CN101346463B - 用于癌患者免疫治疗的瘤反应性t-淋巴细胞扩增的改善方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于扩增和激活瘤反应性淋巴细胞，特别是CD4+辅助细胞和/或CD8+T-淋巴细胞的改善的方法，所述细胞可用于治疗和/或预防癌。该方法在较短的时间跨度内提供了大量的瘤反应性T-淋巴细胞并且可能引导瘤反应性CD4+辅助细胞和/或CD8+T-淋巴细胞朝向特定亚群的发展。方法包括用瘤由来抗原和至少一种具有针对IL-2受体的激动活性的物质刺激瘤反应性CD4+T辅助细胞和/或CD8+T-淋巴细胞以促进瘤反应性CD4+T辅助细胞和/或CD8+T-淋巴细胞的存活的第一阶段；和激活和促进瘤反应性CD4+T辅助细胞和/或CD8+T-淋巴细胞增殖的第二阶段，其中第二阶段当CD4+T辅助细胞和/或CD8+T-淋巴细胞上的CD25细胞表面标记物(或IL-2R标记物)下调时被启动。
Description
技术领域
本发明涉及用于瘤反应性淋巴细胞特别是CD4+辅助细胞和/或CD8+T-淋巴细胞的扩增和激活的改善方法。T-淋巴细胞不是CD4+CD25+Hi淋巴细胞，即，本发明不包括调节T-淋巴细胞。淋巴细胞可用于治疗和/或预防癌。
背景技术
根据免疫监视假说，免疫系统持续敏化以对抗发展瘤，其中实验证据有力地支持这一概念。鉴定特异性瘤抗原提供了用于瘤免疫治疗的新的可能性，并且许多免疫治疗方法目前已转入临床试验。其中，瘤抗原特异性淋巴细胞的过继转移似乎特别有前途。迄今为止，这些努力通常基于得自周围血液的单核细胞或与新鲜瘤样品分离的瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在新近的试验中，已经报告了用扩增的TIL的自身转移治疗恶性黑色素瘤患者，目标应答率高达51％。TIL细胞数量较少，由于从扩增到存在(数月)瘤生成的长期免疫抑制机制它们通常无应答性(无反应性)。另外，方案已经针对CD8+细胞毒性T细胞的扩增，并且已将该细胞再引入到用化学治疗进行预处理的患者内，并且另外，患者已经用高剂量的白细胞介素-2处理以提供CD8+T细胞的存活。
发明公开
本发明人先前已经表明原初T细胞的激活可存在于metinel淋巴器官如前哨淋巴结的高度特异性环境内。换句话说，前哨淋巴结被认为是免疫系统遭遇瘤抗原的主要部位。
本发明人先前已经公开了用于扩增得自前哨淋巴结的瘤反应性T-淋巴细胞的一般方法，表明有可能培养从得自前哨淋巴结的淋巴细胞，以获得瘤反应性T-淋巴细胞的培养物。通过对除去前哨淋巴结的患者给用有效量的瘤反应性T-淋巴细胞，瘤反应性T-淋巴细胞可用于治疗癌。
包括给用瘤反应性T-淋巴细胞的癌治疗的成功性通过测定以下因素确定，诸如，例如，在扩增步骤后获得的瘤反应性T-淋巴细胞的量，即，可用于输注至患者的瘤反应性T-淋巴细胞的量，获得有效量的瘤反应性T-淋巴细胞所需的时间，以及通过扩增方法获得的瘤反应性T-淋巴细胞的特定亚群的浓度和比。
因此，本发明公开了用于扩增瘤反应性CD4+辅助细胞和/或CD8+T-淋巴细胞的改善方法，其中特异性培养条件已经过确定和优化，并且其中在整个扩增期内监控T-淋巴细胞上的和培养物内的特异性标记物，以在最短的可能时间跨度内获得大量的瘤反应性T-淋巴细胞。另外，本发明同时提供了用于引导瘤反应性CD4+辅助细胞和/或CD8+T-淋巴细胞向特定亚群发展的方法。T-淋巴细胞不是CD4+CD25+Hi淋巴细胞，即，本发明不包括调节T-淋巴细胞。
表达转录因子FoxP3的CD4+CD25HiT淋巴细胞被认为是调节T细胞(Treg)。Treg通过抑制激活和增殖而具有调节T辅助细胞和T细胞毒性细胞的性质，并且，另外，Treg抑制有用的Th1细胞因子例如IFN-γ的产生和释放。因此，开发了本发明提供的方法，以促进T辅助细胞和T细胞毒性T细胞扩增并避免Treg细胞扩增。
最通常由本发明产生的瘤反应性T-淋巴细胞是CD4+辅助细胞T-淋巴细胞。本发明扩增方法的一个目的是在一些方面模拟患者自身免疫系统的天然路径，并且在一定程度上让患者免疫系统的组分确定是否首先生成CD4+辅助细胞或CD8+T-淋巴细胞，这根据抗原是否由MCHI或MCHI递呈而定。在大多数场合下，抗原由MCHII分子递呈，导致生成CD4+辅助细胞T-淋巴细胞，然而，有时候，生成CD8+T-淋巴细胞。如果生成CD4+辅助细胞T-淋巴细胞，它们将进一步如本文所述被扩增，然而，该方法还可用于扩增CD8+细胞。本发明人已经发现包括两个不同阶段的扩增方法可特别地用于在较短时间跨度内获得大量的瘤反应性CD4+辅助细胞和/或CD8+T-淋巴细胞，所述两个阶段是：
i)使用瘤由来抗原和至少一种具有针对IL-2受体的激动活性的物质刺激瘤反应性T-淋巴细胞以促进瘤反应性T-淋巴细胞存活的第一阶段，和
ii)激活和促进瘤反应性T-淋巴细胞生长的第二阶段，其中第二阶段ii)当T-淋巴细胞上的CD25细胞表面标记物(IL-2R标记物)下调时被启动。
该扩增方法还可使用分离自患者的作为抗原特异性细胞的单核细胞进行。当通过采用成熟细胞因子例如IL-4，GM_CSF和IL-3而分化成为树状细胞，然后通过添加Toll样受体刺激物质如脂多糖激活该树状细胞时，对患者给用单核细胞。使用成熟的激活树状细胞作为抗原特定群可促进和提高T辅助细胞和T细胞毒性T细胞的扩增。
定义
术语“瘤反应性T-淋巴细胞”是指带有对瘤抗原具有特异性并识别瘤抗原的T细胞受体的T-淋巴细胞。
术语“T辅助细胞”是指当被激活时促进适应性免疫应答的T-淋巴细胞。
术语“Th1细胞”是指当使用细胞因子如IFN-γ被激活时促进细胞介导的免疫应答的T辅助细胞。
术语“Th2细胞”是指当使用细胞因子如IL-4被激活时促进体液免疫应答的T辅助细胞。
术语“CD4+辅助细胞T-淋巴细胞”是指表达CD4而非转录因子FoxP3的T-淋巴细胞。
术语“CD8+T-淋巴细胞”是指表达CD8的T-淋巴细胞。
术语“调节T-淋巴细胞”是指表达转录因子FoxP3的抑制适应性免疫应答的T-淋巴细胞。
术语T-淋巴细胞的“特异性激活”是指抗原特异性的和MHC限制性的T细胞受体介导的激活。相比之下，术语T-淋巴细胞的“非特异性激活”是指所有T细胞的总激活，无论是否是T细胞受体特异性的。
术语“瘤由来抗原”包括瘤细胞，瘤匀浆(该匀浆可经过变性)，或瘤蛋白质、多肽或肽，如为纯的，天然的，合成的和/或重组的蛋白质、多肽或肽的形式。瘤由来抗原可是完整的分子，其片段，或完整分子和/或片段的多聚体或聚集体(aggregate)。适当的多肽和肽的例子为包括约5到约30个氨基酸，诸如例如约10到25个氨基酸，约10到20个氨基酸，或约12到18个氨基酸。如果使用肽，则培养物中的可使用的最终摩尔浓度为约0.1到约5.0μM，例如，例如，约0.1到约4.0μM，约0.2到约3.0μM，约0.3到约2.0μM，或约0.3到约1.0μM。瘤由来抗原可为自身抗原或异种抗原，即，得自待治疗的患者或得自其它的罹患癌的对象。在本发明的实施例中，使用了自身变性瘤提取物，然而，如上所述，在本发明的方法中还可使用其它来源的瘤由来抗原。
术语“第一阶段的第一天”或者例如“第二阶段的第五天”可理解为以下含义：收获淋巴细胞的当天以第零(0)天表示。第一阶段的第一天被定义为其中扩增通过添加至少一种具有针对IL-2受体的激动活性的物质(并且可为培养基和/或瘤由来抗原)而被启动的当天。扩增阶段i)可在第零(0)天或直到收获淋巴细胞以后的第二天被启动。通过添加瘤由来抗原被启动的第二阶段的当天在本文全文中被称作“第二阶段的第一天”。
术语“前哨淋巴结”是指接受瘤淋巴引流的第一淋巴结。术语“metinel淋巴结”是指接受转移瘤淋巴引流的第一淋巴结。
阶段i)
第一阶段i)的目的是获得包括实质上高比例的瘤反应性CD4+辅助细胞和/或CD8+T-淋巴细胞的培养物。第一阶段将被认为是其中使瘤反应性T-淋巴细胞存活和分裂的“保育阶段”。根据T-淋巴细胞(体外扩增方法的原材料)的来源，它们在此阶段可经历相对苛刻的条件，诸如，被癌细胞分泌的因子所抑制。
用于本发明扩增方法中的原材料可以是得自引流原发瘤和/或转移瘤的淋巴结，诸如例如前哨或metinel淋巴结的淋巴细胞的混合物。这些可在手术期间被识别，例如，通过注射淋巴结定位物质，诸如例如在瘤或转移瘤周围和内部的示踪物质。淋巴结定位物质诸如例如示踪剂被输送到淋巴微管内并积聚在前哨/metinel结点内，因此识别引流瘤或转移瘤的淋巴结。本发明人最近表明了接受瘤引流的第一淋巴结是用于体外扩增的天然瘤反应性CD4+辅助细胞和/或CD8+T-淋巴细胞的潜在富集源，因为该淋巴结可含有大量的T-淋巴细胞，其已针对瘤抗原被敏化并在淋巴结内经历体内扩增。
CD4+辅助细胞和/或CD8+T-淋巴细胞的可供选择的来源可以是罹患癌的对象的血液，诸如例如周围血液。该对象可以是长期患病的未经治疗的患者，或者是已经过治疗的患者，可从其获得针对瘤而被敏化的周围血液T-淋巴细胞。CD4+辅助细胞和/或CD8+T-淋巴细胞的其它适当的来源包括骨髓，脾组织和瘤。
然而，在本发明的优选实施方案中，原材料得自前哨或metinel淋巴结。
