JP2022520302A - 超活性化サイトカインキラーｔ細胞の増殖させ濃縮された集団を含む細胞製品を含有する組成物及びその作製方法 - Google Patents

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Abstract

本開示では、薬学的に許容される担体と、超活性化サイトカインキラーＴ細胞の増殖させ濃縮された集団を含む細胞製品とを含む医薬組成物、及びかかる細胞製品を製造するための方法を記載する。【選択図】なし

Description

関連出願
本願は、２０１８年１１月１３日に出願された米国仮出願第６２／７６０，０７７号の利益及び優先権を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれる。
リンパ球は、免疫系制御に関与する白血球の一種である。リンパ球はリンパ系においてより多く見られ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、キラーＴ細胞、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。リンパ球には大きく分けてＴ細胞及びＢ細胞の２種類がある。Ｔ細胞は細胞性免疫に関与し、Ｂ細胞は体液性免疫（抗体に関連する）に関与する。Ｔ細胞は、これらのリンパ球が胸腺で成熟することからそのような名前が付けられており、Ｂ細胞は骨髄で成熟することがそのような名前が付けられている。Ｂ細胞は病原体に結合する抗体を作り、それらの破壊を可能にする。ＣＤ４＋（ヘルパー）Ｔ細胞は免疫応答を調整する。ＣＤ８＋（細胞傷害性）Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、例えば、ウイルスに感染している、または抗原配列を提示している、体の細胞を殺傷することができる。
侵入病原体に対する免疫応答には、自然免疫の活性化の成功を必要とし、これが、次なる適応免疫応答の発達を知らせる。
ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞は、特殊化したＴ細胞の不均一なサブセットである（Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３ Ｆｅｂ；１３（２）：１０１－１７）。これらの細胞は、抗原への曝露に対する即時反応という自然免疫系細胞様の特徴と併せて、適応免疫系細胞の抗原認識の正確さ及び多様なエフェクター応答を示す（Ｓａｌｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４；３２（）：３２３－６６）。通常型Ｔ細胞同様、ＮＫＴ細胞は胸腺で分化し選択を受け、抗原を認識するためのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有する（Ｂｅｒｚｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００４ Ｊｕｎ；８２（３）：２６９－７５）。
ＴＣＲ遺伝子の多様性は、Ｔ細胞の胸腺での分化中、Ｖ遺伝子断片及びＪ遺伝子断片の再構成によって生み出される。（Ｍａｋｉｎｏ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐｔｌ Ｍｅｄ．１７７：１３９９－１４０８）。ＴＣＲのＶ遺伝子断片及びＪ遺伝子断片は、Ｉｇ遺伝子同様、１２／２３ｂｐのスペーサーによって隔てられたヘプタマー配列とノナマー配列が生殖細胞系列のＶ遺伝子断片及びＪ遺伝子断片に隣接している、組換えシグナルを有する。同文献。
ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞は、αβＴ細胞受容体（ＴＣＲ）とＮＫ細胞の系列マーカーのうちのいくつかの両方の発現によって定義される、Ｔリンパ球の小集団を表す。しかしながら、通常型Ｔ細胞とは異なり、ＮＫＴ細胞によって発現されるＴＣＲは、保存された非多型のＭＨＣクラス１様分子であるＣＤ１ｄにより提示される脂質抗原を認識する（Ｇｏｄｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５ Ｎｏｖ；１６（１１）：１１１４－２３）。ＴＣＲに加え、ＮＫＴ細胞はまた、ＮＫ細胞及び自然リンパ球等の自然免疫系細胞同様、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２５、及びＩＬ－２３等のサイトカインに対する受容体も有する（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３ Ｊａｎ；１４（１）：９０－９）。これらのサイトカイン受容体は、ＴＣＲシグナルが存在しない場合であっても、これらの炎症性サイトカインの定常状態での発現によって活性化され得る。したがって、ＮＫＴ細胞は、ＴＣＲ介在性の刺激と炎症性サイトカインの両方からのシグナルを併合して、一連のサイトカインの迅速な放出を発現させることができる（Ｋｏｈｌｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１６ Ａｕｇ；６８（８）：６４９－６３）。次いで、これらのサイトカインは、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）中に存在する異なる免疫細胞を調節し、それによりがんに対する宿主免疫応答に影響を与えることができる。
表１に示すように、ＮＫＴ細胞にはいくつかのサブタイプがあり、それらは、そのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の利用、サイトカイン産生、特定の表面分子の発現及び反応性により決定され得る。
表１
Figure 2022520302000001
Ｉ型ＮＫＴ細胞
ＣＤ１ｄ拘束性ＮＫＴ細胞は、そのＴＣＲの多様性及び抗原特異性に基づいて２つの主要サブセットに大別することができる。最も広く明らかにされているＮＫＴ細胞サブタイプは、Ｉ型ナチュラルキラーＴ細胞またはインバリアントナチュラルキラーＴ細胞（ｉＮＫＴ細胞）である（Ｍａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０：３５８－６８，２００８）。Ｉ型（インバリアント）ＮＫＴ細胞（ｉＮＫＴ細胞）は、そのＴＣＲレパートリーが限られており、セミインバリアントＴＣＲ（ｉＴＣＲ）α鎖（マウスではＶα１４－Ｊα１８、ヒトではＶα２４－Ｊα１８）が不均一なＶβ鎖レパートリー（マウスではＶβ２、７または８．２、ヒトではＶβ１１）と対形成して発現することからそのような名前が付けられている（Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３ Ｆｅｂ；１３（２）：１０１－１７、Ｓａｌｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４；３２（）：３２３－６６）。Ｉ型ＮＫＴ細胞の原型的な抗原は、抗腫瘍スクリーニングの一部として海綿から単離されたガラクトシルセラミド（α－ＧａｌＣｅｒまたはＫＲＮ７０００）である（Ｋａｗａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９７ Ｎｏｖ ２８；２７８（５３４３）：１６２６－９）。α－ＧａｌＣｅｒは、Ｉ型ＮＫＴ細胞の強力な活性化因子であり、Ｉ型ＮＫＴ細胞を誘導して大量のインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）を放出させ、これによりＣＤ８＋Ｔ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）の両方の活性化を助ける（Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２ Ａｕｇ；２（８）：５５７－６８）。Ｉ型ＮＫＴ細胞の研究に使用された主な手法には、ＣＤ１ｄ担持α－ＧａｌＣｅｒ四量体を使用してＩ型ＮＫＴ細胞を染色し同定すること、α－ＧａｌＣｅｒを投与して、Ｉ型ＮＫＴ細胞を活性化させ、その機能を検討すること、最後に、ＣＤ１ｄ欠損マウス（Ｉ型とＩＩ型の両方のＮＫＴを欠く）またはＪα１８欠損マウス（Ｉ型ＮＫＴのみを欠いている）を使用すること（Ｂｅｒｚｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００４ Ｊｕｎ；８２（３）：２６９－７５）が含まれる。Ｊα１８欠損マウスはまた、Ｔｒａｊ１８遺伝子断片（Ｉ型ＮＫＴ細胞の分化に必須）の欠失を有していることに加え、導入遺伝子がＴｒａｊ１８の上流のいくつかのＪαセグメントの再構成に与える影響により引き起こされる、全体的なＴＣＲレパートリーの低さを示し、Ｊα１８欠損マウスから取得したデータの解釈を複雑にしていることが報告されている（Ｂｅｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２ Ｊｕｌ １９；１３（８）：７０５－６）。この欠点を克服するため、今後のＩ型ＮＫＴ細胞の研究が容易になるよう、Ｉ型ＮＫＴ細胞を欠いているが全体的なＴＣＲレパートリーは維持されている、新たな系統のＪα１８欠損マウスが樹立された（Ｃｈａｎｄｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５ Ａｕｇ；１６（８）：７９９－８０）。Ｉ型ＮＫＴ細胞は、ＣＤ４及びＣＤ８の表面発現に基づいて、ＣＤ４＋サブセット及びＣＤ４－ＣＤ８－（ダブルネガティブまたはＤＮ）サブセット、ならびにヒトで見出されるごく一部のＣＤ８＋細胞にさらに細分することができる（Ｂｅｎｄｅｌａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９４ Ｍａｒ ２５；２６３（５１５４）：１７７４－８、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２００２ Ｍａｒ ４；１９５（５）：６３７－４１）。Ｉ型ＮＫＴ細胞は、マウス及びヒトの両方の様々な組織に存在するが、マウスにおいてより頻度が高い（Ａｒｒｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００９ Ｆｅｂ；２１８（２）：２４６－５０）。
Ｉ型ＮＫＴ細胞は、自己脂質と外来脂質の両方に対する二重の反応性を有する。定常状態であっても、Ｉ型ＮＫＴ細胞は活性化／メモリー表現型を有する（Ｂｅｎｄｅｌａｃ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７；２５（）：２９７－３３６、Ｇｏｄｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０ Ｍａｒ；１１（３）：１９７－２０６）。
通常型Ｔ細胞のＴｈ１サブセット、Ｔｈ２サブセット、Ｔｈ１７サブセット、及びＴＦＨサブセットに類似の機能的に別個のＮＫＴ細胞サブセットが報告されている。これらのサブセットは、通常型Ｔ細胞のサブセットそれぞれに対応するサイトカイン、転写因子及び表面マーカーを発現する（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０１５ Ｓｅｐ １５；４３（３）：５６６－７８）。Ｉ型ＮＫＴ細胞には、いくつかの転写因子により制御される特有の分化プログラムがある（Ｄａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２０１０ Ｎｏｖ；２３８（１）：１９５－２１５．）。転写的には、Ｉ型ＮＫＴ細胞の分化及び活性化メモリー表現型の主要調節因子の一つは、転写因子である前骨髄球性白血病ジンクフィンガー（ＰＬＺＦ）である。事実、ＰＬＺＦ欠損マウスは、Ｉ型ＮＫＴ細胞及びサイトカイン産生の重度の欠損を示す（Ｋｏｖａｌｏｖｓｋｙ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００８）９：１０５５－６４．１０．１０３８／ｎｉ．１６４；Ｓａｖａｇｅ ＡＫ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００８）２９：３９１－４０３．）。Ｉ型ＮＫＴ細胞の分化に影響を及ぼすことが知られている他の転写因子は、ｃ－Ｍｙｃ（Ｄｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００９ Ｍａｙ ２６；１０６（２１）：８６４１－６）、ＲＯＲγｔ（Ｍｉｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００８ Ｄｅｃ １６；１０５（５０）：１９８４５－５０）、ｃ－Ｍｙｂ（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０ Ｍａｙ；１１（５）：４３５－４１）、Ｅｌｆ－１（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１１ Ｆｅｂ １０；１１７（６）：１８８０－７）、及びＲｕｎｘ１（Ｅｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００５ Ｊｕｎ；２２（６）：７０５－１６）である。さらに、Ｔｈ１系列特異的転写因子Ｔ－ｂｅｔ及びＴｈ２特異的転写因子ＧＡＴＡ－３等の通常型Ｔ細胞分化を制御する転写因子もまた、Ｉ型ＮＫＴ細胞の分化に影響を与え得る（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００６ Ｎｏｖ １５；１７７（１０）；６６５０－９；Ｔｏｗｎｓｅｎｄ ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ２００４ Ａｐｒ；２０（４）；４７７－９４）。転写因子の他に、ＳＬＡＭ結合タンパク質（ＳＡＰ）シグナル伝達経路もまた、Ｉ型ＮＫＴ細胞の増殖及び分化を選択的に制御し得る（Ｎｉｃｈｏｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００５ Ｍａｒ；１１（３）：３４０－５）。Ｉ型ＮＫＴ細胞は、αとβが結合されたスフィンゴ糖脂質（ＧＳＬ）、セラミド、及びリン脂質に対して自己のものであっても外来性であっても応答することが示されている（Ｍａｃｈｏ－Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５；６：３６２）。Ｉ型ＮＫＴ細胞は、主に、腫瘍に対する効果的な免疫応答の開始を助けることが報告されている（ＭｃＥｗｅｎ－Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．２０１５ Ｍａｙ；３（５）：４２５－３５、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４；５（）：５４３、Ａｍｂｒｏｓｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７ Ｏｃｔ １５；１７９（８）：５１２６－３６）。
ＩＩ型ＮＫＴ細胞
多様性ＮＫＴ細胞またはバリアントＮＫＴ細胞とも呼ばれるＩＩ型ＮＫＴ細胞は、多様性の高いアルファ－ベータＴＣＲを発現し、α－ＧａｌＣｅｒを認識しない、ＣＤ１ｄ拘束性Ｔ細胞である（Ｃａｒｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９９５ Ｏｃｔ １；１８２（４）：９９３－１００４）。ＩＩ型ＮＫＴ細胞はヒトでの主なサブセットであり、Ｉ型ＮＫＴ細胞と比較して頻度が高い。すべてのＩＩ型ＮＫＴ細胞を同定するための特異的マーカー及び作動性抗原が存在しないため、これらの細胞の特徴付けは困難であった。ＩＩ型ＮＫＴ細胞の特徴付けをするために使用される異なる方法としては、Ｊα１８－／－（Ｉ型ＮＫＴのみを欠いている）マウスとＣＤ１ｄ－／－（Ｉ型及びＩＩ型の両方のＮＫＴを欠いている）マウスで免疫応答を比較すること、２４αβＴＣＲトランスジェニックマウス（ＩＩ型ＮＫＴ細胞ハイブリドーマＶＩＩＩ２４からのＶα３．２／Ｖβ９ＴＣＲを過剰発現する）を使用すること、Ｊα１８欠損ＩＬ－４レポーターマウスモデルを使用すること、抗原担持ＣＤ１ｄ四量体を用いて染色すること、及びＩＩ型ＮＫＴハイブリドーマへの結合を評価することが含まれる［Ｍａｃｈｏ－Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５；６：３６２）に概説されている］。
マウスにおいて自己糖脂質反応性のＩＩ型ＮＫＴ細胞で同定された最初の主要抗原はミエリン由来糖脂質スルファチドであった（Ａｒｒｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００９ Ｆｅｂ；２１８（２）：２４６－５０、Ｊａｈｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２００１ Ｄｅｃ １７；１９４（１２）：１７８９－９９）。その後、スルファチド及びリゾスルファチドに反応性のＣＤ１ｄ拘束性ヒトＩＩ型ＮＫＴ細胞が報告されている（（Ｓｈａｍｓｈｉｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００２；１９５：１０１３－１０２１、Ｂｌｏｍｑｖｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９ Ｊｕｌ；３９（７）：１７２６－１７３５．））。スルファチド特異的ＩＩ型ＮＫＴ細胞は主に、オリゴクローナルなＴＣＲレパートリー（Ｖα３／Ｖα１－Ｊα７／Ｊα９及びＶβ８．１／Ｖβ３．１－Ｊβ２．７）を示す（Ａｒｒｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００９ Ｆｅｂ；２１８（２）：２４６－５０）。β ＧｌｃＣｅｒ及びβ ＧａｌＣｅｒ等の他の自己糖脂質は、マウスＩＩ型ＮＫＴ細胞を活性化することが示されている（Ｒｈｏｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２ Ｓｅｐ；７６（３）：２４６－５５、Ｎａｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１５ Ｆｅｂ １９；１２５（８）：１２５６－７１）。ゴーシェ病（ＧＤ）で蓄積した２つの主なスフィンゴ脂質であるβ－グルコシルセラミド（β ＧｌｃＣｅｒ）とその脱アシル化産物グルコシルスフィンゴシンが、マウス及びヒトのＩＩ型ＮＫＴ細胞により認識されることが報告された（Ｎａｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１５ Ｆｅｂ １９；１２５（８）：１２５６－７１）。初期の研究では、髄腫患者で顕著に上方制御されるリゾリン脂質であるリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）がヒトＩＩ型ＮＫＴ細胞の抗原であることが示された（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００８ Ａｕｇ １５；１１２（４）：１３０８－１６）。
ＩＩ型ＮＫＴ細胞は、Ｉ型ＮＫＴ細胞とは、マウスに対してヒトに多いこと、ＴＣＲ結合性、及び異なる抗原特異性により区別することができる（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１７ Ｆｅｂ １；１９８（３）：１０１５－１０２１）。
ＩＩ型ＮＫＴ ＴＣＲ－スルファチド／ＣＤ１ｄ複合体及びＩ型ＮＫＴ ＴＣＲ－α－ＧａｌＣｅｒ／ＣＤ１ｄ複合体の結晶構造から、ＮＫＴのＴＣＲが抗原を認識する機序に関する洞察が得られる（Ｇｉｒａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２０１２ Ｎｏｖ；２５０（１）：１６７－７９）。Ｉ型ＮＫＴのＴＣＲは、剛性の平行な立体配置をしたα－ＧａｌＣｅｒ／ＣＤ１ｄ複合体と主にα鎖を使用して結合することが見出された。Ｉ型ＮＫＴ細胞のセミ－ｉＴＣＲのＣＤＲ２β、ＣＤＲ３α、及びＣＤＲ１αのループ内部にある主要残基が、α－ＧａｌＣｅｒ／ＣＤ１ｄ複合体の検出に関与すること決定された（Ｐｅｌｌｉｃｃｉ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００９ Ｊｕｌ １７；３１（１）：４７－５９）。一方、ＩＩ型ＮＫＴのＴＣＲは、主にそれらのＣＤＲ３αループではなくＣＤＲ３βループを介して、ＭＨＣ拘束性の通常型Ｔ細胞の一部で観察される結合と非常に類似した逆平行様式で自身のリガンドと接触する（Ｇｒｉａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２ Ｓｅｐ；１３（９）：８５１－６）。スルファチド反応性ＴＣＲ分子の三元構造から、ＣＤＲ３αループは主にＣＤ１ｄに接触し、ＣＤＲ３βがスルファチド抗原の特異性を決定することが明らかになった（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２ Ｓｅｐ；１３（９）：８５７－６３）。ＴＣＲ－ペプチド－ＭＨＣ複合体と類似する、ＩＩ型ＮＫＴのＴＣＲがその抗原に結合する際の柔軟性は、ＩＩ型ＮＫＴのＴＣＲの多様性の高さ及び広い範囲のリガンドに応答する能力と共鳴する。
しかしながら、２つのサブセット間の顕著な相違にもかかわらず、その２つのサブセット間での類似性も報告されている。例えば、Ｉ型及びＩＩ型のいずれのＮＫＴ細胞も自己反応性であり、その分化には転写調節因子のＰＬＺＦ及びＳＡＰに依存する、（Ｒｈｏｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２ Ｓｅｐ；７６（３）：２４６－５５）。多くのＩＩ型ＮＫＴ細胞は、Ｉ型ＮＫＴ細胞のように活性化／メモリー表現型を有すると思われるが、他の研究では、ＩＩ型ＮＫＴ細胞のサブセットもまた、ナイーブＴ細胞の表現型（ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＤ６２ｈｉｇｈ、及びＣＤ６９－／ｌｏｗ）を提示していた（Ａｒｒｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１０ Ｊｕｎ １５；１０７（２４）：１０９８４－９）。ＩＩ型ＮＫＴ細胞は、脂質／ＣＤ１ｄ複合体の認識に続くＴＣＲシグナル伝達によって主に活性化され（Ｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８ Ｍａｒ １；１８０（５）：２９４２－５０）、ＴＬＲシグナル伝達またはＩＬ－１２の存在とは無関係である（Ｚｅｉｓｓｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．２０１２ Ｆｅｂ；１２５０：１４－２４）。
Ｔ細胞の分化
Ｔ細胞が胸腺で分化するにつれ、ＴＣＲシグナルは、細胞が成熟の様々なステージを通過する際に重要なチェックポイントを提供する。（Ｈｕａｎｇ，Ｅ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００３）１７１：２２９６－２３０４を参照のこと）。例えば、プレＴＣＲシグナルは、ダブルネガティブ（ＤＮ）と呼ばれる最も未熟な胸腺細胞サブセットが、ＣＤ４とＣＤ８の両方を発現するダブルポジティブ（ＤＰ）胸腺細胞へと分化するために必要である。同文献。ＣＤ３、ｐｒｅＴα、及び機能的に再構成されたＴＣＲβ鎖の構築と表面発現により、このβ選択と呼ばれるチェックポイントが媒介される。同文献。プレＴＣＲシグナル伝達が成功した後、ＤＮ胸腺細胞は、多数回の分裂及び表現型の複数の変更を受ける。同文献。プレＴＣＲ成分をコードする遺伝子に加え、プレＴＣＲシグナル伝達に間接的に影響を与えるかまたはＤＮからＤＰへの移行時に見られる多くの細胞変化に必要とされる他のいくつかの遺伝子が、成熟を制御する。同文献。
Ｉ型ＮＫＴ細胞の分化
