CN102119214A - 适合于癌症治疗的包含体外扩增的t淋巴细胞和血管形成抑制剂的组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种使用组合治疗的改进的癌症疗法，所述组合治疗使用了通过肿瘤反应性淋巴细胞的体外扩增和活化方法获得的肿瘤反应性T淋巴细胞、特别是CD4+辅助细胞和/或CD8+T淋巴细胞，以及血管形成抑制剂的抑制剂、尤其是VEGF的抑制剂。
Description
发明领域
本发明涉及改进的疗法，其包含血管形成抑制剂的抑制剂、尤其是VEGF的抑制剂，其与通过肿瘤反应性淋巴细胞的体外扩增和活化方法获得的肿瘤反应性T淋巴细胞、特别是CD4+辅助细胞和/或CD8+T淋巴细胞组合。肿瘤反应性T淋巴细胞不是CD4+CD25+Hi淋巴细胞，即本发明不涵盖调节性T淋巴细胞。此外，在本发明中使用的肿瘤反应性T淋巴细胞与所谓的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)不同。在本发明中使用的肿瘤反应性T淋巴细胞不是所谓的SNAL(前哨淋巴结获得性淋巴细胞)或MNAL(Metinel淋巴结获得性淋巴细胞)。本发明还涉及包含血管形成抑制剂的抑制剂、尤其是VEGF的抑制剂和肿瘤反应性T淋巴细胞的组合物。一般来说，为了实现在剂量、给药途径和给药时间方面具有灵活性的适合的治疗方案，组合物包含两种分开的制剂，一种含有一种或多种血管形成抑制剂的抑制剂，另一种含有肿瘤反应性T淋巴细胞。肿瘤反应性T淋巴细胞可以通过肿瘤反应性淋巴细胞、特别是CD4+辅助细胞和/或CD8+T淋巴细胞的体外扩增和活化方法获得。
发明背景
根据免疫监视假说，免疫系统持续敏化以对抗形成中的肿瘤，实验证据强烈支持这一看法。特异性肿瘤抗原的鉴定已产生用于肿瘤免疫疗法的新的可能性，并且许多免疫治疗方法现在正转化成临床试验。其中，肿瘤抗原特异性淋巴细胞的过继转移似乎特别有前途。到目前为止，这些尝试通常是基于来自外周血的单核细胞或从新鲜肿瘤样本分离的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。在最近的试验中，使用扩增的TIL的自体转移治疗患有恶性黑素瘤的患者，已报道客观应答率高达51％。TIL细胞很少，由于来自肿瘤的免疫抑制机制，它们通常是无应答性的(无反应性的)，导致需要进行长时间的扩增(几个月)。此外，方案旨在扩增CD8+细胞毒性T细胞，并且已经将细胞重新导入用化疗预先处理的患者中，此外患者已经用高剂量的白介素-2治疗，以提供CD8+T细胞的存活。
血管形成、也称为新生血管化，是用于形成新血管的基础过程。在正常生理条件下，血管形成受到高度调控，并且对于生殖、胚胎发育、组织修复和伤口愈合来说是必不可少的。但是，在各种病理情况下也发生血管形成，这些病理情况包括肿瘤生长和转移、炎性疾病例如类风湿性关节炎、牛皮癣、骨关节炎、炎性肠病、Crohn’s病、溃疡性结肠炎以及与眼部新生血管化相关的各种眼部疾病。事实上，血管形成是对各种不同促血管形成刺激物例如生长因子、细胞因子和其他生理分子以及其他因素例如缺氧和低pH做出响应而发生的。
新血管发生的血管形成级联反应需要调控所需细胞过程例如细胞外基质(ECM)重塑、侵入、迁移、增殖、分化和管形成的各种分子的协作。在起始阶段后，促血管形成分子例如VEGF、bFGF、PDGF等通过刺激内皮细胞表面受体(例如VEGFR1/Flt-1和VEGFR2/Flk-1/KDR)活化内皮细胞。这些被活化的细胞经历了一系列细胞增殖、细胞粘附分子表达增加、蛋白水解酶分泌增加和细胞迁移和侵入增加的过程。许多不同分子参与促进增殖和侵入，包括用于粘附的整合蛋白、选择蛋白和免疫球蛋白基因超家族的成员，以及用于降解细胞外基质的蛋白水解酶例如基质金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶。最后，生物化学信号的复杂级联反应由与细胞外基质组分和可溶性因子的相互作用的细胞表面受体产生，导致管腔形成并分化成成熟血管。
由于VEGF与前面提到的各种疾病的内在关联，VEGF被认为是用于抗癌治疗的有吸引力的靶，特别是与常规的化疗、放疗和其他抗血管形成药剂组合。在本技术领域中已知许多血管形成抑制剂(VEGF和VEGF相关抑制剂)。可以提到的是例如VEGF抑制性适体；例如Macugen
(哌加他尼，辉瑞)抗体或其片段；例如抗VEGF抗体，例如Avastin(贝伐单抗(bevacizumab)，Genentec)，或其片段例如Lucentis
(兰尼单抗(ranibizumab)，Genentec)，已经出现在市场上。
但是，正如前面指出的，例如Avastin
的使用要求疗法与抑制细胞的化合物组合才具有治疗效果。此外，例如Avastin
的使用在用作组合疗法时已显示出多种不想要的副作用。主要的副作用是高血压和出血的风险升高。肠穿孔已有报道。脑部毛细血管渗漏综合征、鼻中隔穿孔和肾脏血栓性微血管病也已有报道。
发明内容
在癌症治疗中使用例如通过本文公开的根据WO 2004/032951和WO 2007/071388(属于同一申请人)的方法获得的肿瘤反应性T淋巴细胞，并与一种或多种VEGF抑制剂组合，设想将可以有效的方式治疗癌症。尤其是设想到将可以获得改进的治疗。因此，设想到与使用本文描述的免疫疗法或VEGF抑制剂的治疗相比，将获得改进的治疗。通过使用VEGF抑制剂产生血管形成的阻断，将会增加氧气的缺乏即缺氧症，导致癌细胞坏死，所述癌细胞将被吸收，并引起免疫系统的呈递和活化加强。因此，免疫疗法与VEGF抑制剂的组合似乎彼此补充。将可能获得下列一种或多种有益效果：
a)总体存活率的提高(优选情况下，与不使用一种或多种VEGF抑制剂的肿瘤反应性T淋巴细胞治疗相比，或可选地，与使用相同的VEGF抑制剂和在特定癌症类型的治疗中经常使用的细胞抑制化合物的治疗相比)，即提高至少10％，例如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约80％；
b)肿瘤尺寸的减小(在实体肿瘤的情况下)；肿瘤尺寸可以使用RECIST判据通过CT扫描、MRI或超声波进行测量，并且减小至少10％，例如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约80％；
c)转移的消退，例如使用RECIST判据通过CT扫描测量到的；消退应该为至少10％，例如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约80％；
d)有害副作用的频率降低；
e)副作用的幅度降低；
f)肿瘤反应性T淋巴细胞的剂量和/或一种或多种VEGF抑制剂的剂量降低(与在不使用一种或多种VEGF抑制剂的肿瘤反应性T淋巴细胞治疗中肿瘤反应性T淋巴细胞的剂量相比，或可选地，与使用相同的VEGF抑制剂和在特定癌症类型的治疗中经常使用的细胞抑制化合物的治疗相比)，即肿瘤反应性T淋巴细胞和/或一种或多种VEGF抑制剂剂量降低至少10％，例如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约80％。
应该理解，本发明的相关T淋巴细胞源自于淋巴结、典型为前哨淋巴结(SEAL)和/或metinel淋巴结(MEAL)。
因此，本发明涉及组合物，其包含：
a)一种或多种VEGF抑制剂，以及
b)肿瘤反应性CD4+T辅助细胞和/或CD8+T淋巴细胞。
正如上面提到的，这样的组合物一般包含两种分开的制剂，各含一种有效成分。此外，使用的肿瘤反应性CD4+T辅助细胞和/或CD8+T淋巴细胞与肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)不同。
此外，预计与同样剂量/数量的组分单独给药相比，组合将具有累加或协同效果。
组合疗法特别适合于可以从前哨或metinel淋巴结产生肿瘤反应性细胞的情况。在这样的情况下，肿瘤反应性细胞可以来自同一患者，即细胞是自体的。但是，不能排除在某些情况下同种异体移植可以提供有效的治疗。
定义
术语“肿瘤反应性T淋巴细胞”是指带有特异性针对并识别肿瘤抗原的T细胞受体的T淋巴细胞。
术语“T辅助细胞”是指活化时促进获得性免疫应答的T淋巴细胞。
术语“Th1细胞”是指当使用细胞因子例如IFN-γ活化时促进细胞介导的免疫应答的T辅助细胞。
术语“Th2细胞”是指当使用细胞因子例如IL-4活化时促进体液免疫应答的T辅助细胞。
术语“CD4+辅助性T淋巴细胞”是指表达CD4的T淋巴细胞；即它们是CD4+T淋巴细胞，不被当作具有标记物例如高的CD25表达和FOXP3表达的调节性T细胞。
术语“CD8+T淋巴细胞”是指表达CD8的T淋巴细胞。
术语“调节性T淋巴细胞”是指抑制获得性免疫应答、表达转录因子FoxP3的T淋巴细胞。
术语T淋巴细胞的“特异性活化”是指抗原特异性的、MHC限制的、T细胞受体介导的活化。相比之下，术语T淋巴细胞的“非特异性活化”泛指所有T细胞的活化，不论T细胞受体特异性如何。
术语“肿瘤浸润性淋巴细胞”或“TIL”是指离开血流并迁移到肿瘤中的白血细胞(白细胞)。治疗性TIL通常是由自体TIL构成的细胞制备物，其在体外被操作，并且在体内给药后重新浸润肿瘤以引发肿瘤细胞裂解。治疗性TIL从肿瘤组织分离。因此，定义TIL的是淋巴细胞的位置。根据定义，TIL是在肿瘤组织中收获的淋巴细胞。但是，它们在功能上通常是不同的，因为它们已经受肿瘤诱导的抑制，并带有例如指示功能性抗肿瘤应答的关闭的表观遗传标志物，正如我们最近发现的(P Jansson，J immunol，2008)。
术语“肿瘤来源的抗原”打算涵盖肿瘤细胞、肿瘤的匀浆液(所述匀浆液可以被变性)、或肿瘤蛋白、多肽或肽，例如以纯化、天然、合成和/或重组蛋白、多肽或肽的形式。肿瘤来源的抗原可以是完整分子、其片段或完整分子和/或片段的多聚体或聚合体。适合的多肽和肽的实例是包含约5到约30个或约1-1000个氨基酸例如约10到25个氨基酸、约10到20个氨基酸或约12到18个氨基酸，或例如约30-50个氨基酸、约70-100个氨基酸、约200-500个氨基酸或约500-1000个氨基酸的多肽和肽。如果使用肽(例如在本文参考实施例1中描述的自体方法中)，在培养物中的终摩尔浓度一般为约0.1到约5.0μM，例如可以使用约0.1到约4.0μM、约0.2到约3.0μM、约0.3到约2.0μM或约0.3到约1.0μM。肿瘤来源的抗原可以是自体的或异体的，即从待治疗的患者产生或从另一个患有癌症的对象获得。在本发明的实施例中，发明人使用了自体的变性肿瘤提取物，但是，正如前面提到的，其他来源的肿瘤来源的抗原也可能适用于本发明。