要在培养物中扩增的T-淋巴细胞可以得自待治疗对象，即，得到的给药用的特定瘤反应性T-淋巴细胞可为自身细胞。然而，T-淋巴细胞还可得自不同于待治疗对象的来源，诸如例如其它罹患癌的对象。在此情况下，接受者和扩增的瘤反应性T-淋巴细胞优选具有免疫相容性(或者说，接受者对扩增的瘤反应性T-淋巴细胞具有免疫耐受性)。
根据原材料来源的不同而异，其将包括多种淋巴细胞，诸如例如T-淋巴细胞，B-淋巴细胞，抗原递呈细胞，瘤反应性T-淋巴细胞和未激活的/无反应性的T-淋巴细胞的混合物。为了特异性促进瘤反应性CD4+辅助细胞和CD8+T-淋巴细胞的存活，添加瘤由来抗原物质和一种或多种具有针对IL-2受体的激动活性的物质。
如上所述，第一阶段i)通过添加至少一种具有针对IL-2受体的激动活性的物质被启动。这种物质的作用是通过IL-2受体刺激T-淋巴细胞，以促进T-淋巴细胞的细胞分裂，从而防止细胞死亡。
T-淋巴细胞的抗原特异性MHC限制的激活促进了对肿瘤细胞识别具有特异性的有用的T-淋巴细胞群的克隆扩增。相反地，T淋巴细胞的非特异性激活将导致识别非相关肽而与肿瘤细胞的识别无任何关系的T淋巴细胞克隆的扩增，因此，大多数的非特异性扩增的T淋巴细胞不会识别瘤。
本发明的目的是促进瘤反应性CD4+辅助细胞和CD8+T-淋巴细胞的特异性激活和生长。针对某些瘤抗原的特异性激活使得当对具有相同瘤类型的癌患者给用T-淋巴细胞时T-淋巴细胞具有治疗作用，因为T-淋巴细胞被针对性地激活。
由于少量的瘤相关T淋巴细胞，给用非特异性激活的T-淋巴细胞针对任何癌不具有治疗作用或具有极低的治疗作用。
在本发明的一个实施方案中，具有针对IL-2受体的激动活性的物质是激动剂，这种物质的例子包括蛋白质，多肽，肽，抗体，亲和体(affibody)，及其片段，融合蛋白，合成的和/或有机分子，诸如例如小分子，和天然配体。在优选实施方案中，该物质是IL-2受体的天然配体，即IL-2。
如果使用IL-2，其优先以小剂量被添加，为的是减少淋巴细胞的细胞程序死亡和增加CD4阳性辅助细胞瘤反应性T-淋巴细胞群。在本发明的具体实施方案中，IL-2的小剂量为约100国际单位/毫升培养物到约700国际单位/毫升培养物，诸如，例如约100国际单位/毫升培养物到约600国际单位/毫升培养物，约100国际单位/毫升培养物到约500国际单位/毫升培养物，约100国际单位/毫升培养物到约400国际单位/毫升培养物，约100国际单位/毫升培养物到约300国际单位/毫升培养物，和约100国际单位/毫升培养物到约200国际单位/毫升培养物。在具体实施方案中，IL-2的添加量为240国际单位/毫升培养物。
在使用其它的非IL-2的具有针对IL-2受体的激动活性的物质的情况下，这些物质的具体剂量将使得得到的效果相当于由以上剂量的IL-2获得的效果。
另外量的至少一种具有针对IL-2受体的激动活性的物质可在整个阶段i)内有规律地被添加，诸如，例如，在阶段i)中每隔一天，每隔两天或每隔三天被添加，以维持用于促进细胞分裂的最佳条件。术语“每隔一天，每隔两天或每隔三天”是指至少一种具有针对IL-2受体的激动活性的物质，在第一次添加该至少一种具有针对IL-2受体的激动活性的物质之后的，即，在启动阶段i)之后的第二天，第三天，或第四天开始，每隔一天，每隔两天或每隔三天，在整个阶段i)内被添加。
在一个实施方案中，在整个阶段i)内有规律地被添加的物质是IL-2的激动剂。在优选实施方案中，该物质是IL-2。
有规律地，诸如例如每隔一天，每隔两天或每隔三天被添加的具有针对IL-2受体的激动活性的物质诸如例如IL-2的其它剂量也处在上述范围内。
在扩增的第一阶段i)的其它重要步骤是添加瘤由来抗原，以促进表达识别瘤抗原的T淋巴细胞受体的T-淋巴细胞即瘤反应性T-淋巴细胞的细胞分裂。
添加瘤抗原的最佳时间点根据淋巴细胞来源的不同而异。当淋巴细胞来自淋巴结诸如例如前哨淋巴结或来自瘤时，淋巴细胞可经历与肿瘤细胞的非常接近和肿瘤细胞的免疫抑制，并且需要使用具有针对IL-2受体的激动活性的物质诸如例如IL-2物质培养一些天以促进T-淋巴细胞在瘤抗原呈递时对增殖应答的能力。因此，在这种情况下，瘤由来抗原优先从第一阶段i)的第二天到第五天被添加，诸如例如在第二天，第三天，第四天，或第五天被添加。
如果淋巴细胞来自血液，则当第一阶段i)启动时瘤由来抗原已被添加，即，与具有针对IL-2受体的激动活性的物质一起被添加，因为T-淋巴细胞没有经历上述的肿瘤细胞的免疫抑制。因此，当使用血液时，基本上在阶段i)启动的同时或者在直到阶段i)启动后的至多2天添加瘤由来抗原。
瘤由来抗原，诸如例如瘤匀浆，可能通过存在于原材料内的抗原递呈细胞诸如例如B-淋巴细胞、树状细胞和巨噬细胞被胞吞和加工。在大多数场合下，瘤由来抗原将由导致CD4+辅助细胞瘤反应性T-淋巴细胞的细胞分裂的MCHII分子递呈。然而，通过交叉递呈，通过胞吞作用被摄入的抗原可在导致CD8+T淋巴细胞激活的I类凹陷中被加工和递呈。如上所述，扩增方法的目的之一是在某些方面模拟患者自身免疫系统的天然路径，并且在一定程度上让患者免疫系统的组分确定是否生成CD4+或CD8+淋巴细胞，根据抗原是否由MCHI或MCHII递呈而定。在大多数场合下，抗原由导致CD4+辅助细胞T-淋巴细胞生成的MCHII分子递呈，然而，有时候，生成CD8+T-淋巴细胞。
阶段ii)
第二阶段ii)的目的是激活和扩增从阶段i)获得的瘤反应性CD4+辅助细胞和/或CD8+T-淋巴细胞，以及通过引导它们进入所需路径而获得瘤反应性CD4+辅助细胞和/或CD8+T-淋巴细胞的特定亚群。
本发明人已经发现确定启动阶段ii)的最佳时间点的一个方法是通过监控T-淋巴细胞上的CD25细胞表面标记物的表达进行，从而具体确定T-淋巴细胞对再刺激敏感的时间。本发明人已经发现第二阶段ii)优选当T-淋巴细胞上的CD25表达下调时被启动。CD25是激活标记物，表明淋巴细胞已经接受激活信号。如果当T-淋巴细胞上的CD25高度表达时启动第二阶段，则意味着淋巴细胞已经接受信号，将发生细胞死亡。
CD25的下调被定义为实质部分的T-淋巴细胞群表达很少的CD25标记物或实质上不表达CD25标记物。在优选实施方案中，CD25的下调被定义为低于5％的T-淋巴细胞群表达CD25，即，培养物中95％或更高的T-淋巴细胞根本不表达CD25。5％或更低的表达CD25的T-淋巴细胞很可能是调节CD4+T-淋巴细胞，其具有CD25的高度恒定表达。另外，T-淋巴细胞群优选表达很少的Foxp3标记物或实质上不表达Foxp3标记物，该标记物是调节T-淋巴细胞的特异性标记物。在优选实施方案中，Foxp3的下调被定义为低于5％的T-淋巴细胞群表达Foxp3，即，培养物内95％或更高的T-淋巴细胞根本不表达Foxp3。
除了CD25之外，还有其它标记物，它们的表达与监测有关，以确定启动第二阶段的最佳时间点。
这些标记物的例子是早期激活标记物CD69，和MCHII(其是T-淋巴细胞的激活标记物)。因为CD69和MCHII的表达显示T-淋巴细胞的“激活程序”已经启动，则意味着该细胞不能响应其它刺激，这两个标记物将在启动第二阶段之前优选下调。术语下调可被定义为低于5-10％的T-淋巴细胞群表达CD69和/或MCHII。
在本发明的又一实施方案中，在扩增方法的阶段ii)的扩增期间，在培养物内，使用抗CD4抗体从可能的肿瘤细胞中分离T辅助细胞。
在本发明的又一实施方案中，使用诸如具有抗CD3和抗CD28抗体的Dynabeads
产品促进扩增方法的阶段ii)内的扩增。DynabeadsCD3/CD28的使用将提供带有激活信号的淋巴细胞，并且还可用于在培养物中从可能的肿瘤细胞中的分离。Dynabeads
CD3/CD28在阶段i)期间将特异性地结合T淋巴细胞扩增的抗原，其中这些细胞现在可以被磁性富集。因为初始抗原特异性激活已被启动并导致克隆T淋巴细胞扩增，Dynabeads
CD3/CD28再刺激将进一步促进克隆扩增，因为阶段i)不支持非特异性T淋巴细胞克隆的激活。
尽管阶段ii)的确切的起始点将根据淋巴细胞何时获得特异性标记物的优选表达的不同而异，第二阶段ii)最通常从第一阶段i)的第17天到第23天(含第23天)被启动，诸如，例如在第17天，第18天，第19天，第20天，第21天，第22天或第23天被启动。换句话说，淋巴细胞表达优选量的标记物和标记物的组合的时间点最通常被认为是第一阶段i)的第17天到第23天。
T-淋巴细胞的扩增，即，阶段i)和ii)最通常在适当的培养基中进行。优选使用无血清培养液或自身血清以避免对患者传播疾病的风险。适当的标准培养基的例子包括AIMV培养基，RPMI 1640，DMEM和MEM。然而，还可使用其它培养基，包括氨基酸、甾族化合物、维生素、生长因子、细胞因子和矿物质的适当的掺混物。
在扩增的两个阶段期间，可将细胞分在若干培养容器中以保持在培养基中的适当的细胞密度。在扩增阶段内T-淋巴细胞的密度将优选为约3到约6百万个细胞/毫升培养基。
在扩增期间，还可能需要使用新鲜培养基交换培养基，其是被称作培养基调理的步骤。分离培养基和调理培养基的时间点可根据细胞形态学和细胞培养密度(其将不会超过约6百万个细胞/毫升)进行确定，或者，该培养基可含有适当的指示剂，诸如例如酚指示剂。如果将指示剂引入到培养基内，则分离培养基或调理培养基的时间点可基于培养基的颜色而定。如果使用酚磺酞指示剂，当培养基变黄时，其表示培养基的pH变成酸性，则细胞应进行分离或调理。本发明中使用的用于调理培养基的适当方法可以是每3-9天，诸如例如一周一次交换培养基的1/4到1/2，诸如例如1/3。