マウス及びヒトのいずれにおいても、Ｉ型ＮＫＴ細胞は、ＴＣＲαβの発現と一致するダブルポジティブ（ＣＤ４＋ＣＤ８＋、ＤＰ）の胸腺細胞ステージでの分化中に通常型Ｔ細胞から分離する（Ｇｏｄｆｒｅｙ ＤＩ，Ｂｅｒｚｉｎｓ ＳＰ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７ Ｊｕｌ；７（７）：５０５－１８）。Ｉ型ＮＫＴ細胞が使用する古典的なＴＣＲαの発生はランダムな事象であると広く考えられており、これは、インバリアントなＶα１４－Ｊα１８再構成を定義するアミノ酸は決して変化しないが、これらのアミノ酸をコードするために使用されるヌクレオチドは多様であることが配列解析から明らかにされたことによる（Ｌａｎｔｚ Ｏ，Ｂｅｎｄｅｌａｃ Ａ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９９４ Ｓｅｐ １；１８０（３）：１０９７－１０６）。ＴＣＲα遺伝子座での組換え事象に対する構造的制約のため、Ｖα及びＪαの多くの遺伝子断片が、遺伝子座でのそれらの相対的位置に応じて組換えのために接近可能となる。結果として、Ｖα１４遺伝子断片は、出生前の２４～４８時間の間にようやくＪα１８との再構成を開始する（Ｈａｇｅｒ Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７ Ａｕｇ １５；１７９（４）：２２２８－３４）。このことは、胸腺でのＮＫＴ細胞の出現が比較的遅いことを説明しており、共通のＴ細胞前駆細胞プール内での古典的Ｖα１４－Ｊα１８再構成のランダムな発生と一致する。さらに、最も初期に同定されるＮＫＴ細胞前駆体の頻度は、１０6個の胸腺細胞につき１個の細胞と推定された（Ｂｅｎｌａｇｈａ Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２００５ Ａｕｇ １５；２０２（４）：４８５－９２）。まとめると、これらのデータは、Ｖα１４－Ｊα１８再構成が非常に低い頻度でランダムに生じるという考えを支持している。
通常型Ｔ細胞の場合と同様、Ｉ型ＮＫＴ細胞の分化には自己の認識を必要とする。拘束要素であるＣＤ１ｄは、ＤＰ胸腺細胞と胸腺上皮細胞の両方により発現される。しかしながら、初期の研究では、Ｉ型ＮＫＴ細胞は、通常型Ｔ細胞の選択を誘導する上皮細胞とは対照的に、ＣＤ１ｄを発現しているＤＰ細胞自身によりＤＰステージにおいて選択されることが明らかになった。そのような選択様式により、選択された胸腺細胞に対してＩ型ＮＫＴ細胞の特有の分化プログラムが付与されるという仮説を立てた。最近、ＤＰ－ＤＰシナプス全体の同型相互作用が、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）ファミリーのうち少なくとも２つのメンバー（Ｓｌａｍｆ１［ＳＬＡＭ］及びＳｌａｍｆ６［Ｌｙ１０８］）［８λλ－１０λλ］の同種親和性受容体の協調的会合により媒介される「第２のシグナル」を生成することが実証された。そのような会合は、これまでＩ型ＮＫＴ細胞系列の増殖及び分化に必須であると認識されていた、アダプターのＳＬＡＭ結合タンパク質（ＳＡＰ）及びＳｒｃキナーゼのＦｙｎの下流への動員をもたらす（Ｇｏｄｆｒｅｙ ＤＩ，２００７）。
正の選択を受けたＩ型ＮＫＴ細胞は、胸腺で増殖し、調整された成熟過程を経て、最終的にそれらの活性化ＮＫ様表現型の獲得がもたらされる。この過程は、サイトカイン受容体、シグナル伝達分子（例えば、Ｆｙｎ、ＳＡＰ）、転写因子（例えば、ＮＦκＢ、Ｔ－ｂｅｔ、Ｅｔｓ１、Ｒｕｎｘ１、ＲＯＲγ、Ｉｔｋ、Ｒｌｋ、ＡＰ－１）（概説はＧｏｄｆｒｅｙ ＤＩ，２００７を参照のこと）、ならびにＣＤ２８及びＩＣＯＳ等の共刺激分子の正常な発現に依存する（Ｈａｙａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１ Ｍａｙ １５；１６６（１０）：６０１２－８、Ａｋｂａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８ Ａｐｒ １５；１８０（８）：５４４８－５４５６）。ほとんどのＩ型ＮＫＴ細胞は、未熟ステージ（ＮＫ１．１等のＮＫ受容体発現の不在により定義される）で胸腺を離れ、末梢で自身の最終成熟を果たす（Ｂｅｎｌａｇｈａ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００２ Ａｐｒ １９；２９６（５５６７）：５５３－５；ＭｃＮａｂ ＦＷ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５ Ｓｅｐ １５；１７５（６）：３７６２－８）。しかしながら、末梢臓器ではこれらのＮＫ１．１－Ｉ型ＮＫＴ細胞のうちかなりの割合の細胞がＮＫマーカーの発現を獲得しておらず、事実、ＮＫ１．１＋胸腺成熟細胞とは機能的に異なる成熟細胞となっている（ＭｃＮａｂ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７；１７９：６６３０－６６３７）。
胸腺から末梢へのＩ型ＮＫＴ細胞の移出には、胸腺間質細胞により発現されるＬＴβ受容体を介した、リンホトキシン（ＬＴ）αβのシグナル伝達必要とする（Ｆｒａｎｋｉ ＡＳ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００６ Ｊｕｎ １３；１０３（２４）：９１６０－５）。そのようなシグナル伝達が胸腺髄質のケモカイン分泌を制御する（Ｚｈｕ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７ Ｄｅｃ １５；１７９（１２）：８０６９－７５）。末梢におけるＩ型ＮＫＴ細胞の組織常在性の確立にはＩ型ＮＫＴ細胞によるスフィンゴシン１－リン酸１受容体（Ｓ１Ｐ１Ｒ）の発現（Ａｌｌｅｎｄｅ ＭＬ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．２００８ Ｊａｎ；２２（１）：３０７－１５）を必要とし、より具体的には、肝臓局在のためにＣｘＣＲ６の発現を必要とする（Ｇｅｉｓｓｍａｎｎ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ．２００５ Ａｐｒ；３（４）：ｅ１１３）。
しかしながら、多くのＩ型ＮＫＴ細胞は胸腺内に残留し、そこでＮＫ１．１＋表現型に成熟し、寿命の長い常在細胞となる（Ｂｅｒｚｉｎｓ ＳＰ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６ Ａｐｒ １；１７６（７）：４０５９－６５）。様々な分化ステージにおけるＩ型ＮＫＴ細胞の胸腺からの輸送／保持に関与する機序は不明である。
Ｉ型ＮＫＴ細胞の活性
Ｉ型ＮＫＴ細胞は、免疫応答の際に多くの異なる活性を有することが示されている。Ｉ型ＮＫＴ細胞は、サイトカイン及びケモカインを急速かつ強く産生する能力を有するだけではなく、その名が示すように、他の細胞を殺傷する能力も有する。さらに、他の多くの免疫細胞の挙動に影響を及ぼすことが示されている。この項では、Ｉ型ＮＫＴ細胞に起因する多数の機能特性について記載する。
サイトカイン及びケモカインの産生
Ｉ型ＮＫＴ細胞は最初、マウスにおいて抗ＣＤ３抗体注入時にＩＬ－４を急速かつ強く産生する特有の能力を有した、ＮＫマーカーを有する異常なＴ細胞集団として同定された。後の研究で、この強いＩＬ－４産生はＩ型ＮＫＴ細胞のシグネチャーではあるが、Ｉ型ＮＫＴ細胞が産生できるサイトカインはこれのみではないことが明らかになった。Ｉ型ＮＫＴ細胞は、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－４、ならびにＩＬ－２、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＴＮＦ－α、ＴＧＦ－β及びＧＭ－ＣＳＦを産生することが示されている（Ｂｅｎｄｅｌａｃ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７；２５（）：２９７－３３６、Ｇｕｍｐｅｒｚ ＪＥ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２００２ Ｍａｒ ４；１９５（５）：６２５－３６）。Ｉ型ＮＫＴ細胞はまた、一連のケモカインを産生することも知られている（Ｃｈａｎｇ ＹＪ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００７ Ｊｕｎ １９；１０４（２５）：１０２９９－３０４）。
α－ＧａｌＣｅｒ抗原投与後のインビボでのＩ型ＮＫＴ細胞によるＩＬ－４及びＩＦＮγの急速かつ二重の産生は、Ｉ型ＮＫＴ細胞のトレードマーク的特徴となっている。事実、インビボでの抗原曝露の２時間以内に、ナイーブマウスのエキソビボＩ型ＮＫＴ細胞の細胞内解析を行ったところ、肝臓内のＩ型ＮＫＴ細胞の大部分がＩＬ－４及びＩＦＮγの両方を産生したことが明らかになった（Ｍａｔｓｕｄａ ＪＬ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２０００ Ｓｅｐ ４；１９２（５）：７４１－５４）。未感作マウスのＩ型ＮＫＴ細胞が活性化された際にいかにしてそれほど急速にサイトカインを産生するのかは不明である。しかしながら、静止期のＩ型ＮＫＴ細胞はＩＬ－４及びＩＦＮγのｍＲＮＡレベルが高いという観察から、可能性の高い１つの機序が提供される（Ｍａｔｓｕｄａ ＪＬ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００３ Ｊｕｌ ８；１００（１４）：８３９５－４００、Ｓｔｅｔｓｏｎ ＤＢ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２００３ Ｏｃｔ ６；１９８（７）：１０６９－７６）。
Ｉ型ＮＫＴ細胞はまた、そのサイトカイン産生を転写レベルで制御する。通常型Ｔ細胞でサイトカイン遺伝子の転写を制御することが知られているいくつかの転写因子（Ｔ－ｂｅｔ、ＧＡＴＡ－３、ＮＦκＢ］、ｃ－Ｒｅｌ、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１、ＳＴＡＴｓ、Ｉｔｋ）もまた、Ｉ型ＮＫＴ細胞に関与することが示唆されている。例えば、Ｉ型ＮＫＴ細胞は、Ｔ－ｂｅｔ及びＧＡＴＡ－３の両方の転写因子を共発現して、ＩＦＮγ及びＩＬ－４の両ｍＲＮＡの転写をもたらすと思われる。これは、Ｔ－ｂｅｔがＧＡＴＡ－３の発現を抑制し、その逆でＧＡＴＡ－３がＴ－ｂｅｔの発現を抑制することが示されている通常型Ｔ細胞とは対照的である。
Ｉ型ＮＫＴ細胞の細胞溶解活性
Ｉ型ＮＫＴ細胞は高レベルのグランザイムＢ、パーフォリン、及びＦａｓＬを発現し、これらの細胞の細胞溶解機能と一致する。インビトロでのアッセイでは、Ｉ型ＮＫＴ細胞が、抗原パルスＡＰＣをＣＤ１ｄ依存的に殺傷する能力を有することが実証された。さらに、いくつかのマウスモデルから、Ｉ型ＮＫＴ細胞は、腫瘍監視及び腫瘍拒絶において重要な役割を果たすことが明らかになった。いくつかの腫瘍モデルでは、Ｉ型ＮＫＴ細胞によるＩＦＮγ産生はＮＫ細胞の活性化に役立ち、これを受けて強い抗腫瘍応答が開始される（Ｃｒｏｗｅ ＮＹ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２００２ Ｊｕｌ １；１９６（１）：１１９－２７）。同様に、Ｉ型ＮＫＴ細胞は、細菌性抗原を認識して応答し、細菌の排除に関与することが示されている（Ｍａｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００５ Ｍａｒ ２４；４３４（７０３２）：５２５－９、Ｒａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５ Ｊｕｌ １５；１７５（２）：１１３７－４４）。
他の免疫細胞の制御
初期の研究では、Ｉ型ＮＫＴ細胞由来のサイトカインは、ＮＫ細胞、通常型のＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞、マクロファージならびにＢ細胞を含め、いくつかの他の細胞型を活性化して、骨髄樹状細胞を動員できることが実証された（Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ Ｍ，Ｇａｐｉｎ Ｌ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２ Ａｕｇ；２（８）：５５７－６８）。Ｉ型ＮＫＴ細胞はまた、自身のＩＦＮγ分泌を介して好中球の動員を調節することができる（Ｎａｋａｍａｔｓｕ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ．２００７ Ｍａｒ；９（３）：３６４－７４）。さらに、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）とＩ型ＮＫＴ細胞間のクロストークが報告されており、その場合、活性化Ｉ型ＮＫＴ細胞は、ＩＬ－２依存的機序を介してＴｒｅｇの機能を量的及び質的に調節し、Ｔｒｅｇは、Ｉ型ＮＫＴ細胞の機能を細胞接触依存的機序により抑制することができる（ＬａＣａｖａ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６ Ｊｕｌ；２７（７）：３２２－７）。同様の、Ｉ型ＮＫＴ細胞と、Ｉ型ＮＫＴ細胞を特徴付けるインバリアントＴＣＲ－α鎖を発現しない他のＣＤ１ｄ拘束性ＮＫＴ細胞（ＩＩ型ＮＫＴ細胞）との間の交差制御もまた観察されている（Ａｍｂｒｏｓｉｎｏ Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７ Ｏｃｔ １５；１７９（８）：５１２６－３６）。Ｉ型ＮＫＴ細胞はまた、アレルギー性気道過敏症モデルにおいてγδＴ細胞と相乗作用することが報告されている（Ｊｉｎ Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７ Ｓｅｐ １；１７９（５）：２９６１－８）。最終的に、α－ＧａｌＣｅｒ注入による全身的なＩ型ＮＫＴ細胞の活性化により非特異的にＢ細胞活性化が誘導されることがしばらくの間、認識されてきた。データは、ループス易発症性ＮＺＢ／ＷＦ１マウスから得た精製Ｉ型ＮＫＴ細胞が、濾胞帯Ｂ細胞ではなくＢ－１及び辺縁帯Ｂ細胞による抗体分泌を自然に高めることができることを示している（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｔ，Ｓｔｒｏｂｅｒ Ｓ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８ Ｊａｎ；３８（１）：１５６－６５）。Ｉ型ＮＫＴ細胞とＢ細胞サブセット間の相互作用が必要であり、その作用は抗ＣＤ１ｄ及び抗ＣＤ４０ＬのｍＡｂにより遮断することができた（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｔ，２００８）。タンパク質及びα－ＧａｌＣｅｒで免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスでは、タンパク質単独で誘導された免疫よりも抗体価が１～２ログ高い抗体が作られ、生成されるメモリーＢ細胞の頻度が増した（Ｇａｌｌｉ Ｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００７；１０４：３９８４－３９８９）。かかる機序は、ＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌ相互作用とサイトカイン分泌との複合作用を介して媒介された。Ｂ細胞によるＣＤ１ｄの発現はまた、Ｉ型ＮＫＴ細胞の応答増強のために必要とされ、これは、Ｉ型ＮＫＴ細胞とＢ細胞の同族相互作用を示唆している（Ｌａｎｇ ＧＡ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００８ Ｆｅｂ １５；１１１（４）：２１５８－６２）。
Ｉ型ＮＫＴ細胞が認識する抗原
最初に報告されたＩ型ＮＫＴ細胞リガンドはα－ガラクトシルセラミド（α－ＧａｌＣｅｒ）であり、これは、その抗腫瘍活性について海洋性抽出物のパネルから同定されたものであった（Ｋａｗａｎｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９７ Ｎｏｖ ２８；２７８（５３４３）：１６２６－９）。それ以降、内因性抗原と外因性抗原の両方を含め、さらに多くのＩ型ＮＫＴ細胞抗原が発見されている。通常型Ｔ細胞抗原が主にＭＨＣ分子により提示されるペプチドであるのとは異なり、Ｉ型ＮＫＴ細胞抗原は明確に異なる脂質成分を有する。今日まで定義されているほとんどのＩ型ＮＫＴ細胞抗原は、共通の構造、すなわち、ＣＤ１ｄ内に埋設されている脂質尾部、及びＣＤ１ｄから突出する糖頭部基を共有し、ＮＫＴのＴＣＲと接触する。これに対する主な例外は、Ｉ型ＮＫＴ抗原のホスファチジルエタノールアミンであり、糖頭部基を欠く。
ＮＫＴ細胞による抗原の認識
Ｉ型ＮＫＴ細胞の特有の抗原特異性はセミインバリアントＴＣＲの発現により決定される。このＴＣＲは、既知のペプチド／ＭＨＣ反応性ＴＣＲと同様の全体構造を有することが知られていたが、それが、ＣＤ１ｄとの関連においていかにして糖脂質抗原を代わりに認識し得るのかが絶えず思索の対象であった。結晶解析の成功及び変異解析により、このＴＣＲがいかにしてＣＤ１ｄ／糖脂質複合体を認識するのかが明らかになった。ＣＤ１ｄ／α－ＧａｌＣｅｒと複合体を形成しているヒトＩ型ＮＫＴのＴＣＲの結晶構造から、既知のＴＣＲ／ＭＨＣ／ペプチド相互作用とは異なる独特のドッキング戦略が明らかになった（Ｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００７；４４８：４４－４９）。ＴＣＲがＭＨＣの遠位部分と対角線方向に会合する通常型ＴＣＲ－ＭＨＣ相互作用と比較すると、Ｉ型ＮＫＴのＴＣＲは、ＣＤ１ｄ－α－Ｇａｌｃｅｒ複合体の最端部に複合体と平行した状態でドッキングした。かかる構造では、Ｉ型ＮＫＴ ＴＣＲとＣＤ１ｄ－α－ＧａｌＣｅｒ複合体との結合表面は、主に、６本の相補性決定領域（ＣＤＲ）ループのうちの３本、すなわち、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ３α及びＣＤＲ２βで構成されており、インバリアントＴＣＲα鎖が糖脂質とＣＤ１ｄの双方との相互作用を支配していたが、ＴＣＲα鎖の役割は、ＣＤ１ｄのα１ヘリックスとのＣＤＲ２βループの相互作用に制限されていた。通常型ＴＣＲの場合に通常はＣＤＲ３αと共に抗原特異性を媒介するＣＤＲ３βは、Ｉ型ＮＫＴ ＴＣＲの唯一の超可変領域であるが、抗原とは何ら接触はなかった。したがって、Ｉ型ＮＫＴ ＴＣＲによるα－Ｇａｌｃｅｒ－ＣＤ１ｄの認識は完全に、Ｉ型ＮＫＴ ＴＣＲ上の生殖細胞系列にコードされた表面によって媒介されている。
これらの結果を、マウス及びヒトの両方のＩ型ＮＫＴ ＴＣＲについての詳細な変異解析を介して確認し、さらに拡大した（Ｂｒｏｗｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７；８：１１０５－１１１３）。結果から、α－ＧａｌＣｅｒ－ＣＤ１ｄ複合体の認識にはＴＣＲのＣＤＲ１α、ＣＤＲ３α及びＣＤＲ２βのループ内部の残基により形成された活発な「ホットスポット」が重要であることが確認され、Ｉ型ＮＫＴ細胞のＴＣＲレパートリーが極めて偏っていることの根拠が得られた。マウス系では、この「ホットスポット」が同様に、α－ＧａｌＣｅｒ及びｉＧｂ３等の構造的に異なる糖脂質抗原の認識に必要とされた。多様な糖脂質抗原の認識に生殖細胞系列にコードされた同じ残基が使用されていることから、これらの観察により、Ｉ型ＮＫＴのＴＣＲはパターン認識受容体として機能することが示唆される（Ｂｒｏｗｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７；８：１１０５－１１１３）。このようにして、異なるＮＫＴ細胞のクローンは、ＴＣＲβ鎖の多様性にもかかわらず重複する抗原特異性を有する。
Ｉ型ＮＫＴ細胞の活性化
外来性抗原によるＩ型ＮＫＴ細胞の同族認識及び活性化
Ｉ型ＮＫＴ細胞を活性化する同族抗原として提示される微生物の糖脂質が同定されている。Ｉ型ＮＫＴ細胞は、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ及びＢｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ等の細菌により発現される、α結合したスフィンゴ糖脂質抗原及びジアシルグリセロール抗原をＣＤ１ｄ依存的に直接認識することが示されている（Ｍａｔｔｎｅｒ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００５ Ｍａｒ ２４；４３４（７０３２）：５２５－９、Ｋｉｎｊｏ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００５ Ｍａｒ ２４；４３４（７０３２）：５２０－５）。これらの糖脂質抗原に対する生物学的応答には、Ｉ型ＮＫＴ細胞によるＩＦＮγ及びＩＬ－４の産生が含まれる。
Ｉ型ＮＫＴ細胞の間接的な認識及び活性化
Ｉ型ＮＫＴ細胞のＴＣＲにより認識される同族糖脂質抗原は、ヒトの疾患で顕著に見られる主要なグラム陰性及びグラム陽性の細菌病原体では何も見つかってはいないが、そのような細菌のＩ型ＮＫＴ細胞活性化の代替的様式が報告されている。例えば、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａまたはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａのようなＬＰＳ陽性菌はＩ型ＮＫＴ細胞を間接的に活性化することが示されている。これらの間接的な認識手段は大きく分けて２つあり、抗原提示細胞の活性化と併せたＣＤ１ｄ／ＴＣＲ相互作用に少なくとも部分的に依存するもの、及びＣＤ１ｄ非依存的と思われるものがある。
最初に、樹状細胞と共に培養されたグラム陰性菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ等）またはグラム陽性菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ等）は、特定の同族外来性糖脂質の非存在下でＩ型ＮＫＴ細胞を刺激することができることが示された（Ｍａｔｔｎｅｒ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００５ Ｍａｒ ２４；４３４（７０３２）：５２５－９、Ｂｒｉｇｌ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３ Ｄｅｃ；４（１２）：１２３０－７）。そのような刺激は、インビトロ及びインビボで抗ＣＤ１ｄ ｍＡｂまたは抗ＩＬ－１２ ｍＡｂのいずれかにより遮断される。これらの結果は、数多くの微生物が、ＡＰＣの刺激を介してＩ型ＮＫＴの活性化を間接的に誘導することができる可能性を示唆している。この機序はＡＰＣのＴＬＲの会合に依存的であり、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍに曝露した野生型由来の骨髄由来樹状細胞（ＤＣ）はインビトロでＩ型ＮＫＴ細胞を刺激することができたが、ＴＬＲシグナル伝達分子欠損ＤＣはできなかった（Ｍａｔｔｎｅｒ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００５ Ｍａｒ ２４；４３４（７０３２）：５２５－９）。また、ＣＤ１欠損ＤＣが同様の刺激を受けた際にＩ型ＮＫＴ細胞を刺激することができないことから、Ｉ型ＮＫＴのＴＣＲによる自己糖脂質の認識に依存的である可能性も高い。さらに、ＴＬＲリガンドによるＡＰＣの活性化は、染色試薬として多量体Ｉ型ＮＫＴ ＴＣＲを使用して実証されるように、脂質生合成経路を調節してＣＤ１ｄ結合リガンド（複数可）の特異的な上方制御を誘導することが示された（Ｓａｌｉｏ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００７；１０４：２０４９０－２０４９５）。これらの結果とは対照的に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＬＰＳは、Ｉ型ＮＫＴ細胞の刺激をＡＰＣ依存的であるがＣＤ１ｄ非依存的に誘導することが報告された（Ｎａｇａｒａｊａｎ ＮＡ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７；１７８：２７０６－２７１６）。これらの実験では、Ｉ型ＮＫＴ細胞によるＩＦＮγ産生には、ＣＤ１ｄに媒介される内因性抗原の提示は必要とされず、ＩＬ－１２とＩＬ－１８の組み合わせへの曝露で十分に活性化された。
最後に、ＬＰＳ検出センサーであるＴＬＲ４に加え、ＤＣでの核酸センサーであるＴＬＲ７及びＴＬＲ９の活性化もまた、細胞のＩＦＮγ産生として測定されるＩ型ＮＫＴ細胞の刺激をもたらすことが報告された（Ｐａｇｅｔ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００７；２７：５９７－６０９）。
疾患におけるＩ型ＮＫＴ細胞
