球蛋白Fc區與新生兒Fc受體(FcRn)之結合所引起。
- 如申請專利範圍第1項所述之酶接合物,其中該酶接合物相較於未鏈接該免疫球蛋白Fc區的艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶,具有增加的組織分布。
- 如申請專利範圍第5項所述之酶接合物,其中該酶接合物相較於未鏈接該免疫球蛋白Fc區的艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶,具有增加的骨髓靶向。
- 如申請專利範圍第1項所述之酶接合物,其中該免疫球蛋白Fc區為無醣基化的。
- 如申請專利範圍第1項所述之酶接合物,其中該免疫球蛋白Fc區係由1至4個選自由CH1,CH2,CH3和CH4結構域所成群組的結構域組成。
- 如申請專利範圍第1項所述之酶接合物,其中該免疫球蛋白Fc區還包括鉸鏈區。
- 如申請專利範圍第1項所述之酶接合物,其中該免疫球蛋白Fc區是衍生自IgG,IgA,IgD,IgE或IgM的免疫球蛋白Fc片段。
- 如申請專利範圍第1項所述之酶接合物,其中該免疫球蛋白Fc區的每個結構域是具有不同來源的結構域的雜合體,該結構域衍生自選自由IgG,IgA,IgD,IgE和IgM所成群組的免疫球蛋白。
- 如申請專利範圍第1項所述之酶接合物,其中該免疫球蛋白Fc區是由相同來源的結構域所組成的單鏈免疫球蛋白所組成的二聚體或多聚體。
- 如申請專利範圍第1項所述之酶接合物,其中該免疫球蛋白Fc區係IgG4 Fc片段。
- 如申請專利範圍第1項所述之酶接合物,其中該免疫球蛋白Fc區係人類無醣基化的IgG4 Fc片段。
- 如申請專利範圍第1項所述之酶接合物,其中在該酶接合物中,非肽聚合物鏈接基部分係鏈接至艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶的N端。
- 一種用於預防或治療第二型黏多醣症(MPS II)之醫藥組成物,其包含如申請專利範圍第1項所述之酶接合物。
- 如申請專利範圍第16項所述之醫藥組成物,其中該醫藥組成物增加胞吞轉送,生物可用率,組織分布和骨髓靶向。
- 一種用於製備如化學式1所示的酶接合物之方法,包 括:(a)使其中相同或不同的反應性官能基位於兩端之非肽聚合物的任一反應性官能基與游離的艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶進行反應,以獲得其中非肽聚合物通過末端與艾杜醣醛酸鹽-2-硫酸酯酶共價鏈接之鏈接材料;和(b)將該鏈接材料之未反應端的反應性官能基與能夠增加活體內半衰期的生物相容性物質反應,使該生物相容性物質與該鏈接材料共價鏈接,[化學式1]X-L a-F其中,X為艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶;L為非肽聚合物鏈接基部分;A為0或自然數,但當a是2或更大時,每個L彼此獨立;和F為能夠增加X的活體內半衰期的物質。
- 如申請專利範圍第18項所述之用於製備酶接合物之方法,其中該艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶能夠治療第二型黏多醣症(MPS II)。
- 如申請專利範圍第18項所述之用於製備酶接合物之方法,其中該F係選自由聚合物,脂肪酸,膽固醇,白蛋白及其片段,白蛋白結合物質,特定胺基酸序列的重複單元聚合物,抗體,抗體片段,FcRn結合物質,體內結締組織,核苷酸,纖連蛋白,轉鐵蛋白,醣,肝素 和彈性蛋白所成群組。
- 如申請專利範圍第20項所述之用於製備酶接合物之方法,其中該FcRn結合物質係免疫球蛋白Fc區。
- 如申請專利範圍第18項所述之用於製備酶接合物之方法,其中該非肽聚合物係選自由聚乙二醇,聚丙二醇,乙二醇-丙二醇共聚物,聚氧乙烯化多元醇,聚乙烯醇,多醣,葡聚醣,聚乙烯乙醚,可生物降解的聚合物,脂質聚合物,幾丁質,玻尿酸及其組合所成群組。
- 如申請專利範圍第22項所述之用於製備酶接合物之方法,其中該非肽聚合物係聚乙二醇。
- 如申請專利範圍第18項所述之用於製備酶接合物之方法,其中該反應性官能基係選自由醛基,順丁烯二醯亞胺基和丁二醯亞胺衍生物所成群組。
- 如申請專利範圍第24項所述之用於製備酶接合物之方法,其中該醛基係丙醛基或丁二醛基。
- 如申請專利範圍第24項所述之用於製備酶接合物之方法,其中該丁二醯亞胺衍生物係選自丁二醯亞胺基羧甲基,戊酸丁二醯亞胺酯,丁酸丁二醯亞胺甲酯,丙酸丁二醯亞胺基甲酯,丁酸丁二醯亞胺酯,丙酸丁二醯亞胺酯, N-羥基琥珀醯亞胺或碳酸丁二醯亞胺酯所成群組。
- 如申請專利範圍第24項所述之用於製備酶接合物之方法,其中該反應性官能基係位於二端的醛基。
- 如申請專利範圍第24項所述之用於製備酶接合物之方法,其中該非肽聚合物在各端具有一個醛基和一個順丁 烯二亞胺基作為反應性官能基。
- 如申請專利範圍第24項所述之用於製備酶接合物之方法,其中該非肽聚合物在各端具有一個醛基和一個丁二醯亞胺作為反應性官能基。
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