CN105031608A

CN105031608A - 一种txndc5短肽在制备抗类风湿性关节炎药物中的应用

Info

Publication number: CN105031608A
Application number: CN201510350788.3A
Authority: CN
Inventors: 丁兆明
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-06-23
Filing date: 2015-06-23
Publication date: 2015-11-11

Abstract

本发明公开了一种TXNDC5短肽在制备抗类风湿性关节炎药物中的应用，其中所述短肽是SEQ？ID？NO.1所示的氨基酸序列，所述抗类风湿性关节炎药物是抑制类风湿关节炎关节的血管翳生成药物。试验表明本发明的短肽可以通过免疫干预方式抑制类风湿关节炎关节滑膜毛细血管增生，阻断滑膜细胞增殖的营养途径和T细胞渗入途径，抑制组织炎症和组织损伤，从而抑制类风湿关节炎过程病变进程，有望成为抗类风湿关节炎药物。

Description

一种TXNDC5短肽在制备抗类风湿性关节炎药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种短肽的制药应用，尤其涉及一种TXNDC5短肽在制备抗类风湿性关节炎药物中的应用。

背景技术

类风湿关节炎(rheumatoidarthritis，RA)是一种自我免疫疾病，临床表现为慢性、多滑膜关节炎。RA病理学表现为关节滑膜严重炎症,组织增厚，滑膜内T细胞大量渗入，B细胞和滑膜纤维状细胞异常增生，毛细血管大量生成，解剖学上称之为血管翳。

已报到硫氧还蛋白5(thiredoxindomaincontaining5,TXNDC5)位于人6号染色体上(6p24.3)，其编码的二硫化物异构酶含有蛋白质二硫键异构酶(proteindisulfideisomerase，PDI)结构，在缺氧的状况下高表达，催化蛋白质二硫键异构过程。研究发现TXNDC5在RA的滑膜组织中显著性高表达，并显示TXNDC5可能与RA发病过程有关。进一步研究发现，RA低氧条件下诱导滑膜TXNDC5高表达。高浓度的TXNDC5可以上调RA滑膜血管内皮生长因子VEGF表达，VEGF刺激滑膜组织毛细血管增生，形成血管翳，导致T细胞得以向滑膜组织大量渗入造成炎症，同时，病变组织获得充足的营养支持B细胞和纤维状细胞大量增殖。因此目前有报道通过抑制TXNDC5酶活性，实现抑制RA滑膜组织毛细血管生成，从而阻断病变滑膜细胞增生的营养途径和T细胞转移途径，达到杀伤RA滑膜细胞和抑制炎症过程的治疗RA目的。故，TXNDC5有望成为潜在的RA治疗靶点。

发明内容

针对现有技术，本发明的目的是提供一种TXNDC5短肽在制备抗类风湿性关节炎药物中的应用。

本发明所述的TXNDC5短肽在制备抗类风湿性关节炎药物中的应用，其特征在于：所述短肽是SEQIDNO.1所示的氨基酸序列，所述抗类风湿性关节炎药物是抑制类风湿关节炎关节的血管翳生成药物。

上述的应用是采用免疫治疗的途径，人为刺激RA患者免疫系统产生抗TXNDC5抗体，利用抗原、抗体特异性结合原理，用抗TXNDC5抗体结合高表达的TXNDC5，从而抑制该酶活性，阻断毛细血管形成，达到治疗RA病程的目的。目前已报道的RA有效的生物制剂，如益塞谱(Etanercept)、类克等，皆是用RA炎症相关因子TNF(肿瘤坏死因子)的抗体，通过向患者体内注射抗TNF抗体，结合RA高表达的TNF，抑制TNF的生物活性，阻断RA炎症发展，获得RA治疗效果。本申请也按此RA治疗思路，首先以RA实验动物为模型，通过免疫干预治疗的方式，通过抑制TXNDC5生物功能，达到治疗RA目的。

将本发明所述的TXNDC5短肽注入大白鼠体内，使动物产生抗TXNDC5抗体。然后，按常用的RA关节炎动物模型建立方法，向动物体内注射II型胶原诱导动物表现RA临床症状(向大鼠注射胶原诱导动物全身性关节炎症是RA病理研究和药物筛选最常用的动物模型)。与对照组相比，观察注射了TXNDC5短肽注射后的实验动物是否表现RA关节炎症。如果动物未出现RA症状，则说明注射后的动物体内抗TXNDC5抗体和TXNDC5抗原特异性结合，通过抑制该酶的PDI催化功能有效地阻止了TXNDC5下游病理途经，阻断了TXNDC5对毛细血管生成的刺激作用，从而达到RA治疗目的。

实验结果表明:在注射了本发明所述的TXNDC5短肽后抗TXNDC5抗体水平明显升高，显示TXNDC5抗体和其抗原在大鼠体内发生特异性结合，可以对TXNDC5酶活性形成免疫抑制。在胶原诱导RA之前注射了TXNDC5短肽的动物不再表现RA临床症状和组织学特征，说明对TXNDC5的免疫抑制可以有效地抑制RA的病理进程。对照组包括α头发角蛋白短肽或BSA替代TXNDC5短肽后，RA现象未受到抑制，证实TXNDC5短肽对RA抑制结果不是免疫耐受不造成的。TXNDC5短肽注射后用BSA免疫的大鼠未表现RA，这意味着TXNDC5短肽本身并没有对RA影响。在实验中，TXNDC5短肽相对应该酶的C-末端，钙离子结合区、PDI活性部位等部位，因此，其产生的抗体可以通过免疫结合有效地抑制TXNDC5酶的生理功能。