Ｉ型ＮＫＴ細胞は、比較的頻度の低いヒト末梢血Ｔ細胞であるが、それらの限られたＴＣＲ多様性は、それらが活性化後に高頻度で応答することを意味する。したがって、Ｉ型ＮＫＴ細胞は、適応免疫応答を形成するよう独特の位置にあり、がん、自己免疫、炎症性疾患、組織移植関連障害、及び感染症等の多種多様な疾患において調節的役割を果たすことが示されている（Ｔｅｒａｂｅ ＆ Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｃｈ．８，Ａｄｖ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１０１：２７７－３４８，２００８、Ｗｕ ＆ ｖａｎ Ｋａｅｒ，Ｃｕｒｒ Ｍｏｌ Ｍｅｄ，９：４－１４，２００９、Ｔｅｓｓｍｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ，１３：１５３－１６２，２００９）。例えば、ＮＫＴ細胞が欠損したマウスは、化学物質誘発腫瘍を発症し易いが、野生型マウスは防御される（Ｇｕｅｒｒａ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２８：５７１－８０，２００８）。これらの実験所見は、進行癌の患者で末梢血中のＩ型ＮＫＴ細胞数が減少していることを示す臨床データと相関する（Ｇｉｌｆｉｌｌａｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，２０５：２９６５－７３，２００８）。
Ｉ型ＮＫＴ細胞は、末梢血の０．１％未満、ヒトの骨髄Ｔ細胞の１％を構成するが、その相対的な少なさにもかかわらず、ＩＬ－２、Ｔｈ１タイプ（ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α）、Ｔｈ２タイプ（ＩＬ－４、ＩＬ－１３）、ＩＬ－１０、及びＩＬ－１７といったサイトカインの産生を介して強力な免疫制御を発揮する。（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，２００２；１９５：６３７－６４１、Ｂｅｎｄｅｌａｃ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００７；１７８：５８－６６、Ｂｕｒｒｏｗｓ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００９；１０（７）：６６９－７１）。Ｉ型ＮＫＴ細胞は、高度に制限された（インバリアント）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）－Ｖα鎖（ヒトではＶα２４）を特徴とする。それらのＴＣＲは、広く分布するＨＬＡ様分子であるＣＤ１ｄとの関連において提示される細胞膜の変化した糖脂質を認識するという点で独特である。（Ｚａｊｏｎｃ ＆ Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ，２００９；２３０（１）：１８８－２００）。ＣＤ１ｄは、多くの上皮組織及び造血組織ならびに多くの腫瘍標的で高レベルで発現され、Ｉ型ＮＫＴのＴＣＲのみと特異的に結合することが知られている。（Ｂｏｒｇ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２００７，４４８：４４－４９）。
ＮＫ細胞同様、Ｉ型ＮＫＴ細胞は、パーフォリン／グランザイムＢ、Ｆａｓ／ＦａｓＬ、及びＴＲＡＩＬ経路を介して誘導される直接的細胞傷害性により、腫瘍免疫監視における主要な役割を果たす。（Ｂｒｕｔｋｉｅｗｉｃｚ ＆ Ｓｒｉｒａｍ，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｌ Ｈｅｍａｔｏｌ，２００２；４１：２８７－２９８、Ｓｍｙｔｈ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００２；１９１：６６１－８、Ｗｉｌｓｏｎ ＆ Ｄｅｌｏｖｉｔｃｈ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００３；３：２１１－２２２、Ｍｏｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００８；１２９：１８２－１９４、Ｓｍｙｔｈ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，２００５；２０１（１２）：１９７３－１９８５、Ｇｏｄｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００４，４：２３１－２３７）。マウスでは、Ｉ型ＮＫＴ細胞はＧＶＨＤに対して防御し、ＮＫ細胞を含む多くの細胞集団の細胞傷害性を高める。ＮＫ細胞とは異なり、Ｉ型ＮＫＴ細胞は、クラスＩ ＭＨＣ等のリガンドにより抑制されるかどうかは不明であるため、クラスＩの上方制御によるＮＫ細胞傷害性からの腫瘍エスケープという状況において有用な補助となる。（Ｂｒｕｔｋｉｅｗｉｃｚ ＆ Ｓｒｉｒａｍ，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｌ Ｈｅｍａｔｏｌ，２００２；４１：２８７－２９８、Ｓｍｙｔｈ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２００２；１９１：６６１－８、Ｗｉｌｓｏｎ ＆ Ｄｅｌｏｖｉｔｃｈ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００３；３：２１１－２２２、Ｍｏｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００８；１２９：１８２－１９４、Ｓｍｙｔｈ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，２００５；２０１（１２）：１９７３－１９８５、Ｇｏｄｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００４，４：２３１－２３７）。
Ｉ型ＮＫＴ細胞のみを欠くＪα１８遺伝子標的ノックアウトマウスを使用した研究において、Ｉ型ＮＫＴ細胞の抗腫瘍免疫における役割を支持するさらなる証拠が記載されている（Ｓｍｙｔｈ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１９１：６６１－６６８，２０００）。例えば、Ｉ型ＮＫＴ欠損マウスは、メチルコラントレンで誘発した肉腫及びメラノーマ腫瘍に対する易罹患性の顕著な増大を示し、効果は、腫瘍増殖の初期段階での肝臓由来Ｉ型ＮＫＴ細胞の投与により改善した（Ｃｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１９６：１１９－１２７，２００２）。
抗腫瘍免疫に対するＩ型ＮＫＴ細胞の少なくとも１つの寄与は、ＤＣによるＩ型ＮＫＴ細胞の活性化を介して間接的に生じる。活性化Ｉ型ＮＫＴ細胞は、抗腫瘍免疫応答のプライミング相の増強を助ける、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）の産生を含めた一連のサイトカインカスケードを開始させることができる（Ｔｅｒａｂｅ ＆．Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｃｈ ８，Ａｄｖ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１０１：２７７－３４８，２００８）。Ｉ型ＮＫＴ細胞、ならびにＮＫ細胞及びＣＤ８＋エフェクターによるＩＦＮ－γの産生は、腫瘍拒絶において重要であることが示されている（Ｓｍｙｔｈ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，９９：１２５９－１２６６，２００２）。基礎にある機序は十分に明らかにされている（Ｕｅｍｕｒａ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍ，１８３：２０１－２０８，２００９）。
さらに、Ｉ型ＮＫＴ細胞は、免疫抑制機能を発揮する、血中単球に由来の炎症細胞の高度に可塑的なサブセットである、ＣＤ１ｄ陽性腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の殺傷を特異的に標的にすることが示されている（Ｓｉｃａ ＆ Ｂｒｏｎｔｅ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１１７：１１５５－１１６６，２００７）。ＴＡＭは、神経芽細胞腫ならびに乳癌及び前立腺癌を含め、多くの固形腫瘍の増殖を促進するインターロイキン－６（ＩＬ－６）の産生の大半を担うことが知られている（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１１９：１５２４－１５３６，２００９、Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ，１１０：１９１１－１９２８，２００７）。Ｉ型ＮＫＴ細胞のＴＡＭに対する直接的なＣＤ１ｄ依存的細胞傷害活性は、Ｉ型ＮＫＴ細胞が抗腫瘍免疫、特に、ＣＤ１ｄを発現しない固形腫瘍に対する免疫を媒介することができる、代替となる重要な間接的経路が存在することを示唆している。
ヒトでは、Ｉ型ＮＫＴ細胞が神経芽細胞腫細胞（Ｍｅｔｅｌｉｔｓａ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２００４；１９９（９）：１２１３－１２２１）及びＢ細胞性標的（Ｗｉｌｓｏｎ ＆ Ｄｅｌｏｖｉｔｃｈ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００３；３：２１１－２２２、Ｍｏｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００８；１２９：１８２－１９４）へホーミングし、そのどちらも高レベルのＣＤ１ｄを発現する。Ｉ型ＮＫＴ細胞によるサイトカインはＮＫの細胞傷害性を増大させ得る。ＩＦＮ－γはＮＫの細胞増殖及び直接的細胞傷害性を増強させる一方、ＩＬ－１０は、直接的ＤＮＡ切断作用のある、ＮＫ細胞傷害性顆粒内分子のＴＩＡ－１を強力に増加させ（Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，１９９１；６７（３）：６２９－３９）、ＮＫ細胞標的でのｍＲＮＡスプライシングを制御して、標的上での膜結合Ｆａｓの発現を促進することができる。（Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ，２００５；１９（４）：４７５－８４）。ＩＬ－１０はさらに、ＮＫ細胞に対する主な抑制性リガンドであるクラスＩ ＭＨＣの腫瘍下方制御を誘導することによって、腫瘍標的がＮＫによる溶解を受ける可能性を高める。（Ｋｕｎｄｕ ＆ Ｆｕｌｔｏｎ，Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９７；１８０：５５－６１）。
炎症性疾患及び／または自己免疫疾患の治療におけるＩ型ＮＫＴ細胞の重要な役割を支持する証拠が、自己免疫疾患モデルマウスを使用した研究から得られている。例えば、Ｉ型糖尿病（Ｍ．Ｆａｌｃｏｎｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７２：５９０８－５９１６，２００４、Ｍｉｚｕｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ，２３：２９３－３００，２００４）、関節リウマチ（Ｋａｉｅｄａ ｅｔ ａｌ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，５６：１８３６－１８４５，２００７、Ｍｉｅｌｌｏｔ－Ｇａｆｓｏｕ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３０：２９６－３０６，２０１０）、自己免疫性大腸炎（クローン病及び潰瘍性大腸炎モデル ＤＳＳ誘発大腸炎ならびに自己免疫性Ｔ細胞誘導性大腸炎、Ｇｅｒｅｍｉａ ｅｔ ａｌ．，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ Ｒｅｖ．１３（１）：３－１０，２０１４ ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｕｔｒｅｖ．２０１３．０６．００４．Ｅｐｕｂ ２０１３ Ｊｕｎ．１５．Ｋａｔｓｕｒａｄａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，７（９）：ｅ４４１１３，２０１２；Ｆｕｓｓ ａｎｄ Ｓｔｒｏｂｅｒ，Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１ Ｓｕｐｐｌ １：Ｓ３１－３，２００８）、及び実験的自己免疫性脳炎（ＥＡＥ）（ｖａｎ ｄｅ Ｋｅｅｒｅ ＆ Ｔｏｎｅｇａｗａ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１８８：１８７５－１８８２，１９９８；Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１９４：１８０１－１８１１，２００１；Ｍｉｙａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，４１３：５３１－５３４，２００１）のマウスモデルでは、Ｉ型ＮＫＴ細胞は、免疫寛容の確立及び自己免疫病理の予防において主要な役割を果たした。
Ｉ型ＮＫＴ細胞はまた、活性化され、移植組織に対する応答に関与する。任意の１つの理論だけを承認するわけではないが、証拠は、移植関連障害におけるＩ型ＮＫＴ細胞の重要な役割を支持するものである。例えば、Ｉ型ＮＫＴ細胞は、拒絶より前に心臓及び皮膚の両方の同種移植片に浸潤することが示されており、移植後の末梢リンパ組織において数が増加していた（Ｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｍｅｄ，７：５５７－６２，２００１、Ｏｈ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７４：２０３０－６，２００５、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７５：２０５１－５，２００５）。Ｉ型ＮＫＴ細胞は、活性化されるだけではなく、後続の免疫応答にも影響を及ぼす（Ｊｕｋｅｓ ｅｔ ａｌ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，８４：６７９－８１，２００７）。例えば、全ＮＫＴ細胞またはＩ型ＮＫＴ細胞が欠損している動物はいずれも、共刺激／共受容体分子遮断による寛容誘導に対して抵抗性であることが一貫して見出されている（Ｓｅｉｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９８：２５７７－８１，２００１、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７５：２０５１－５，２００５、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ａｍ Ｊ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，７：１４８２－９０，２００７）。注目すべきことに、そのようなマウスへのＮＫＴ細胞の養子移入により、インターフェロン（ＩＦＮ）－γ、ＩＬ－１０及び／またはＣＸＣＬ１６に依存的である寛容が回復する（Ｓｅｉｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９８：２５７７－８１，２００１、Ｏｈ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７４：２０３０－６，２００５、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７５：２０５１－５，２００５、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ａｍ Ｊ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，７：１４８２－９０，２００７、Ｉｋｅｈａｒａ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１０５：１７６１－７，２０００）。さらに、Ｉ型ＮＫＴ細胞は、角膜同種移植片に対する寛容誘導に必須であることが証明されており、移植片対宿主病をＩＬ－４依存的に予防することが実証されている（Ｓｏｎｏｄａ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６８：２０２８－３４，２００２、Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１８９：１０７３－８１ １９９９、Ｐｉｌｌａｉ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ．２００９；１１３：４４５８－４４６７、Ｌｅｖｅｓｏｎ－Ｇｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，１１７：３２２０－９，２０１１）。
Ｉ型ＮＫＴ細胞応答は、行われた移植の種類、例えば、アロ抗原が、脾臓に存在するＩ型ＮＫＴ細胞へ流入する血管柄付（心臓）移植の後なのか、またはアロ抗原が、腋窩リンパ節に存在するＩ型ＮＫＴ細胞へ流入する血管柄無し（皮膚）移植の後なのかによって異なり得る。さらに、Ｉ型ＮＫＴ細胞応答は、例えば、α－ＧａｌＣｅｒの複数回注入を介してＩ型ＮＫＴ細胞がＩＬ－１０を放出するよう操作することによって操作することができ、それにより、皮膚移植片生着が延長され得る（Ｏｈ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７４：２０３０－６，２００５）。
移植片対腫瘍（ＧＶＴ）活性を維持しつつ同種免疫寛容を達成することは、同種造血細胞移植（ＨＣＴ）ではこれまで達成困難とされていた。ＮＫＴ細胞及びＣＤ４+Ｆｏｘｐ３+制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞を含め、免疫制御性細胞集団は、寛容及びＧＶＴの決定において重要な役割を果たすと考えられている。このために、最近、ＮＫＴ細胞及びＴｒｅｇ細胞を豊かにする強度減弱前処置の方法が適用され、ある程度の成功を収めている。具体的には、全身リンパ照射（ＴＬＩ）及び抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）のレジメンにより、小児及び成人のいずれにおいても生着及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）からの防御がもたらされており（Ｌｏｗｓｋｙ ｅｔ ａｌ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００５，３５３：１３２１－１３３１、Ｋｏｈｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ．２００９；１１４：１０９９－１１０９、Ｋｏｈｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１０；４０：１８６２－１８６９、Ｐｉｌｌａｉ ｅｔ ａｌ，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．２０１１；１５：６２８－６３４）、ＧＶＴは、疾患特性により再発リスクが高い成人患者において維持されるようであった（Ｌｏｗｓｋｙ ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００５，３５３：１３２１－１３３１、Ｋｏｈｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ．２００９；１１４：１０９９－１１０９、Ｋｏｈｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１０；４０：１８６２－１８６９）。
このレジメンのマウス前臨床モデリングでは、ＧＶＨＤ防御は、ＩＬ－４の分泌及びＩ型ＮＫＴ細胞の制御能力に依存すること、及びこれらの細胞はＧＶＴを維持しながらＧＶＨＤを制御することが示された（Ｐｉｌｌａｉ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００７；１７８：６２４２－６２５１）。さらに、Ｉ型ＮＫＴに由来するＩＬ－４の結果は、制御性ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｆｏｘｐ３+Ｔｒｅｇ細胞の強力なインビボ増殖を誘導することができ、これらの細胞は自身がドナー内のエフェクターＣＤ８+Ｔ細胞を制御して致死的急性ＧＶＨＤを防いでいる（Ｐｉｌｌａｉ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ．２００９；１１３：４４５８－４４６７）。Ｉ型ＮＫＴ細胞依存的な免疫偏向は制御性骨髄樹状細胞の機能の発達と増強をもたらし、それが、制御性ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の強力なインビボ増殖を誘導して、有害なＴ細胞応答からの防御をさらに増強させることが示されている（ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｒｗｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１３；Ｎｏｖ．４，２０１３）。
感染への応答では、免疫系は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に発現されるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）等、病原体関連分子パターンに対する受容体の活性化を介したシグナルの複雑なネットワークに依存し、その結果として、抗原特異的Ｔ細胞応答が促進される（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ ＆ Ｊａｎｅｗａｙ Ｊｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６：２９８－３００，２００２）。例えば、そのような応答の際、Ｉ型ＮＫＴ細胞は、微生物由来脂質抗原の認識を介して応答するか、または自己由来もしくは微生物由来の脂質の提示及び非提示と組み合わせたＴＬＲの結合に続くＡＰＣ由来サイトカインを介して応答する。細菌性抗原はまた、ＣＤ１ｄに結合している場合にＩ型ＮＫＴ細胞を直接刺激して、ＴＬＲ媒介性のＡＰＣの活性化とは独立して作用することができる（Ｋｉｎｊｏ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，７：９７８－８６，２００６、Ｋｉｎｊｏ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，４３４：５２０－５，２００５、Ｍａｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，４３４：５２５－９，２００５、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１０７：１５３５－４０，２０１０）。
さらに、ＮＫＴ細胞欠損（ＣＤ１ｄ－／－）マウス及びＩ型ＮＫＴ細胞欠損（Ｊα１８－／－）マウスは、野生型マウスと比較してインフルエンザに対する感受性が高いことが示されている（Ｄｅ Ｓａｎｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１１８：４０３６－４８，２００８）。このモデルでは、Ｉ型ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄ－／－マウス及びＪα１８－／－マウスで増殖していた骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の増殖を抑制することが見出された（同文献）。重要なことに、Ｉ型ＮＫＴ細胞活性化の正確な機序は決定されなかったが、著者らは、Ｉ型ＮＫＴ細胞の養子移入により、ＣＤ１ｄ－／－マウスではなくＪα１８－／－マウスにおいてＰＲ８感染後のＭＤＳＣ増殖が抑制されたことから、Ｉ型ＮＫＴ細胞がＴＣＲ－ＣＤ１ｄ相互作用を必要としたことを提案する（Ｄｅ Ｓａｎｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１１８：４０３６－４８，２００８）。したがって、Ｉ型ＮＫＴ細胞の別の用途は、病原体（例えば、細菌、ウイルス、原虫、及び蠕虫といった病原体）に対する免疫応答の増強である。