术语“前哨淋巴结”是指接受来自肿瘤的淋巴引流液的第一个淋巴结。术语“metinel淋巴结”是指接受来自转移肿瘤的淋巴引流液的第一个淋巴结。
术语“副作用频率的降低”是指在使用组合进行治疗的临床试验中观察到的有害副作用，与如果使用单独组分进行治疗的情况相比频率较低。
术语“有害副作用”是指对药物的反应是有害的和不是有意的，并且其发生在通常在人类中用于疾病的预防、诊断或治疗或用于改变生理功能的剂量下。
术语“副作用的幅度降低”是指任何可测量的副作用的测量到的幅度和/或频率降低。
正如上面提到的，组合给药可以引起累加或协同效果。典型情况下，如果获得的效果相当于组合单独给药时所获得的效果的“加和”，存在累加效果，而如果获得的效果高于组合单独给药时所获得的效果的“加和”，存在协同效果。两种情况都是有利的，因为能够使用较低量的组分获得足够的效果。
术语“单克隆抗体”是指都是由同一亲本细胞的克隆的一种类型的免疫细胞产生的相同的单特异性抗体。该定义还包括保留了与VEGF或其受体的相关免疫反应性的抗体的片段、部分或形式。
术语“表位”、也称为抗原决定簇，是指大分子被免疫系统识别的部分。
术语“多克隆抗体”是指源自于不同B细胞系的抗体。它们是针对特异性抗原分泌的各识别不同表位的免疫球蛋白分子的混合物。
术语“VEGF”是指被分类为血管内皮生长因子蛋白的蛋白类别。该定义还包括VEGF的任何亚型、同种型或表位。
术语“VEGF抑制剂”、“抗血管形成化合物”、“血管形成抑制剂”可以互换使用，是指抑制血管内皮生长因子(VEGF)的活性或产生的化合物或多种化合物。它是指例如在核酸水平上抑制VEGF表达的蛋白例如单克隆抗体、抗体、抗体片段或肽(环状或非环状)、核酸、siRNA、核酶，以及抑制VEGF的小分子。该术语还指VEGF的所有同种型、亚型和表位的抑制剂。
术语“药物赋形剂”或“可药用赋形剂”可以互换使用，是指任何用作药物活性成分的载体的无治疗活性的物质。
术语“相关T淋巴细胞”是指特异性针对所靶向的癌症类型的肿瘤反应性CD4+辅助细胞和/或CD8+T淋巴细胞。
术语“组合物”是指单独地或以任何组合形式构成组合物的一种或多种独立实体或制备物。因此，该术语被用于指称各自在独立的制备物中的相关T淋巴细胞、一种或多种VEGF抑制剂和任选的化疗化合物；或相关T淋巴细胞在一种独立制备物中，一种或多种VEGF抑制剂和任选的化疗化合物在另一种或其他独立制备物中。该术语也可用于指称相关T淋巴细胞、VEGF抑制剂和任选的化疗化合物的一种单一组合物，只要所有活性成分在相同时间点适时地并通过相同给药途径给药。
在下文中，术语“免疫治疗组分”用于指称T淋巴细胞组分，“抗血管形成组分”用于指称含有一种或多种VEGF抑制剂的组分，即本发明的组合物中的两种必备组分。
免疫治疗组分——肿瘤反应性T淋巴细胞
本发明人以前已经显示，未接触过抗原的T细胞的活化可以在次级淋巴器官例如前哨淋巴结的高度特化的微环境中发生。换句话说，前哨淋巴结可以被当作免疫系统遇到肿瘤抗原的原始位点。
本发明人以前公开了用于从前哨淋巴结扩增肿瘤反应性T淋巴细胞的通用方法，显示了能够对从前哨淋巴结获得的T淋巴细胞进行培养以获得肿瘤反应性T淋巴细胞的培养物(WO 2004/032951和WO2007/071388，二者在此引为参考)。通过向移除前哨淋巴结的患者给药有效量的肿瘤反应性T淋巴细胞，肿瘤反应性T淋巴细胞可用于治疗癌症。
相关T淋巴细胞通过扩增肿瘤反应性CD4+辅助细胞和/或CD8+T淋巴细胞的方法获得，其中特异性培养条件已被确定和优化，并且其中在整个扩增阶段中监测T淋巴细胞上和培养基中的特异性标志物，以便在可能的最短时间跨度内获得大量肿瘤反应性T淋巴细胞。此外，本发明同时还提供了引导肿瘤反应性CD4+辅助细胞和/或CD8+T淋巴细胞朝向特异性亚群发育的方法。T淋巴细胞不是CD4+CD25+Hi淋巴细胞，即本发明不包含调节性T淋巴细胞。
表达转录因子FoxP3的CD4+CD25HiT淋巴细胞被认为是调节性T细胞(Treg)。Treg具有通过抑制活化和增殖来调控T辅助细胞和细胞毒性T细胞的性质，此外Treg抑制有用的Th1细胞因子例如IFN-γ的产生和释放。因此，本发明的方法促进T辅助细胞和T细胞毒性T细胞的扩增，并避免Treg细胞的扩增。
活化的、增殖的CD4+辅助性T淋巴细胞可以分化成两个主要细胞亚类，Th1和Th2细胞，它们根据产生的特异性细胞因子来定义。Th1细胞产生γ-干扰素和白介素12(IL-12)，而Th2细胞产生白介素-4、白介素-5和白介素-13。Th1 T淋巴细胞据信促进细胞毒性T淋巴细胞(Tc)、NK细胞、巨噬细胞和单核细胞的活化，所有这些细胞都能攻击癌细胞并普遍防御肿瘤。
Th1和Th2类型的T-辅助(CD4+)淋巴细胞能够分化成记忆细胞和效应细胞。记忆性T-辅助(CD4+)淋巴细胞特异性针对它们首次遇到的抗原，并能够在第二次免疫应答期间被唤醒，唤起针对肿瘤抗原的更快速和强烈的应答。在人类中有证据表明淋巴细胞存活至少20年，并可能终生。效应性CD4+T淋巴细胞是产生细胞因子和INF-γ的活性细胞。
因此，本发明涵盖了CD4+辅助T淋巴细胞，包括Th1和Th2亚型和从其衍生的记忆和效应细胞以及CD8+T淋巴细胞的应用。
最经常通过参考实施例中描述的方法产生的肿瘤反应性T淋巴细胞是CD4+辅助T淋巴细胞。在某些情况下，扩增方法的一个目的是模拟患者自身免疫系统的天然途径，并在某种程度上让患者的免疫系统的成分根据呈递抗原的是MHC I还是MHC II来确定首先产生的是CD4+辅助细胞还是CD8+T淋巴细胞。在大多数情况下，抗原将被II类MHC分子呈递，导致CD4+辅助T淋巴细胞的产生。但是，在某些情况下产生CD8+T淋巴细胞。如果产生CD4+辅助T淋巴细胞，它们将按照本文的描述进一步扩增；但是，该方法也可用于扩增CD8+细胞。本发明人以前已提出了用于扩增相关T淋巴细胞的详细方法(WO2007/071388和WO2004/032951)，它们在此引为参考。但是，也可以使用其他方法，只要能够产生CD4+辅助T淋巴细胞和/或CD8+T淋巴细胞而没有显著含量的Treg细胞、即高达1％的细胞可以是Treg细胞、优选没有细胞是Treg细胞即可。
Th2细胞产生刺激B细胞的细胞因子。这将不导致肿瘤的缩小，因此应该避免Th2细胞的大量出现。相反，Th1细胞促进CD8细胞毒性细胞，因此将破坏肿瘤细胞。为了显著避免Th2类型的肿瘤反应性T淋巴细胞的产生，可以添加一种或多种能够拮抗Th2型T淋巴细胞的发育的物质。这样的物质的实例是能够中和白介素IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF-β(后者不是白介素)的物质，所有这四种物质都为建立Th2细胞因子分布和下调Th1细胞因子生产所需。
这样的物质的实例包括蛋白、多肽、肽、可溶性受体、抗体、亲合体(affibody)及其片段、融合蛋白、合成和/或有机分子例如小分子，以及天然配体。在具体实施方案中，物质选自与白介素结合从而中和它们的抗体例如抗IL-4抗体、IL-5抗体和/或抗IL-10抗体，以及TGF-β的可溶性受体(例如TGF-β受体I和II)和结合蛋白(例如LAP和/或LTBP)。
一种或多种能够拮抗Th2型T淋巴细胞的发育的物质，例如一种或多种能够中和IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF-β的物质，可以在第二阶段ii)的第1天添加(参见本文参考实施例1)。但是，因为抗体昂贵，因此抗体的添加也可以在随后的步骤中，在添加能够上调T淋巴细胞上的IL-12R的物质后，例如在添加能够上调T淋巴细胞上的IL-12R的物质后一天、两天或三天进行。
中和物质应该以足以中和白介素的量添加，例如与待中和的白介素的量相比过量10-100倍(摩尔)。当使用抗体时，一般需要终浓度为约2到约4ng/ml培养基。对于其他类型的中和物质来说，应该使用提供与上述浓度的抗体同样的效果的终浓度。
为了维持对Th2型T淋巴细胞发育的抑制，可以定期、例如在阶段ii)中每两天、三天或四天向扩增物添加附加量的一种或多种能够拮抗Th2型T淋巴细胞发育的物质，例如一种或多种能够中和IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF-β的物质。应该理解，术语每两天、三天或四天是指在整个扩增过程中，从第一次添加至少一种能够拮抗Th2型T淋巴细胞发育的物质后的第二天、第三天或第四天开始，在每个第二天、第三天或第四天添加至少一种能够拮抗Th2型T淋巴细胞发育的物质。
为了有利于Th1型肿瘤反应性T淋巴细胞的产生，第二阶段ii)(参见本文参考实施例1)可以包含添加一种或多种促进Th1型T淋巴细胞发育的物质。这样的物质的实例是对IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21受体具有激动活性的物质。更具体来说，物质可以是IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21受体的激动剂。这样的激动剂的实例包括蛋白、多肽、肽、抗体、亲合体及其片段、融合蛋白、合成和/或有机分子例如小分子，以及天然配体。在具体实施方案中，物质分别是IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21受体的天然配体，例如IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21。
IL-12的效应是通过刺激IL-12R来活化IFN-γ诱导的STAT途径，从而促进Th1淋巴细胞的活化。IL-21的功能是增加朝向Th1型T淋巴细胞的增殖、活化和发育。
IL-7和IL-15都通过促进T淋巴细胞的稳态扩增、增加活化的Th1程序化T淋巴细胞的数目起作用。