除了本文提及的具体条件之外，对于其它参数，将使用淋巴细胞培养基生长的标准条件，诸如例如37℃的温度和5％的CO2。
如上所述，第二阶段ii)通过向用于激活瘤反应性CD25阴性T-淋巴细胞的T-淋巴细胞中添加上述的瘤由来抗原被启动，以促进瘤反应性T-淋巴细胞的克隆扩增。
在本发明的具体实施方案中，将抗原递呈细胞(APC)和瘤由来抗原添加到T-淋巴细胞中。抗原递呈细胞(APC)包括白细胞，诸如例如单核细胞，巨噬细胞，和淋巴细胞诸如例如B细胞。这些不同的细胞类型通常能够递呈被特异性T淋巴细胞受体识别的形式的抗原。从待治疗患者获得的例如血液、淋巴液、骨髓、淋巴器官组织或组织培养液中分离出白细胞制剂。在优选实施方案中，APC细胞是经照射的包含抗原递呈B细胞和/或单核细胞的周围血液白细胞。APC的添加量为约5十万个APC/毫升淋巴细胞培养物到约5百万个APC/毫升淋巴细胞培养物，诸如例如约1百万个APC/毫升淋巴细胞培养物到约4百万个APC/毫升淋巴细胞培养物，约1百万个APC/毫升淋巴细胞培养物到约3百万个APC/毫升淋巴细胞培养物，或约1百万个APC/毫升淋巴细胞培养物到约2百万个APC/毫升淋巴细胞培养物。
除了添加瘤由来抗原到T-淋巴细胞以促进瘤反应性T-淋巴细胞的克隆扩增之外，第二阶段ii)包括添加特异性组分，其作用是引导瘤反应性T-淋巴细胞向所需亚群扩增。
如上所述，本发明提供了生成瘤反应性CD4+辅助细胞T-淋巴细胞的方法。当瘤抗原与主要组织相容性复合物II(MCHII)分子结合时，CD4+辅助细胞T-淋巴细胞识别并结合该瘤抗原。激活的CD4+辅助细胞T淋巴细胞分泌细胞因子、蛋白质和/或肽，它们刺激免疫系统的其它细胞如其它的淋巴细胞。分泌的最常见的细胞因子是白细胞介素-2(IL-2)，其是强力的T淋巴细胞生长因子。被激活的增殖CD4+辅助细胞T-淋巴细胞可被分为两大细胞亚型，Th1和Th2细胞，其根据产生的特异性细胞因子进行定义。Th1细胞生成干扰素-γ和白细胞介素12(IL-12)，而Th2细胞生成白细胞介素-4，白细胞介素-5和白细胞介素-13。Th1T-淋巴细胞据信促进细胞毒性T淋巴细胞(Tc)、NK细胞、巨噬细胞和单核细胞的激活，所有这些细胞可攻击癌细胞并通常抵御瘤。
Th1和Th2型T-辅助细胞(CD4+)淋巴细胞可被分为记忆型细胞和效应器型细胞。记忆型T-辅助细胞(CD4+)淋巴细胞对它们首先遭遇到的抗原具有特异性，并且可在二次免疫应答中被召集，引起更迅速的和更大的对瘤抗原的应答。在人类中有证据说明淋巴细胞存活至少20年；或许存活终生。效应器型CD4+T-淋巴细胞是产生细胞因子和INF-γ的活性细胞。
对于癌的有效治疗，给用Th1型的瘤反应性T-淋巴细胞特别有益，因为该类型据信促进细胞毒性T淋巴细胞(Tc)、NK细胞、巨噬细胞和单核细胞的激活，所有这些细胞可攻击癌细胞并通常抵御瘤。即，在具体实施方案中，本发明涉及生成瘤反应性CD4+辅助细胞T-淋巴细胞的方法，并且在其它的实施方案中，由本发明方法生成的Th2型的T-淋巴细胞的百分数是30％或更低，诸如例如25％或更低，20％或更低，15％或更低，10％或更低，5％或更低，或0％，即，生成至少70％的Th1型的瘤反应性CD4+T-淋巴细胞，诸如例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的Th1型的瘤反应性CD4+T-淋巴细胞。
因此，第二阶段可包括添加能够上调T-淋巴细胞上的IL-12R的物质。IL-12R的上调将增加T细胞对接受和优化IL-12细胞因子激活的准备，引起最大STAT-4信号传导，并因此使淋巴细胞向Th1细胞和IFN-γ生成倾斜。
能够上调T-淋巴细胞上的IL-12R的物质可以是具有针对干扰素受体的激动活性的物质。在本发明的一个实施方案中，具有针对干扰素受体的激动活性的物质是激动剂，这种物质的例子包括蛋白质，多肽，肽，抗体，亲和体，及其片段，融合蛋白，合成的和/或有机分子，诸如例如小分子，和天然配体。在具体实施方案中，该物质是干扰素受体的天然配体，即干扰素，诸如干扰素-α。
添加能够上调T-淋巴细胞上的IL-12R的物质诸如例如具有针对干扰素受体的激动活性的物质的最佳时间点可根据测定培养基中的IL-12的水平进行确定。当与阶段ii)第一天的IL-12的水平相比，IL-12的水平为至少1倍，诸如例如至少2倍，至少3倍，至少4倍，或至少5倍增加时，优选添加所述物质。在大多数场合下，这种IL-12水平的增加可在启动第二阶段ii)后的第1天到第4天(包括第4天)可见，诸如例如在第2天，第3天或第4天可见。
为了实质上避免Th2型的瘤反应性T-淋巴细胞的生成，第二阶段可进一步包括添加一种或多种能够对抗Th2型T-淋巴细胞的发展的物质。这种物质的例子是能够中和白细胞介素IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF-β(后者不是白细胞介素)的物质，所有这四种物质是建立Th2细胞因子分布和下调Th1细胞因子生成所需的。
这种物质的例子包括蛋白质，多肽，肽，可溶受体，抗体，亲和体，及其片段，融合蛋白，合成的和/或有机分子，诸如例如小分子，和天然配体。在具体实施方案中，该物质选自与白细胞介素结合从而中和白细胞介素的抗体，诸如例如，抗IL-4抗体，抗IL-5抗体和/或抗IL-10抗体，以及可溶受体(诸如例如I和II型TGF-β受体)和TGF-β的结合蛋白(诸如例如LAP和/或LTBP)。
可在第二阶段ii)的第一天添加一种或多种能够对抗Th2型T-淋巴细胞发展的物质，诸如例如一种或多种能够中和IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF-β的物质。然而，因为抗体昂贵，抗体的添加还可在添加能够上调T-淋巴细胞上的IL-12R的物质后的随后步骤中进行，诸如，例如，在添加能够上调T-淋巴细胞上的IL-12R的物质后的1天，2天或3天被添加。
中和物质应该以足够中和白细胞介素的量被添加，诸如例如，相对于待中和的白细胞介素的量过量10-100倍(摩尔)。当使用抗体时，通常需要最终浓度为约2到约4ng/毫升培养基。对于其它类型的中和物质，应当使用给出与上述关于抗体所述浓度的效果给出相同效果的最终浓度。
为了维持对Th2型T-淋巴细胞发展的抑制，可在整个阶段ii)中有规律地，诸如例如在阶段ii)中每隔一天，每隔两天或每隔三天添加另外量的一种或多种能够对抗Th2型T-淋巴细胞的发展的物质，诸如例如一种或多种能够中和IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF-β的物质。可理解的是，术语每隔一天，每隔两天或每隔三天是指至少一种能够对抗Th2型T-淋巴细胞的发展的物质在整个阶段ii)内，在首次添加至少一种能够对抗Th2型T-淋巴细胞的发展的物质后的第2天，第3天或第4天开始，每隔一天，每隔两天或每隔三天被添加。
另外，就阶段ii)而论，可在整个阶段ii)中有规律地，诸如例如在阶段ii)中每隔1-3天，即，在第2天，第3天或第4天添加另外量的具有针对IL-2受体的激动活性的物质，诸如例如激动剂，以维持促进细胞分裂的最佳条件。被有规律地添加的物质的剂量处在关于阶段i)中用于添加具有针对IL-2受体的激动活性的物质诸如例如IL-2所提到的最佳范围内。
为了有利于Th1型的瘤反应性T-淋巴细胞的生成，第二阶段ii)可包括添加一种或多种促进Th1型T-淋巴细胞发展的物质。这种物质的例子是具有针对IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21受体的激动活性的物质。更特别地，该物质可为IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21受体的激动剂。这种激动剂的例子包括蛋白质，多肽，肽，抗体，亲和体，及其片段，融合蛋白，合成的和/或有机分子，诸如例如小分子，和天然配体。在具体实施方案中，该物质分别是IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21受体的天然配体，诸如IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21。
IL-12的作用是通过刺激IL-12R激活诱导STAT路径的IFN-γ，从而促进Th1淋巴细胞的激活。IL-21的作用是增强向Th1型的T-淋巴细胞的增殖、激活和发展。
IL-7和IL-15两者都通过促进T-淋巴细胞的稳态扩增，增强激活的Th1编程的T-淋巴细胞的计数发挥作用。