最後に、Ｉ型ＮＫＴ細胞は、サイトカインの分泌を介して、また制御性Ｆｏｘｐ３＋細胞、ＡＰＣ、及びＮＫ細胞等の他の免疫サブセットの調節を介してのアレルギー性免疫応答の調節及び／または増強において重要な役割を果たすことが示されている（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２６（６）：１０８１－９１，２０１０、Ｃａｒｖａｌｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐａｒａｓｉｔｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８（１０）：５２５－３４，２００６、Ｋｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７１（２）：１８６－９１，２０１０）。これには、アトピー性皮膚炎モデルでの証拠が含まれる（Ｓｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｌｅｒｇｙ，６４（１１）：１６８１－４，２００９）。
しかしながら、免疫療法においてヒトの制御性自然Ｉ型ＮＫＴ細胞の適用で主な障害となるのは、それらが、ヒト末梢血を含めた一般の細胞治療細胞製品において相対的に不足していること（Ｂｅｒｚｉｎｓ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１１；１１：１３１－１４２、Ｅｘｌｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１０；Ｃｈａｐｔｅｒ １４：Ｕｎｉｔ １４－１１、Ｅｘｌｅｙ ＆ Ｎａｋａｙａｍａ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１１；１４０：１１７－１１８）、及び増殖後のヒトＩ型ＮＫＴ細胞の潜在的用途を治療用に検証するための、エキソビボ増殖させたヒトＩ型ＮＫＴ細胞に関する明らかな表現型及び機能のデータが不足していることである。
Ｉ型ＮＫＴ細胞の免疫学的重要性の高さ及び治療としての可能性の高さにもかかわらず、当該技術分野では、治療方法でＩ型ＮＫＴ細胞を使用できるだけの十分なＩ型ＮＫＴ細胞のエキソビボでの効率的な増殖及び／または活性調節に必要な技術が不足している。
一態様によれば、記載の発明は、薬学的に許容される担体と、サイトカインキラーＴ細胞の集団に由来する超活性化サイトカインキラー細胞（ＳＣＫＴＣ）の増殖させ濃縮された集団を含む細胞製品とを含む医薬組成物を提供し、ＳＣＫＴＣは、未刺激かつ未活性化サイトカインキラーＴ細胞対照集団と比較して、サイトカインの誘導分泌、ＳＣＫＴＣ集団の刺激増殖、ＳＣＫＴＣの細胞傷害性改善、及びＳＣＫＴＣの細胞表面上の１つ以上のマーカーの調節発現のうちの２つ以上により特徴付けられる。一実施形態によれば、発現が調節されるサイトカインは、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、またはＩＬ－１０及びＩＦＮγからなる群から選択される１つ以上である。別の実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団は、ＩＬ－４、ＩＬ－５、１Ｌ－６、及びＩＬ－１０からなる群から選択される１つ以上のサイトカインの低発現ならびにＩＦＮγの高発現を含む。別の実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団によるサイトカイン産生は、Ｉｌ－５－、ＩＬ－６－、Ｉｌ－１０－、ＩＬ－４ ｌｏｗ、ＩＦＮγ ｈｉｇｈとして特徴付けられる。別の実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団により産生されるＩＦＮ－γの量は約５０００ｐｇ／ｍｌ以上である。別の実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団により産生されるＩＬ－４の量は５ｐｇ／ｍｌ未満である。別の実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団の培養上清中のＩＦＮγ：ＩＬ－４の比は１０００以上である。別の実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団による標的細胞の殺傷率は、約２５％～約７５％の両端を含めた範囲である。別の実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団の殺傷率は、非増殖かつ非活性化サイトカインキラーＴ細胞の対照細胞の殺傷率より少なくとも１．５倍高い。別の実施形態によれば、ＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は少なくとも１０００であり、殺傷率は、非増殖かつ非活性化サイトカインキラーＴ細胞の対照細胞の殺傷率と比較して、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団により少なくとも１．５倍高く増大する。別の実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団は、ＮＫＴ細胞マーカーを発現するＳＣＫＴＣの亜集団を含む。別の実施形態によれば、ＳＣＫＴＣ細胞の増殖させ濃縮された集団は、ＣＤ３＋Ｖα２４＋細胞、ＣＤ３＋Ｖα２４－細胞またはＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞のうちの１つ以上を含むＳＣＫＴＣの亜集団を含む。別の実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団は、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋であるＳＣＫＴＣの亜集団を含む。別の実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団は、ＮＫＴ細胞マーカーを発現するＳＣＫＴＣの亜集団を含む。別の実施形態によれば、１型ＮＫＴ細胞マーカーは、ＴＣＲ Ｖαマーカー及びＴＣＲ Ｖβマーカーを含む。別の実施形態によれば、１型ＮＫＴ細胞マーカーを発現するＳＣＫＴＣの亜集団は、ＣＤ３＋Ｖα２４＋、ＣＤ３＋Ｖα２４－、またはＣＤ３＋ＣＤ５６＋として特徴付けられる細胞を含む。別の実施形態によれば、サイトカインキラーＴ細胞（ＣＫＴＣ）の集団に由来するＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団は、総ＣＫＴＣ集団の約４０％～約６０％を構成する。別の実施形態によれば、医薬組成物は、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団によるそれら自身のＴ細胞エフェクター活性の保持に有効な、安定化量の血清を含む。別の実施形態によれば、血清の安定化量は少なくとも１０％である。別の実施形態によれば、血清はヒト血清である。
別の態様によれば、記載の発明では、以下を順に含む、超活性化サイトカインキラーＴ細胞（ＳＣＫＴＣ）の増殖させ濃縮された集団を含む医薬組成物を調製するための方法を提供する。
（ａ）サイトカインキラーＴ細胞（ＣＫＴＣ）の集団を含む単核球（ＭＣ）の集団を分離すること、
（ｂ）任意選択で、（ａ）の調製物を無菌条件下で処理施設に輸送すること、
（ｃ）ＭＣの集団を培養系で培養すること、
（ｄ）ステップ（ｃ）の培養系を、アルファ－ガラクトシルセラミド（αＧａｌＣｅｒ）、またはその類似体もしくは機能的同等物と接触させること、及びＣＤ１ｄと、αＧａｌＣｅｒまたはその類似体もしくは機能的同等物とを含む細胞の集団と接触させることであって、ＣＫＴＣの集団の増殖を刺激するのに十分である、接触させること、
（ｅ）ステップ（ｄ）の培養系を、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５及びＩＬ－１２に、ＣＤ１ｄ及びαＧａｌＣｅｒを含む細胞の新鮮集団のパルスと共に所定の添加順序と添加時間で接触させることであって、ＣＴＫＣ集団の一部の活性化を刺激して、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団を形成させるのに十分である、接触させること、
（ｆ）ＳＣＫＴＣ細胞製品を形成するために、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団を培養系から回収することであって、前記（ｆ）のＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団を含む細胞製品は、（ａ）のＣＫＴＣの集団と比較してエフェクターサイトカイン分泌能改善または細胞傷害性改善のうちの１つ以上を特徴とする、回収すること、及び
（ｈ）薬学的に許容される担体を用いて細胞製品を製剤化し、医薬組成物を形成すること。
一実施形態によれば、（ａ）における単核球（ＭＣ）供給源は血液である。別の実施形態によれば、ＭＣはヒト対象に由来する。別の実施形態によれば、ＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ勾配遠心分離により全血から分離される。別の実施形態によれば、方法は、ステップ（ｅ）と（ｆ）の間に、培養物を処理施設から治療施設まで輸送することを含む別の実施形態によれば、輸送ステップは、ＩＬ１２添加後約１時間～約２４時間以内に開始される。別の実施形態によれば、ステップ（ｃ）は、任意選択で、ステップ（ｄ）を実施する前に、ＭＣを再懸濁させること、及びＭＣを約５×１０5細胞／ｍｌ～約３×１０6細胞／ｍｌの範囲の濃度に調節することを含む。別の実施形態によれば、ステップ（ｅ）は、培養系に対し、ＣＤ１ｄ及びαＧａｌＣｅｒまたはその類似体もしくは機能的同等物を含む細胞の新鮮集団のパルスを加えることを含む。いくつかの実施形態によれば、ＣＤ１ｄ及びαＧａｌＣｅｒを含む細胞の新鮮集団のパルス回数は、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、または少なくとも１０回である。別の実施形態によれば、αＧａｌＣｅｒ、またはその類似体もしくは機能的同等物は、ステップ（ｄ）からステップ（ｆ）まで一定濃度で維持される。別の実施形態によれば、αＧａｌＣｅｒ、またはその類似体もしくは機能的同等物の濃度は、約５０ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌの間である。別の実施形態によれば、ＩＬ－２は、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）まで一定濃度で維持される。別の実施形態によれば、ＩＬ－２の濃度は、約１０Ｕ／ｍｌ～約１００Ｕ／ｍｌの範囲である。別の実施形態によれば、ＩＬ－７は、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）まで一定濃度で維持される。別の実施形態によれば、ＩＬ－７の濃度は、約２０ｎｇ／ｍｌ～２００ｎｇ／ｍｌの範囲である。別の実施形態によれば、ＩＬ－２及びＩＬ－７は、培養の約７日目に加えられる。別の実施形態によれば、ＩＬ－１５は、培養の約１４日目に加えられる。別の実施形態によれば、ＩＬ－１２は、培養の約２０日目に加えられる。別の実施形態によれば、ステップ（ｆ）は、培養の少なくとも約２１日目に行われる。別の実施形態によれば、ＩＬ－１５は、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）まで一定濃度で維持される。別の実施形態によれば、ＩＬ－１５の濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌの範囲である。別の実施形態によれば、ＩＬ－１２は、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）まで一定濃度で維持される。別の実施形態によれば、ＩＬ－１２の濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌの範囲である。別の実施形態によれば、方法はさらに、ＳＣＫＴＣ集団による細胞表面マーカーの発現をフローサイトメトリーにより特徴付けるステップを含む。別の実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団の亜集団は、ＣＤ３＋Ｖα２４＋細胞、ＣＤ３＋Ｖα２４－細胞またはＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞のうちの１つ以上を含む。別の実施形態によれば、亜集団はさらにＶβ１１＋細胞を含む。一実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団は、ＣＤ３＋Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞、ＣＤ３＋Ｖα２４－細胞、またはＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞の亜集団を含む。
別の実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団は、総ＣＫＴＣ集団の約４０％～約６０％を構成する。別の実施形態によれば、ＩＬ－２及びＩＬ－７は、培養物に同時に加えられる。別の実施形態によれば、ＩＬ－２、ＩＬ－７及びＩＬ－１５は、培養物に同時に加えられる。別の実施形態によれば、ステップ（ｃ）のＭＣ集団には、約５×１０5細胞／ｍｌ～約３×１０6細胞／ｍｌ含まれる。別の実施形態によれば、ＣＤ１ｄ及びアルファ－ガラクトシルセラミド（αＧａｌＣｅｒ）を含む細胞は、抗原提示細胞である。別の実施形態によれば、抗原提示細胞は樹状細胞（ＤＣ）である。別の実施形態によれば、樹状細胞は、αＧａｌＣｅｒを担持している。別の実施形態によれば、αＧａｌＣｅｒ担持樹状細胞はＭＣに由来し、かつ接着細胞である。別の実施形態によれば、αＧａｌＣｅｒ担持樹状細胞は、（ａ）単核球（ＭＣ）の集団を分離すること、（ｂ）ＭＣの集団を培養系で培養すること、（ｃ）培養系をＩＬ－４及びＧＭ－ＣＳＦと接触させることであって、ＭＣの樹状細胞への分化を誘導するのに十分である、接触させること、及び（ｄ）培養系をαＧａｌＣｅｒと接触させることであって、樹状細胞にαＧａｌＣｅｒを担持させるのに十分である、接触させること、を含む方法により調製される。αＧａｌＣｅｒ担持樹状細胞を調製するための方法における別の実施形態によれば、αＧａｌＣｅｒ担持樹状細胞は接着細胞である。別の実施形態によれば、αＧａｌＣｅｒ担持樹状細胞を調製するための方法では、ＩＬ－４の濃度は５００Ｕ／ｍｌである。別の実施形態によれば、αＧａｌＣｅｒ担持樹状細胞を調製するための方法では、ＧＭ－ＣＳＦの濃度は５０ｎｇ／ｍｌである。別の実施形態によれば、αＧａｌＣｅｒ担持樹状細胞を調製するための方法では、ステップ（ｄ）は、ステップ（ｂ）の約５日～約７日後に行われる。別の実施形態によれば、αＧａｌＣｅｒ担持樹状細胞を調製するための方法では、ステップ（ｂ）のＭＣ集団には、約１×１０5細胞／ｍｌ～約５×１０6細胞／ｍｌ含まれる。αＧａｌＣｅｒ担持樹状細胞を調製するための方法における別の実施形態によれば、ステップ（ｂ）～（ｄ）は、１０％ウシ胎児血清または１０％自己血清を含有するＲＰＭＩ １６４０培地から選択される培地中で行われる。
別の実施形態によれば、組成物を調製するための方法はさらに、培養系の培地を２～３日ごとに補充することを含む。別の実施形態によれば、ステップ（ｃ）～（ｆ）は、Ｘ－ＶＩＶＯ－１５無血清培地、１０％ウシ胎児血清または１０％自己血清を含有するＲＰＭＩ １６４０培地から選択される培地中で行われる。
別の態様によれば、記載の発明は、薬学的に許容される担体と、記載され、かつ特許請求される方法により産生される超活性化サイトカインキラーＴ細胞（ＳＣＫＴＣ）の増強させ濃縮された集団を含む細胞製品とを含む医薬組成物を提供する。本明細書に記載される方法により生産される医薬組成物の一実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団は、ＣＤ３＋Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞、ＣＤ３＋Ｖα２４－細胞、またはＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞の亜集団を含む。別の実施形態によれば、亜集団はさらにＶβ１１＋細胞を含む。一実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団は、ＣＤ３＋Ｖα２４＋Ｖβ１１＋細胞、ＣＤ３＋Ｖα２４－細胞、またはＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞の亜集団を含む。
いくつかの実施形態によれば、医薬組成物はさらに、化学療法剤、生物学的応答調節剤、及び免疫療法剤からなる群から選択される追加の治療剤を含む。
いくつかの実施形態によれば、免疫療法剤は抗体である。いくつかの実施形態によれば、抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体またはキメラ抗体である。
本開示により記載される組成物及び方法により、現在の免疫療法に対するいくつかの利点が提供される。例えば、ＣＡＲ－Ｔ療法は様々ながんを治療するうえで有望であるが、ＣＡＲ－Ｔ療法にはいくつかの短所が伴う。ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は様々な副作用を引き起こし得、それらの多くは、始まりは軽微であるが急速に悪化し得る。特に重度の合併症は、サイトカインストームとしても知られるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）である。ＣＡＲ－Ｔ細胞は一旦体内に入ると、サイトカインの大量放出を開始し、これにより免疫系の他の要素が呼び出されて腫瘍細胞に対する攻撃に加わる。ＣＲＳは、インターロイキン－６（ＩＬ－６）を含め、血清サイトカインの上昇と関連する発熱、低血圧及び呼吸不全を特徴とし（Ｄａｖｉｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．６，２２４ｒａ２５（２０１４）、ＣＲＳは通常、Ｔ細胞注入数日以内にＣＡＲ－Ｔ細胞増殖ピーク時に生じる。状態は、広範囲のがんに罹患する患者において特に重度の傾向がある。
本発明の組成物及び方法では、注入される細胞製品が自己であること、及びサイトカインストームは細胞培養に任されていることからＣＲＳの問題が有利に回避される。
Ａ及びＢは、実施例３における、増殖したＣＴＫＣ集団中のＳＣＫＴＣ標的細胞の割合を決定するためのフローサイトメトリー実験の結果を示す。Ａは、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞のマーカーを発現している細胞の割合を示す。Ｂは、Ｉ型ＮＫＴ細胞マーカーを発現している細胞の割合を示す。 Ａ～Ｄは、実施例４において、サイトカインＩＬ－１２及びＩＬ－７を加える時間が、増殖したＣＴＫＣ集団中のＩ型ＮＫＴ細胞マーカー発現細胞の割合に与える影響を示す。マーカーのＴＣＲ Ｖα２４（Ｖａ２４）及びＴＣＲ Ｖβ１１（Ｖｂ１１）を発現している細胞の存在を決定するためフローサイトメトリーを使用し、その際、Ｖａ２４＋Ｖｂ１１＋細胞に基づいてゲートを設定した。Ａは、ＩＬ－２を培養開始時に加えた群Ａの結果を示す。Ｂは、ＩＬ－２及びＩＬ－７を培養開始時に同時に加えた群Ｂの結果を示す。Ｃは、ＩＬ－２及びＩＬ－７を培養の３日目に加えた群Ｃの結果を示す。Ｄは、ＩＬ－２及びＩＬ－７を培養の７日目に加えた群Ｄの結果を示す。 Ａ～Ｄは、実施例５において、サイトカインＩＬ－１５を加える時間が、増殖したＣＴＫＣ集団中のＩ型ＮＫＴ細胞マーカー発現細胞の割合に与える影響を示す。ＴＣＲ Ｖα２４（Ｖａ２４）及びＴＣＲ Ｖβ１１（Ｖｂ１１）を発現している細胞の存在を決定するためフローサイトメトリーを使用し、その際、Ｖａ２４＋Ｖｂ１１＋細胞に基づいてゲートを設定した。Ａは、ＩＬ－２及びＩＬ－７を培養の７日目に同時に加え、ＩＬ－１５は加えなかった群Ａの結果を示す。Ｂは、ＩＬ－２及びＩＬ－７を培養の７日目に同時に加え、ＩＬ－１５を培養開始時に加えた群Ｂの結果を示す。Ｃは、ＩＬ－２及びＩＬ－７を培養の７日目に同時に加え、ＩＬ－１５を培養の７日目に加えた群Ｃの結果を示す。Ｄは、ＩＬ－２及びＩＬ－７を培養の７日目に同時に加え、ＩＬ－１５を培養の１４日目に加えた群Ｄの結果を示す。 Ａ～Ｄは、実施例５において、サイトカインＩＬ－１２を加える時間が、増殖したＣＴＫＣ集団中のＩ型ＮＫＴ細胞マーカー発現細胞の割合に与える影響を示す。ＴＣＲ Ｖα２４（Ｖａ２４）及びＴＣＲ Ｖβ１１（Ｖｂ１１）を発現している細胞の存在を決定するためフローサイトメトリーを使用し、その際、Ｖａ２４＋Ｖｂ１１＋細胞に基づいてゲートを設定した。Ａは、ＩＬ－２及びＩＬ－７を培養の７日目に同時に加え、ＩＬ－１５を培養の１４日目に加え、ＩＬ－１２は加えなかった群Ａの結果を示す。Ｂは、ＩＬ－２及びＩＬ－７を培養の７日目に同時に加え、ＩＬ－１５を培養の１４日目に加え、ＩＬ－１２を培養開始時に加えた群Ｂの結果を示す。Ｃは、ＩＬ－２及びＩＬ－７を培養の７日目に同時に加え、ＩＬ－１５を培養の１４日目に加え、ＩＬ－１２を培養の７日目に加えた群Ｃの結果を示す。Ｄは、ＩＬ－２及びＩＬ－７を培養の７日目に同時に加え、ＩＬ－１５を培養の１４日目に加え、ＩＬ－１２を培養の２０日目に加えた群Ｄの結果を示す。
本開示は、一部には、エフェクターサイトカイン分泌能が改善され、細胞傷害性が改善された超活性化サイトカインキラーＴ細胞（ＳＣＫＴＣ）の増殖させ濃縮された集団を含む細胞製品を含む医薬組成物を調製するための、エキソビボでの方法の発見に基づいている。したがって、本開示は、養子移入にさらに使用することができる多数の機能性ＳＣＫＴＣを生成させるインビトロでの方法を提供する。
本願組成物及び方法を記載する前に、記載されている特定の分子、組成物、方法論またはプロトコルは変更され得るため、本開示はそれらに限定されないことを理解されるべきである。記載において使用される用語は、個々のバージョンまたは個々の実施形態を説明することのみを目的としており、本開示の範囲を限定することは意図しておらず、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるということも理解されるべきである。これらの実施形態は、記載されている特定の方法、プロトコル、細胞株、ベクター、及び試薬が変更され得るため、それらに限定されないと理解される。本明細書で使用される用語は個々の実施形態を説明することのみを目的とするものであり、本実施形態または特許請求の範囲を限定することは意図しないと理解されるべきである。さらに、記載及び特許請求の範囲での第１、第２、第３等の用語は、類似要素同士を区別するために使用され、必ずしも連続する順序または時系列の順序を記載しているわけではない。そのように使用される用語は、適切な状況下では同義であること、本明細書に記載される開示の実施形態は、本明細書で記載または例示されている以外の順序で実施可能であることを理解されるべきである。
定義
別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本開示の属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本開示の実施形態の実施または試験に際し、本明細書に記載される方法及び材料と類似または同等の任意のものを使用することができるが、ここでその好ましい方法、デバイス、及び材料を記載する。本明細書で言及される刊行物はすべて参照により組み込まれる。本明細書のいかなる記載も、本発明が先行開示を理由としてかかる開示に先行する権利がないことを承認するとして解釈されるべきではない。
明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、文脈で特に明確に指示されない限り、複数の指示対象が含まれる。
本明細書で、量、持続時間等のような測定可能な値に言及する際に使用される用語「約」は、規定した値から±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．９％、±０．８％、±０．７％、±０．６％、±０．５％、±０．４％、±０．３％、±０．２％または±０．１％の変動であって、開示方法を実施するのに適切な変動を包含することを意図する。