用于提供相关T淋巴细胞的扩增方法优选是提供Th1型CD4+肿瘤反应性T淋巴细胞的扩增方法。本发明的另一方面是通过使用本文描述的扩增肿瘤反应性T淋巴细胞的方法，获得相对大量的记忆类型的T淋巴细胞。在癌症治疗中，被治疗患者接受大量效应性肿瘤反应性CD4+T淋巴细胞当然是重要的，因为正如前面提到的，这促进了细胞毒性T淋巴细胞(Tc)、NK细胞、巨噬细胞和单核细胞的活化，所有这些细胞都能攻击癌细胞并普遍抵御肿瘤。
因此，本发明的相关T淋巴细胞(CD4+T辅助细胞和/或CD8+反应性T淋巴细胞)可以通过下述方法获得：用肿瘤来源的抗原连同至少一种对IL-2受体具有激动活性的物质一起刺激肿瘤反应性CD4+T辅助细胞和/或CD8+T淋巴细胞，以促进肿瘤反应性CD4+T辅助细胞和/或CD8+T淋巴细胞的存活；以及活化并促进肿瘤反应性CD4+T辅助细胞和/或CD8+T淋巴细胞的生长，其中当CD4+T辅助细胞和/或CD8+T淋巴细胞上的CD25细胞表面标志物(或IL-2R标志物)下调时启动第二阶段ii)。
通过同时给药显著量的记忆肿瘤反应性CD4+T淋巴细胞，患者获得了长达终生的针对肿瘤复发或原发肿瘤转移的保护。
正如从本文参考实施例1显示的，T淋巴细胞上细胞表面活化标记物CD25和CD69的表达可用于确定何时启动本发明的重要步骤，例如何时启动第二阶段ii)。因此，在整个阶段i)和阶段ii)中连续地、例如每两天、每三天或每四天监测CD25和CD69的表达，可能是有益的。但是，除了本文公开的扩增方法之外，其他方法也可能是适合的。使用参考实施例1中描述的方法的一个优点是高的细胞产量，以及对方法进行指导以提供所选T淋巴细胞的可能性；但是，也存在例如较低产量也可接受的情况，因此也可以使用其他方法。
因为本发明的一个目的是获得可用于向患者给药的包含特异性CD4+肿瘤反应性T淋巴细胞的组合物，因此可以在某些时间点收获肿瘤反应性T淋巴细胞，导致扩增步骤的终止。收获肿瘤反应性T淋巴细胞的最适时间点是T淋巴细胞上CD25的表达下调时，其中下调被定义为5％或以下的CD4+T淋巴细胞和/或CD8+T淋巴细胞群表达CD25。最适收获时间点也可以根据产生的IFN-γ量的测量值来确定。IFN-γ的产量与初始IFN-γ产量相比应该增加至少2倍，例如增加至少3倍、至少4倍或至少5倍，所述初始IFN-γ产量一般对应于至少100pg/ml培养基的IFN-γ水平。
包含肿瘤反应性T淋巴细胞给药的癌症治疗的成功由多种因素决定，所述因素例如为在从前哨淋巴结扩增细胞后获得的肿瘤反应性T淋巴细胞的量、即可用于灌输到患者中的肿瘤反应性T淋巴细胞的量，获得有效量肿瘤反应性T淋巴细胞所需的时间，以及通过所使用的扩增方法获得的肿瘤反应性T淋巴细胞的特定亚群的浓度和比率。当疗法与一种或多种VEGF抑制剂组合时，所有这些成功因素也被设想是重要的。
在标题“肿瘤反应性T淋巴细胞”下的本段落中描述的所有详细情况，对于包含在含有免疫治疗组分和血管形成组分的组合物中的T淋巴细胞也同样有效。
抗血管形成组分——血管形成抑制剂、尤其是VEGF抑制剂
血管内皮生长因子(VEGF)是生长因子的亚家族，更具体来说是半胱氨酸结生长因子的血小板衍生的生长因子家族。它们是重要的信号传导蛋白，参与血管发生(胚胎循环系统的从头形成)和血管形成(从已存在的血管系统生长血管)两者。最重要的成员是VEGF-A。其他成员是胎盘生长因子(PIGF)、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D。已发现许多VEGF相关蛋白由病毒编码(VEGF-E)和编码在某些蛇的毒液中(VEGF-F)。
由于VEGF的固有特性，这类蛋白在癌症治疗中极为重要，并已成为使用蛋白、单克隆抗体或抗体衍生物和作为VEGF抑制剂的小分子或VEGF所刺激的酪氨酸激酶的疗法中重要的靶。单克隆抗体或抗体衍生物的实例是贝伐单抗(Avastin
用于转移的结肠直肠癌、非小细胞肺癌和转移的乳腺癌的医学适应症)和兰尼单抗(Lucentis
)。小分子抑制剂的实例是舒尼替尼(Sutent)、索拉非尼(Nexavar
)、N-甲基-2-[[3-[(E)-2-吡啶-2-基乙烯基]-1H-吲唑-6-基]硫烷基]苯甲酰胺(Axitinib
)和5-[[4-[(2，3-二甲基-2H-吲唑-6-基)(甲基)氨基]嘧啶-2-基]氨基]-2-甲基苯磺酰胺(Pazopanib)。
但是，在贝伐单抗(Avastin
)的情况下，已发现这种疗法必须与标准的化疗例如基于5-氟尿嘧啶的化疗或紫杉醇组合才具有疗效。除了需要组合疗法之外，在Avastin治疗过程中已发现许多副作用，例如胃肠道(GI)穿孔、伤口愈合并发症和出血。
如上所述，VEGF抑制剂的作用主要是抑制肿瘤组织中的血管形成，从而终止肿瘤生长。据认为，血管内皮生长因子(VEGF)介导的血管形成在肿瘤生长和转移中发挥关键作用。因此，正在对抗VEGF疗法作为潜在的抗癌症疗法、作为常规化疗或放疗的替代或辅助疗法进行活跃的研究。用于阻断VEGF途径的技术包括：1)针对VEGF或其受体的中和单克隆抗体，2)VEGF受体的小分子酪氨酸激酶抑制剂，3)用作VEGF的假受体的可溶性VEGF受体，以及4)特异性靶向VEGFmRNA的核酶。最近来自III期临床试验的证据使得FDA批准了贝伐单抗、抗VEGF单克隆抗体与本技术领域已知的其他常规化疗药剂组合，作为转移的结肠直肠癌的一线疗法。
因此，本发明的组合物可以包含VEGF抑制剂，例如VEGF或其受体的中和单克隆抗体、VEGF受体的小分子酪氨酸激酶抑制剂、用作VEGF的假受体的可溶性VEGF受体和特异性靶向VEGF mRNA的核酶，或其任何组合。
其他可能有用的VEGF或相关抑制剂是被分类为属于下列一种或多种的单克隆或多克隆或重组抗体：
抗VEGF A、B、C、D、E或F抗体，包括所有亚型
抗VEGF受体1或2抗体
抗FLT 1或4抗体
抗KDR抗体
抗NRP1或2抗体
抗VEGFR 1-4抗体
抗ARHGEF4抗体
抗前动力蛋白1抗体
抗-神经纤毛蛋白1抗体
抗促肾上腺皮质激素释放因子受体2抗体
抗FIGF抗体。
设想任何血管形成的抑制剂可以与免疫疗法组合使用。因此，抑制剂可以是VEGF抑制剂，包括抗VEGF抗体(例如单克隆或多克隆抗体或重组抗体)或其片段。与免疫疗法、尤其是本文中示例的免疫疗法组合使用的血管形成抑制剂，包括在本文中具体公开的那些。
在标题“血管形成抑制剂、尤其是VEGF抑制剂”下的本段落中描述的所有详细情况，对于包含在含有免疫治疗组分和血管形成组分的组合物中的VEGF抑制剂也同样有效。
组合疗法
现在，本发明人令人吃惊地发现，将作为一种或几种VEGF抑制剂与CD4+辅助T淋巴细胞和/或CD8+T淋巴细胞的单一组合物(例如可以通过本文描述的方法获得的)，或作为两种独立的组合物、一种组合物包含一种或多种VEGF抑制剂、一种组合物包含T淋巴细胞的组合，给药于需要的对象，能够产生一种或多种上面提到的效应。
T淋巴细胞可以是CD4+辅助T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、Th1细胞、源自于Th1细胞的记忆细胞和/或源自于Th1细胞的效应细胞，及其任何组合。
在实践中，几乎不可能获得只含有一种特定类型T淋巴细胞的100％纯的细胞群。但是，正如可以从本文的实施例看到的，一般来说，CD4+和CD8+T淋巴细胞占使用的组合物中细胞群的至少35％；通常它们占细胞群的至少60％，并且在大多数情况下占85％以上(使用流式细胞术检测)。在本发明的情况下，如果组合物的免疫治疗组分含有51％或以上、例如60％或以上、75％或以上、90％或以上或95％或以上的CD4+辅助T淋巴细胞，该组分被说成是CD4+辅助T淋巴细胞组分。类似地，如果组合物的免疫治疗组分含有51％或以上、例如60％或以上、75％或以上、90％或以上或95％或以上的CD8+T淋巴细胞，该组分被说成是CD8+T淋巴细胞组分。
对于癌症的有效治疗来说，给药Th1类型的肿瘤反应性T淋巴细胞特别有利，因为据信该类型促进细胞毒性T淋巴细胞(Tc)、NK细胞、巨噬细胞和单核细胞的活化，所有这些细胞都能攻击癌细胞并普遍抵御肿瘤。即在具体实施方案中，本发明涉及组合物，其中免疫治疗组分包含至少85％的肿瘤反应性CD4+辅助T淋巴细胞。一般来说，通过参考实施例中描述的方法产生的Th2类型T淋巴细胞的百分率为30％或以下，例如25％或以下、20％或以下、15％或以下、10％或以下、5％或以下、或0％，而至少70％的肿瘤反应性CD4+T淋巴细胞是Th1类型的，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％。
正如前面提到的，如果免疫治疗组分含有显著量的记忆性肿瘤反应性CD4+T淋巴细胞，将是有利的。记忆性肿瘤反应性CD4+T淋巴细胞能够长达终生地针对肿瘤复发或原发肿瘤的转移保护患者。
因此，本发明还提供了组合物，其中免疫治疗组分包含记忆T淋巴细胞。一般来说，当按照本文参考实施例1扩增肿瘤反应性T淋巴细胞的培养物时，将获得约35％到约90％、例如约40％到约90％、约50％到约80％或约60％到约70％的记忆类型的肿瘤反应性T淋巴细胞。本发明人推测，阶段i)中的淋巴细胞在肿瘤抗原添加之前被允许再生这一事实，与相对慢的扩增阶段结合在一起，导致形成了记忆淋巴细胞与效应淋巴细胞的高比率。
尤其是，本发明涉及组合物，其包含通过本文参考实施例1中公开的两步法获得的相关T淋巴细胞以及下列一种或多种：VEGF或其受体的中和单克隆抗体、VEGF受体的小分子酪氨酸激酶抑制剂、用作VEGF的假受体的可溶性VEGF受体和特异性靶向VEGF mRNA的核酶。
正如本文前面提到的，可能存在组合物可以是单一组合物的情况，即组合物包含两种活性成分，即肿瘤反应性T淋巴细胞和VEGF抑制剂。在这种情况下，两种活性成分存在于适合于肠胃外或口服给药的组合物中，尤其是在对T淋巴细胞无害(即细胞的特性得以维持并且细胞存活)并且VEGF抑制剂可以溶解或分散在其中的介质中。取决于癌症的具体类型和对治疗的反应，这样的单一组合物可以一次或以较高或较低频率的时间间隔几次给药。一般来说，设想组合物用于一次给药，因此它必须含有有效量的两种活性成分(对于剂量参见下文)。但是，这样的单一组合物要求待治疗的疾病从每种活性成分(分别为T淋巴细胞和VEGF抑制剂)的同时给药获益。