添加一种或多种促进Th1型T-淋巴细胞发展的最佳时间点是T-淋巴细胞对改性敏感的时候。如果当T-淋巴细胞对改性不敏感时添加该物质，则该添加将是无效的，即，不会有利于Th1型T-淋巴细胞的发展。为了确定添加促进Th1型T-淋巴细胞的发展的物质诸如例如具有针对IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21受体的激动活性的物质的最佳时间点，可监控由T-淋巴细胞进行的INF-γ的产生。在优选实施方案中，一种或多种促进Th1型T-淋巴细胞的发展的物质，诸如例如具有针对IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21受体的激动活性的物质应当在IFN-γ的水平同第二阶段ii)启动时IFN-γ的水平相比增加时被添加。
在具体实施方案中，IFN-γ水平的增加可确定为，与第二阶段ii)启动时的IFN-γ的水平相比，IFN-γ水平至少1倍增加，诸如例如至少2倍，至少3倍，至少4倍增加。通常这种增加可与以下有关：培养基中的内容物IFN-γ应当为至少100皮克/毫升培养基，诸如例如至少150皮克/毫升培养基，至少200皮克/毫升培养基，或至少250皮克/毫升培养基。
当确定添加促进Th1型T-淋巴细胞发展的物质诸如例如具有针对IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21受体的激动活性的物质的最佳时间点，人们可进一步关注CD4+T-淋巴细胞上的激活标记物CD25和CD69的表达，该标记物将优先上调。上调可理解为是，与阶段ii)第1天T-淋巴细胞上的CD25和CD69的表达相比，至少约40％到约60％或更高的CD4+T-淋巴细胞将表达CD25和CD69，表明T-淋巴细胞已经接受激活信号。
通常，添加促进Th1型T-淋巴细胞的发展的物质的最佳时间点处在添加能够上调T-淋巴细胞上的IL-12R的物质和能够对抗Th2型T-淋巴细胞的发展的物质之后。更具体而言，添加促进Th1型T-淋巴细胞的发展的物质的最佳时间点将处在启动第二阶段ii)后的第5天到第8天，诸如例如在第5天，第6天，第7天或第8天。
如果添加了IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21，则这些物质中每一种在培养基中的浓度范围为约150国际单位/毫升培养基到约300国际单位/毫升培养基，诸如例如250国际单位/毫升培养基。当使用与上述的具体物质不同的其它物质时，这些物质应当以最终浓度被添加到培养基中，该最终浓度导致的效果与添加在上述具体范围内的IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21所给出的效果相同。
如上所述，本发明的方法优先用于扩增T-淋巴细胞，以实现Th1型的CD4+瘤反应性T-淋巴细胞。本发明的另一方面是通过使用本文所述的用于扩增瘤反应性T-淋巴细胞的方法，获得比较大量的记忆型T-淋巴细胞。在治疗癌中，当然重要的是待治疗患者接受大量的效应器瘤反应性CD4+T-淋巴细胞，因为这些细胞-如上所述-促进细胞毒性T淋巴细胞(Tc)、NK细胞、巨噬细胞、和单核细胞的激活，所有这些细胞可攻击癌细胞并通常抵御瘤。
然而，通过同时给药实质量的记忆型瘤反应性CD4+T-淋巴细胞，患者获得长达终生的针对瘤或原发瘤的转移瘤复发的保护作用。
因此，本发明涉及制备记忆型T-淋巴细胞的方法。通常，当根据本发明扩增瘤反应性T-淋巴细胞的培养物时，将获得约35％到约90％的记忆型瘤反应性T-淋巴细胞，诸如例如约40％到约90％，约50％到约80％，或约60％到约70％的记忆型瘤反应性T-淋巴细胞。本发明人推测了在添加瘤抗原之前阶段i)中的淋巴细胞允许被再生的事实，以及相对缓慢的扩增阶段导致形成高的记忆型淋巴细胞到效应器淋巴细胞的比。
如上所述，T-淋巴细胞上的细胞表面激活标记物CD25和CD69的表达可用于确定何时启动本发明方法的重要步骤，诸如例如何时启动第二阶段ii)。因此，在整个阶段i)和阶段ii)内连续地，诸如例如每隔一天、每隔两天或每隔三天，监控CD25和CD69的表达可是有益的。
因为本发明方法的目的之一是获得大量的特异性CD4+瘤反应性T-淋巴细胞，其可用于给药至患者，可在某些时间点收获瘤反应性T-淋巴细胞，导致扩增步骤终止。收获瘤反应性T-淋巴细胞的最佳时间点是当T-淋巴细胞上的CD25的表达下调时，其中下调被定义为5％或更低的CD4+T-淋巴细胞群表达CD25。还可基于测量IFN-γ的产生量来确定收获的最佳时间点。与最初的IFN-γ生成相比，IFN-γ生成应该为至少2倍增加，诸如例如至少3倍增加，至少4倍增加，或至少5倍增加，最初的IFN-γ生成通常对应于至少100皮克IFN-γ/毫升培养基的水平。
通常，该事件将在启动第二阶段ii)之后的第10天到第14天(包括第14天)发生，即，通常在启动第二阶段ii)之后的第10天到第14天(包括第14天)收获细胞。
因此，根据本发明的用于瘤反应性T-淋巴细胞的扩增的整个过程通常为约25天到约45天(包括45天)，诸如例如约26天到约44天(包括约44天)，约27天到约43天(包括约43天)，约27天到约42天(包括约42天)，约27天到约41天(包括约41天)，约27天到约40天(包括约40天)。
当CD25标记物下调时，如果不收获瘤反应性T-淋巴细胞，它们可经历一个或多个另外回合的阶段ii)。如果通过所述表达方法获得的瘤反应性T-淋巴细胞的量不被认为是可给药至罹患癌的患者的有效量，或者如果患者正接受化学治疗方案时，这样做是有益的，其中可可认为推持T-淋巴细胞的给药直到化学治疗结束时有益的。为了确定瘤反应性T-淋巴细胞是否应经历一个或多个另外回合的阶段ii)，人们可关注IFN-γ的生成水平，和/或获得的瘤反应性T-淋巴细胞的总数和/或CD25的表达。如果IFN-γ水平为30皮克/毫升培养基或更低，诸如例如20皮克/毫升培养基或更低，和/或T细胞的总数不令人满意，当T细胞是CD25阴性(即低于5％的T-淋巴细胞群表达CD25)并从而对再刺激敏感时可启动另外回合的阶段ii)。
收获瘤反应性T-淋巴细胞后，可通常任何常规方法诸如例如采用密度梯度法诸如例如菲可(Ficoll)培养基进行纯化。在收获和纯化瘤反应性T-淋巴细胞后，可通过冷冻在适当的冷冻介质中而将一份瘤反应性T-淋巴细胞保存。
治疗方法
通过上述的改善的扩增方法获得的瘤反应性T-淋巴细胞可用在治疗罹患瘤来源的疾病的对象的方法中，或用在用于实现瘤对象中的瘤退化的方法中，该方法包括对有需要的对象给用有效量的本发明的瘤反应性T-淋巴细胞。
本文所述的方法可用于治疗在任何解剖学部位内的上皮的、间冲质的或胚胎学来源的任何实体瘤，诸如例如，用于治疗上皮瘤，例如在乳房、结肠、胰腺、膀胱、小肠、前列腺、颈、外阴、卵巢中的癌；用于治疗间冲质瘤，例如在关节、骨、肌肉和腱内的肉瘤，以及一些血液学瘤如淋巴瘤；用于治疗胚胎瘤，如畸胎瘤。
瘤反应性T-淋巴细胞的有效量的定义根据淋巴细胞的具体类型，记忆型T-淋巴细胞与效应器型T-淋巴细胞的比，和疾病的严重程度而定。然而，可给药的平均下限为至少1000万，诸如例如至少2000万，至少3000万，至少4000万，至少5000万，至少6000万，至少7000万或至少8000万个瘤反应性T-淋巴细胞。本发明人尚未确定单剂量内待给药的瘤反应性T-淋巴细胞的量的上限。
在优选实施方案中，用于给药的瘤反应性T-淋巴细胞包括效应器型T-淋巴细胞和记忆型T-淋巴细胞的组合。更具体而言，记忆型瘤反应性T-淋巴细胞的量可为约35％到约90％，诸如例如约40％到约90％，约50％到约80％，或约60％到约70％，并且效应器型T-淋巴细胞的百分数为约10％到约65％，诸如例如约20％到约50％，或约30％到约40％。
瘤反应性T-淋巴细胞可配制为适于对患者进行非肠道给药，诸如例如适于静脉内、动脉内、鞘内或腹膜内给药的药物组合物。
当非肠道给药瘤反应性T-淋巴细胞时，它们可在等渗介质内，即，在与血液具有相同张力并包括一种或多种防止细胞聚集的物质的介质内进行配制。适当的介质的具体例子是0.9％的NaCl溶液，其包括高达3％的人血清白蛋白，诸如例如高达2％的人血清白蛋白或高达1％的人血清白蛋白。对于静脉内给药，待给药组合物中的瘤反应性T-淋巴细胞的浓度范围为约50万个淋巴细胞/毫升培养基到约400万个淋巴细胞/毫升培养基，诸如例如约50万个淋巴细胞/毫升培养基到约300万个淋巴细胞/毫升培养基，约50万个淋巴细胞/毫升培养基到约200万个淋巴细胞/毫升培养基，或约100万个淋巴细胞/毫升培养基到约200万个淋巴细胞/毫升培养基。
包括瘤反应性T-淋巴细胞的组合物可以单一剂量或多个剂量给药，其可在1-2小时内被输注。
根据疾病的严重程度，该治疗方法可进行一次或重复进行。另外，在疾病复发时可重复这种治疗。
本发明的治疗可补充有任何其它相关的癌疗法。这种补充性疗法可在给药淋巴细胞之前、同时或之后被给予，并且这种补充性疗法可以通常用于这种治疗的频率被给予。补充性疗法的适当例子是化学治疗等。
试剂盒
本发明另外涉及用在本发明方法中的试剂盒，该试剂盒包括用于培养T-淋巴细胞的培养基。该培养基可以是任何适当的无血清培养液，诸如例如AIMV、RPMI 1640、DMEM或MEM。
所述试剂盒可另外包括一种或多种用于刺激、激活和引导瘤反应性T-淋巴细胞的物质。这种物质的例子可为瘤由来抗原，具有针对IL-2受体的激动活性的物质，能够上调T-淋巴细胞上的IL-12R的物质，能够对抗Th2型T-淋巴细胞的发展的物质和/或促进Th1型T-淋巴细胞的发展的物质。