本明細書及び特許請求の範囲で使用される語句「及び／または」、それにより接続されている要素の「いずれか、または両方」、すなわち、要素が、ある場合には結合的に存在し、別の場合には選言的に存在すること意味すると理解されるべきである。「及び／または」節で具体的に特定される要素以外に任意選択で他の要素が存在してよく、他の意味が別段明示されない限り、それらの具体的に特定された要素との関連を問わない。したがって、非限定的な例として、「Ａ及び／またはＢ」への言及は、「含むこと」等の非限定的言語と併用される場合であり得る。一実施形態によれば、Ｂを含まないＡ（任意選択でＢ以外の要素が含まれる）である。いくつかの実施形態では、Ａを含まないＢ（任意選択でＡ以外の要素が含まれる）であり、さらに別の実施形態では、ＡとＢの両方（任意選択で他の要素が含まれる）である、となる。
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、「または」は、上記で定義した「及び／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、列挙されている項目を分ける場合、「または」または「及び／または」は包含的である、すなわち、いくつかまたは列挙の要素、及び、任意選択で、列挙されていない追加項目のうち、少なくとも１つが包含されるが、２つ以上も包含されと解釈されるものとする。「のうち１つのみ」または「のうち正確に１つ」のように他の意味を明示する用語、または特許請求の範囲で使用される場合の「からなる」に限り、いくつかまたは列挙の要素のうちの正確に１つの要素の包含を指す。一般に、本明細書で使用される用語「または」は、「いずれか」、「のうち１つ」、「のうち１つのみ」、または「のうち正確に１つ」という排他性の用語が先行する場合は、排他的な代替（すなわち、「一方または他方であるが両方ではない」）を示すという解釈に限られるものとし、特許請求の範囲で使用される「本質的に～からなる」は、それが特許法分野において使用される通常の意味を有するものとする。
本明細書で使用される場合、語句「ＸからＹまでの整数」とは、その端点を含めた任意の整数を意味する。すなわち、ある範囲が開示されている場合、その端点を含む範囲内の各整が数開示される。例えば、語句「ＸからＹまでの整数」では、１～５という範囲同様、１、２、３、４、または５が開示される。
本明細書で製品、組成物及び方法を定義するために使用される場合、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに 「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」等、含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）の任意の形）、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに「有する（ｈａｖｅ）」及び「有する（ｈａｓ）」等、有している（ｈａｖｉｎｇ）の任意の形）、「含まれている（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅ）」等、含まれている（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）の任意の形）または「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」等、含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）の任意の形）は、非限定的であり、記述されていない追加の要素または方法ステップを除外するものではない。したがって、あるアミノ酸配列が、あるポリペプチドの最終アミノ酸配列の一部であることが考えられる場合、そのポリペプチドはそのアミノ酸配列を「含む」。そのようなポリペプチドは、追加の数百のアミノ酸残基（例えば、本明細書で言及されるようなタグ及び標的指向性ペプチド）を有し得る。「本質的に～からなる」とは、任意の本質的な意義のある他の構成要素またはステップを除外することを意味する。したがって、本質的に記述構成要素からなる組成物の場合、微量の汚染物質及び薬学的に許容される担体は除外されない。あるポリペプチドが、あるアミノ酸配列「から本質的になる」とは、そのようなアミノ酸配列が最終的に少数の追加アミノ酸残基しか含まずに存在する場合である。「からなる」とは、他の構成要素またはステップの微量以上の要素を除外することを意味する。例えば、ポリペプチドはアミノ酸配列「からなる」とは、そのポリペプチドが、記述アミノ酸配列以外のいかなるアミノ酸も含有しない場合である。
本明細書で使用される場合、「実質的に同等」とは、所与の測定基準で異常または正常な範囲と相関することが知られている範囲内にあることを意味する。例えば、対照試料が罹患患者からのものである場合、実質的に同等とは、異常範囲内にあることである。対照試料が、試験される状態を有していないことが分かっている患者からのものである場合、実質的に同等とは、その所与の測定基準の正常範囲内にあることである。
特に明記しない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者に共通して理解される意味と同一の意味を有する。本発明の試験の実施に際し、本明細書に記載される方法及び材料と類似または同等の任意のものを使用できるが、好ましい材料及び方法を本明細書に記載する。
本明細書で使用される場合、「活性化させる」、「刺激する」、「増強させる」「増大させる」及び／または「誘導する」という用語（及び同等の用語）は同じ意味で使用され、一般に、濃度、レベル、機能、活性、または挙動を、天然のもの、予測されるもの、もしくは平均的なものに対して、または対照状態に対して、直接であれ間接的であれ改善または増大させる行為を指す。「活性化させる」とは、細胞表面部分の結合により誘導される一次応答を指す。例えば、受容体との関連において、そのような刺激では、受容体の結合及びそれに続くシグナル伝達事象を伴う。さらに、刺激事象により、細胞が活性化されて、分子の発現もしくは分泌が上方制御または下方制御され得る。したがって、細胞表面部分の結合は、直接的なシグナル伝達事象が存在しない場合であっても、細胞骨格構造の再構成、または細胞表面部分の融合を生じさせる場合があり、その各々が、その後の細胞応答の増強、調節、または変化を担い得ると考えられる。
本明細書で使用される場合、用語「サイトカインキラーＴ細胞を活性化する（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）または活性化する（ａｃｔｉｖａｔｅ）」または「ＣＫＴＣｌ活性化」は、ＣＫＴＣの１つ以上の細胞応答を引き起こすかまたは結果として生じさせる過程を指すことが意図され、これには、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害活性、及び活性化マーカーの発現が含まれる。本明細書で使用される場合、「活性化サイトカインキラーＴ細胞」とは、活性化シグナルを受け取っており、したがって、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害活性、及び活性化マーカーの発現が含まれる、１つ以上の細胞応答を示すサイトカインキラーＴ細胞を指す。ＣＫＴＣを活性化させることには、ＣＫＴＣからのサイトカインの分泌を誘導すること、ＣＫＴＣの増殖を刺激すること、及びＣＫＴＣでの細胞表面マーカーの発現を上方制御することのうち、１つ以上が含まれ得る。サイトカインは、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、及びＩＦＮ－γのうちの１つ以上であり得る。特定の実施形態によれば、ＣＫＴＣを活性化させることには、ＩＬ－４、ＩＬ－５、Ｉｌ－６、ＩＬ－１０、またはＩＦＮ－γのうちの１つ以上の分泌が含まれ得る。ＣＫＴＣ活性化を測定する好適なアッセイは、当該技術分野で公知であり、本明細書に記載される。
用語「活性な」とは、記載の発明の医薬組成物の成分、構成要素または構成成分が、意図された治療効果の原因であることを指す。
本明細書で使用される場合、用語「投与」及びその様々な文法上の形は、哺乳類、細胞、組織、器官、または生体液に適用される場合、外因性のリガンド、試薬、プラセボ、小分子、医薬剤、治療剤、診断用薬、または組成物と、対象、細胞、組織、器官、または生体液等との接触を指すが、これに限定されない。「投与」は、例えば、治療的、薬物動態学的、診断用、研究、プラセボ、及び実験的な方法を指し得る。「投与」はまた、試薬、診断用、結合用組成物によるかまたは別の細胞による、インビトロ及びエキソビボでの処理、例えば、細胞の処理をも包含する。
本明細書で使用される場合、用語「養子免疫療法」または「養子移入」とは、免疫系が疾患と闘うのを助けるために使用される処置を指し、疾患と闘うことのできるＴ細胞数を増加させるため、患者から採取されたＴ細胞を増殖させる（実験室での培養で増殖）。これらのＴ細胞はその後、患者へ戻される。
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は最も広い意味で使用され、様々な抗体構造を包含し、これらには、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片、キメラ抗体及び完全合成抗体が含まれるが、これらに限定されない。実際は、抗体は血清タンパク質であり、その分子は、自身の表面に、その標的とする小さな化学基と相補的な小さな領域を有する。抗体のこれらの相補領域（抗体結合部位または抗原結合部位と呼ばれる）は、抗体分子あたり少なくとも２つあり、抗体分子の種類によっては１０、８、または種によっては１２もの領域があり、これらの領域と対応する抗原上の相補領域（抗原決定基またはエピトープ）と反応して、いくつかの多価抗原分子を一緒につないで格子を形成し得る。全抗体分子の基本構造単位は、４本のポリペプチド鎖、すなわち、２本の同一軽（Ｌ）鎖（それぞれが約２２０個のアミノ酸を含有する）及び２本の同一重（Ｈ）鎖（通常それぞれが約４４０個のアミノ酸を含有する）からなる。２本の重鎖と２本の軽鎖は、非共有結合と共有結合（ジスルフィド結合）の組み合わせにより結合している。分子は、２つの同一な部分で構成され、各々に、軽鎖のＮ末端領域と重鎖のＮ末端領域とで構成される同一の抗原結合部位がある。通常、軽鎖と重鎖の両方が協力して抗原結合表面を形成する。
ヒト抗体は、κ及びλの２種類の軽鎖を示し、免疫グロブリンの個々の分子は一般にいずれか一方である。哺乳類では、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭという５クラスの抗体があり、各々にそれ自身のクラスの重鎖がある。５つの免疫グロブリンクラスはいずれも、それらが広い範囲の電気泳動移動度を示し、かつ均一ではない点で、他の血清タンパク質とは異なる。個々のＩｇＧ分子が、例えば、実効電荷において互いに異なるというこの不均一性は、免疫グロブリンの固有の特性である。
相補性の原理は、しばしば鍵穴に鍵を差し込むことに例えられるが、比較的弱い結合力（疎水性結合及び水素結合、ファンデルワールス力、ならびにイオン相互作用）を伴うもので、これらの結合力は、２個の反応分子が互いに非常に近くまで接近でき、実に、ある分子の突出する構成原子または構成原子団が、他方の分子の相補的なくぼみまたは陥凹に適合することができるほど近くまで接近できる場合にのみ効果的に作用することができる。抗原－抗体相互作用は高度の特異性を示し、多くのレベルで明らかである。分子レベルまで下げた場合、特異性とは、ある抗原に対する抗体の結合部位が、非関連抗原の抗原決定基にはまったく類似していない相補性を有することを意味する。２つの異なる抗原の抗原決定基に何らかの構造上の類似点がある場合は常に、ある決定基が、他の決定基に対するいくつかの抗体の結合部位に、ある程度の適合することが起こり得、この現象が交差反応を生じさせる。交差反応は、抗原抗体反応の相補性または特異性を理解するうえで大いに重要である。免疫学的な特異性または相補性が、抗原にある少量の不純物／汚染物の検出を可能にしている。
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、免疫されたドナー由来マウス脾臓細胞と、マウス骨髄腫細胞株とを融合させて、選択培地で増殖するマウス樹立ハイブリドーマクローンを得ることによって作製することができる。ハイブリドーマは、抗体分泌Ｂ細胞と骨髄腫細胞とのインビトロでの融合から得られる不死化ハイブリッド細胞である。抗原特異的培養Ｂ細胞の主要活性化を指すインビトロ免疫は、十分に確立された、マウスモノクローナル抗体生産のもう一つの手段である。
末梢血リンパ球由来の免疫グロブリン重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（Ｖκ及びＶλ）可変遺伝子の多様なライブラリーもまた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅により増幅させることができる。重鎖及び軽鎖の可変ドメインがポリペプチドスペーサーで連結されている単一ポリペプチド鎖（一本鎖ＦｖまたはｓｃＦｖ）をコードする遺伝子は、ＰＣＲを使用して、重鎖及び軽鎖のＶ遺伝子をランダムに結合させることによって作製することができる。その後、コンビナトリアルライブラリーをクローニングして、ファージ先端で少量のコートタンパク質への融合により糸状バクテリオファージの表面に提示させることができる。
誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）という手法は、ヒト免疫グロブリンＶ遺伝子とげっ歯類免疫グロブリンＶ遺伝子のシャッフリングに基づいている。かかる方法では、（ｉ）ヒトＶL鎖のレパートリーを、目的抗原と反応性のあるマウスモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶH）ドメインとシャッフリングすること、（ｉｉ）その抗原に対する半ヒトＦａｂを選択すること、（ｉｉｉ）、選択されたＶL遺伝子を、ヒト軽鎖遺伝子を有するクローンＦａｂ断片を単離するための第２シャッフルでヒト重鎖ライブラリー用「ドッキングドメイン」として使用すること、（ｖ）、かかる遺伝子を含有する哺乳類細胞発現ベクターで電気穿孔によりマウス骨髄腫細胞に形質移入すること、及び（ｖｉ）抗原と反応性のあるＦａｂのＶ遺伝子を完全ＩｇＧ１抗体分子としてマウス骨髄腫に発現させることを伴う。
本明細書で使用される場合、用語「抗原提示」とは、ＭＨＣ分子に結合しているペプチド断片の形態で抗原を細胞表面に提示することを指す。
本明細書で使用される場合、用語「抗原提示細胞（ＡＰＣ）」とは、自身の表面に１つ以上の抗原を、免疫系の特定のエフェクター細胞が認識可能なペプチド－ＭＨＣ複合体の形態で提示（ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ）（「提示（ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ）」）し、それにより、提示されている抗原（複数可）に対する効果的な細胞性免疫応答を誘導する能力がある細胞群を指す。プロフェッショナルＡＰＣの例は樹状細胞及びマクロファージであるが、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩの分子を発現しているどの細胞もペプチド抗原を提示する可能性がある。ＡＰＣは、「人工ＡＰＣ」であり得、１つ以上の抗原を提示するよう操作されている細胞を指すことが意図される。Ｔ細胞が外来タンパク質を認識できる前に、そのタンパク質がペプチド－ＭＨＣ複合体として細胞表面に提示され得るよう、タンパク質は抗原提示細胞または標的細胞の内部でプロセシングを受けていなければならない。
本明細書で使用される場合、用語「抗原プロセシング」とは、外来タンパク質を、Ｔ細胞に提示するために、ＭＨＣ分子に結合することができるペプチドに細胞内で分解することを指す。
本明細書で使用される場合、用語「自己」とは、同一個体に由来することを指すことが意図される。本明細書で使用される場合、用語「同種」とは、に由来すること遺伝学的に異なる２つの個体を指すことが意図される。
本明細書で使用される場合、用語「オートファジー」とは、細胞による、自身のリソソーム内細胞小器官及びタンパク質の消化及び分解を指す。
本明細書で使用される場合、用語「バイオマーカー」（または「生命存在指標（ｂｉｏｓｉｇｎａｔｕｒｅ）」）とは、生物学的状態の指標として使用されるペプチド、タンパク質、核酸、抗体、遺伝子、代謝産物、または他の任意の物質を指す。客観的に測定され、正常な生物学的過程、発病過程、または治療介入に対する薬理学的反応についての細胞もしくは分子の指標として評価される特性である。本明細書で使用する用語「指標」とは、時系列の相対的変化；または目視可能なシグナル、形跡、目印、兆候もしくは症状、またはそれらの実存または存在の証拠が明らかされ得る、一連の観察事実に由来する任意の物質、数または比を指す。提案されたバイオマーカーが確認された後は、それを、疾患リスク、個体における疾患の存在を診断するため、または、個体の疾患の治療を個別化（薬物治療または投与計画の選択）するために使用してよい。可能性のある薬物療法を評価する際、生存または不可逆的罹患率等の自然エンドポイントの代替としてバイオマーカーが使用され得る。治療によりバイオマーカーが変化し、その変化が健康状態の改善と直接関連がある場合、そのバイオマーカーは、臨床上の利益を評価するための代替エンドポイントとして役立ち得る。臨床的エンドポイントは、患者の気分、機能または生存を測定するために使用され得る変数である。代替エンドポイントは、臨床的エンドポイントを代替することが意図されるバイオマーカーであり、これらのバイオマーカーは、規制当局及び臨床コミュニティにとって受け入れられる信頼水準で臨床的エンドポイントを予測することが示されている。
本明細書で使用される場合、用語「がん」とは、異常細胞が無制御で分裂し、他の組織に侵入することができる疾患を指すことが意図される。がんには異なる種類が１００以上ある。ほとんどのがんは、その出発点となった器官または細胞の種類にちなんで名前が付けられており、例えば、結腸で始まるがんは結腸癌と呼ばれ、皮膚のメラノサイトで始まるがんはメラノーマと呼ばれる。がんの種類は、大きなカテゴリーに分けることができる。がんの主なカテゴリーとしては、癌腫（皮膚、または内臓を覆うかもしくはカバーする組織で始まるがん、ならびにその亜型、例えば、腺癌、基底細胞癌、扁平上皮癌、及び移行上皮癌を意味する）、肉腫（骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、または他の結合組織もしくは支持組織で始まるがんを意味する）、白血病（造血組織（例えば、骨髄）を出発点とし、多数の異常血液細胞を産生させ、血液に入るがんを意味する）、リンパ腫及び骨髄腫（免疫系の細胞で始まるがんを意味する）、及び中枢神経系のがん（脳及び脊髄の組織で始まるがんを意味する）が挙げられる。用語「骨髄異形成症候群」とは、骨髄で十分な正常血液細胞（白血球、赤血球、及び血小板）が作られず、血液及び／または骨髄に異常細胞があるがん種類を指す。骨髄異形成症候群は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）になり得る。
本明細書で使用される場合、用語「ＣＤ１ｄ」とは、膜貫通型糖タンパク質のファミリーを指すことが意図され、これらは、構造的にＭＨＣタンパク質に関連しており、ベータ－２－ミクログロブリンとヘテロ二量体を形成し、これが、自己または微生物を起源とする主要な脂質及び糖脂質抗原のＴ細胞への提示を媒介する。
本明細書で使用される場合、用語「ケモカイン」とは、特定の方向へ移動するよう白血球にシグナル伝達する走化性サイトカインの一群を指すことが意図される。
本明細書で使用される場合、用語「構成要素」とは、構成する部分、要素または成分を指すことが意図される。
本明細書で使用される場合、用語「組成物」とは、２つ以上の物質の混合により形成される材料を指すことが意図される。
本明細書で使用される場合、用語「状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」とは、様々な健康の状態（ｓｔａｔｅ）を指し、任意の基礎にある機序または障害によって生じる障害もしくは疾患が含まれることが意図される。
本明細書で使用される場合、用語「接触」及びその様々な文法上の形は、触れるかまたは直近であるかまたは局部的な近接の、状態（ｓｔａｔｅ）または状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を指すことが意図される。組成物と標的とする目的部位との接触は、当業者に知られている任意の投与手段により起こり得る。
本明細書で使用される場合、用語「共刺激分子」とは、ナイーブＴ細胞が活性化されてエフェクター細胞になる際の役割を担うＡＰＣの細胞表面に提示される、一緒に結合される１つまたは２つまたはそれ以上の原子団を指すことが意図される。例えば、外来性抗原をＴ細胞受容体に提示するＭＨＣタンパク質もまた、Ｔ細胞の活性化をもたらすために、Ｔ細胞の表面にある相補的受容体に結合する共刺激タンパク質を必要とする。
本明細書で使用される場合、用語「共刺激受容体」とは、ナイーブリンパ球にある細胞表面受容体を指すことが意図され、これを介して、ナイーブリンパ球は、抗原受容体を介して受け取ったシグナルの他に追加シグナルを受け取り、リンパ球の完全活性化にはこれらが必要である。例は、Ｂ細胞上のＣＤ３０及びＣＤ４０、ならびにＴ細胞上のＣＤ２７及びＣＤ２８である。
本明細書で使用される場合、用語「同族補助」とは、ヘルパーＴ細胞との密接な相互作用との関連において、最も効率的に生じる過程を指すことが意図される。
本明細書で使用される場合、用語「培養」及びその他の文法上の形は、細胞の集団を人工培地において基材上で成長及び増殖させる過程を指すことが意図される。
本明細書で使用される場合、用語「サイトカイン」とは、細胞により分泌される、他の細胞に対する多種多様な作用を有する小さな可溶性タンパク質を指す。サイトカインは、成長、発達、創傷治癒、及び免疫応答を含め、多くの重要な生理学的機能を媒介する。それらは、細胞膜に位置する自身の細胞特異的受容体に結合することによって作用し、これにより、別個のシグナル伝達カスケードが細胞内で開始可能となり、最終的に、標的細胞において生化学的変化及び表現型変化をもたらす。サイトカインは、放出部位の局部的であっても遠位であっても作用することができる。それらとしては、インターロイキンの多く及びいくつかの造血因子を包含するＩ型サイトカイン；インターフェロン及びインターロイキン－１０が含まれるＩＩ型サイトカイン；ＴＮＦα及びリンホトキシンが含まれる腫瘍壊死因子（「ＴＮＦ」）関連分子；インターロイキン１（「ＩＬ－１」）が含まれる免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー；ならびに多種多様な免疫機能及び炎症性機能において重要な役割を果たす分子のファミリーであるケモカインが挙げられる。同一のサイトカインでも、ある細胞に対する作用は、その細胞の状態に応じて異なり得る。多くの場合、サイトカインは、他のサイトカインの発現を制御し、それらのカスケードを誘発する。サイトカインの非限定的な例としては、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２／ＩＬ－２３ Ｐ４０、ＩＬ１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５／ＩＬ１５－ＲＡ、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＴＧＦ－β、ＩＦＮγ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇｒｏα、ＭＣＰ－１及びＴＮＦ－αが挙げられる。
本明細書で使用される場合、用語「樹状細胞」または「ＤＣ」とは、Ｔ細胞に外来性抗原を提示する、様々なリンパ組織及び非リンパ組織に見られる形態の似た細胞型の多様な集団を表し、Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２７１－２９６（１９９１）を参照にされたい。本明細書で使用される場合、用語「由来する」とは、元の供給源から何かを受け取る、取得する、または変更するための任意の方法を包含することが意図される。
本明細書で使用される場合、用語「検出可能マーカー」とは、選択マーカーとアッセイマーカーの両方を指すことが意図される。用語「選択マーカー」とは、発現コンストラクトで形質転換された細胞が、それについて選択またはスクリーニングされ得る様々な遺伝子産物を指すことが意図され、それらには、薬物耐性マーカー、蛍光活性化細胞分類において有用な抗原マーカー、選択的接着を可能にする接着リガンドの受容体についての接着マーカー等が含まれる。