但是，正如本文所述，活性成分的给药一般在时间上分开，因此本发明的组合物一般采用打算同时(或基本上同时)或相继给药、即一种组分在例如0时、另一种组分在较晚的t时给药的两种独立制备物的形式。这样的组合物能够在剂量和给药形式方面有较大变化。因此，免疫治疗组分可以采用用于注射或灌注的肠胃外制备物的形式，而血管形成组分可以采用例如皮下或体腔内(例如阴道、膀胱等)植入的植入物的形式。此外一种组分可以包含在能够每天超过一次给药的形式中。因此，设想了可以进行各种不同组合而不背离本发明的目的。
当前，细胞免疫治疗和抗血管形成治疗都涉及肠胃外给药。但是，由于细胞死亡的风险，目前相信组合物应该储存在独立的制备物中，并且照此给药，或者应该在给药前相对短的时间(高达1小时)将两种制备物混合并给药。但是，不排除其他给药途径，参见下文。
本发明的组合物的给药可以通过本技术领域已知的各种途径来实现，例如肠内、肠胃外、其他肠胃外或局部给药。
肠胃外给药的实例包括但不限于：静脉内(进入静脉)、动脉内(进入动脉)、肌肉内、皮下、骨内灌注、真皮内、鞘内或腹膜内。
肠胃外给药可以通过静脉内、动脉内、肌肉内、鞘内、真皮内、腹膜内、皮下等方式注射或灌注药物组合物来实现。
其他肠胃外给药的实例包括但不限于：透皮、透过粘膜、颊(通过牙床线附近的面颊吸收)、植入物。其他的给药手段可以是但不限于：硬膜外(硬膜外)或玻璃体内。
透皮给药可以通过向皮肤或粘膜等施加、裱糊、滚动、贴附、倾倒、挤压、摩搓透皮制备物等来实现。
局部给药的实例包括但不限于：表皮(施加在皮肤上)、吸入、灌肠、滴眼(在结膜上)、滴耳或阴道。
肠内给药的实例包括但不限于：口服、通过胃饲管、十二指肠饲管、胃造口术或直肠。
口服给药可以通过吞咽、咀嚼、吸吮包含药物及其制剂的口服剂型来实现。口服制剂可以是常规的片剂、胶囊、囊片(caplet)、溶液、悬液、乳液等。
常规的片剂可以是立即或持续释放口服片剂。片剂也可以通过例如应用不同的涂层技术设计成在特定组织释放药物组合物。因此，片剂可以用薄膜或糖涂层，以控制药物释放的速率和位点。
目前，没有设想细胞免疫疗法可以通过例如口服途径提供，但是不能排除例如口或食管中的癌症可以通过口服给药来治疗。局部给药对于例如直肠癌、结肠癌、膀胱癌、皮肤癌等的治疗也是一种选择。
正如上面提到的，目前使用的给药途径是肠胃外。因此，这一方面是重要的。
应该理解，包含本发明的组合物的给药可以通过任何上述给药途径分别给药。当组合物包含具有两种独立组合物的试剂盒，其中一种组合物包含相关T淋巴细胞、一种包含一种或多种VEGF抑制剂时，可以进行给药以便包含相关T细胞的组合物可以肠胃外给药，包含一种或多种VEGF抑制剂的组合物可以肠胃外或通过任何其他相关途径给药，这取决于与目标最适合的给药方法。
本发明涉及包含相关T淋巴细胞和一种或多种针对VEGF的单克隆抗体的组合物，其中单克隆抗体可以是但不限于贝伐单抗(Avastin)、Ab-153、Ab-309、Ab-342(参见Chen J.H.等，Biochemisry and molecular biology international 47(2)：161-9，1999Feb)或兰尼单抗(Lucentis
)。
本发明还涉及含相关T淋巴细胞和一种或多种小分子酪氨酸激酶抑制剂的组合物，其中酪氨酸激酶抑制剂可以是但不限于舒尼替尼(Sutent)、索拉非尼(Nexavar)、阿西替尼和帕唑帕尼、ABT-869、BIBF1120、4-[(4-氟-2-甲基-1H-吲哚-5-基)氧基]-6-甲氧基-7-[3-(吡咯烷-1-基)丙氧基]喹唑啉(西地尼布)、氨基-5-氟-3-[6-(4-甲基-1-哌嗪基)-1H-苯并咪唑-2-基]-2(1H)-喹啉酮(多韦替尼)、3-吡啶甲酰胺、N-(2，3-二氢-3，3-二甲基-1H-吲哚-6-基)-2-[(4-吡啶甲基)氨基]-N-(3，3-二甲基-2，3-二氢-1H-吲哚-6-基)-2-[(吡啶-4-基甲基)氨基]吡啶-3-甲酰胺(莫替沙尼)或[N-(4-溴-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[(1-甲基哌啶-4-基)甲氧基]喹唑啉-4-胺(凡德他尼)或西妥昔单抗，或其任何可药用盐。
本发明的组合物可以包含相关T淋巴细胞和一种或多种特异性靶向VEGF mRNA的核酶，其中核酶可以是但不限于抗Flt-1核酶。一个这样的实例是Angiozyme
(US 6,346,398)。这种情况也包含其他锤头型核酶。
本发明的组合物可以包含在常规化疗中使用的其他药物活性化合物。因此，组合物可以包含但不限于在Avastin疗法中使用的化合物。因此，组合物业可以包含但不限于5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸、奥沙利铂、紫杉醇、多西他赛、福马加林(fumagallin)、蒽环类抗生素例如柔红霉素、多柔比星和表柔比星、喜树碱类药物例如伊立替康和拓扑替康、长春新碱、卡铂、顺铂、环磷酰胺、丝裂霉素C、米托蒽醌、氟尿苷、吉西他滨、甲氨蝶呤、博来霉素、依托泊苷、长春碱、长春地辛、长春瑞滨和染料木素(genistein)。
本发明还涉及在治疗癌症的药物的制造中使用包含相关T淋巴细胞和一种或多种下列物质的组合物：针对VEGF或其受体的中和单克隆/多克隆/重组抗体，VEGF受体的小分子酪氨酸激酶抑制剂，用作VEGF的假受体的可溶性VEGF受体和特异性靶向VEGF mRNA的核酶，以及任选的一种或多种化疗药剂，所述化疗药剂选自但不限于5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸、奥沙利铂、紫杉醇、多西他赛、福马加林(fumagallin)、蒽环类抗生素例如柔红霉素、多柔比星和表柔比星、喜树碱类药物例如伊立替康和拓扑替康、长春新碱、卡铂、顺铂、环磷酰胺、丝裂霉素C、米托蒽醌、氟尿苷、吉西他滨、甲氨蝶呤、博来霉素、依托泊苷、长春碱、长春地辛、长春瑞滨和染料木素。
本发明还涉及在治疗癌症的药物的制造中使用包含相关T淋巴细胞和一种或多种针对VEGF的单克隆抗体的组合物，其中单克隆抗体可以是但不限于贝伐单抗(Avastin
)、Ab-153、Ab-309、Ab-342或兰尼单抗(Lucentis
)。
本发明的组合物可以包含一种或多种附加的药物赋形剂。特别是，免疫治疗组分可以包含适合于维持细胞特性和存活性的介质，它同时适合于注射到哺乳动物(人类)体内(即它必须是安全的)。适合的介质可以是等渗盐水(0.9％w/w氯化钠溶液)，任选添补有血清白蛋白尤其是人类血清白蛋白和/或pH调节剂，例如磷酸盐缓冲剂。
取决于具体的制备物或组合物，赋形剂可以选自例如但不限于
-对于肠胃外给药来说：溶剂包括水和丙二醇、植物油、渗透压调节剂、pH调节剂、无血清介质、细胞营养液或营养剂、人类或人造血清白蛋白、自体血清、可以任选地具有与血液相同渗张度的等渗介质、生理盐水溶液等。
-对于肠内给药来说：抗粘附剂、粘合剂、涂层剂、崩解剂、填料/稀释剂、调味剂和着色剂、pH调节剂、助流剂、润滑剂、防腐剂、吸附剂、甜味剂和改变活性物质的溶解速率的药剂、无血清介质、缓冲剂或溶液、细胞营养液或药剂、pH调节剂、人类或人造血清白蛋白、自体血清、可以任选地具有与血液相同渗张度的等渗介质、生理盐水溶液、防腐剂等。
本发明的组合物可用于治疗任何解剖位置中上皮、间充质或胚胎学来源的任何实体赘生物的治疗，例如对于上皮赘生物来说例如乳腺、结肠、胰腺、膀胱、小肠、前列腺、子宫颈、外阴、卵巢中的癌，对于间充质赘生物来说例如关节、骨骼、肌肉和肌腱中的肉瘤以及一些血液肿瘤例如淋巴瘤，对于胚胎学赘生物来说例如畸胎瘤。更具体的实例包括但不限于结肠直肠癌、转移的结肠直肠癌、乳腺癌、转移的乳腺癌、转移的肾细胞癌、转移的多形性胶质母细胞瘤、转移的卵巢癌、转移的激素抵抗型前列腺癌、不能切除的原位晚期胰腺癌、肾细胞癌、卵巢癌、耐受性小细胞肺癌和肺癌。
本文描述的治疗尤其适合于治疗选自下列的癌症：乳腺、结肠、直肠、胰腺、肝脏、胆囊、胆管、膀胱、小肠、肺、前列腺、肾脏、子宫颈、外阴、卵巢中的癌、恶性黑素瘤、头颈部癌；关节、骨骼、肌肉和肌腱中的肉瘤、淋巴瘤；畸胎瘤；以及转移和原位晚期(不可动手术的)的上述肿瘤。
本发明的组合物可以包含癌症类型特异性CD4+T淋巴细胞，其中至少70％的癌症特异性CD4+T淋巴细胞是Th1类型，30％或以下的癌症特异性CD4+T淋巴细胞是Th2类型，以及一种或多种VEGF抑制剂，和任选的在Avastin
疗法或任何疗法中使用的附加药物活性化合物，所述一种或多种VEGF抑制剂包括VEGF抑制剂例如抗VEGF或其受体的中和单克隆抗体、VEGF受体的小分子酪氨酸激酶抑制剂、用作VEGF的假受体的可溶性VEGF受体和特异性靶向VEGF mRNA的核酶。
本发明的组合物也可以包含其中约35％到约90％是记忆类型的癌症特异性T淋巴细胞，以及一种或多种VEGF-抑制剂，和任选的在Avastin
疗法或任何疗法中使用的附加药物活性化合物，所述一种或多种VEGF抑制剂包括VEGF抑制剂例如抗VEGF或其受体的中和单克隆抗体、VEGF受体的小分子酪氨酸激酶抑制剂、用作VEGF的假受体的可溶性VEGF受体和特异性靶向VEGF mRNA的核酶。
本发明的组合物也可以包含其中约10％到约65％是效应T淋巴细胞的癌症特异性T淋巴细胞，以及一种或多种VEGF-抑制剂，和任选的在Avastin
疗法中使用的附加药物活性化合物。
本发明的组合物也可以包含癌症特异性T淋巴细胞，其中组合物包含至少1百万、至少5百万、至少1千万或至少2千万或至少3千万或至少4千万或至少5千万或至少1亿个癌症特异性T淋巴细胞，以及一种或多种VEGF-抑制剂，和任选的在Avastin
疗法中使用的附加药物活性化合物。细胞的剂量取决于疾病的严重性。此外，由于肿瘤反应性T淋巴细胞短缺，也可以使用较低剂量。
本发明的组合物可以包含的VEGF抑制剂的量为约1mg到约2000mg、或约70mg到约1400mg、或约140mg到约1050mg、或约210mg到约1050mg、或约280mg到约1050mg、或约350mg到约1050mg。
本发明的组合物可以包含的VEGF抑制剂的剂量为约0.1到约50mg/kg体重、或约0.5到约30mg/kg体重、或约1mg/kg到约20mg/kg体重、或约2mg/kg到约15mg/kg体重、或约3mg/kg到约15mg/kg体重、或约4mg/kg到约15mg/kg体重、或约5mg/kg到约15mg/kg体重。
上述数据是常用于Avastin