更具体而言，这种物质可为IL-2，干扰素-α，抗IL-4抗体，抗IL-5抗体，抗IL-10抗体，IL-7，IL-12，IL-15和/或IL-21。
所述试剂盒还可包括适于静脉内给药的药物组合物，该药物组合物可与瘤反应性T-淋巴细胞群在给药前进行混合。
所述试剂盒还可包括一个或多个注射器，其包括淋巴结定位物质，诸如例如上述的那些。
所述试剂盒还可包括使用说明书，诸如例如计算机软件形式的说明书。
在具体实施方案中，本发明涉及以下项目：
1.用于扩增瘤反应性CD4+T辅助细胞和/或CD8+T-淋巴细胞的方法，该方法包括：
i)使用瘤由来抗原和至少一种具有针对IL-2受体的激动活性的物质刺激瘤反应性CD4+T-辅助细胞和/或CD8+T-淋巴细胞以促进瘤反应性CD4+T-辅助细胞和/或CD8+T-淋巴细胞存活的第一阶段；和
ii)激活和促进瘤反应性CD4+T辅助细胞和/或CD8+T-淋巴细胞生长的第二阶段，其中第二阶段ii)当CD4+T辅助细胞和/或CD8+T-淋巴细胞上的CD25细胞表面标记物(或IL-2R标记物)下调时被启动，其中下调被定义为5％或更低的T-淋巴细胞群表达CD25并且其中阶段ii)通过向T淋巴细胞添加用于激活瘤反应性CD25-阴性T淋巴细胞的瘤由来抗原被启动。
2.项目1的方法，其中T-淋巴细胞存在于培养基中。
3.项目2的方法，其中培养基是无血清培养基，诸如例如AIMV培养基。
4.前述项目中任一项的方法，其中第一阶段i)通过添加至少一种具有针对IL-2受体的激动活性的物质被启动。
5.项目4的方法，其中具有针对IL-2受体的激动活性的物质是IL-2。
6.项目5的方法，其中IL-2以诸如例如以下的小剂量被添加，约100国际单位/毫升培养基到约700国际单位/毫升培养基，约100国际单位/毫升培养基到约600国际单位/毫升培养基，约100国际单位/毫升培养基到约500国际单位/毫升培养基，约100国际单位/毫升培养基到约400国际单位/毫升培养基，约100国际单位/毫升培养基到约300国际单位/毫升培养基，和约100国际单位/毫升培养基到约200国际单位/毫升培养基。
7.前述项目中任一项的方法，其中另外量的至少一种具有针对IL-2受体的激动活性的物质在整个阶段i)中有规律地被添加，诸如，例如，在阶段i)中每隔一天，每隔两天或每隔三天被添加。
8.项目7的方法，其中具有针对IL-2受体的激动活性的物质是IL-2。
9.项目8的方法，其中IL-2的添加浓度为约100国际单位/毫升培养基到约700国际单位/毫升培养基，约100国际单位/毫升培养基到约600国际单位/毫升培养基，约100国际单位/毫升培养基到约500国际单位/毫升培养基，约100国际单位/毫升培养基到约400国际单位/毫升培养基，约100国际单位/毫升培养基到约300国际单位/毫升培养基，和约100国际单位/毫升培养基到约200国际单位/毫升培养基。
10.前述项目中任一项的方法，其中瘤由来抗原在第一阶段i)的第2天到第5天并包括第5天被添加，诸如例如在第2天、第3天、第4天或第5天被添加。
11.项目1-9中任一项的方法，其中瘤由来抗原基本上在与阶段i)启动的同时或在阶段i)启动后的至多长达3天被添加。
12.前述项目中任一项的方法，其中瘤由来抗原是经变性的瘤匀浆。
13.项目12的方法，其中瘤由来抗原是自身抗原。
14.前述项目中任一项的方法，其中瘤由来抗原是蛋白质、多肽或肽。
15.前述项目中任一项的方法，其中第二阶段ii)在第一阶段i)的第17天到第23天并包括第23天被启动，诸如例如在第17天、第18天、第19天、第20天、第21天、第22天或第23天被启动。
16.前述项目中任一项的方法，其中瘤由来抗原是自身抗原。
17.项目16的方法，其中瘤由来抗原是经变性的瘤匀浆。
18.项目16的方法，其中瘤由来抗原是瘤蛋白质、多肽或肽。
19.项目16-18中任一项的方法，其另外包括向T-淋巴细胞添加抗原递呈细胞和瘤由来抗原。
20.项目19的方法，其中抗原递呈细胞是经照射的包含抗原递呈B细胞和/或单核细胞的周围血液白细胞。
21.前述项目中任一项的方法，其中第二阶段ii)包括添加至少一种能够上调T-淋巴细胞上的IL-12R的物质。
22.项目21的方法，其中能够上调T-淋巴细胞上的IL-12R的物质是具有针对干扰素受体的激动活性的物质。
23.项目22的方法，其中具有针对干扰素受体的激动活性的物质是干扰素。
24.项目23的方法，其中具有针对干扰素受体的激动活性的物质是干扰素-α。
25.项目21-24中任一项的方法，其中能够上调T-淋巴细胞上的IL-12R的物质，诸如例如具有针对干扰素受体的激动活性的物质，当IL-12的水平与阶段ii)第1天的IL-12的水平相比至少1倍增加，诸如例如至少2倍增加，至少3倍增加，至少4倍增加，或至少5倍增加时被添加。
26.项目21-25中任一项的方法，其中能够上调T-淋巴细胞上的IL-12R的物质，诸如例如具有针对干扰素受体的激动活性的物质，在启动第二阶段ii)后的第2天到第4天并包括第4天，诸如例如在第2天、第3天或第4天被添加。
27.前述项目中任一项的方法，其中第二阶段ii)包括添加一种或多种能够对抗Th2型T-淋巴细胞的发展的物质。
28.项目27的方法，其中一种或多种能够对抗Th2型T-淋巴细胞的发展的物质是一种或多种能够中和IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF-β的物质。
29.项目28的方法，其中一种或多种能够中和IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF-β的物质是抗IL-4抗体、抗IL-5抗体和/或抗IL-10抗体。
30.项目27-29中任一项的方法，其中一种或多种能够对抗Th2型T-淋巴细胞的发展的物质，诸如例如一种或多种能够中和IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF-β的物质在第二阶段ii)的第1天被添加。
31.项目27-29中任一项的方法，其中一种或多种能够对抗Th2型T-淋巴细胞的发展的物质，诸如例如一种或多种能够中和IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF-β的物质在添加能够上调T-淋巴细胞上的IL-12R的物质后的随后步骤中被添加。
32.项目31的方法，其中一种或多种能够对抗Th2型T-淋巴细胞的发展的物质，诸如例如一种或多种能够中和IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF-β的物质在添加能够上调T-淋巴细胞上的IL-12R的物质后的一天被添加。
33.前述项目中任一项的方法，其中另外量的一种或多种能够对抗Th2型T-淋巴细胞的发展的物质，诸如例如一种或多种能够中和IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF-β的物质在整个阶段ii)中有规律地被添加。
34.项目33的方法，其中另外量的一种或多种能够对抗Th2型T-淋巴细胞的发展的物质，诸如例如一种或多种能够中和IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF-β的物质在阶段ii)中每隔一天、每隔两天或每隔三天被添加。
35.前述项目中任一项的方法，其中另外量的具有针对IL-2受体的激动活性的物质在整个阶段ii)中有规律地被添加。
36.项目35的方法，其中具有针对IL-2受体的激动活性的物质在阶段ii)中每隔一天、每隔两天或每隔三天，诸如例如每隔两天被添加。
37.项目35或36的方法，其中具有针对IL-2受体的激动活性的物质是IL-2。
38.前述项目中任一项的方法，其中第二阶段ii)包括添加一种或多种促进Th1型T-淋巴细胞的发展的物质。
39.项目38的方法，其中一种或多种促进Th1型T-淋巴细胞的发展的物质是具有针对IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21受体的激动活性的物质。
40.项目39的方法，其中一种或多种物质选自IL-7、IL-12、IL-15和IL-21。
41.项目38-40中任一项的方法，其中一种或多种促进Th1型T-淋巴细胞的发展的物质，诸如例如具有针对IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21受体的激动活性的物质，当IFN-γ的水平与第二阶段ii)启动时的IFN-γ的水平相比增加时被添加。
42.项目41的方法，其中IFN-γ水平的增加被确定为是，同第二阶段ii)启动时的IFN-γ的水平相比，IFN-γ水平至少1倍增加，诸如例如至少2倍增加，至少3倍增加，至少4倍增加。
43.项目38-42中任一项的方法，其中一种或多种促进Th1型T-淋巴细胞的发展的物质，诸如例如具有针对IL-12、IL-5和/或IL-21受体的激动活性的物质，当CD25和/或CD69下调时被添加。