目前治疗RA的生物制剂主要是益赛普、英夫利昔、利妥昔(Rituximab)，但这些生物制剂均针对RA大量增生的滑膜细胞或炎症因子，无一针对另一RA重要病理特征-血管翳生成。本发明提供的TXNDC5短肽可以通过免疫抑制TXNDC5活性，直接抑制RA的血管翳生成。通过切断滑膜细胞大量增殖所需的营养渠道和T细胞侵入途径，从根本上达到治疗RA的目的。RA病变关节组织的本质是低氧，低氧环境诱导病变进程。抑制低氧所诱导的TXNDC5的生物活性，为从整体上治疗RA开辟了一个新途径。

附图说明

图1血中抗TXNDC5抗体水平图。

图2血中VEGF水平图。

具体实施方式

实施例1

按常规人工合成方法合成SEQIDNO.1的氨基酸序列，即为本发明所述的TXNDC5短肽。进行药物用途验证试验。

雄性Lewis大鼠60只，平均体重120克，8周龄。

通过尾静脉向每只大鼠分别注射100微克的SEQIDNO.1所示氨基酸序列的短肽。短肽分别与载体蛋白匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联。

将上述短肽与同等体积浓度的弗氏佐剂(5ug/ml)充分混合，在第1、14和28天对实验动物免疫注射，按常规方法使之产生抗TXNDC5抗体。然后，在第一次注射后的第42，56和70天，向这些动物注射牛Ⅱ型胶原(Sigma公司)，按常规建立RA动物模型方法诱导动物表现RA。每日检查大鼠的肢体发红、肿胀和僵硬程度。RA炎症程度按研究通常所用的12分评分标准评判，评分标准如下：0：正常，无肿胀/发红，1：轻度发红，2：变红和整个足肿胀；3：强炎症和足严重变形。每只鼠四肢RA程度最大累计12分。同时，在第0，35，77和102天采集动物血液样本，用常规ELISA方法测定血中抗TXNDC5抗体和血管内皮生长因子VEGF水平。VEGF代表组织毛细血管发育程度。VEGF水平用大鼠VEGFELISA试剂盒(Invitrogen公司)完成。大鼠在第一次注射后的第102天处死。解剖出来的滑膜组织用常规免疫组织化方法检查组织病变程度和TXNDC5表达状况。

实验同时设置一系列对照组，每组大鼠为60只，具体组别如下：(1)，α头发角蛋白短肽(AAVGSRPIHCGVRFC肽)替代TXNDC5短肽；(2)牛血清白蛋白(BSA，Sigma公司)的取代II型胶原蛋白诱导；(3)BSA代替TXNDC5短肽和II型胶原诱导；(4)只注射II胶原诱导；(5)只用BSA免疫动物，取代短肽和胶原免疫注射；(6)未注射任何短肽和蛋白质。

实验组大鼠在免疫TXNDC5短肽后按常规用胶原诱导RA。

实验结果如下：

以在第一次注射胶原蛋白后第50天(即第一次注射后第92天)，60只大鼠(97％)中的58只没有表现任何炎症和四肢关节僵硬。只有两只在第一次注射胶原后第56天肢体出现轻微发炎(炎症评分＝3)。用α头发角蛋白短肽替代TXNDC5短肽注射的大鼠中，54只大鼠(90％)在胶原诱导后第35.2±3.4关节出现明显肿胀。在用BSA替代TXNDC5短肽的大鼠中，51只(85％)大鼠在第一次注射胶原蛋白的第38.5±3.8天，关节出现明显炎症。所有60只(100％)用BSA替代TXNDC5短肽、其他短肽和胶原的大鼠均不表现RA的临床表现。57只(95％，其中5只在实验期间死亡)大鼠在单独注射胶原后第37.8±2.7天显示关节炎症。注射TXNDC5短肽，然后注射BSA替代II型胶原的60只大鼠(100％)均没有表现RA症状。没有任何注射的大鼠也均没有显示任何关节发炎症状。

实验中用ELISA法检测大鼠血液中抗TXNDC5水平。

结果表明，大鼠在第一次TXNDC5短肽注射后的35和77天，血液中出现高水平的抗TXNDC5抗体，在第102天后下降到正常水平(见图1)。ELISA对动物血液检测还表明，VEGF水平在第一次注射后的102天明显升高。但是，相比之下，VEGF水平明显降低在注射了TXNDC5寡肽的大鼠血液对中却明显降低，甚至比没有治疗的大鼠低(见图2)，说明该组大鼠滑膜组织内毛细血管发育程度也相对低。

实验中用免疫组织化学方法对实验动物关节滑膜病理结构变化及TXNDC5表达进行了研究。在胶原注射后的大鼠滑膜组织里，滑膜明显变厚并含有大量T细胞，B细胞和纤维状细胞，同时观察到大量毛细血管生成，这种状况存在于所有的注射了胶原的大鼠中，不管它们是否同时也被注射了其它短肽和或BSA。但在那些在胶原诱导前注射了本发明所述TXNDC5短肽的大鼠中，它们的滑膜比较薄，与非RA诱导的对照组相似，同时，滑膜毛细血管也明显低于胶原RA诱导的大鼠。免疫组织化学在所有动物的关节滑膜中检测出TXNDC5的表达，该酶多在位于滑膜的表层细胞表达。然而，在注射本发明所述TXNDC5短肽的大鼠关节滑膜中，TXNDC5免疫信号的强度明显低于胶原RA诱导对照组的水平。

Claims

1.一种TXNDC5短肽在制备抗类风湿性关节炎药物中的应用，其特征在于：所述短肽是SEQIDNO.1所示的氨基酸序列，所述抗类风湿性关节炎药物是抑制类风湿关节炎关节的血管翳生成药物。