的剂量，并设想与用于其他VEGF抑制剂的剂量在同一数量级上。但是，本技术领域的专业人员将知晓如何确定正确剂量。此外，设想VEGF抑制剂的剂量可以略微降低，例如约10％或以上、例如约20％或以上、例如约30％或以上、例如约40％或以上、例如约50％或以上、例如约60％或以上、例如约70％或以上、例如约80％或以上。例如，预计降低约10％、从50mg到1250mg的剂量是足够的。
应该理解，本发明的组合物可以是包含治疗有效量的肿瘤反应性T淋巴细胞和治疗有效量的一种或多种VEGF抑制剂的组合物。
应该理解，本发明的组合物可以是包含两种独立制备物的组合物，其中一种制备物包含治疗有效量的肿瘤反应性T淋巴细胞，第二种制备物包含治疗有效量的一种或多种VEGF抑制剂。治疗有效量的一种或多种化疗药剂，如果存在的话，可以包含在另一种独立的制备物中，或者它可以包括在包含一种或多种VEGF抑制剂的制备物中。
应该理解，本发明的组合物可以是包含两种独立组合物的试剂盒，其中一种组合物包含治疗有效量的肿瘤反应性T淋巴细胞，第二种组合物包含治疗有效量的一种或多种VEGF抑制剂。试剂盒可以任选包含化疗药剂作为试剂盒中的独立组合物，或以任何顺序与相关T淋巴细胞或一种或多种VEGF抑制剂组合。
治疗方法
本文前面描述的一种或多种VEGF抑制剂与肿瘤反应性T淋巴细胞的组合，可用于治疗肿瘤来源的疾病。本文描述的关于VEGF抑制剂、T淋巴细胞、组合物、给药途径、剂量等方面的所有详细和具体情况，做适当修正后可适用于本发明的方法的各种情况。
通过本文描述的扩增方法获得的肿瘤反应性T淋巴细胞和一种或多种VEGF抑制剂，可用在治疗患有肿瘤来源疾病的对象或在患有肿瘤的对象中进行肿瘤消减的方法中，所述方法包含向需要的对象给药有效量的本发明的肿瘤反应性T淋巴细胞和有效量的一种或多种VEGF抑制剂。方法可以包含将有效量的本发明的肿瘤反应性T淋巴细胞和有效量的一种或多种VEGF抑制剂作为单一组合物给药，或者可以作为独立的组合物给药，所述独立的组合物向需要的对象的给药可以同时或以任何次序相继进行。方法还包含作为第一种治疗方法给药肿瘤反应性T淋巴细胞，然后进行第二种治疗方法，包括肿瘤反应性T淋巴细胞与一种或多种VEGF抑制剂的组合给药。
本文描述的方法可用于治疗任何解剖位置中上皮、间充质或胚胎学来源的任何实体赘生物，例如对于上皮赘生物来说例如乳腺、结肠、胰腺、膀胱、脑、小肠、前列腺、子宫颈、外阴、卵巢中的癌，对于间充质赘生物来说例如关节、骨骼、肌肉和肌腱中的肉瘤以及一些血液肿瘤例如淋巴瘤，对于胚胎学来源赘生物来说例如畸胎瘤。更具体的实例包括但不限于结肠直肠癌、转移的结肠直肠癌、乳腺癌、转移的乳腺癌、转移的肾细胞癌、转移的多形性胶质母细胞瘤、转移的卵巢癌、转移的激素抵抗型前列腺癌、不能切除的原位晚期胰腺癌、肾细胞癌、卵巢癌、耐受性小细胞肺癌和肺癌。
肿瘤反应性T淋巴细胞的有效量的定义取决于淋巴细胞的具体类型、记忆与效应T淋巴细胞的比例和疾病的严重性。但是，可以给药的平均最小值为至少1百万、至少5百万、至少1千万例如至少2千万、至少3千万、至少4千万、至少5千万、至少6千万、至少7千万、至少8千万或至少1亿个肿瘤反应性T淋巴细胞。本发明没有在以单剂给药的肿瘤反应性T淋巴细胞的量方面鉴定到任何上限。
用于给药的肿瘤反应性T淋巴细胞可以包含效应T淋巴细胞和记忆T淋巴细胞的组合。更具体来说，记忆类型的肿瘤反应性T淋巴细胞的量可以为约35％到约90％，例如约40％到约90％、约50％到约80％或约60％到约70％，效应T淋巴细胞的百分率为约10％到约65％，例如约20％到约50％或约30％到约40％。
VEGF抑制剂的有效量的定义取决于疾病的严重性和类型。但是，正常的给药剂量在1mg/kg到约20mg/kg的范围内，例如2mg/kg到约15mg/kg、例如3mg/kg到约15mg/kg、例如4mg/kg到约15mg/kg、例如5mg/kg到约15mg/kg。
用于给药的肿瘤反应性T淋巴细胞可以包含效应T淋巴细胞和记忆T淋巴细胞的组合。更具体来说，记忆类型的肿瘤反应性T淋巴细胞的量可以为约35％到约90％，例如约40％到约90％、约50％到约80％或约60％到约70％，效应T淋巴细胞的百分率为约10％到约65％，例如约20％到约50％或约30％到约40％，并且一种或多种VEGF抑制剂的剂量为1mg/kg到约20mg/kg，例如2mg/kg到约15mg/kg、例如3mg/kg到约15mg/kg、例如4mg/kg到约15mg/kg、例如5mg/kg到约15mg/kg体重(尤其是降低至少10％，参见上文)。
肿瘤反应性T淋巴细胞和VEGF抑制剂可以配制成适合于肠胃外给药于患者的药物组合物，例如静脉内、动脉内、鞘内或腹膜内给药，或通过采用常规的片剂、胶囊、囊片、溶液、悬液或乳液形式的剂型口服给药。
当肿瘤反应性T淋巴细胞肠胃外给药时，它们可以配制在等渗介质、即具有与血液相同的渗张度并包含一种或多种防止细胞聚集的物质的介质中，并可以包含附加的药物赋形剂。适合的介质的具体实例是含有高达3％人血清白蛋白、例如高达2％人血清白蛋白或高达1％人血清白蛋白的0.9％NaCl溶液。对于静脉内给药来说，待给药组合物中肿瘤反应性T淋巴细胞的浓度一般在约50万淋巴细胞/ml介质到约4百万淋巴细胞/ml介质的范围内，例如从约50万淋巴细胞/ml介质到约3百万淋巴细胞/ml介质、从约50万淋巴细胞/ml介质到约2百万淋巴细胞/ml介质或从约1百万淋巴细胞/ml介质到约2百万淋巴细胞/ml介质。
当VEGF抑制剂肠胃外给药时，它们可以配制在等渗介质、即具有与血液相同渗张度的介质中，并可以包含附加的药物赋形剂。适合的介质的具体实例是含有高达3％人血清白蛋白、例如高达2％人血清白蛋白或高达1％人血清白蛋白的0.9％NaCl溶液。对于静脉内给药来说，待给药组合物中VEGF抑制剂的剂量一般在约1mg/kg到约20mg/kg的范围内，例如2mg/kg到约15mg/kg、例如3mg/kg到约15mg/kg、例如4mg/kg到约15mg/kg、例如5mg/kg到约15mg/kg(尤其是降低至少10％，参见上文)。对于口服或其他给药途径来说，考虑到剂量应该为相同数量级或高达高50％。
包含VEGF抑制剂的组合物可以作为单剂或多剂给药。它可以在1到2小时或以上的时间内灌注。
包含肿瘤反应性T淋巴细胞的组合物可以作为单剂或多剂给药。它可以在1到2小时或以上的时间内灌注。
本发明的组合物可以配制成单一组合物，其包含肿瘤反应性T淋巴细胞和一种或多种VEGF抑制剂作为单一组合物，或作为两种独立组合物组合使用(同时或以任何次序顺序地)，其中一种组合物包含肿瘤反应性T淋巴细胞，另一种组合物包含一种或多种VEGF-抑制剂。
取决于疾病的严重性，治疗可以执行一次或重复执行。此外，可以在疾病复发后、或以根据待治疗的疾病的严重性或特点所认为需要的任何时间间隔重复进行治疗。
本发明的治疗可以用任何其他相关的癌症疗法进行补充。这样的补充疗法可以在淋巴细胞和一种或多种VEGF-抑制剂给药之前、同时或之后提供，并且可以正常用于该治疗的频率提供。补充疗法的适合的实例是化疗等。化疗药剂可以包括但不限于5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸、奥沙利铂、紫杉醇、多西他赛、福马加林(fumagallin)、蒽环类抗生素例如柔红霉素、多柔比星和表柔比星、喜树碱类药物例如伊立替康和拓扑替康、长春新碱、卡铂、顺铂、环磷酰胺、丝裂霉素C、米托蒽醌、氟尿苷、吉西他滨、甲氨蝶呤、博来霉素、依托泊苷、长春碱、长春地辛、长春瑞滨和染料木素。
上述组合物的给药可以采用试剂盒的形式，其中试剂盒可以是单一组合物或两种或三种单一组合物的试剂盒。不同单一组合物可以同时或以任何次序以任何时间间隔给药。试剂盒成分的给药可以任何次序独立地口服或者肠胃外给药。
正如在本文实施例中所证实的，组合疗法可以及时替换并仍能获得出色结果。因此，组合疗法可以一开始进行
i)肿瘤反应性T淋巴细胞的给药，然后进行
ii)VEGF抑制剂任选地与化疗鸡尾酒混合物(一种或多种化疗药剂，例如在结肠癌的治疗中5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸和奥沙利铂或伊立替康的组合)组合给药；这种方式一般按照传统上适用于这种组合的流程进行，即在给药频率和剂量方面。
两种给药方式可以在至少15天、尤其是1-90天例如15-60天、包括30天或1个月的时间内变换。
下面描述两种不同的优选步骤，其中可以实现两种不同作用方式。
优选程序1：在前哨淋巴结收获之前约4周通过灌注进行化疗。化疗按照相关药物的足够剂量和程序来进行。程序的该化疗步骤是任选的。
在收获后约另外四周后，对前哨或Metinel淋巴结获得的淋巴细胞(SNAL或MNAL)进行给药。SNAL或MNAL的最适剂量是未知的，但是从灌注五千万淋巴细胞已经观察到效果。最适剂量可能更高，因为据信效果与灌注的SNAL或MNAL的数量相关。患者已经耐受超过十亿个淋巴细胞的灌注。淋巴细胞灌注程序的近似时间是1小时。
在约另外三周后，按照相关药物的足够剂量通过灌注给药VEGF抑制剂。
在该治疗方式中，据信VEGF抑制剂可以因子血管炎性的增加，从而引起肿瘤反应性SNAL或MNAL的召集/归巢的增加。
优选程序2：在前哨或Metinel淋巴结收获前约三周，给药VEGF抑制剂。如上所述，在收获后约4周，给药SNAL或MNAL。两种药物的剂量等如上所述。
在该治疗方式中，不进行化疗。
由于增加肿瘤细胞死亡，这种治疗方式的作用方式预期增加收获的SNAL或MNAL的数量，从而增加了前哨或Metinel淋巴结中的抗原呈递。
正如前面提到的，也可以包含化疗鸡尾酒混合物(其性质取决于待治疗的具体癌症)。
作为后续疗法，可以提供i)和ii)两者，或可以仅仅给药i)和ii)之一。当在起始ii)后30天提供i)时，获得了出色结果。
或者，组合疗法可以一开始进行
i)VEGF抑制剂任选地与化疗鸡尾酒混合物(一种或多种化疗药剂，例如在结肠癌的治疗中5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸和奥沙利铂或伊立替康的组合)组合给药；这种方式一般按照传统上适用于这种组合的流程进行，即在给药频率和剂量方面，然后进行
ii)肿瘤反应性T淋巴细胞的给药。
两种给药方式可以在至少15天、尤其是1-90天例如15-60天、包括30天或1个月的时间内变换。
作为后续疗法，可以提供i)和ii)两者，或可以仅仅给药i)和ii)之一。
附图说明