44.项目38-43中任一项的方法，其中一种或多种促进Th1型T-淋巴细胞的发展的物质诸如例如具有针对IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21受体的激动活性的物质的每一种的添加浓度为约150国际单位/毫升培养基到约300国际单位/毫升培养基，诸如例如250国际单位/毫升培养基。
45.项目38-44中任一项的方法，其中一种或多种促进Th1型T-淋巴细胞的发展的物质，诸如例如具有针对IL-12、IL-15和/或IL-21受体的激动活性的物质，在启动第二阶段ii)后的第5天到第8天并包括第8天，诸如例如在第5天、第6天、第7天或第8天被添加。
46.前述项目中任一项的方法，用于制备CD4+辅助细胞T-淋巴细胞。
47.前述项目中任一项的方法，用于制备效应器型T-淋巴细胞。
48.前述项目中任一项的方法，用于制备记忆型T-淋巴细胞。
49.前述项目中任一项的方法，用于制备Th1型T-淋巴细胞。
50.前述项目中任一项的方法，其另外包括在第一阶段i)和第二阶段ii)期间连续地监控T-淋巴细胞上的细胞表面标记物诸如例如CD25和/或CD69的表达。
51.项目50的方法，其中T-淋巴细胞当在第二阶段ii)中T-淋巴细胞上的CD25下调时被收获。
52.项目51的方法，其中当T-淋巴细胞上的CD25下调时T-淋巴细胞经历至少一个另外回合的阶段ii)。
53.项目51或52的方法，其中下调被定义为5％或更低的CD4阳性T-淋巴细胞群表达CD25。
54.前述项目中任一项的方法，其中瘤反应性T-淋巴细胞在启动第二阶段ii)后的第10天到第14天并包括第14天被收获。
55.项目54的方法，其中瘤反应性T-淋巴细胞在收获后经过纯化。
56.前述项目中任一项的方法，另外包括冷冻在第二阶段ii)中获得的瘤反应性T-淋巴细胞的步骤。
57.前述项目中任一项的方法，其中T-淋巴细胞来自引流原发瘤和/或转移瘤的淋巴结，或者T-淋巴细胞来自血液。
58.根据项目1-57中任一项的方法制备的瘤反应性T-淋巴细胞。
59.项目58的瘤反应性T-淋巴细胞，其是CD4+T-淋巴细胞。
60.项目58或59的瘤反应性T-淋巴细胞，其是效应器型T-淋巴细胞。
61.项目58-60中任一项的瘤反应性T-淋巴细胞，其是记忆型T-淋巴细胞。
62.项目58-61中任一项的瘤反应性T-淋巴细胞，其是Th1型T-淋巴细胞。
63.药物组合物，其包括项目58-62中任一项的瘤反应性T-淋巴细胞。
64.治疗罹患瘤来源疾病的对象的方法，该方法包括对有需要的对象给用有效量的项目58-63中任一项的瘤反应性T-淋巴细胞。
65.在罹患瘤的对象中实现瘤退化的方法，该方法包括对有需要的对象给用有效量的项目58-63中任一项的瘤反应性T-淋巴细胞。
66.项目64或65的方法，其中瘤反应性T-淋巴细胞通过静脉内、动脉内、鞘内或腹膜内途径给用。
67.项目64-66中任一项的方法，其中给用的瘤反应性T-淋巴细胞的量为至少1000万，诸如例如至少2000万，至少3000万，至少4000万，至少5000万，至少6000万，至少7000万或至少8000万。
68.项目64-67中任一项的方法，其中给用的瘤反应性T-淋巴细胞是效应器型T-淋巴细胞和记忆型T-淋巴细胞的组合。
69.项目68的方法，其中效应器型T-淋巴细胞的百分数为约10％到约65％，诸如例如约20％到约50％，或约30％到约40％。
70.项目64-69中任一项的方法，其中瘤反应性T-淋巴细胞是自身的。
71.项目64-69中任一项的方法，其中瘤反应性T-淋巴细胞是非自身的。
72.项目64-71中任一项的方法，其中瘤疾病选自在任何解剖学部位内的上皮的、间冲质的或胚胎学来源的任何实体瘤，诸如上皮瘤，例如在乳房、结肠、胰腺、膀胱、小肠、前列腺、颈、外阴、卵巢内的癌；间冲质瘤，例如在关节、骨、肌肉和腱内的肉瘤和一些血液瘤诸如淋巴瘤；胚胎瘤如畸胎瘤。
73.根据项目1-57中任一项制备的瘤反应性T-淋巴细胞用于制备治疗瘤来源的疾病的药物的用途。
74.在项目1-57或64-72中任一项的方法中使用的试剂盒，该试剂盒包括用于培养T-淋巴细胞的培养基。
75.项目74的试剂盒，另外包括一种或多种用于刺激、激活和引导瘤反应性T-淋巴细胞的物质。
76.项目74或75的试剂盒，其中培养基是无血清培养基，诸如例如AIMV、RPMI 1640、DMEM或MEM。
77.项目74-76中任一项的试剂盒，其中一种或多种用于刺激、激活和引导瘤反应性T-淋巴细胞的物质选自：瘤由来抗原，具有针对IL-2受体的激动活性的物质，能够上调T-淋巴细胞上的IL-12R的物质，能够对抗Th2型T-淋巴细胞的发展的物质，和促进Th1型T-淋巴细胞的发展的物质。
78.项目74-77中任一项的试剂盒，其中一种或多种用于刺激、激活和引导瘤反应性T-淋巴细胞的物质选自：IL-2、干扰素-α、抗IL-4抗体、抗IL-5抗体、抗IL-10抗体、IL-7、IL-12、IL-15和IL-21。
79.项目74-78中任一项的试剂盒，包括适于静脉内给药的药物组合物。
80.项目74-79中任一项的试剂盒，另外包括包含淋巴结定位物质的注射器。
81.项目74-80中任一项的试剂盒，另外包括使用说明书。
82.项目81的试剂盒，其中说明书为计算机软件形式。
附图说明
图1说明前哨淋巴结是用于递呈和激活T细胞针对瘤抗原的反应性的天然的主要部位。
图2表示最初用瘤抗原和小剂量的IL-2激活前哨淋巴结淋巴细胞，导致激活标记物CD25的激活和表达(上图)。阶段I激活阶段的终止被定义为表达CD25的CD4+T细胞的数目降低(下图)。当低于5％的CD4+T细胞表达CD25时，使用抗原的再刺激启动阶段II。
图3说明阶段I和阶段II激活引起CD4+T辅助细胞的扩增和富集。
图4说明在阶段I内大多数细胞是原初CD62L+细胞或激活的CD69+CD62L+细胞。在阶段I1后，大多数细胞是CD62L-T细胞并由记忆型和效应器型CD4+T辅助细胞组成。CD62L-T细胞不表达优选的淋巴结归巢分子，因为它们寻找非淋巴器官内的炎性区域。
图5表示在阶段I内从瘤(瘤浸润淋巴细胞)，前哨淋巴结(SN)和不相关淋巴结(LN)刺激的初级细胞，导致IFN-γ生成很少。
图6说明在阶段ii)后的扩增之后，存在抗原依赖性IFN-γ生成的剂量依赖性增加。
图7说明扩增和激活过程促进抗原特异性T细胞克隆的扩增，这通过TCR Vβ表达的选择性富集进行调查说明。
图8A-D是第5号患者的CT扫描图。在输注瘤反应性淋巴细胞后，患者位于两个叶突内的肝转移瘤(其据称不能通过肝手术被医治)总体退化，CEA水平正常化，腹水消失和身体健康状况良好，有规律地锻炼。
图9A-F是第10号患者的CT扫描图。在输注瘤反应性淋巴细胞后，患者的肝转移瘤和腹水退化。其健康状况一般好并且经一步成像显示病情稳定。
图10A-H是第12号患者的CT扫描图。在输注3个月之后，其肝和肺内的转移瘤退化，CEA水平几乎正常，为5.9(标准值＜4.0)，腹水消失，并且临床表现健康。
图11显示在扩增的开始(A)和终止(B)时经门控用于表达被染色用于CD25和转录因子FoxP3表达的CD4+的T淋巴细胞。开始(图A)，4.8％的CD4+T淋巴细胞表达FoxP3和高水平的CD25，因此称作Treg。在扩增终止时，存在极少量(0.3％)的Treg(图B)。
实施例
实施例1
瘤反应性T-淋巴细胞的扩增
使用前哨淋巴结技术手术鉴定前哨淋巴结，简而言之，在瘤周围的浆膜内注射1ml的专利蓝染料(Guerbet，Paris)并进行表面分布。在5-10分钟内，1-3个肠系膜淋巴结被染成蓝色，这些前哨淋巴结用缝线做标记并被取出(参见图1)。一个非前哨肠系膜淋巴结，其与瘤远离，也被鉴定并被取出作为对照。
将前哨淋巴结和非前哨淋巴结切成两半，并从中心和周边取1毫米厚的切片。将其余的淋巴结送去做例行的组织病理学检查。还取出一部分瘤(其包括浸润边缘的样品)用于研究目的。
细胞培养
阶段I，最初激活
将前哨淋巴结物质保存在冰上并立即和一直用AIM V
培养基(Invitrogen)照料。通过在松动配合的玻璃匀浆器中进行温和匀浆，并且在匀浆后将细胞在培养基中洗涤两次获得前哨淋巴结淋巴细胞的单细胞悬浮液。将前哨淋巴结淋巴细胞以400万个细胞/毫升的浓度置于细胞培养烧瓶中，并且添加白细胞介素-2(IL-2)(Proleukin，Chiron)至240国际单位/毫升培养基的浓度。
通过使用Ultra Turrax在5体积(w/v)2x PBS匀浆，然后在97℃变性5分钟制备自身瘤提取物。在细胞培养开始之后的3到4天，添加浓度为1/100的自身瘤提取物。对于长期培养，将细胞置于37℃和5％CO2的细胞培养箱中，并且每3-4天添加240国际单位的IL-2/毫升培养基。
阶段II，激活和扩增
在18-22天后，监控细胞培养物的CD25的表达。当CD25表达细胞的数目减少到低于5％时，在阶段II(图2)中通过添加浓度为1/100的自身瘤提取物对细胞进行再刺激。为了有效的抗原呈递，使用菲克-帕PLUS(Amersham Biosciences，GE Healthcare)收集自身PBMC，并用2500吸收辐射剂量单位进行照射并添加到细胞培养物中。再刺激之后3天，添加浓度为100-500国际单位/毫升的干扰素-α(Introna)并添加抗IL-4抗体至2μg/毫升的浓度。在5-8天后，向扩增过程中添加IL-12(4ng/ml)以促进生成IFN-γ的Th1细胞的诱导。