本明細書で使用される場合、用語「検出可能な応答」とは、検出試薬の有無を問わず実施され得る、アッセイで検出され得る任意のシグナルまたは応答を指すことが意図される。検出可能な応答としては、放射性崩壊及びエネルギー（例えば、蛍光、紫外線、赤外線、可視光）放出、吸収、偏光、蛍光、燐光、伝達、反射または共鳴伝達、が挙げられるが、これらに限定されない。検出可能な応答には、クロマトグラフィーでの移動度、濁度、電気泳動移動度、マススペクトル、紫外スペクトル、赤外スペクトル、核磁気共鳴スペクトル及びＸ線回折も含まれる。別法として、検出可能な応答は、融点、密度、伝導率、弾性表面波、触媒活性または元素組成等、生物学的物質の１つ以上の特性を測定するアッセイの結果であり得る。「検出試薬」は、目的物質の有無を示す検出可能な応答を発生する任意の分子である。検出試薬としては、抗体、核酸配列及び酵素等の様々な分子のいずれも含まれる。検出を容易にするため、検出試薬はマーカーを含み得る。
本明細書で使用される用語「疾患」または「障害」とは、健康異常または異常機能の状態を指す。
本明細書で使用される場合、用語「用量」とは、一度に摂取するよう処方されている治療用物質の量を指すことが意図される。本明細書で使用される用語「最大耐用量」とは、忍容できない副作用を引き起こさない、薬物または治療薬の最高用量を指すことが意図される。
本明細書で使用される用語「内在性」とは、生物、細胞、組織もしくは系の内部から得られるかまたは産生される任意の物質を指す。
本明細書で使用される場合、用語「濃縮する」とは、ある細胞集団において、例えば、細胞のサブタイプの相対的頻度をその天然での頻度と比較して増大させるために、所望の物質の割合を増大させることを指すことが意図される。陽性選択、陰性選択、またはその両方は一般に、いかなる濃縮スキームにとっても必要と考えられる。選択方法には、限定することなく、磁気分離及びＦＡＣＳが含まれる。濃縮に使用される特定の技術にかかわらず、分化ステージ及び活性化特異的応答は細胞の抗原特性を変化され得るため、選択工程で使用される特異的マーカーは極めて重要である。
本明細書で使用される場合、用語「サイトカインキラーＴ細胞（ＣＫＴＣ）の集団を増殖させる」または「サイトカインキラーＴ細胞（ＣＫＴＣ）増殖」とは、サイトカインキラーＴ細胞集団を一連の細胞分裂に供し、それにより細胞数を増やす（例えば、インビトロ培養により）工程を指すことが意図される。用語「増殖超活性化サイトカインキラーＴ細胞」は、細胞増殖を介して得られる超活性化サイトカインキラーＴ細胞に関する。
本明細書で使用される場合、用語「発現」とは、遺伝子による、通常はタンパク質合成の誘導による、観察可能な表現型の生成を包含することが意図される。それには、ｍＲＮＡの生合成、ポリペプチド生合成、ポリペプチド活性化（例えば、翻訳後修飾による）、または細胞内位置を変化させるかもしくはクロマチンへの動員による発現の活性化が含まれる。
本明細書で使用される場合、用語「Ｆａｓ」とは、ＴＮＦスーパーファミリーに属する、リンパ球で見られる２型膜タンパク質を指すことが意図される。Ｆａｓを発現する細胞では、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）による細胞デスレセプターＦａｓの会合で、カスパーゼ活性化により媒介されるアポトーシス細胞死がもたらされる。
本明細書で使用される場合、用語「フローサイトメトリー」とは、細胞の表現型及び特徴を調べるためのツールを指すことが意図される。これは、細胞または粒子が液体流中を移動する際に、感知領域を過ぎたレーザー（放射の誘導放出による光の増幅）／光線を介してそれらを感知する。微視的粒子の相対的光散乱及び色分けされた蛍光を測定する。フロー解析及び細胞の鑑別は、大きさ、粒度に基づく他、細胞が抗体または色素のいずれかの形態で蛍光分子を担持しているか否かに基づく。細胞がレーザー光線を通過する際、光は全方向に散乱し、軸から低角度（０．５～１０°）で前方に散乱する光は、球体の半径の二乗に比例するため、細胞または粒子の大きさに比例する。光は細胞に入り得るため、９０°の光（直角、側方）散乱は、蛍光色素結合抗体で標識されているか、または蛍光膜、細胞質用色素、または核用色素で染色されている可能性がある。したがって、細胞型の鑑別、膜受容体及び抗原の存在、膜電位、ｐＨ、酵素活性、及びＤＮＡ含量が容易になり得る。フローサイトメーターはマルチパラメータであり、各細胞のいくつかの測定値を記録するため、不均一な集団内の均一な亜集団を特定することが可能である（Ｍａｒｉｏｎ Ｇ．Ｍａｃｅｙ，Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００７）。蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）は、物理特性が非常に類似しているためにサイズまたは密度によって分離することができない別個の細胞集団の分離を可能にするもので、差次的に発現されている表面タンパク質を検出するために蛍光タグを使用するため、物理的に均一な細胞集団内での微細な区別をすることができる。
本明細書で使用される場合、用語「製剤」及び「組成物」は、本明細書では同じ意味で使用され、すべての活性成分及び不活性成分を含む本発明の製品を指す。本明細書で使用される用語「医薬製剤」または「医薬組成物」とは、標的とする状態もしくは疾患を、予防する、強度を軽減する、治癒させるか他の場合には治療する、製剤または組成物を指す。
本明細書で使用される場合、用語「機能的同等物」または「機能的に同等な」は、本明細書では同じ意味で使用され、同様または同一の効果または使用を有する物質、分子、ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを指す。
本明細書で使用される場合、用語「細胞増殖」は、細胞が質量を蓄積して物理的な大きさを増大させる過程である。細胞がどのようにして増殖できるのかに関する自然の様々な例が数多くある。場合によっては、細胞サイズはＤＮＡ含量に比例する。例えば、細胞分裂のない連続ＤＮＡ複製（内部複製と呼ばれる）細胞サイズの増大をもたらす。巨核芽球は、成熟して顆粒状の巨核球になる、骨髄の血小板産生細胞であるが、典型的にはこのような様態で増殖する。異なる戦略で、脂肪細胞は、細胞内脂質を蓄積させることにより約８５～１２０μｍまで増殖することができる。内部複製または脂質蓄積とは対照的に、ニューロン及び心筋細胞等、一部の最終分化細胞は、分裂を停止して、そのＤＮＡ含量を増大させずに増殖する。これらの細胞は、自身の特殊化した機能を実施しなければならなくなるまで、それらの巨大分子含量（大くはタンパク質）を比例的に増加させる。これには、栄養及び増殖因子からの細胞外の合図と、細胞内エネルギー利用率及び巨大分子合成を制御することに関与する細胞内シグナル伝達ネットワークとの間の協調を伴う。おそらく、最も厳密に制御される細胞増殖は分裂中の細胞で起こり、その場合、細胞増殖と細胞分裂は明確に分けることのできる過程である。分裂中の細胞は一般に、一定の平均細胞サイズが確実に維持されるよう、細胞分裂周期を介した各経過を経るごとにサイズが大きくならなければならない。典型的な分裂中の哺乳類細胞では、増殖は細胞周期のＧ１期で起こり、Ｓ期（ＤＮＡ合成）及びＭ期（有糸分裂）と密接に協調している。増殖因子、ホルモン、及び栄養利用率の複合的な影響により、細胞が増殖するための外部の合図が提供される。Ｇｕｅｒｔｉｎ，Ｄ．Ａ．，Ｓａｂａｔｉｎｉ，Ｄ．Ｍ．，“Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ，”ｉｎ Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ（４th Ｅｄｎ）Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ Ｅｄｓ，Ｓａｕｎｄｅｒｓ（２０１５），１７９－１９０。
本明細書で使用される場合、用語「細胞増殖」とは、細胞数の増加をもたらす過程を指すことが意図され、細胞分裂と細胞死または分化による細胞消失との調和により定義される。
本明細書で使用される場合、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子」（ＧＭ－ＣＳＦ）という用語は、造血前駆細胞の増殖及び分化ならびに好中球、好酸球、及びマクロファージの発生を促進するサイトカインを指すことが意図される。また、幹細胞因子、ＩＬ－３、エリスロポエチン、及びトロンボポエチン等、他のサイトカインとの相乗作用で、赤血球及び巨核球前駆細胞も刺激する（Ｂａｒｒｅｄａ，ＤＲ，ｅｔ ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ＆ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００４）２８（５０：５０９－５５４）。ＧＭ－ＣＳＦは、間質細胞、パネート細胞、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、ならびにＴｈ１及びＴｈ１７ Ｔ細胞を含め、複数の細胞型により産生される（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ－Ｃｒｕｚ ，Ａ．ｅｔ ａｌ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２０１４）３１：７７４ｅｔ ａｌ．）。
本明細書で使用される場合、用語「免疫応答」及び「免疫媒介性」は本明細書では同じ意味で使用され、外来性または自己の抗原に対する、対象の免疫系のあらゆる機能発現を指すことが意図され、これらの反応の結果が対象にとって有益であるか有害であるかは問わない。
本明細書で使用される場合、「免疫調節性の（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ）」、「免疫調節因子」及び「免疫調節性の（ｉｍｍｕｎｅ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ）」という用語は、本明細書では同じ意味で使用され、ケモカイン、サイトカイン及び他の免疫応答メディエーターを発現させることによって免疫応答を直接または間接的に増強または低下させることができる物質、薬剤、または細胞を指す。
本明細書で使用される用語「炎症」とは、血管組織がそれによって損傷に応答する生理学的過程を指す。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ， ４ｔｈ Ｅｄ．， Ｗｉｌｌｉａｍ Ｅ． Ｐａｕｌ， ｅｄ． Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ （１９９９） ａｔ １０５１－１０５３を参照のこと。炎症過程の間、解毒及び修復に関与する細胞は、炎症メディエーターによって障害のある部位に動員される。炎症は、炎症の部位における白血球、特に好中球（多形核細胞）の強い浸潤を特徴とする場合が多い。これらの細胞は、血管壁または非損傷組織において毒性物質を放出することによって組織損傷を促進する。従来より、炎症は急性反応と慢性反応に分けられている。
本明細書で使用される用語「急性炎症」とは、体液、血漿タンパク質、及び好中球の蓄積を特徴とする急性の損傷に対する、急速で長続きしない（数分から数日）比較的一様な応答を指す。急性炎症を引き起こす有害物質の例としては、病原体（例えば、細菌、ウイルス、寄生虫）、外因性の異物源（例えば、アスベスト）または内在性の異物源（例えば、尿酸結晶、免疫複合体）、及び物理的（例えば、熱傷）もしくは化学的（例えば、腐食剤）物質が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される用語「慢性炎症」とは、長期的な炎症であり、停止が漠然として定まらないものを指す。急性炎症が、初期炎症性物質の不完全なクリアランスによるかまたは複数の急性イベントが同じ位置で生じている結果として持続した場合、慢性の炎症となる。慢性炎症には、リンパ球及びマクロファージの流入ならびに線維芽細胞増殖が含まれ、長期または繰り返される炎症活性の部位で組織瘢痕化をもたらし得る。
本明細書で使用される場合、用語「インターフェロンガンマ」（ＩＦＮ－γ）とは、自然免疫系及び適応免疫系の両方の細胞により分泌される、ＩＩ型クラスのインターフェロンの一種である可溶性サイトカインを指すことが意図される。活性タンパク質は、インターフェロンガンマ受容体に結合して、ウイルス感染及び微生物感染に対する細胞応答を誘発するホモ二量体である。
本明細書で使用される場合、用語「インターロイキン－２」（ＩＬ－２）とは、Ｔリンパ球の一種によって作られるサイトカインの一種であり、他のＴリンパ球及びＢリンパ球の増殖と活性を増大させ、免疫系の発達に影響を与えるものを指すことが意図される。実験室で作られたＩＬ－２はアルデスロイキンと呼ばれる。
本明細書で使用される場合、用語「インターロイキン４」（ＩＬ－４）は、その作用が一般にインターフェロンガンマの作用に対して拮抗的な多面的サイトカインである。ＩＬ－４Ｒは広く発現されるため、ＩＬ－４はほとんどすべての細胞型に影響を与える。Ｔ細胞では、ＩＬ－４は、Ｔｈ２サブセットの分化及び増殖に不可欠である。そのため、ＩＬ－４は、細胞外で生存し複製する病原体と闘うために必要な液性応答の確立を促進する。Ｂ細胞では、ＩＬ－４は、増殖及び分化を刺激し、ＭＨＣクラスＩＩ及びＦｃεＲＩＩ（ＣＤ２３）の上方制御を誘導する。ＩＬ－４はまた、マウスＢ細胞においてＩｇＧ１及びＩｇＥへのアイソタイプのスイッチを促進するが、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３へのスイッチを阻害する。ＩＬ－４はマスト細胞の増殖因子であり、アレルギー反応においては、これらの反応がＩｇＥ媒介性のマスト細胞の分解を伴うことから、調節性の主要な役割を果たす。ＩＬ－４はまた、ＩＬ－４で促進されるＩｇＥ産生がＦｃεＲＩＩＢ担持好酸球の効率的なＡＤＣＣ実行を可能にすることから、蠕虫に対する防御に重要である。マクロファージでは、ＩＬ－４は、ＴＮＦ及びＩＬ－１β等の炎症誘発性ケモカイン及びサイトカインの分泌を阻害し、これらの細胞が活性酸素及び窒素中間体を産生する能力を障害し、ＩＣＡＭ及びＥ－セレクチン等の細胞接着分子のＩＦＮγ誘導性発現を遮断する。しかしながら、ＩＬ－４はまた、ＤＣ及びマクロファージを誘導して、そのＩＬ－１２の合成を上方制御させ、Ｔｈ２応答を制御する負のフィードバック機序を供給することもできる。Ｍａｋ，ＴＷ，Ｓａｕｎｄｅｒｓ，ＭＥ，Ｃｈａｐｔｅｒ １７，“Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，” ｉｎ Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ，Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（２００６），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．４６３－５１６）。
本明細書で使用される場合、用語「インターロイキン－７」（ＩＬ－７）またはリンパ球新生因子（ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）－１）とは、器官、腺及び体内の他の構造体を覆い、支持する細胞によって作られる、Ｔリンパ球及びＢリンパ球の増殖を引き起こすサイトカインの一種を指すことが意図される。
本明細書で使用される場合、用語「インターロイキン－１２」（ＩＬ－１２）とは、他の免疫細胞にサイトカインを作らせ、Ｔリンパ球増殖を増大させる、主にＢリンパ球及びマクロファージによって作られるサイトカインの一種を指すことが意図される。これはまた、新たな血管の増殖を遮断する。
本明細書で使用される場合、用語「インターロイキン－１５」（ＩＬ－１５）とは、サイトカインの一種であり、その特異的受容体であるＩＬ－１５Ｒαを介して作用し、抗原を提示する樹状細胞、単球及びマクロファージに発現されるものを指すことが意図される。ＩＬ－１５は、Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞の活性化及び増殖を制御する。ＩＬ－１５及びＩＬ－２は多くの生物学的活性を共有する。それらは、共通のヘマトポエチン受容体サブユニットと結合することが分かっており、同じ受容体を競合し得るため、互いの活性を負に制御する。ＣＤ８＋メモリー細胞数は、ＩＬ－１５とＩＬ２のバランスにより制御されることが示されている。ＩＬ－１５は、ＪＡＫキナーゼの活性化、ならびに転写活性化因子ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、及びＳＴＡＴ６のリン酸化と活性化を誘導する。これらについてのマウスでの研究から、ＩＬ－１５は、可能性として、ＳＴＡＴ６の転写活性化活性を介してアポトーシス阻害因子ＢＣＬ２Ｌ１／ＢＣＬ－ｘ（Ｌ）の発現を増大させ、それによりアポトーシスを妨げ得ることが示唆された。
本明細書で使用される場合、用語「分離された」とは、限定するわけではないが、機械的分離または選択培養等の１つ以上の分離方法を介した、ある集団からの細胞の分離を指すことが意図される。細胞の「分離された」集団は純粋である必要はない。他の細胞型が存在してよい。いくつかの実施形態によれば、特定の細胞型の分離された集団とは、１０％超純粋である、２０％超純粋である、３０％超純粋である、４０％超純粋である、５０％超純粋である、６０％超純粋である、７０％超純粋である、８０％超純粋である、９０％超純粋である、または９５％超純粋であることを指す。
本明細書で使用される場合、用語「カプラン・マイヤープロット」または「カプラン・マイヤー生存曲線」とは、臨床試験被検者が、時間をいくつもの微小区間で考慮した一定の期間生存する確率のプロットを指すことが意図される。カプラン・マイヤープロットでは、（ｉ）どの時点においても、打ち切られる（すなわち、脱落）被検者は、追跡が継続される被検者と生存見込みが同じである、（ｉｉ）生存確率は、試験初期に募集された被検者も後半に募集された被検者も同じである、（ｉｉｉ）イベント（事象）（例えば、死亡）は特定の時間に起こると仮定している。イベントの出現確率は、特定時点で算出され、連続確率に、それより前に算出された任意の確率を乗算して最終推定値を得る。どの特定の時間においても生存確率は、生存被検者数をリスクのある被検者数で除算して計算される。死亡した被験者、試験から脱落した、または打ち切られた被検者は、リスクとして計数されない。
本明細書で使用される場合、用語「標識すること」とは、追跡可能な構成成分を導入することによって、化合物、構造、タンパク質、ペプチド、抗体、細胞または細胞成分を区別する方法を指すことが意図される。一般的な追跡可能構成成分としては、蛍光抗体、フルオロフォア、色素または蛍光色素、染色または蛍光染色、マーカー、蛍光マーカー、化学染色、分別染色、分別標識、及び放射性同位体が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「マーカー」または「細胞表面マーカー」は、本明細書では同じ意味で使用され、特定の種類の細胞表面で見られる抗原決定基またはエピトープを指す。細胞表面マーカーにより、細胞型の特徴付け、その同定、及び最終的にその分離を容易にすることができる。細胞分類技術は細胞バイオマーカーに基づいており、細胞表面マーカー（複数可）が、陽性選択または陰性選択、すなわち、細胞集団からの包含または排除のいずれにも使用され得る。
本明細書で使用される場合、用語「ＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）分子」とは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の遺伝子によりコードされる、広く分布する細胞表面糖タンパク質の大きなファミリーの一つを指す。それらは外来性抗原のペプチド断片と結合し、それらをＴ細胞に提示して免疫応答を誘導する」。一連の多型性の高い遺伝子によりコードされるクラスＩ ＭＨＣ分子はほとんどすべての細胞型で存在し、ウイルスペプチドをウイルス感染細胞表面に提示し、そこで、細胞傷害性Ｔ細胞により認識される。ＭＨＣクラスＩの機序では、外来ペプチドは取り込まれて抗原提示細胞内で輸送される。その後、外来タンパク質の少なくとも一部は細胞質プロテアソームによるタンパク質分解を受けて短いペプチドを形成し、それらは、抗原提示細胞の小胞体の内腔内へ輸送される。そこで、外来ペプチドがＭＨＣクラスＩ分子に担持され、小胞により抗原提示細胞の細胞表面へ輸送され、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞により認識される。がん細胞でのＭＨＣ Ｉ発現はＴ細胞による検出及び破壊に必要であり、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ、ＣＤ８＋）は、自己と非自己を明らかにするために、ＭＨＣクラスＩ分子による標的細胞上での腫瘍抗原提示を必要とする。腫瘍が宿主免疫応答を回避する最も一般的な手段の一つは、腫瘍がＭＨＣＩを低発現することにより、内因性または治療による抗腫瘍Ｔ細胞応答を無効にするというような、腫瘍細胞によるＭＨＣクラスＩ分子発現の下方制御によるものである（Ｈａｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒ Ｂｌｏｏｄ Ｃａｎｃｅｒ．２０１５ Ａｐｒ；６２（４）：５７１－５７６）。ほとんどの場合、腫瘍細胞でのＭＨＣ発現の消失は、エピジェネティックなイベントならびにＭＨＣ遺伝子座及び／または抗原プロセシング装置の転写下方制御により媒介される。空のＭＨＣ分子は細胞表面で安定ではないため、プロセシングされたペプチド抗原の不足はＭＨＣ発現の減少をもたらす。
プロフェッショナル抗原提示細胞上に存在するクラスＩＩ ＭＨＣ分子は、外来ペプチドをヘルパーＴ細胞に提示する。外来ペプチドはエンドソームの酸性環境に取り込まれて分解されるが、これは、ペプチドが、サイトゾルで一度も提示されずに、形態的に細胞外間隙と同等な細胞内区画内に残ることを意味する。ペプチドは、特殊化したエンドソーム区画内であらかじめ構築されているＭＨＣクラスＩＩタンパク質に結合し、次いで、担持ＭＨＣクラスＩＩ分子は抗原提示細胞の原形質膜へ輸送され、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞に提示される。（Ａｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ ４ｔｈ Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００２）ｐ．１４０７）。抗原はまた、ドナー細胞表面からのＭＨＣクラスＩＩ分子の獲得によって抗原提示細胞上にも担持され得る。ペプチド－ＭＨＣ輸送（「クロスドレッシング（ｃｒｏｓｓ－ｄｒｅｓｓｉｎｇ）」）では、ドナー細胞内部でのペプチド－ＭＨＣクラスＩＩ複合体の生成、及びそれに続くそれらの複合体のレシピエント抗原提示細胞への輸送を伴い、その後、それらの細胞は、プロセシングを受けていない無傷の大きなペプチド－ＭＨＣクラスＩＩ複合体をヘルパーＴ細胞に提示することができる。（Ｃａｍｐａｎａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ（２０１５）１６８（２）：３４９－５４）。内因性抗原はまた、オートファジーを介して分解される場合にもＭＨＣクラスＩＩにより提示され得る．（Ｓｃｈｍｉｄ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２６（１）：７９－９２）。
本明細書で使用される場合、用語「修飾する」または「調節する」及びそれらの様々な文法上の形は、ある程度の量または割合に、制御する、改変する、適応させる、または調節することを指すことが意図される。腫瘍細胞への免疫応答に関しては、これらの用語は、免疫細胞が腫瘍細胞を認識し、殺傷することができるよう、１つ以上の組換えＤＮＡ技術を介して腫瘍細胞に対する免疫応答の形態または特性を変化させることを指すことが意図される。