图1显示了前哨淋巴结是针对肿瘤抗原的T细胞反应性的呈递和活化的天然原初位点。
图2显示了前哨淋巴结淋巴细胞最初被肿瘤抗原和低剂量IL-2活化，导致活化标志物CD25的活化和表达(上图)。阶段I活化阶段的结束由表达CD25的CD4+T细胞数量的减少所定义(下图)。当低于5％的CD4+T细胞表达CD25时，使用抗原重新刺激来起始阶段II。
图3显示阶段I和阶段II的活化导致CD4+T辅助细胞的扩增和富集。
图4显示了在阶段I中，大部分细胞是未接触过抗原的CD62L+细胞或活化的CD69+CD62L+细胞。在阶段II后，大部分细胞是CD62L-，并由记忆和效应CD4+T辅助细胞构成。CD62L-T细胞不表达优选的淋巴结归巢分子，因此它们寻找非淋巴器官中的炎性区域。
图5显示了阶段I中来自肿瘤(肿瘤浸润性淋巴细胞)、前哨淋巴结(SN)和无关淋巴结(LN)的受到刺激的初级细胞产生不少IFN-γ。
图6显示在阶段ii)扩增后，出现抗原依赖性IFN-γ生产的剂量依赖性增加。
图7显示扩增和活化流程促进了抗原特异性T细胞克隆的扩增，正如通过TCR Vβ表达的选择性富集所研究的。
实施例
参考实施例1
肿瘤反应性T淋巴细胞的扩增
手术前，使用前哨淋巴结技术进行前哨淋巴结的鉴定。简单来说，将1ml专利蓝染料(Patent blue dye)注射(Guerbet，Paris)并表面分布在肿瘤周围的浆膜中。在5到10分钟内，1到3个肠系膜淋巴结被染成蓝色，将这些前哨淋巴结用缝合线标记并取出(参见图1)。一个远离肿瘤的非前哨淋巴结也被鉴定并取下作为对照。
将前哨和非前哨淋巴结对剖，从中心和周围获取1mm厚切片。将剩余淋巴结送去按照标准程序进行组织病理学检查。出于研究目的，也取下一部分肿瘤、包括侵入性边缘的样品。
细胞培养
阶段I，初始活化
将前哨淋巴结材料保持在冰上，并在所有时间内立即使用AIM V
培养基(Invitrogen)照管。通过在松散装配的玻璃匀浆器中轻柔匀浆，获得前哨淋巴结淋巴细胞的单细胞悬液，然后将匀浆的细胞在培养基中清洗两次。将前哨淋巴结淋巴细胞以4百万个细胞/ml的浓度置于细胞培养瓶中，并加入白介素2(IL-2)(Proleukin
Chiron)至浓度为240IU/ml培养基。
通过使用Ultra Turrax在5倍体积(w/v)的2x PBS中匀浆制备自体肿瘤提取物，然后在97℃下变性5分钟。在开始细胞培养后3到4天，以1/100的浓度加入自体肿瘤提取物。对于长期培养来说，将细胞保持在37℃和5％CO2的细胞培养箱中，每3-4天加入240IU IL-2/mL培养基。
阶段II，活化和扩增
18-22天后，监测细胞培养物的CD25表达。当表达CD25的细胞数量减少到低于5％时，通过加入浓度为1/100的自体抗原提取物在阶段II中重新刺激细胞(图2)。为了有效的抗原呈递，使用Ficoll-Paque PLUS(Amersham Biosciences，GE Healthcare)收集自体PBMC，用2500rad进行辐照，并添加到细胞培养物中。重新刺激后三天，加入浓度为100-500IU/ml的干扰素-α(Introna)和抗IL-4抗体至浓度为2μg/ml。5到8天后，向扩增物添加IL-12(4ng/ml)，以便促进产IFN-γ的Th1细胞的诱导。
在向患者输液的前一天，使用Ficoll-Paque PLUS(Amersham Biosciences，GE Healthcare)对细胞培养物进行纯化，以便回收培养物中的活细胞。在输液当天，将细胞在盐水溶液(氯化钠Baxter，Viaflo 9mg/ml，Baxter)中洗涤两次，然后转移到含有100-200ml盐水溶液和1％人血清白蛋白(Baxter)的输液袋中。在输液之前进行微生物存在的调查。细胞的输液在专业医学监督下在1-2小时内进行。
免疫评估
进一步的免疫评估使用氚标记的胸苷掺入增殖分析法进行。为此目的，留出前哨淋巴结淋巴细胞的等份试样，通过在松散装配的玻璃匀浆器中轻柔挤压来获得无前哨淋巴结淋巴细胞的单细胞悬液，并通过Ficoll-Paque PLUS(Amersham Biosciences，GE Healthcare)纯化外周血单核细胞。
将细胞在含有2.5％胎牛血清(FCS)(Life technologies)的RPMI1640(Life technologies)中重悬浮并洗涤两次。最后，将细胞重悬浮在含有10％人类AB血清(Sigma)、1％青霉素-链霉素(Sigma)和1％谷氨酰胺(Sigma)的RPMI 1640增殖培养基中。淋巴结细胞和纯化的PBL以3x105个细胞/孔的量使用在96孔板中，并用1/100、1/10稀释的肿瘤匀浆液或10μg/ml Con A(Sigma)刺激，一式三份。在第5、6和7天通过在收获前18小时加入1μCi3H-胸腺嘧啶/孔(Amersham)来测量增殖。对样品进行闪烁计数。
在细胞培养开始时，为了测量IFN-γ的分泌，使用1/10和1/100稀释的肿瘤匀浆液或10μg/ml Con A(Sigma)在96孔板中进行淋巴结细胞和PBL的刺激，一式三份。分泌的IFN-γ量在三份平行样的合并样品中的培养上清液中使用ELISA(人类IFN-γDuoset，R&D Systems)进行测量(图5)。在细胞培养结束时，取出上清液样品，在三份平行样中使用ELISA(人类IFN-γDuoset和人类IL-4 Duoset，R&D Systems)测量IFN-γ和IL-4的分泌(图6A和6B)。
流式细胞术分析
首先使用流式细胞术对来自前哨淋巴结、非前哨淋巴结、PBMC和来自肿瘤的细胞进行细胞性质研究。每2到3周从培养物样品中获取前哨淋巴结获得性淋巴细胞用于流式细胞术分析。将细胞在添加有2％FCS和0.05％NaN3的PBS(FACS)缓冲液中，与针对免疫细胞亚群和用于淋巴细胞活化的标记物的抗体温育(图3、4和5)。使用了针对下列标志物的与荧光素异硫氰酸酯(FITC)偶联的抗体：CD69、HLA-DR、CD45RA、CD25，针对下列标志物的与藻红蛋白(PE)偶联的抗体：CD62L、CD19、CD45RO、CD56，针对下列标志物的与多甲藻素-叶绿素-蛋白(PerCP)偶联的抗体：CD8、CD3，针对下列标志物的与别藻蓝素(APC)偶联的抗体：CD4、CD14、CD8。
使用β标记试剂盒(Beckman Coulter)检测Vβ-全部组成成分，将5x105个细胞/管在10μl的8种不同玻璃管中染色，每个玻璃管包含FITC、PE和双色FITC-PE偶联的TCR Vβ抗体，并向每个管添加CD8 PerCP和CD4 APC(图7)。
参考实施例2
通过给药肿瘤反应性T淋巴细胞治疗结肠癌
从结肠癌患者鉴定并取出前哨和metinel淋巴结
研究了16位被诊断有结肠癌的患者，6位女性和10位男性，平均年龄62岁。患者在组织病理学上分类为Duke′s C或D。也有5位患者患有Duke′s B，具有侵袭性肿瘤特征例如溃疡、血管或围神经侵入。但是，7号和14号患者在较早时间由于结肠癌进行了手术治疗，现在患有转移到肝脏的复发疾病。当地伦理委员会批准了本研究，每位患者提供了书面知情同意书。
前哨或Metinel淋巴结的鉴定在手术过程中进行。通过分开腹膜粘连使结肠肿瘤位点松动，以便于检查肿瘤和肠系膜。专利蓝染料(Patent blue dye)(Guerbet，Paris)的注入表面分布于肿瘤周围的浆膜中。在5分钟内，1到3个肠系膜淋巴结被染成蓝色，将这些前哨淋巴结用缝合线标记，并在切除术完成时取出。一个远离肿瘤的非前哨肠系膜淋巴结也以同样方式操作。
将前哨和非前哨淋巴结对剖，从中心和周围获取1mm厚切片。将剩余淋巴结送去按照常规程序进行组织病理学检查。也取下一片肿瘤、包括侵入性边缘部分，用于抗原制备。
然后将从淋巴结获得的淋巴细胞按照参考实施例1中的描述进行扩增。
肿瘤反应性T淋巴细胞的给药
通过灌注按照实施例1中所述扩增的自体淋巴细胞，对16位患者进行治疗。作为输液给药了平均7470万个活化和克隆扩增的T细胞。没有观察到毒性副作用例如发烧、寒战、不适、严重体液潴留、肺水肿或呼吸窘迫。
追踪评估
追踪包括每第3到第6个月进行临床检查并控制CEA水平。所有III级和IV级患者还使用胸腹部计算机断层扫描术进行附加检查。患者平均被跟踪36个月(在6-51个月范围内)，并按照瑞典结肠直肠癌追踪方案(Swedish colorectal cancer follow-up protocol)进行监测。在使用自体淋巴细胞灌注进行治疗的16位患者中，8位在诊断时具有已知的远处转移。四位患者由于已知的复发而接受输液，其中三位仍没有复发迹象。一位患者由于单生肝脏转移而进行手术，并从那时起尚未复发。一位具有位于两叶中的肝脏转移肿瘤的患者(已被宣布不能通过肝脏手术治愈)，在输入肿瘤反应性淋巴细胞后肝脏转移肿瘤完全减退，并且CEA水平变为正常、腹水消失、身体健康并定期锻炼。另一位具有肝脏转移肿瘤的患者在输液后肝脏转移肿瘤和腹水减退。一位患者在输液后3个月肝脏和肺脏的转移肿瘤消退、具有5.9的几乎正常的CEA水平(正常值＜4.0)、腹水消失，并且他在临床上表现为健康。
结果
16位患有结肠癌或单生的结肠直肠肝脏转移肿瘤的患者在南斯德哥尔摩综合医院(South Stockholm General Hospital)进行手术，并包含在研究中。肿瘤的原发位点有3位在盲肠、4位在升结肠、1位在降结肠、7位在乙状结肠、1位在直肠中。进行了7例右侧结肠部分切除术、1例左侧结肠部分切除术、7例乙状结肠切除和1例直肠切断术。两位患者早些时候已进行直肠切断术和乙状结肠切除；他们现在由于肝脏转移肿瘤而经历部分肝脏切除。一位患者在两个腹部位置复发，并在早些时候由于直肠中的肿瘤而进行过手术。在我们的手术中，鉴定了两个从转移肿瘤引出的前哨淋巴结，一个在结肠肠系膜中，一个在小肠肠系膜中。进行了回肠结肠与肠系膜联合区的扩展切除。
在所有患者中，通过在肿瘤周围注射专利蓝，在手术中鉴定到1到3个(平均2.1个)前哨淋巴结。在进行初次结肠切除的患者中，从每个样本回收到平均15.8个淋巴结。在这些淋巴结的组织病理学研究后，5位患者被分类为Duke′s C，5位患者为Duke′s B，由于在病理解剖调查中肿瘤细胞沿着神经并在血管中生长，它们全都被分类为高风险肿瘤。5位患者具有远处转移肿瘤，并且在转移肿瘤切除时被分类为Duke′s D。它们中的两位患者具有单生肝脏转移肿瘤。此外，也通过FACS(荧光活化的细胞分拣)和针对由结肠癌肿瘤表达的细胞角蛋白20的抗体对前哨淋巴结进行分析，以检测微型转移肿瘤。通过流式细胞术进行的淋巴结的细胞角蛋白20的评估与病理解剖诊断相一致(未显示)，除了在一个病例中假阴性前哨淋巴结(根据组织病理学分析)在细胞角蛋白20FACS分析中是阳性的。