在对患者输注的前一天，使用菲克-帕PLUS(Amersham Biosciences，GE Healthcare)对细胞培养物进行纯化，从而找回培养物内的活细胞。在输注当天，细胞在盐溶液(Natriumklorid Baxter Viaflo 9mg/ml，Baxter)中洗涤两次，然后被转移到含100-200ml盐溶液和1％人血清白蛋白(Baxter)的转移袋中。在输注之前检查微生物的存在。在专业医务监督下在1-2小时内完成细胞输注。
免疫学评价
使用用氚示踪的胸苷结合增殖试验进行进一步的免疫学评价。留出小份的前哨淋巴结淋巴细胞用于该目的，通过在松动配合的玻璃匀浆期中进行温和的匀浆获得非前哨淋巴结淋巴细胞的单细胞悬浮液，并且通过菲克-帕PLUS(Amersham Biosciences，GE Healthcare)纯化周围血液白细胞。
将细胞再悬浮并在含2.5％胎牛血清(FCS)(Life technologies)的RPMI 1640(Life technologies)中洗涤两次。最后，将细胞再悬浮在含10％人AB血清(Sigma)、1％青霉素-链霉素(Sigma)和1％谷氨酰胺(Sigma)的RPMI 1640增殖培养基中。在96孔板中以3×105个细胞/孔的浓度使用淋巴结细胞和纯化的PBL，并使用以1/100、1/10稀释的瘤匀浆或Con A 10μg/ml(Sigma)一式三份进行刺激。在收获之前18小时通过添加1μCi的3H-胸苷/孔(Amersham)，在第5、6和7天测量增殖。样品经历闪烁计数。
在开始细胞培养时，在96孔板内使用3×105个细胞/孔的浓度，使用以1/10和1/100稀释的瘤匀浆或Con A 10μg/ml(Sigma)一式三份进行用于测量IFN-y分泌的淋巴结细胞和PBL的刺激。对一式三份的合并的样本中的培养上清液进行ELISA(Human IFN-y Duoset，R&DSystems)来测量IFN-y的分泌量(图5)。在细胞培养终止时，取出上清液的样品，使用ELISA(Human IFN-Duoset and Human IL-4 Duoset，R&D Systems)一式三份测量IFN-Y和IL-4分泌(图6A和6B)。
流式细胞术
最初使用流式细胞术对得自前哨淋巴结、非前哨淋巴结、PBMC的和得自瘤的细胞进行细胞表征。每2-3周取得在培养样品内的得自前哨淋巴结的淋巴细胞用于流式细胞术分析。将细胞和抗标记物的抗体在补充有2％FCS和0.05％NaN3(FACS缓冲液)的PBS中培养30分钟用于免疫细胞亚群和用于淋巴细胞活化(图3、4和5)。使用对抗以下标记物的与异硫氰酸荧光素(FITC)结合的抗体：CD69，HLA-DR，CD45RA，CD25，对抗以下标记物的与藻红蛋白(PE)结合的抗体：CD62L，CD19，CD45RO，CD56，对抗以下标记物的与多甲藻黄素叶绿素蛋白(PerCP)结合的抗体：CD8，CD3，对抗以下标记物的与别藻蓝蛋白(APC)结合的抗体：CD4，CD14，CD8。
使用Beta mark试剂盒(Beckman Coulter)检测Vβ所有组成成分，将5×105个细胞/试管在10μl的8个不同的小瓶中进行染色，所述小瓶含有FITC、PE和双色FITC-PE结合型TCR Vβ抗体的混合物，并且在各试管中添加CD8PerCP和CD4APC(图7)。
实施例2
通过给药瘤反应性T-淋巴细胞治疗结肠癌
鉴定和取出得自结肠癌患者的前哨淋巴结和metinel淋巴结：
研究了十六名被诊断罹患结肠癌的患者，六名女性和十名男性，平均年龄为62岁。患者在解剖病理学上被分成Duke’s C或D期。还有5名Duke’s B期患者具有侵袭性瘤特征，诸如溃疡、血管或神经周浸润。然而，第7和14号患者先前已经历结肠癌手术，并且目前复发疾病，并有肝转移瘤。地方伦理委员会批准该项研究并且每名患者提供了知情同意书。
手术鉴定前哨淋巴结或metinel淋巴结。通过腹膜粘连分离术使结肠瘤部位发生移位以便于对瘤和肠系膜的检查。注射的专利蓝染料(Guerbet，Paris)在瘤周围的浆膜内进行表面分布。在5分钟内，1-3个肠系膜淋巴结被染成蓝色，当完成切除时这三个前哨淋巴结用缝线标明并被取出。以相同方式处理了一个与瘤远离的非前哨肠系膜淋巴结。
将前哨淋巴结和非前哨切成两半，并且从中心和周边取1mm厚的切片。其余的淋巴结被送去做例行的组织病理学检查。使用一片瘤(其包括一部分的浸润边缘)用于抗原制备。
得自淋巴结的淋巴细胞如实施例1所述进行扩增。
瘤反应性T-淋巴细胞的给药：
16名患者通过输注如实施例1所述进行扩增的自身淋巴细胞进行治疗。作为输注剂，给药了平均为7470万个激活的和克隆扩增的T细胞。没有观察到诸如发烧、发冷、不适、严重体液潴留、肺水肿或呼吸困难的毒副作用。
跟踪评价
跟踪评价包括每3-6个月临床检查并控制CEA水平。所有的III和IV期患者另外进行胸和腹的计算机层析成象术研究。患者平均13个月(5-20个月)定期寻访，中值跟踪时间为
个月。在经过输注自身淋巴细胞进行治疗的16名患者中，有8名患者在诊断时已知有远距离转移瘤。四名患者由于已知的疾病复发而接受了输注，其中三名患者仍然没有复发迹象。一名患者由于单独的肝转移瘤进行了手术并且在术后没有复发。从图8A-D可知，一名在两叶突内具有肝转移瘤(其据称不能通过肝手术进行医治)的患者在输注瘤反应性淋巴细胞后肝转移瘤总体退化，并另外CEA水平正常化，腹水消失和身体非常健康，和有规律地锻炼。另外一名患有肝转移瘤的患者在输注后肝转移瘤退化和腹水消失(参见图9A-F)。一名患者在输注后3个月，肝和肺内的转移瘤退化(参见图10A-H)，CEA水平几乎正常，为5.9(标准值＜4.0)，腹水消失并且其表现为临床健康。
结果
16名罹患结肠癌或单独的结肠直肠肝转移瘤的患者在the SouthStockholm General Hospital进行手术并且被包括在本项研究中。瘤的主要部位是：3名在盲肠，4名在升结肠，1名在降结肠，7名在乙状结肠，和1名在直肠。进行了1个右侧结肠部分切除，1个左侧结肠部分切除，7个乙状结肠切除和1个直肠切除。两名患者先前已经经过直肠切除和乙状结肠切除；它们目前经历由于肝转移瘤的局部肝切除。一种患者在两个腹部位置复发并且先前经历了盲肠瘤手术。在手术中，确定了二个引流转移瘤的前哨淋巴结，一个在结肠肠系膜内，另一个在小肠的肠系膜内。进行了具有肠系膜的吻合回肠结肠区域的延伸切除。
在全部患者中，通过在肿瘤周围手术注射专利蓝鉴定1-3个(平均数2.1个)前哨淋巴结。在进行初次结肠切除术的患者中，从各个样品重新得到平均15.8个淋巴结。在对这些淋巴结进行组织病理学检查后，5名患者被分在Duke’s C期，5名患者被分在Duke’s B期，所有这些患者由于在病理解剖学检查中沿着神经和血管的肿瘤细胞生长而被分为高风险瘤类别。5名患者具有远距离转移瘤并且在转移瘤切除时被分在Duke’s D期。他们中的两名患者具有单独的肝转移瘤。另外，还通过FACS(激发荧光细胞分离器)和抗细胞角蛋白20的抗体分析了前哨淋巴结，细胞角蛋白20由结肠癌肿瘤表达，用于检测微转移目的。通过流式细胞术对淋巴结进行的细胞角蛋白20分析与病理解剖诊断(未显示)一致，除了在一个病例中，在细胞角蛋白20FACS分析中假阴性前哨淋巴结(根据组织病理学分析)是阳性的之外。
前哨淋巴结是瘤引流的第一淋巴结并因此是淋巴结转移瘤的第一部位(Dahl等)，但是其它前哨淋巴结也是用于免疫系统激活的主要部位。肿瘤细胞、碎片、坏死细胞和抗原递呈细胞积聚在前哨淋巴结中，在那里发生针对瘤的T细胞的递呈、激活和克隆扩增。本发明人利用了得自该前哨淋巴结的淋巴细胞的体内扩增T细胞群用于体外细胞培养、扩增和输注。
得自前哨淋巴结的淋巴细胞是针对瘤抗原被激活和克隆扩增的T细胞群，其可在手术过程中被有效地收获。与新近的集中于细胞毒性T细胞的免疫治疗试验相反，本发明人瞄准的是生成用于体内启动的T辅助细胞克隆扩增的体外增强过程。T辅助细胞似乎是细胞毒性T细胞发挥有效作用和产生记忆细胞所必需的。另外，在靶向于小岛细胞抗原的T细胞受体转基因系统中，Th1细胞的输注被发现足够用于β细胞的破坏和糖尿病的发展。得自前哨淋巴结的淋巴细胞的体外培养导致T辅助细胞的Th1激活和克隆扩增，根据标志Th1细胞因子IFN-γ的支配性产生和限制性的TCR Vβ所有组成成分的富集所示。用于扩增T细胞的瘤匀浆可能通过用于导致扩增有利的T辅助细胞的CD4+T辅助细胞的激活的II级递呈的抗原递呈细胞进行内吞和加工。通过交叉递呈，由内吞作用被摄入的抗原在导致CD8+细胞毒性T细胞的激活的I类凹陷内被加工和存在。有趣地是，在一些情况下本发明人发现CD4+和CD8+T细胞二者的克隆扩增。