本明細書で使用される場合、用語「ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞」とは、グループＩ自然リンパ球に分類される、Ｔ細胞及びＢ細胞と同じファミリーのリンパ球を指す。それらは、プライミングまたは事前活性化がなくても腫瘍細胞を殺傷する能力を有し、抗原提示細胞によるプライミングを必要とする細胞傷害性Ｔ細胞とは対照的である。ＮＫ細胞は、ＩＦＮγ及びＴＮＦα等のサイトカインを分泌し、マクロファージ及び樹状細胞のような他の免疫細胞に対して作用し、免疫応答を増強させる。ＮＫ細胞表面の活性化受容体は、がん細胞及び感染細胞の表面で発現されている分子を認識し、ＮＫ細胞のスイッチを入れる。抑制性受容体は、ＮＫ細胞による殺傷のチェックとして作用する。ほとんどの健康な正常細胞は、「自己」の印を付けるＭＨＣＩ受容体を発現する。ＮＫ細胞表面の抑制性受容体は同族ＭＨＣＩを認識し、これにより、ＮＫ細胞のスイッチが切られ、殺傷されないようにしている。一旦殺傷の決定が下されると、ＮＫ細胞はパーフォリン及びグランザイムを含有する細胞傷害性顆粒を放出し、標的細胞の溶解をもたらす。サイトカイン分泌及び細胞傷害性を含むナチュラルキラーの反応性は、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）と細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）等、生殖細胞系列でコードされるいくつかの抑制性受容体と活性化受容体のバランスにより制御される。標的細胞上でのＭＨＣクラスＩ分子の存在は、ＮＫ細胞上のＭＨＣクラスＩ特異的受容体であるキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の、上記のような抑制性リガンドとして働く。ＫＩＲ受容体の会合はＮＫ活性化を阻害し、逆説的に、不活性化シグナルを誘発して、それらが以降の遭遇に応答する能力を保持する。したがって、ＫＩＲが、ＭＨＣクラスＩに十分に結合することができる場合、この会合が殺傷のためのシグナルに優先して標的細胞の生存を可能にすることができる。対照的に、ＮＫ細胞が標的細胞上のＭＨＣクラスＩに十分に結合できない場合、標的細胞の殺傷が進行し得る。結果として、ＭＨＣクラスＩを低発現し、かつ、Ｔ細胞媒介性の攻撃を回避することができると考えられている腫瘍は、代わりに、ＮＫ細胞媒介性の免疫応答に感受性であり得る。
本明細書で使用される場合、用語「ナチュラルキラーＴ細胞」または「ＮＫＴ」とは、Ｉ型ＮＫＴ細胞としても知られるインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞、ならびにＣＤ３及びαβＴ細胞受容体（ＴＣＲ）（本明細書では「ナチュラルキラーαβＴ細胞」と呼ばれる）またはγΔＴＣＲ（本明細書では「ナチュラルキラーγΔＴ細胞」と呼ばれる）を発現する、非インバリアント（Ｖα２４－及びＶα２４＋）ナチュラルキラーＴ細胞の全サブセットを指し、そのいずれもＣＤ１抗原により提示される非タンパク質抗原に対する応答能が実証されているものを指す。記載の発明方法により包含される非インバリアントＮＫＴ細胞は共通して、一般的にナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に起因する表面受容体の発現、ならびにαβまたはγΔのＴＣＲ遺伝子座再構成／組換えのＴＣＲの発現をＩ型ＮＫＴ細胞と共有する。
本明細書で使用される場合、用語「インバリアントナチュラルキラーＴ細胞」は用語「ｉＮＫＴ」と同じ意味で使用され、例えば、ヒトでは、Ｖβ１１ ＴＣＲβ鎖と結合しているＶα２４－Ｊａ１８ ＴＣＲα鎖で構成される拘束ＴＣＲレパートリーを発現するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α発現細胞のサブセットを指すことが意図される。これには、ＣＤ３＋Ｖα２４＋Ｖβ１１＋Ｉ型ＮＫＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８－Ｖα２４＋Ｖβ１１＋、ＣＤ３＋ＣＤ４－ＣＤ８＋Ｖα２４＋Ｖβ１１＋、及びＣＤ３＋ＣＤ４－ＣＤ８－Ｖα２４＋Ｖβ１１＋）ならびに、遺伝子発現または他の免疫プロファイリングによってＩ型ＮＫＴ細胞であるが、Ｖα２４（ＣＤ３＋Ｖα２４－）の表面発現が下方制御されていることが確認され得る細胞の全サブセットが包含される。これには、調節性転写因子ＦＯＸＰ３を発現する細胞も、発現しない細胞も含まれる。大部分がＭＨＣ分子により提示されるペプチド抗原を認識する通常型Ｔ細胞とは異なり、ｉＮＫＴ細胞は、非多型ＭＨＣクラス１様ＣＤ１ｄにより提示される糖脂質抗原を認識する。
本明細書で使用される場合、用語「パターン認識受容体」または「ＰＲＲ」とは、細胞外病原体を認識するよう細胞表面に存在し、エンドソームでは、細胞内侵入者を感知し、最終的に細胞質で感知する受容体を指す。それらは、微生物に特異的な、その生存に必須の病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と呼ばれる、病原体の保存された分子構造を認識する。ＰＲＲは、４つのファミリー、すなわち、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）；ヌクレオチドオリゴマー化受容体（ＮＬＲ）；Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）、及びＲＩＧ－１様受容体（ＲＬＲ）に分けられる。
本明細書で使用される場合、用語「ＮＫＴ細胞」とは、ＣＤ３＋Ｖα２４＋ＮＫＴ細胞、ＣＤ３＋Ｖα２４－ＮＫＴ細胞、ＣＤ３＋Ｖα２４－ＣＤ５６＋ＮＫＴ細胞、ＣＤ３＋Ｖα２４－ＣＤ１６１＋ＮＫＴ細胞、ＣＤ３＋γδ－ＴＣＲ＋Ｔ細胞、及びそれらの混合が含まれる細胞の集団を指す。
本明細書で使用される場合、用語「非増殖」とは、細胞集団内での細胞数を増加するために、培養で（インビトロで）は増殖させていない細胞集団を指すことが意図される。
本明細書で使用される場合、用語「全生存期間」（ＯＳ）とは、がん等の疾患についての診断日または処置開始日からの、その疾患の診断をされた患者が生存している時間の長さを指すことが意図される。
本明細書で使用される場合、用語「非経口」及びその文法上の他の形は、口以外の身体または消化管に行う物質の投与を指すことが意図される。例えば、本明細書で使用される用語「非経口」とは、注射による体内への導入（すなわち、注射による投与）を指し、これには、例えば、皮下注射（すなわち、皮下注射）、筋肉内注射（すなわち、筋肉内への注射）、静脈内注射（すなわち、静脈内への注射）、髄腔内注射（すなわち、脊髄周囲の空隙または脳のくも膜下への注射）、または注入という手法が含まれる。
本明細書で使用される場合、用語「パーフォリン」とは、標的細胞の膜内に挿入し、それらの標的細胞の溶解を促進することができる分子を指すことが意図される。パーフォリン媒介性の溶解はグランザイムと呼ばれる酵素により増強される。
本明細書で使用される場合、「末梢血単核球」または「ＰＢＭＣ」とは、バフィーコートと呼ばれることの多い、低密度のフィコール層の上部界面に残る末梢血に見られる丸い核をした免疫細胞であり、フィコール分画法が使用される際に回収される細胞を指す。これらの細胞は、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）及び単球からなる。ヒトでは、リンパ球はＰＢＭＣ集団の大部分を構成し、次に単球が多く、ごくわずかの割合で樹状細胞がある。
本明細書で使用される場合、用語「医薬組成物」とは、標的とする状態、症候群、障害または疾患を、予防する、強度を軽減する、治癒させるか他の場合には治療する、活性成分と薬学的に許容される担体とを含む組成物を指すことが意図される。
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」とは、従来より医薬品の投与に使用可能な実質的に非毒性の任意の担体であって、本発明の細胞製品を安定かつ生物学的に利用可能に維持するものを指すことが意図される。薬学的に許容される担体は、それが処置される哺乳類への投与に好適となるよう、十分に高純度かつ十分に低毒性でなければならない。さらに、活性物質の安定性及び生物学的利用能を維持するべきである。薬学的に許容される担体は液体または固体であり得、計画された投与様式を考慮に入れて、所与の組成物の活性物質及び他の構成要素を組み合わせた際に所望のバルク、一貫性等を提供するよう選択される。
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される用語「薬学的に許容される塩」とは、正当な医学的判断の範囲内で、過渡の毒性、刺激、アレルギー反応等を伴うことなくヒト及び下等動物の組織と接触する使用に好適であり、妥当なベネフィット／リスク比に見合う塩を指す。医薬品に使用する場合、塩は薬学的に許容されるべきであるが、その薬学的に許容される塩を調製するために非薬学的に許容される塩が好都合に使用される場合がある。そのような塩としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ－トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン－２－スルホン酸、及びベンゼンスルホン酸といった酸から調製されるものが挙げられるが、これらに限定されない。また、そのような塩は、カルボン酸基のナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩等、アルカリ金属塩またはアルカリ土類塩として調製され得る。「薬学的に許容される塩」は、正当な医学的判断の範囲内で、過渡の毒性、刺激、アレルギー反応等を伴うことなくヒト及び下等動物の組織と接触する使用に好適であり、妥当なベネフィット／リスク比に見合う塩が意図される。薬学的に許容される塩は当該技術分野で周知である。例えば、Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌらは、‘’Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ”（Ｗｉｌｅｙ ＶＣＨ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ：２００２）において薬学的に許容される塩について詳述している。塩は、本発明内または別々に記載される化合物の最終単離及び精製の際に、遊離塩基官能基と好適な有機酸とを反応させることによってインサイチュで調製され得る。代表的酸添加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、二グルコン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミスルファート、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩（イセチオン酸塩）、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸、ニコチン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、リン酸塩、グルタミン酸塩、重炭酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸及びウンデカン酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。また、塩基性窒素含有基は、メチル、エチル、プロピル、及びブチルの塩化物、臭化物及びヨウ化物等、低級アルキルハロゲン化物；硫酸ジメチル、硫酸ジエチル、硫酸ジブチル及び硫酸ジアミルのような硫酸ジアルキル；デシル、ラウリル、ミリスチル及びステアリルの塩化物、臭化物及びヨウ化物等、長鎖ハロゲン化物；臭化ベンジル及び臭化フェネチルのようなアリールアルキルハロゲン化物等、のような物質と四級化され得る。それにより水または油に可溶性または分散性の生成物が得られる。薬学的に許容される酸添加塩を形成するために使用され得る酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸及びリン酸のような無機酸、ならびにシュウ酸、マレイン酸、コハク酸及びクエン酸のような有機酸が挙げられる。塩基添加塩は、本発明内に記載される化合物の最終単離及び精製の際に、カルボン酸含有部分を、薬学的に許容される金属陽イオンの水酸化物、炭酸塩もしくは重炭酸塩等の好適な塩基、あるいはアンモニアまたは有機第一級、第二級もしくは第三級アミンと反応させることによってインサイチュで調製され得る。薬学的に許容される塩としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩及びアルミニウム塩等のようなアルカリ金属またはアルカリ土類金属に基づく陽イオン、ならびにアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエチルアミン、エチルアミン等が含まれる無毒性第四級アンモニア及びアミンの陽イオンが挙げられるが、これらに限定されない。塩基添加塩の形成に有用な他の代表的有機アミンとしては、エチレンジアミン、エタノールアミン系、ジエタノールアミン、ピペリジン、ピペラジン等が挙げられる。薬学的に許容される塩は、当該技術分野で周知の標準的手順を使用して、例えば、アミン等の十分に塩基性な化合物と、生理学的に許容される陰イオンが得られる好適な酸とを反応させることによっても得られ得る。カルボン酸のアルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウムまたはリチウム）塩またはアルカリ土類金属（例えば、カルシウムまたはマグネシウム）塩も作られ得る。
本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書では同じ意味で使用され、アミノ酸残基の重合体を指す。かかる用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する、天然に存在するアミノ酸及び天然に存在するアミノ酸ポリマーの人工的な化学類似体であるアミノ酸ポリマーに該当する。天然に存在するアミノ酸のそのような類似体の本質的性質は、あるタンパク質内に組み込まれた際に、そのタンパク質は、その同じタンパク質に対して誘発された抗体に特異的に反応性であるが、全体が天然に存在するアミノ酸からなるということである。
本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」にはまた修飾が含まれ、それらには、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ－カルボキシル化、ヒドロキシル化、及びＡＤＰリボース化が含まれるが、これらに限定されない。周知であり、また上述されているように、ポリペプチドは完全直鎖でなくてもよいことは認識されよう。例えば、ポリペプチドはユビキチン化の結果として分岐していてよく、また、一般には天然のプロセシング事象等の翻訳後事象及び天然では生じない人為的操作による事象の結果として、分岐の有無を問わず環状であってよい。環状、分岐及び分岐環状のポリペプチドは、非翻訳天然過程によって、また完全に合成の方法によっても合成され得る。いくつかの実施形態によれば、ペプチドは任意の長さまたはサイズである。
本明細書で使用される場合、用語「精製する」とは、外来性または望ましくない要素を除去することを指すことが意図される。
本明細書で使用される場合、がんに関して「再発」という用語は、通常、がんが検出不可能であったある期間の経過後に再発した（再び現れた）がんを指すことが意図される。がんは、元の（原発）腫瘍と同じ場所に再び現れる場合もあれば、体の別の場所に現れる場合もある。
本明細書で使用される場合、用語「抵抗性がん」とは、治療開始時、またはそのような治療中のある時期にそのような治療に応答しないがんを指すことが意図される。
本明細書で使用される場合、用語「分泌」及びその文法上の様々な形は、細胞による生理活性物質の産生、及びかかる物質の、それが形成された細胞からの移動を指すことが意図される。
本明細書で使用される場合、用語「刺激する」とは、本明細書で使用されるその文法上のいかなる形でも、活性化を誘導することまたは活性を増大させることを指すことが意図される。
本明細書で使用される場合、用語「ＮＫＴ細胞増殖を刺激するのに十分な」とは、Ｉ型ＮＫＴ細胞の選択的増殖を促進する、シグナル伝達事象または刺激の量またはレベル、例えば、アルファ－ガラクトシルセラミド（αＧａｌＣｅｒ）、またはその類似体もしくは機能的同等物の量を指す。
本明細書で使用される場合、用語「ＮＫＴ細胞活性化を刺激するのに十分な」とは、Ｉ型ＮＫＴ細胞のサイトカイン分泌または細胞殺傷活性を促進する、シグナル伝達事象または刺激の量またはレベル、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５及びＩＬ－１２の量を指す。
本明細書で使用される場合、用語「対象」または「個体」または「患者」は同じ意味で使用され、ヒトを含め、哺乳類起源の動物種のメンバーを指す。
本明細書で使用される場合、語句「それを必要とする対象」とは、文脈及びその語句の使用から他の意味が示されない限り、（ｉ）記載の発明による免疫原性組成物（例えば、Ｉ型ＮＫＴ細胞の集団）を投与される患者、（ｉｉ）記載の発明による免疫原性組成物（例えば、Ｉ型ＮＫＴ細胞の集団）を受けている患者、または（ｉｉｉ）記載の発明による免疫原性組成物（例えば、Ｉ型ＮＫＴ細胞の集団）を受けたことがある患者を指すことが意図される。
本明細書で使用される場合、用語「超活性化サイトカインキラーＴ細胞」（またはＳＣＫＴＣ）とは、インビトロでＣＫＴＣと、サイトカインＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５及びＩＬ－１２とを所定の添加順序と添加時間で接触させることによってサイトカインキラーＴ細胞（ＣＫＴＣ）から誘導される細胞を指す。
本明細書で使用される場合、用語「Ｔ細胞受容体」（ＴＣＲ）とは、抗原に応答してＴ細胞の活性化に関与する内在性膜タンパク質の複合体を指すことが意図される。大部分のＴ細胞により発現されるＴＣＲは、α鎖とβ鎖からなる。小数のグループのＴ細胞はγ鎖及びδ鎖で構成される受容体を発現する。α／βＴ細胞には、２つの下位系列（ｓｕｂｌｉｎｅａｇｅ）、すなわち、共受容体分子ＣＤ４を発現するもの（ＣＤ４＋細胞）、及びＣＤ８を発現するもの（ＣＤ８＋細胞）がある。これらの細胞は、それらが抗原を認識する様態ならびにそれらのエフェクター及び調節性の機能において異なる。
通常型のナイーブなＣＤ４ Ｔ細胞は、４つの別個のＴ細胞集団に分化することができ、過程は、細胞が抗原との初期相互作用時に受け取るシグナルのパターンによって決定される。これら４つのＴ細胞集団は、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、及び誘導性制御性Ｔ（ｉＴｒｅｇ）細胞である。細胞性免疫応答の効果的インデューサーであるＴｈ１細胞は、細胞内病原体に対する免疫応答を媒介し、一部の自己免疫疾患の誘導原因である。それらの主なサイトカイン産物は、ＩＦＮγ（マクロファージ活性化に重要ないくつかの機序を増強させ、それらの殺菌活性を増大させる）、リンホトキシンα（ＬＴα）、及びＣＤ４ Ｔ細胞記憶にとって重要なＩＬ－２である。Ｂ細胞が抗体産生細胞に分化し、また細胞外寄生虫に対する宿主防御を媒介することを効果的に助けるＴｈ２細胞は、喘息及び他のアレルギー性疾患の誘発と持続において重要であり、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－９、ＩＬ－１０（Ｔｈ１細胞増殖を抑制し、樹状細胞の機能を抑制することができる）、ＩＬ－１３、ＩＬ－２５（ＩＬ－１７ＲＢを介したシグナル伝達；ｃ－ｋｉｔ－ＦｃεＲＩ－非リンパ球集団によるＩＬ－４、ＩＬ－５、及びＩＬ－１３の産生を増強させ、Ｔｈ２応答の開始因子及び増幅因子として働く）及びアンフィレグリンを産生する。Ｔｈ２細胞により産生されるＩＬ－４及びＩＬ－１０は、Ｔｈ１細胞によるＩＦＮγ産生を遮断する。Ｔｈ１７細胞は、ＩＬ－１７ａ、ＩＬ－１７ｆ、ＩＬ－２１、及びＩＬ－２２を産生する。ＩＬ－１７ａは、多くの炎症性サイトカイン、ＩＬ６ならびにＩＬ－８等のケモカインを誘導することができ、炎症反応の誘導において重要な役割を果たす。Ｔｒｅｇ細胞は、自己寛容の維持及び免疫応答の調節において重要な役割を果たす。それらは、いくつかの機序を介して抑制機能を発揮するが、一部の機序は細胞同士の接触を必要とする。分子による抑制は、場合によっては、それらによる、ＴＧＦβ、ＩＬ－１０、及びＩＬ－３５等のサイトカイン産生を介する。Ｔｒｅｇ細胞により産生されるＴＧＦβもまた、Ｔｒｅｇ細胞がナイーブＣＤ４ Ｔ細胞由来の場合に誘導をもたらし得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、それらの表面に、Ｂ細胞のクラスＩＩ／ペプチド複合体に特異的な受容体を持っている。Ｂ細胞活性化は、Ｔ細胞が、そのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して結合することに依存するだけではなく、この相互作用により、Ｔ細胞上の活性化リガンド（ＣＤ４０リガンド）が、Ｂ細胞上のその受容体（ＣＤ４０）に結合し、Ｂ細胞活性化シグナル伝達が可能になる。Ｚｈｕ，Ｊ．ａｎｄ Ｐａｕｌ，ＷＥ，Ｂｌｏｏｄ（２００８）１１２：１５５７－６９）。静止期ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞は、リンパ節及び脾臓等の二次リンパ器官での直接感染または交差提示を介して、感染マクロファージからの獲得抗原を有する抗原提示細胞によりプライミングされると、大量増殖、及び体内のあらゆる部位に遊走して感染を排除する細胞傷害性Ｔリンパ球エフェクター細胞への分化により、病原体に対して反応する。しかしながら、ウイルス感染の大部分では、ＣＤ８Ｔ細胞の活性化には、ＣＤ４エフェクターＴ細胞が、樹状細胞を感染に対して活性化し、完全なＣＤ８Ｔ細胞応答を刺激することができるようになるために補助する必要がある。ＡＰＣにより提示される関連抗原を認識するＣＤ４ Ｔ細胞は、ＡＰＣをさらに活性化させることによってナイーブＣＤ８Ｔ細胞の活性化を増幅させることができる。樹状細胞により発現されるＢ７はまず、ＣＤ４ Ｔ細胞を活性化させて、ＩＬ－２及びＣＤ４０リガンドを発現させる。ＣＤ４０リガンドは、樹状細胞上のＣＤ４０と結合し、樹状細胞によるＢ７及び４－１ＢＢＬの発現を増大させる追加シグナルを送達し、それにより、ナイーブＣＤ８Ｔ細胞に対する追加の共刺激が提供される。活性化ＣＤ４ Ｔ細胞により産生されたＩＬ－２もまた、エフェクターＣＤ Ｔ細胞の分化を促進するよう作用する。
ＣＤ３（ＴＣＲ複合体）は４本の別個の鎖で構成されるタンパク質複合体である。哺乳類では、複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、及び２本のＣＤ３ε鎖を含有し、それらはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及びζ鎖と会合してＴリンパ球の活性化シグナルを生成する。これらを合わせ、ＴＣＲ、ζ鎖及びＣＤ３分子がＴＣＲ複合体を構成する。ＣＤ３分子の細胞内尾部は、ＴＣＲのシグナル伝達能力に欠かせない、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）として知られる保存されたモチーフを含有する。ＩＴＡＭがリン酸化されると、ＣＤ３鎖は、Ｔ細胞のシグナル伝達カスケードに関与するキナーゼであるＺＡＰ７０（ゼータ関連タンパク質）と結合することができる。
本明細書で使用される場合、用語「治療剤」とは、治療効果を提供する薬物、分子、核酸、タンパク質、代謝産物、組成物または他の物質を指すことが意図される。本明細書で使用される用語「活性」とは、意図される治療効果の原因となる、記載の発明の組成物の成分、構成要素または構成成分を指す。用語「治療剤」及び「活性物質」は本明細書では同じ意味で使用される。本明細書で使用される用語「治療用成分」とは、ある集団の一定の割合において特定の疾患の症状発現の進行を消失させる、低減させる、または予防する、治療的に有効な投与量（すなわち、投与の用量及び頻度）を指す。一般的に使用される治療成分の一例はＥＤ５０であり、これは、集団の５０％において、特定の疾患の症状発現に対し治療的に有効な特定の投与量での用量を表す。