前哨淋巴结是引流肿瘤的第一个淋巴结，因此是淋巴结转移肿瘤的第一个位点(Dahl等，Eur.J.Surgical Oncology，2005，31，381-385)，但是前哨淋巴结也是免疫系统活化的最初位点。肿瘤细胞、碎片、坏死的细胞和抗原呈递细胞积累在前哨淋巴结中，在那里发生针对肿瘤的T细胞的呈递、活化和克隆扩增。本发明人利用了该前哨淋巴结获得性淋巴细胞的体内扩增T细胞群进行体外细胞培养、扩增和灌输。
前哨淋巴结获得性淋巴细胞是针对肿瘤抗原而活化和克隆扩增的T细胞群，其能够在外科手术过程中有效地收获。与近来聚焦于细胞毒性T细胞的免疫治疗试验相反，本发明人的目的是产生用于体内引发的T辅助细胞克隆扩增的体外增强的方法流程。T辅助细胞对于细胞毒性T细胞的有效功能和记忆细胞的产生似乎是必需的。此外，在靶向胰岛细胞抗原的T细胞受体转基因系统中，发现Th1细胞的灌输对于β-细胞破坏和糖尿病的发生是足够的。前哨淋巴结获得性淋巴细胞的体外培养物导致Th1活化和T辅助细胞的克隆扩增，正如由标志性的Th1细胞因子IFN-γ的优势生产和限制性TCR Vβ全部组成成分的富集所表明的。用于扩增T细胞的肿瘤匀浆物可能被II类呈递的抗原呈递细胞内吞并加工，导致CD4+T辅助细胞的活化，引起有利T辅助细胞的扩增。通过交换，由胞吞作用摄取的呈递抗原可以被加工并呈递在I类袋囊中，引起CD8+细胞毒性T细胞的活化。有趣的是，在某些情况下，发明人发现CD4+和CD8+T细胞两者的克隆扩增。
在扩增开始时，前哨淋巴结获得性淋巴细胞的平均数量是1.074亿个细胞(在360万-5.09亿之间，中值为7千万)。细胞通过流式细胞术表征。在开始时，CD4+和CD8+细胞的比率平均为4.9(在0.36-10之间，中值为5.4)，与外周血中CD4/CD8的比率(正常范围为1.0-2.5)相比，表明在前哨淋巴结中CD4+T辅助细胞的扩增(图2A)。此外，B淋巴细胞(CD 19)和自然杀伤(NK)细胞(CD 56)存在于前哨淋巴结中(未显示)。细胞在培养中保持平均36.1天(范围为23-58天)，中值为33天。至少每周通过流式细胞术对细胞进行密切监测。开始时，细胞总数降低。B细胞和NK细胞几乎完全消失，并且CD8+T杀伤细胞的数量减少。使用的培养步骤主要促进T辅助细胞的扩增，因为CD4/CD8的平均比率是92.5。用自体肿瘤抗原重新刺激导致肿瘤反应性T细胞的克隆扩增，正如在体外培养之前和之后通过调查前哨淋巴结获得性淋巴细胞的T细胞受体Vβ全部组成成分所评估的。
在灌输之前，通过测量活化和Th1细胞因子IFN-γ与Th2细胞因子IL-4的细胞因子产生，针对自体肿瘤抗原对扩增的T细胞进行功能测试。体外扩增的前哨淋巴结获得性淋巴细胞在用肿瘤抗原重新刺激后做出响应，产生IFN-γ以及没有或非常少的IL-4，表明扩增的T细胞是有功能的和Th1反应性的。
在本研究中对6位Duke′s D患者进行治疗。两位在手术时被定为Duke′s D阶段、分别具有转移到肝脏和肺脏与肝脏的肿瘤的患者，显示出疾病的明显减退(患者5和12)。在灌输淋巴细胞后，第一位患者具有位于两叶中的肝脏转移肿瘤(其已被宣布不能通过肝脏手术治愈)的完全消退(图3)、正常的CEA水平、腹水的消失，并表现出健康。患者12显示出肝脏和肺脏中的转移肿瘤的减退，并伴有5.9的几乎正常的CEA水平(正常值＜4.0)、腹水的消失，并且他表现出临床健康。患者1显示出肝脏转移肿瘤的尺寸减小，并在开始时CEA水平降低、腹水消失，并且当她似乎由于肺栓塞突然死亡时(第191天)体型极好。两位Duke′s D患者表现出疾病稳定，转移肿瘤没有发展、CEA水平也没有增加。研究中最老的7号患者显示出5个月的疾病稳定，但是随后CEA水平开始增加，她在83岁时死亡。没有进行尸体剖检。一位患者在手术是被分为Duke′s C阶段，但是不久后发生向肝脏和肺脏的肿瘤转移(Duke′s D)，但是在灌输和化疗后，观察到肺部和肝脏转移肿瘤的减退，并仅具有略微升高的CEA水平。被分类为Duke′s C的患者都具有正常的CEA水平，并且没有表现出疾病的放射学或临床复发的任何迹象。被分类为Duke′s C的4位患者都健康，具有正常的CEA水平，并且没有疾病复发的迹象。9号患者被分类为Duke′s B，但是具有侵袭性生长的肿瘤，显示出疾病复发的迹象并具有升高的CEA水平(67)和肝脏转移肿瘤的迹象。
为了研究被灌输的T细胞的命运，本发明人分析了外周血中针对肿瘤提取物的T细胞增殖。正如前面提到的，他们能够在灌输前的任何患者中证明外周血中T细胞针对自体肿瘤抗原的任何反应性。但是，我们能够在所有调查的患者中在长达灌输后42个月内检测到外周血中针对自体肿瘤抗原的T细胞增殖，表明存在克隆增殖的循环的肿瘤反应性T细胞。
患者特征的概述
下面是本研究的所有参加者的表，在手术中Duke′s分类后分组：SD＝稳定的疾病，CR＝完全响应
参加者特征
a)数量表示使用FACS检测到的CD4和CD8阳性细胞的百分数。
实施例1
通过给药肿瘤反应性T淋巴细胞和Avastin
治疗弥散性结肠癌
患者是35岁的女性，患有直肠癌和多发性肝脏转移肿瘤。她首先进行直肠切除手术，鉴定并收获引流原发肿瘤的前哨淋巴结。按照以前描述的方法(参见上文)扩增肿瘤反应性T细胞。她在手术后一个月接受细胞疗法(灌输肿瘤反应性T细胞)。在又一个月后，她的临床状况良好，CT扫描显示肝脏中疾病稳定，没有其他转移肿瘤。在那时，她开始用常规的(标准化的)5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸、奥沙利铂和贝伐单抗(Avastin
)的组合进行治疗。在另外约一个月后，她接受了一次附加的基于从她自己的外周血收集的肿瘤反应性T细胞的扩增的肿瘤反应性T细胞灌输。正如每个月的CT扫描所看见的，转移肿瘤继续消退。在6个月后，似乎在肝脏中只剩余几个坏死。为了消除任何活的肿瘤，对肝脏中剩余的浓密区域进行手术切除。组织病理性检查证实在样本中仅存在坏死组织，没有肿瘤细胞。在第一次手术后18个月的最近一次跟踪随访时，根据腹部/胸部CT扫描和外周血中的肿瘤标志物的正常值，患者完全没有疾病。
实施例2
通过给药Avastin
和肿瘤反应性T淋巴细胞治疗弥散性结肠癌
32岁的年轻男性，被诊断患有结肠癌并具有腹膜内转移肿瘤。患者经历了结肠切除和腹膜切开术，并在手术中组合化疗药剂治疗。两年后复发，首先用5-氟尿嘧啶+甲酰四氢叶酸+奥沙利铂+贝伐单抗(Avastin
)进行治疗。跟踪CT扫描显示出剩余的发展的腹内疾病以及外周血中肿瘤标志物的升高。在这时，患者进行了切除转移肿瘤包括右部结肠的手术，并鉴定了引流转移肿瘤的淋巴结(Metinel淋巴结)。根据以前的方法(本文中所述)进行了肿瘤反应性T细胞的扩增。在最后一次手术后一个月，患者进行了第一次肿瘤反应性T细胞灌输。根据CT扫描和肿瘤标志物的降低，疾病减退。患者还进行了另一次肿瘤反应性T细胞的灌输。目前，他健康状况良好、全时工作，从第一次T细胞灌输后已有两年。
Claims (56)
1.一种组合物，其包含：
a)一种或多种VEGF抑制剂，以及
b)肿瘤反应性CD4+T辅助细胞和/或CD8+T淋巴细胞。
2.权利要求1的组合物，其中CD4+T辅助细胞和/或CD8+反应性T淋巴细胞通过下述方法获得：
用肿瘤来源的抗原连同至少一种对IL-2受体具有激动活性的物质刺激肿瘤反应性CD4+T辅助细胞和/或CD8+T淋巴细胞，以促进肿瘤反应性CD4+T辅助细胞和/或CD8+T淋巴细胞的存活；以及
活化并促进肿瘤反应性CD4+T辅助细胞和/或CD8+T淋巴细胞的生长，其中当CD25细胞表面标志物(或IL-2R标志物)在CD4+T辅助细胞和/或CD8+T淋巴细胞上被下调时启动第二阶段ii)。
3.权利要求1-2任一项的组合物，其中VEGF抑制剂选自抗VEGF或其受体的中和单克隆抗体、VEGF受体的小分子酪氨酸激酶抑制剂、用作VEGF的假受体的可溶性VEGF受体和特异性靶向VEGF mRNA的核酶或其组合。
4.权利要求3的组合物，其中抗VEGF的中和单克隆抗体是贝伐单抗(Avastin
)。
5.权利要求3的组合物，其中抗VEGF的中和单克隆抗体是兰尼单抗(Lucentis)。
6.权利要求3的组合物，其中抗VEGF的中和单克隆抗体选自Ab-153、Ab-309、Ab-342。
7.权利要求3的组合物，其中VEGF受体的酪氨酸激酶抑制剂选自舒尼替尼(Sutent
)、索拉非尼(Nexavar
)、N-甲基-2-[[3-[(E)-2-吡啶-2-基乙烯基]-1H-吲唑-6-基]硫烷基]苯甲酰胺(Axitinib
)和5-[[4-[(2，3-二甲基-2H-吲唑-6-基)(甲基)氨基]嘧啶-2-基]氨基]-2-甲基苯磺酰胺(Pazopanib
)。
8.权利要求3的组合物，其中特异性靶向VEGF mRNA的核酶是锤头型核酶。
9.权利要求8的组合物，其中锤头型核酶选自抗Flt-1核酶。
10.权利要求9的组合物，其中抗Flt-1核酶是Angiozyme。
11.前述权利要求任一项的组合物，其包含癌症类型特异性CD4+T淋巴细胞，其中至少70％的癌症特异性CD4+T淋巴细胞是Th1型，30％或低于30％的癌症特异性CD4+T淋巴细胞是Th2型。
12.前述权利要求任一项的组合物，其包含癌症特异性T淋巴细胞，其中约35％至约90％是记忆型的。
13.权利要求1-11任一项的组合物，其包含癌症特异性T淋巴细胞，其中约10％至约65％是效应T淋巴细胞。
14.权利要求11-13任一项的组合物，其包含癌症特异性T淋巴细胞，其中组合物包含至少1千万或至少2千万或至少3千万或至少4千万或至少5千万或至少1亿个肿瘤反应性T淋巴细胞。
15.前述权利要求任一项的组合物，其中VEGF抑制剂的量为约1mg至约2000mg、或约70mg至约1400mg、或约140mg至约1050mg、或约210mg至约1050mg、或约280mg至约1050mg、或约350mg至约1050mg。
16.前述权利要求任一项的组合物，其中组合物是包含治疗有效量的肿瘤反应性T淋巴细胞和治疗有效量的一种或多种VEGF抑制剂的单一组合物。