在扩增开始时得自前哨淋巴结的淋巴细胞的平均数为10740万个细胞(范围为360-50900万个，中值7000万个)。通过流式细胞术对细胞进行表征。在开始时，CD4+和CD8+的比为平均4.9(范围为0.36-10，中值5.4)，表明前哨淋巴结内的CD4+T辅助细胞与周围血液内的CD4/CD8比(正常范围为1.0-2.5)有扩增(图2A)。另外，B淋巴细胞(CD19)和天然杀伤(NK)细胞(CD 56)存在于前哨淋巴结内(未显示)。所述细胞在培养基中保持平均36.1天(范围为23-58天，中值33天)。至少每周通过流式细胞术严密监视细胞。最初细胞总数减少。B细胞和NK细胞几乎完全消失，并且CD8+T杀伤细胞数减少。使用的培养过程主要促进T辅助细胞的扩增，因为CD4/CD8的平均数比为92.5。使用自身瘤抗原的再刺激导致瘤反应性T细胞的克隆扩增，这通过研究在体外培养之前和之后的得自前哨淋巴结的淋巴细胞的T细胞受体Vβ所有组成成分进行评价。
在输注之前，检测了扩增的T细胞针对自身瘤抗原的功能，通过测量Th1细胞因子IFN-γ和Th2细胞因子IL-4的激活和细胞因子生产进行。体外扩增的得自前哨淋巴结的淋巴细胞对瘤抗原的再刺激产生应答，产生IFN-γ，并且不产生或产生很少的IL-4，表明扩增的T细胞具有作用并且是Th1应答的。
6名Duke’s D期患者在本项研究中进行治疗。2名Duke’s D期患者，在向肝和向肺和肝中转移瘤的手术中，分别显示明显的疾病退化(第5和12号患者)。在输注淋巴细胞后，第5号患者在两个叶突内的肝转移瘤(其据称不能通过肝手术进行医治)总体退化(图3)，CEA水平正常化，腹水失踪和表现健康。第12号患者肝和肺内的转移瘤退化，CEA水几乎正常，为5.9(标准值＜4.0)，腹水消失，和临床表现健康。第1号患者(女)表现出肝转移瘤的尺寸退化，并且CEA水平最初降低，腹水消失，并且当其突然死亡(第191天)时状态良好，好像是肺栓塞所致。两名Duke’s D期患者表现出病情稳定，没有转移瘤的发展或CEA水平的增加。年龄最大的第7号患者(女)表现出为期5个月的稳定病情，但是之后CEA水平开始增加，并且在其83岁时死亡。没有进行尸体解剖。一名Duke’s C期患者进行手术，但是不久发展成向肝和肺的转移瘤(Duke’s D期)，但是在输注和化疗后，可见肺和肝转移瘤的退化，并仅有CEA水平的轻微升高。被分在Duke’s C期的所有患者都具有标准的CEA水平，并且没有任何疾病的放射性或临床复发迹象。四名Duke’s B期患者是健康的，具有标准的CEA水平并且没有疾病复发迹象。第9号患者被分在Duke’s B期，但是具有侵袭性的生长瘤，显示病情复发，CEA水平提高(67)和肝转移瘤迹象。
为了研究输注的T细胞的走向，本发明人分析了周围血液中的针对瘤提取物的T细胞增殖。如上所述，本发明人不能证明在输注之前在任一患者中在周围血液内的任何针对自身瘤抗原的T细胞反应性。然而，本发明人能够检测在所有输注之后长达10个月的所有被调查患者的周围血液中针对自身瘤抗原的T细胞增殖，表明存在克隆扩增的循环瘤反应性T细胞。
患者特征概述
以下是在本项研究中的所有参与者的表格，手术进行Duke’s分期：
参与者特征：
年龄/性别 Duke’s分期 输注细胞数 CD4/CD8a IFN-γ 总体存 应答
(×106) (pg/ml) 活(月)
67/男 B 4 92/0.2 ND 31 SD
67/女 B 8 15/51 ND 30 SD
71/男 B 50 74/15 2091 29 SD
74/男 B 63 64/22 ND 29 SD
66/男 B 152 82/1.5 1411 27 SD
64/女 C 110 64/25 ND 34 SD
58/女 C 16 77/18 417 23 SD
61/女 D 1 3.7/35 ND 6 SD
47/男 D 80 24/16 ND 36 CR
54/男 D 40 37/24 ND 36 SD
65/男 D 270 82/15 ND 36 CR
42/女 D 80 66/11 ND 33 CR
82/女 D 40 98/0.1 ND 6 SD
74/男 D 130 73/22 142 30 CR
33/男 D 72 72/1.5 908 12 PR
66/男 D 25 37/27 764 26 PR
a)该数字表示使用FACS检测的CD4和CD8阳性细胞的百分数。
讨论
根据本发明人所掌握的知识，在本发明之前没有提供在结肠癌患者中使用基于前哨或metinel淋巴结的免疫治疗。因此，本发明是第一次试图使用从前哨或metinel淋巴结获得的淋巴细胞用于治疗。在本项研究和例如使用高剂量的IL-2(Rosenberg)之间存在一些较大差异。第一，使用通过自身瘤匀浆和APC进行体外刺激的得自前哨淋巴结的淋巴细胞引起针对瘤的高度特异性的细胞免疫应答。输注之前仅仅与原发瘤具有高亲合性的T细胞会存活。在使用高剂量的IL-2对患者静脉内给药的系统性一般治疗中，所有的淋巴细胞被同等地刺激并且有理由认为仅有极少部分的淋巴细胞是瘤特异性的。本发明人相信因为前哨淋巴结是瘤的第一引流淋巴结，因此会有瘤特异性淋巴细胞的过度积聚。真实的瘤识别T细胞的增殖和输注将产生大规模的瘤特异性反应。第二，高剂量的IL-2方案导致高的毒性和严重的并发症，治疗周期长，并且成本高。根据本发明方法的输注在约1小时内没有并发症，并且患者在当天出院。第三，本发明的方法针对得自前哨淋巴结的T辅助细胞的扩增，与作为瘤浸润淋巴细胞被收获的细胞毒性T细胞的扩增相反。
本研究表明新分离的得自前哨淋巴结的淋巴细胞具有体外针对自身瘤匀浆的增殖能力并且作为过继性免疫疗法被输注到患者时没有并发症。使用扩增的得自前哨淋巴结的淋巴细胞进行治疗强烈地显示了可改善具有结肠癌高风险或散布性结肠癌的患者，以及罹患各种类型的实体瘤的患者。
Claims (2)
1.用于扩增瘤反应性CD4+ T辅助细胞和/或CD8+ T-淋巴细胞的体外方法，该方法包括：
i) 使用瘤由来抗原和IL-2刺激瘤反应性CD4+T-辅助细胞和/或CD8+ T-淋巴细胞以促进瘤反应性CD4+T-辅助细胞和/或CD8+ T-淋巴细胞存活的第一阶段；和
ii) 激活和促进瘤反应性CD4+T辅助细胞和/或CD8+T-淋巴细胞生长的第二阶段，其中第二阶段ii)当CD4+ T辅助细胞和/或CD8+ T-淋巴细胞上的CD25细胞表面标记物下调时被启动，其中下调被定义为5%或更低的T-淋巴细胞群表达CD25，并且其中阶段ii)通过向T淋巴细胞添加用于激活瘤反应性CD25-阴性T淋巴细胞的瘤由来抗原被启动。
2.权利要求1的方法，其中第一阶段i)通过添加IL-2被启动。
3.权利要求1或2的方法，其中瘤由来抗原是经变性的瘤匀浆。
4. 权利要求1或2的方法，其中的瘤由来抗原是纯的蛋白质、多肽或肽形式的瘤由来抗原。
5.权利要求1或2的方法，其还包括向T-淋巴细胞添加抗原递呈细胞连同瘤由来抗原。
6. 权利要求3的方法，其中瘤由来抗原是自身抗原。
7. 权利要求5的方法，其中抗原递呈细胞是经照射的包含抗原递呈B细胞和/或单核细胞的周围血液白细胞。
8. 权利要求1或2的方法，其中第二阶段ii)包括添加至少一种能够上调T-淋巴细胞上的IL-12R的物质。
9. 权利要求1或2的方法，其中第二阶段ii)包括添加一种或多种能够对抗Th2型T-淋巴细胞的发展的物质。
10. 权利要求9的方法，其中一种或多种能够对抗Th2型T-淋巴细胞的发展的物质是一种或多种能够中和IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF- β的物质。
11. 权利要求10的方法，其中一种或多种能够中和IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF-β的物质是抗IL-4抗体、抗IL-5抗体和/或抗IL-10抗体，以及TGF- β的可溶受体和TGF-β的结合蛋白。
12. 权利要求1或2的方法，其中另外量的一种或多种能够对抗Th2型T-淋巴细胞的发展的物质在整个阶段ii)中有规律地被添加。
13. 权利要求12的方法，其中一种或多种能够对抗Th2型T-淋巴细胞的发展的物质选自一种或多种能够中和IL-4、IL-5、IL-10和/或TGF- β的物质。
14. 权利要求1或2的方法，其中第二阶段ii)包括添加一种或多种促进Th1型T-淋巴细胞的发展的物质。
15. 权利要求14的方法，其中一种或多种促进Th1型T-淋巴细胞的发展的物质是具有针对IL-7、IL-12、IL-15和/或IL-21受体的激动活性的物质。
16. 权利要求15的方法，其中一种或多种物质选自IL-7、IL-12、IL-15和IL-21。
17. 权利要求1或2的方法，用于制备记忆型和/或效应器型的Th1-淋巴细胞。
18. 权利要求1或2的方法，其另外包括在第一阶段i)和第二阶段ii)期间连续地监控T-淋巴细胞上的细胞表面标记物CD25和/或CD69的表达，并且其中T-淋巴细胞当在第二阶段ii)中T-淋巴细胞上的CD25下调时被收获。
19. 权利要求18的方法，其中当T-淋巴细胞上的CD25下调时T-淋巴细胞经历至少一个另外回合的阶段ii)。
20. 权利要求1或2的方法，其中T-淋巴细胞来自引流原发瘤和/或转移瘤的淋巴结，或者T-淋巴细胞来自血液。
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