17.前述权利要求任一项的组合物，其包含两种独立的制备物，其中一个制备物包含治疗有效量的肿瘤反应性T淋巴细胞，第二个制备物包含治疗有效量的一种或多种VEGF抑制剂。
18.前述权利要求任一项的组合物，其还包含化疗药剂，所述化疗药剂选自5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸、奥沙利铂、紫杉醇、多西他赛、福马加林、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊立替康、拓扑替康、长春新碱、卡铂、顺铂、环磷酰胺、丝裂霉素C、米托蒽醌、氟尿苷、吉西他滨、甲氨蝶呤、博来霉素、依托泊苷、长春碱、长春地辛、长春瑞滨、染料木素或其组合。
19.权利要求18的组合物，其中组合物包含含有治疗有效量的肿瘤反应性T淋巴细胞的制备物和包含治疗有效量的一种或多种VEGF抑制剂的制备物，以及任选的，包含治疗有效量的一种或多种化疗药剂的制备物。
20.权利要求18的组合物，其中组合物是两种独立组合物的试剂盒，其以任意组合包含治疗有效量的肿瘤反应性T淋巴细胞和治疗有效量的一种或多种VEGF抑制剂以及任选的治疗有效量的化疗药剂，或组合物是包含3种独立组合物的试剂盒，其中一种组合物包含治疗有效量的肿瘤反应性T淋巴细胞，第二种组合物包含治疗有效量的一种或多种VEGF抑制剂，第三种组合物包含治疗有效量的一种或多种化疗药剂。
21.前述权利要求任一项的组合物，其中组合物还包含可药用赋形剂，所述赋形剂选自抗粘附剂、粘合剂、涂层剂、崩解剂、填料/稀释剂、调味剂和着色剂、pH调节剂、助流剂、润滑剂、防腐剂、吸附剂、甜味剂和改变活性物质的溶解速率的材料、无血清介质、缓冲剂或溶液、细胞营养液或营养剂、人类或人造血清白蛋白、自体血清、能任选地具有与血液相同渗张度的等渗介质、生理盐水溶液、防腐剂或其组合。
22.前述权利要求任一项中限定的一种或多种VEGF抑制剂和肿瘤反应性CD4+T辅助细胞和/或CD8+T淋巴细胞在制造用于治疗癌症的药物中的应用。
23.权利要求22的应用，其中癌症选自乳腺、结肠、直肠、胰腺、肝脏、胆囊、胆管、膀胱、脑、小肠、肺、前列腺、肾脏、子宫颈、外阴、卵巢中的癌，恶性黑素瘤，头颈部癌；关节、骨骼、肌肉和肌腱中的肉瘤，淋巴瘤；畸胎瘤；以及转移和原位晚期(不可动手术的)的上述肿瘤。
24.权利要求22的应用，其中药物是单一组合物或包含两种或三种独立制备物的试剂盒，其中一种制备物包含肿瘤反应性T淋巴细胞，另一种制备物包含一种或多种VEGF抑制剂，以及其它制备物包含一种或多种化疗药剂，所述化疗药剂任选与任意的两种前面提到的组合物组合在单一组合物中。
25.权利要求24的应用，其中试剂盒的制备物可以同时或以任意次序顺序给药。
26.权利要求25的应用，其中至少一种制备物打算用于肠胃外或口服给药。
27.权利要求26的应用，其中肠胃外给药可以是静脉内、动脉内、鞘内或腹膜内给药。
28.权利要求26的应用，其中口服制备物可以是常规的片剂、胶囊、囊片、溶液、悬液、乳液。
29.权利要求25-28任一项的应用，其中试剂盒中的组合物可以任意次序独立地肠胃外或口服给药。
30.一种用于治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括向患者给药肿瘤反应性CD4+T辅助细胞和/或CD8+T淋巴细胞和一种或多种VEGF抑制剂以及任选的一种或多种化疗药剂，并且其中肿瘤反应性T淋巴细胞。
31.权利要求30的方法，其中CD4+T辅助细胞和/或CD8+反应性T淋巴细胞通过下述方法获得：
用肿瘤来源的抗原连同至少一种对IL-2受体具有激动活性的物质刺激肿瘤反应性CD4+T辅助细胞和/或CD8+T淋巴细胞，以促进肿瘤反应性CD4+T辅助细胞和/或CD8+T淋巴细胞的存活；以及
活化并促进肿瘤反应性CD4+T辅助细胞和/或CD8+T淋巴细胞的生长，其中当CD25细胞表面标志物(或IL-2R标志物)在CD4+T辅助细胞和/或CD8+T淋巴细胞上被下调时启动第二阶段ii)。
32.权利要求30的方法，其中VEGF抑制剂选自抗VEGF或其受体的中和单克隆抗体、VEGF受体的小分子酪氨酸激酶抑制剂、用作VEGF的假受体的可溶性VEGF受体和特异性靶向VEGF mRNA的核酶或其组合。
33.权利要求32的方法，其中抗VEGF的中和单克隆抗体是贝伐单抗(Avastin)。
34.权利要求32的方法，其中抗VEGF的中和单克隆抗体是兰尼单抗(Lucentis)。
35.权利要求32的方法，其中抗VEGF的中和单克隆抗体选自Ab-153、Ab-309、Ab-342。
36.权利要求32的方法，其中VEGF受体的酪氨酸激酶抑制剂选自舒尼替尼(Sutent
)、索拉非尼(Nexavar)、N-甲基-2-[[3-[(E)-2-吡啶-2-基乙烯基]-1H-吲唑-6-基]硫烷基]苯甲酰胺(Axitinib)和5-[[4-[(2，3-二甲基-2H-吲唑-6-基)(甲基)氨基]嘧啶-2-基]氨基]-2-甲基苯磺酰胺(Pazopanib
)。
37.权利要求32的方法，其中特异性靶向VEGF mRNA的核酶是锤头型核酶。
38.权利要求37的方法，其中锤头型核酶选自抗Flt-1核酶。
39.权利要求38的方法，其中抗Flt-1核酶是Angiozyme
。
40.权利要求30-39任一项的方法，其包含给药癌症类型特异性CD4+T淋巴细胞，其中至少70％的癌症特异性CD4+T淋巴细胞是Th1型，30％或以下的癌症特异性CD4+T淋巴细胞是Th2型。
41.权利要求30-39任一项的方法，其包含给药癌症特异性T淋巴细胞，其中约35％至约90％是记忆型。
42.权利要求30-39任一项的方法，其包含给药癌症特异性T淋巴细胞，其中约10％到约65％是效应T淋巴细胞。
43.权利要求30-42任一项的方法，其包含给药含有治疗有效量肿瘤反应性T淋巴细胞和治疗有效量的一种或多种VEGF抑制剂的组合物。
44.权利要求30-42任一项的方法，其包含给药两种独立的制备物，其中一种制备物包含治疗有效量的肿瘤反应性T淋巴细胞，第二种制备物包含治疗有效量的一种或多种VEGF抑制剂。
45.权利要求30-44任一项的方法，其任选还包含化疗药剂，所述化疗药剂选自5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸、奥沙利铂、紫杉醇、多西他赛、福马加林、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊立替康、拓扑替康、长春新碱、卡铂、顺铂、环磷酰胺、丝裂霉素C、米托蒽醌、氟尿苷、吉西他滨、甲氨蝶呤、博来霉素、依托泊苷、长春碱、长春地辛、长春瑞滨、染料木素或其组合。
46.权利要求30-42任一项的方法，其中给药的是包含治疗有效量的肿瘤反应性T淋巴细胞和治疗有效量的一种或多种VEGF抑制剂以及治疗有效量的一种或多种化疗药剂的组合物。
47.权利要求30-42任一项的方法，其中给药的组合物是两种独立组合物的试剂盒，其以任意组合包含治疗有效量的肿瘤反应性T淋巴细胞和治疗有效量的一种或多种VEGF抑制剂以及任选的治疗有效量的化疗药剂，或组合物是包含三种独立组合物的试剂盒，其中一种组合物包含治疗有效量的肿瘤反应性T淋巴细胞，第二种组合物包含治疗有效量的一种或多种VEGF抑制剂，第三种组合物包含治疗有效量的一种或多种化疗药剂。
48.权利要求30-47任一项的方法，其包含给药至少1千万或至少2千万或至少3千万或至少4千万或至少5千万或至少1亿个肿瘤反应性T淋巴细胞的癌症特异性T淋巴细胞。
49.权利要求30-48任一项的方法，其中给药的VEGF抑制剂的量选自约1mg到约2000mg、或约70mg到约1400mg、或约140mg到约1050mg、或约210mg到约1050mg、或约280mg到约1050mg、或约350mg到约1050mg。
50.权利要求30-49任一项的方法，其中癌症选自乳腺、结肠、直肠、胰腺、肝脏、胆囊、胆管、膀胱、脑、小肠、肺、前列腺、肾脏、子宫颈、外阴、卵巢中的癌，恶性黑素瘤，头颈部癌；关节、骨骼、肌肉和肌腱中的肉瘤，淋巴瘤；畸胎瘤；以及转移和原位晚期(不可动手术的)的上述肿瘤。
51.权利要求30-50任一项的方法，其中至少一种活性成分通过肠胃外或口服途径给药。
52.权利要求51的方法，其中肠胃外给药是静脉内、动脉内、鞘内或腹膜内给药。
53.权利要求51的方法，其中口服给药采用常规的片剂、胶囊、囊片、溶液、悬液或乳液制备物的形式。
54.权利要求30的方法，其中肿瘤反应性CD4+T辅助细胞和/或CD8+T淋巴细胞通过静脉内给药。
55.权利要求30-51任一项的方法，其中肿瘤反应性T淋巴细胞和一种或多种VEGF抑制剂以及任选的一种或多种化疗药剂同时或以任意次序以任意时间间隔顺序给药。
56.权利要求54或55的方法，其中试剂盒组分可以任意次序独立地口服或肠胃外给药。
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Legal Events
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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Free format text: CORRECT: ADDRESS; TO: 215400 SUZHOU, JIANGSU PROVINCE |
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Effective date of registration: 20111222 Address after: 215400 No. six West Beijing Road, Jiangsu, Taicang Applicant after: Jiangsu SentoClone Co., Ltd. Address before: Stockholm Applicant before: Sentoclone AB |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20110706 |
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