本明細書で使用される場合、ある活性物質の「治療量」、「治療的有効量」、「有効な量」、または「薬学的有効量」という用語は同じ意味で使用され、意図される治療利益を提供するために十分な量を指す。ただし、投与量レベルは、損傷の種類、患者の年齢、体重、性別、医学的状態、状態の重症度、投与経路、及び使用される個別の活性物質を含め、多種多様な因子に基づく。したがって、投与レジメンは大きく変動し得るが、標準的方法を使用して医師が日常的に決定することができる。さらに、用語「治療量」、「治療的有効量」及び「薬学的有効量」には、記載の発明の組成物の予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）量が含まれる。記載の発明の予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）適用では、医薬組成物または薬物は、疾患、障害もしくは状態に罹患し易いか、そうでなければ罹患リスクのある患者に対し、疾患、障害もしくは状態の生化学的、組織学的及び／または行動上の症状、その合併症、ならびに疾患、障害もしくは状態の発症中に現れている病理学的中間表現型が挙げられる疾患、障害もしくは状態の、リスクを排除する、もしくは低減させるか、重症度を軽減するか、または発症を遅延させるのに十分な量で投与される。最高用量、すなわち、何らかの医学的判断に従った最も高い安全用量を使用することが一般的には好ましい。用語「用量」及び「投与量」は本明細書では同じ意味で使用される。
本明細書で使用される場合、用語「治療効果」とは、治療がもたらす結果であり、その結果が望ましく、かつ有益であると判断されるものを指すことが意図される。治療効果には、直接的でも間接的でも、疾患の症状発現の停止、軽減、または消失が含まれ得る。治療効果にはまた、直接的でも間接的でも、疾患の症状発現の進行の停止、軽減または消失も含まれ得る。
本明細書に記載されるいかなる治療剤の場合も、有効量は、最初に、予備的インビトロ研究及び／または動物モデルにより決定され得る。治療的有効用量はまた、ヒトデータによっても決定され得る。投与量は、投与化合物の相対的な生物学的利用能及び効力に基づいて調整され得る。上記方法及び他の周知の方法に基づいて、最大効力を達成するための用量を調節することは、当業者の能力の範囲内である。
参照により本明細書に組み込まれるＣｈａｐｔｅｒ １ ｏｆ Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（２００１）に見出され得る、治療効果を決定するための一般原則を以下に概説する。
薬物動態学の原則により、忍容できない有害作用が最小である、所望の程度の治療有効性を得るための投与レジメンの変更についての基礎が提供される。薬物の血漿中濃度が、測定可能であり、かつ治療濃度域に関連する状況の場合は、投与量変更について追加の手引きを得ることができる。
製剤は、それらが同じ活性成分を含有し、強度または濃度、剤形、及び投与経路が同一である場合は医薬同等物と見なされる。薬学的に同等な２つの製剤は、２剤の活性成分の生物学的利用能の率及び程度が、好適な試験条件下で顕著な差がない場合は生物学的に同等であると見なされる。
本明細書で使用される場合、用語「治療すること」には、状態の進行を、抑止する、実質的に阻害する、減速するか、もしくは回復に向かわせること、状態の臨床症状を実質的に改善すること、または状態の臨床症状の出現を実質的に予防することが含まれる。治療することはさらに、以下の（ａ）障害の重症度を軽減すること、（ｂ）治療される障害（複数可）に特徴的な症状の発症を制限すること、（ｃ）治療される障害（複数可）に特徴的な症状の悪化を制限すること、（ｄ）以前に障害（複数可）を有していた患者においてその障害（複数可）の再発を制限すること；及び（ｅ）以前に障害（複数可）で無症状であった患者において、その障害（複数可）の症状の再発を制限すること、のうちの１つ以上を達成することを指す。
記載の発明によれば、当業者の技量の範囲内である従来の分子生物学、微生物学、及び組換えＤＮＡの技術が採り入れられ得る。そのような技術は文献に十分な説明がある。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（本明細書では「Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９」）、ＤＮＡクローニング：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）、オリゴヌクレオチド合成（Ｍ Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．１９８４）、核酸ハイブリダイゼーション（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５）、転写及び翻訳（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）、動物細胞培養（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６）、固定化細胞及び酵素（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）、Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を特に参照のこと。
超活性化サイトカインキラーＴ細胞（ＳＣＫＴＣ）の増殖させ濃縮された集団を含む細胞製品を含む医薬組成物を調製するための方法
一態様によれば、本開示では、以下を順に含む、超活性化サイトカインキラーＴ細胞（ＳＣＫＴＣ）の濃縮された集団を含む医薬組成物を調製するための方法を記載する。
（ａ）サイトカインキラーＴ細胞（ＣＫＴＣ）の集団を含む単核球（ＭＣ）の集団を分離すること、
（ｂ）任意選択で、（ａ）の調製物を無菌条件下で処理施設に輸送すること、
（ｃ）ＭＣの集団を培養系で培養すること、
（ｄ）ステップ（ｃ）の培養系を、アルファ－ガラクトシルセラミド（αＧａｌＣｅｒ）、またはその類似体もしくは機能的同等物と接触させることであって、細胞の第１の集団は、ＣＤ１ｄ及びαＧａｌＣｅｒ、またはその類似体もしくは機能的同等物、またはその両方を含み、接触させることがＣＫＴＣ増殖を刺激するのに十分である、接触させること、
（ｅ）ステップ（ｄ）の培養系を、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５及びＩＬ－１２に所定の添加順序と添加時間で接触させることであって、ＣＫＴＣ活性化を刺激するため、及びＳＣＫＴＣ細胞の濃縮された集団を形成するために十分である、接触させること、
（ｆ）ＳＣＫＴＣ細胞製品を形成するために、ＳＣＫＴＣ細胞の濃縮された集団を培養系から回収することであって、（ｆ）のＳＣＫＴＣの濃縮された集団は、（ａ）のＣＫＴＣ集団と比較して、エフェクターサイトカイン分泌能改善または細胞傷害性改善のうちの１つ以上を特徴とする、回収すること、及び
（ｇ）薬学的に許容される担体を用いて細胞製品を製剤化し、医薬組成物を形成すること。
いくつかの実施形態によれば、単核球の供給源は血液である。いくつかのそのような実施形態によれば、血液は末梢血であり、ＭＣは末梢血ＭＣ（ＰＢＭＣ）である。いくつかの実施形態によれば、ＰＢＭＣはヒト対象に由来する。いくつかの実施形態によれば、ＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ勾配により分離される。
いくつかの実施形態によれば、（ｃ）での培養することは、最長１日、最長２日間、最長３日間、最長４日間、最長５日間、最長６日間、最長７日間、最長８日間、最長９日間、最長１０日間、最長１１日間、最長１２日間、最長１３日間、最長１４日間、最長１５日間、最長１６日間、最長１７日間、最長１８日間、最長１９日間、最長２０日間、最長２１日間、またはそれ以上である。いくつかの実施形態によれば、（ｃ）での培養することは、少なくとも一部のＣＴＫＣの培養系表面への接着に有効な時間である。いくつかの実施形態によれば、ステップ（ｃ）は、ステップ（ｄ）を実施する前に、任意選択で、ＭＣを再懸濁させること、及びＭＣの濃度を、約５×１０5細胞／ｍｌ～約３×１０6細胞／ｍｌの両端を含めた範囲に調節することを含む。一実施形態によれば、ステップ（ｃ）は、任意選択で、ステップ（ｃ）を実施する前に、ＭＣを再懸濁させること、及びＭＣの濃度を約５×１０5細胞／ｍｌ、約５．１×１０5細胞／ｍｌ、約５．２×１０5細胞／ｍｌ、約５．３×１０5細胞／ｍｌ、約５．４×１０5細胞／ｍｌ、約５．５×１０5細胞／ｍｌ、約５．６×１０5細胞／ｍｌ、約５．７×１０5細胞／ｍｌ、約５．８×１０5細胞／ｍｌ、約５．９×１０5細胞／ｍｌ、約６×１０5細胞／ｍｌ、約６．１×１０5細胞／ｍｌ、約６．２×１０5細胞／ｍｌ、約６．３×１０5細胞／ｍｌ、約６．４×１０5細胞／ｍｌ、約６．５×１０5細胞／ｍｌ、約６．６×１０5細胞／ｍｌ、約６．７×１０5細胞／ｍｌ、約６．８×１０5細胞／ｍｌ、約６．９×１０5細胞／ｍｌ、約７×１０5細胞／ｍｌ、約７．１×１０5細胞／ｍｌ、約７．２×１０5細胞／ｍｌ、約７．３×１０5細胞／ｍｌ、約７．４×１０5細胞／ｍｌ、約７．５×１０5細胞／ｍｌ、約７．６×１０5細胞／ｍｌ、約７．７×１０5細胞／ｍｌ、約７．８×１０5細胞／ｍｌ、約７．９×１０5細胞／ｍｌ、約８×１０5細胞／ｍｌ、約８．１×１０5細胞／ｍｌ、約８．２×１０5細胞／ｍｌ、約８．３×１０5細胞／ｍｌ、約８．４×１０5細胞／ｍｌ、約８．５×１０5細胞／ｍｌ、約８．６×１０5細胞／ｍｌ、約８．７×１０5細胞／ｍｌ、約８．８×１０5細胞／ｍｌ、約８．９×１０5細胞／ｍｌ、約９×１０5細胞／ｍｌ、約９．１×１０5細胞／ｍｌ、約９．２×１０5細胞／ｍｌ、約９．３×１０5細胞／ｍｌ、約９．４×１０5細胞／ｍｌ、約９．５×１０5細胞／ｍｌ、約９．６×１０5細胞／ｍｌ、約９．７×１０5細胞／ｍｌ、約９．８×１０5細胞／ｍｌ、約９．９×１０5細胞／ｍｌ、約１×１０6細胞／ｍｌ、約１．１×１０5細胞／ｍｌ、約１．２×１０5細胞／ｍｌ、約１．３×１０5細胞／ｍｌ、約１．４×１０5細胞／ｍｌ、約１．５×１０6細胞／ｍｌ、約１．６×１０5細胞／ｍｌ、約１．７×１０5細胞／ｍｌ、約１．８×１０5細胞／ｍｌ、１．９×１０5細胞／ｍｌ、約２×１０6細胞／ｍｌ、約２．１×１０5細胞／ｍｌ、約２．２×１０5細胞／ｍｌ、約２．３×１０5細胞／ｍｌ、２．４×１０5細胞／ｍｌ、約２．５×１０6細胞／ｍｌ、約２．６×１０5細胞／ｍｌ、約２．７×１０5細胞／ｍｌ、２．８×１０5細胞／ｍｌ、２．９×１０5細胞／ｍｌ、または約３×１０6細胞／ｍｌに調節することを含む。
いくつかの実施形態によれば、αＧａｌＣｅｒ、またはその類似体もしくは機能的同等物はＯＣＨである。一実施形態によれば、αＧａｌＣｅｒ、またはその類似体もしくは機能的同等物は、以下の構造式
Figure 2022520302000002
 のα－ＧａｌＣｅｒ類似体である。
いくつかの実施形態によれば、αＧａｌＣｅｒ、またはその類似体もしくは機能的同等物は、ステップ（ｃ）からステップ（ｆ）まで一定濃度で維持される。さらなる実施形態では、αＧａｌＣｅｒ、またはその類似体もしくは機能的同等物の濃度は、約５０ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌ、約１５０ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌ、約２５０ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌ、約３００ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌ、約３５０ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌ、約４００ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌ、または約４５０ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの実施形態によれば、αＧａｌＣｅｒ、またはその類似体もしくは機能的同等物の濃度は、約５０ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ、約１１０ｎｇ／ｍｌ、約１２０ｎｇ／ｍｌ、約１３０ｎｇ／ｍｌ、約１４０ｎｇ／ｍｌ、約１５０ｎｇ／ｍｌ、約１６０ｎｇ／ｍｌ、約１７０ｎｇ／ｍｌ、約１８０ｎｇ／ｍｌ、約１９０ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ、約２１０ｎｇ／ｍｌ、約２２０ｎｇ／ｍｌ、約２３０ｎｇ／ｍｌ、約２４０ｎｇ／ｍｌ、約２５０ｎｇ／ｍｌ、約２６０ｎｇ／ｍｌ、約２７０ｎｇ／ｍｌ、約２８０ｎｇ／ｍｌ、約２９０ｎｇ／ｍｌ、約３００ｎｇ／ｍｌ、約３１０ｎｇ／ｍｌ、約３２０ｎｇ／ｍｌ、約３３０ｎｇ／ｍｌ、約３４０ｎｇ／ｍｌ、約３５０ｎｇ／ｍｌ、約３６０ｎｇ／ｍｌ、約３７０ｎｇ／ｍｌ、約３８０ｎｇ／ｍｌ、約３９０ｎｇ／ｍｌ、約４００ｎｇ／ｍｌ、約４１０ｎｇ／ｍｌ、約４２０ｎｇ／ｍｌ、約４３０ｎｇ／ｍｌ、約４４０ｎｇ／ｍｌ、約４５０ｎｇ／ｍｌ、約４６０ｎｇ／ｍｌ、約４７０ｎｇ／ｍｌ、約４８０ｎｇ／ｍｌ、約４９０ｎｇ／ｍｌ、または約５００ｎｇ／ｍｌの濃度で維持される。
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態によれば、ＩＬ－２は、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）まで一定の濃度に維持される。いくつかの実施形態によれば、ＩＬ－２の濃度は、約１０Ｕ／ｍｌ～約１００Ｕ／ｍｌの間、例えば、約１０Ｕ／ｍｌ～約１００Ｕ／ｍｌの間、約１５Ｕ／ｍｌ～約１００Ｕ／ｍｌ、約２０Ｕ／ｍｌ～約１００Ｕ／ｍｌ、約２５Ｕ／ｍｌ～約１００Ｕ／ｍｌ、約３０Ｕ／ｍｌ～約１００Ｕ／ｍｌ、約３５Ｕ／ｍｌ～約１００Ｕ／ｍｌ、約４０Ｕ／ｍｌ～約１００Ｕ／ｍｌ、約４５Ｕ／ｍｌ～約１００Ｕ／ｍｌ、約５０Ｕ／ｍｌ～約１００Ｕ／ｍｌ、約５５Ｕ／ｍｌ～約１００Ｕ／ｍｌ、約６０Ｕ／ｍｌ～約１００Ｕ／ｍｌ、約６５Ｕ／ｍｌ～約１００Ｕ／ｍｌ、約７０Ｕ／ｍｌ～約１００Ｕ／ｍｌ、約７５Ｕ／ｍｌ～約１００Ｕ／ｍｌ、約８０Ｕ／ｍｌ～約１００Ｕ／ｍｌ、約８５Ｕ／ｍｌ～約１００Ｕ／ｍｌ、約９０Ｕ／ｍｌ～約１００Ｕ／ｍｌ、または約９５Ｕ／ｍｌ～約１００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態によれば、ＩＬ－２の濃度は、約１０Ｕ／ｍｌ、約１５Ｕ／ｍｌ、約２０Ｕ／ｍｌ、約２５Ｕ／ｍｌ、約３０Ｕ／ｍｌ、約３５Ｕ／ｍｌ、約４０Ｕ／ｍｌ、約４５Ｕ／ｍｌ、約５０Ｕ／ｍｌ、約５５Ｕ／ｍｌ、約６０Ｕ／ｍｌ、約６５Ｕ／ｍｌ、約７０Ｕ／ｍｌ、約７５Ｕ／ｍｌ、約８０Ｕ／ｍｌ、約８５Ｕ／ｍｌ、約９０Ｕ／ｍｌ、約９５Ｕ／ｍｌ、または約１００Ｕ／ｍｌである。
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態によれば、ＩＬ－７は、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）まで一定濃度で維持される。いくつかの実施形態によれば、ＩＬ－７の濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌの間、例えば、約１０ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌの間、約２０ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌ、約１１０ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌ、約１２０ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌ、約１３０ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌ、約１４０ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌ、約１５０ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌ、約１６０ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌ、約１７０ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌ、約１８０ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌ、または約１９０ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態によれば、ＩＬ－７の濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約２５ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ、約３５ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ、約４５ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約５５ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ、約６５ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ、約７５ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ、約８５ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ、約９５ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ、約１１０ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌ、約１２０ｎｇ／ｍｌ、約１２５ｎｇ／ｍｌ、約１３０ｎｇ／ｍｌ、約１３５ｎｇ／ｍｌ、約１４０ｎｇ／ｍｌ、約１４５ｎｇ／ｍｌ、約１５０ｎｇ／ｍｌ、約１５５ｎｇ／ｍｌ、約１６０ｎｇ／ｍｌ、約１６５ｎｇ／ｍｌ、約１７０ｎｇ／ｍｌ、約１７５ｎｇ／ｍｌ、約１８０ｎｇ／ｍｌ、約１８５ｎｇ／ｍｌ、約１９０ｎｇ／ｍｌ、約１９５ｎｇ／ｍｌ、または約２００ｎｇ／ｍｌである。
いくつかの実施形態によれば、ＩＬ－２は、培養の約６日目～８日目でステップ（ｅ）において加えられる。いくつかの実施形態によれば、ＩＬ－２は、培養の約６日目でステップ（ｅ）において加えられる。いくつかの実施形態によれば、ＩＬ－２は、培養の約７日目でステップ（ｅ）において加えられる。いくつかの実施形態によれば、ＩＬ－２は、培養の約８日目でステップ（ｅ）において加えられる。
いくつかの実施形態によれば、ＩＬ－７は、培養の約６日目～８日目でステップ（ｅ）において加えられる。いくつかの実施形態によれば、ＩＬ－７は、培養の約６日目でステップ（ｅ）において加えられる。いくつかの実施形態によれば、ＩＬ－７は、培養の約７日目でステップ（ｅ）において加えられる。いくつかの実施形態によれば、ＩＬ－２は、培養の約８日目でステップ（ｅ）において加えられる。
いくつかの実施形態によれば、ＩＬ－２及びＩＬ－７は同時に加えられる。いくつかの実施形態によれば、ＩＬ－２及びＩＬ－７は７日目に同時に加えられる。
いくつかの実施形態によれば、ＩＬ－１５は、培養の約１３日目～１５日目でステップ（ｅ）において加えられる。いくつかの実施形態によれば、ＩＬ－１５は、培養の約１３日目でステップ（ｅ）において加えられる。いくつかの実施形態によれば、ＩＬ－１５は、培養の約１４日目でステップ（ｅ）において加えられる。いくつかの実施形態によれば、ＩＬ－１５は、培養の約１５日目でステップ（ｅ）において加えられる。
いくつかの実施形態によれば、ＩＬ－１５は、培養の約１９日目～２１日目でステップ（ｅ）において加えられる。いくつかの実施形態によれば、ＩＬ－１２は、培養の約１９日目でステップ（ｅ）において加えられる。いくつかの実施形態によれば、ＩＬ－１２は、培養の約２０日目でステップ（ｅ）において加えられる。いくつかの実施形態によれば、ＩＬ－１２は、培養の約２１日目でステップ（ｅ）において加えられる。
いくつかの実施形態によれば、ステップ（ｆ）は、少なくとも２１日目に行われる。いくつかの実施形態によれば、ステップ（ｆ）は２１日目に行われる。いくつかの実施形態によれば、ステップ（ｆ）は２２日目に行われる。いくつかの実施形態によれば、ステップ（ｆ）は２３日目に行われる。いくつかの実施形態によれば、ステップ（ｆ）は２４日目に行われる。
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態によれば、ＩＬ－１５は、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）まで一定濃度で維持される。いくつかの実施形態によれば、ＩＬ－１５の濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌの間、例えば、約１０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌの間、約１５ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約２５ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約３５ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約４５ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約５５ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約６５ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約７５ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約８５ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、または約９５ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態によれば、ＩＬ－１５の濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約２５ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ、約３５ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ、約４５ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約５５ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ、約６５ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ、約７５ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ、約８５ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ、約９５ｎｇ／ｍｌ、または約１００ｎｇ／ｍｌである。
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態によれば、ＩＬ－１２は、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）まで一定濃度で維持される。
いくつかの実施形態によれば、方法はさらに、ステップ（ｅ）と（ｆ）の間に、培養物を処理施設から治療施設まで輸送するステップを含む。いくつかの実施形態によれば、輸送ステップは、ＩＬ－１２の添加の少なくとも１時間以内、少なくとも２時間以内、少なくとも３時間以内、少なくとも４時間以内、少なくとも５時間以内、少なくとも６時間以内、少なくとも７時間以内、少なくとも８時間以内、少なくとも９時間以内、少なくとも１０時間以内、少なくとも１１時間以内、少なくとも１２時間以内、少なくとも１３時間以内、少なくとも１４時間以内、少なくとも１５時間以内、少なくとも１６時間以内、少なくとも１７時間以内、少なくとも１８時間以内、少なくとも１９時間以内、少なくとも２０時間以内、少なくとも２１時間以内、少なくとも２２時間以内、少なくとも２３時間以内、または少なくとも２４時間以内に開始される。
いくつかの実施形態によれば、ＩＬ－１２の濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌの間、例えば、約１０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌの間、約１５ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約２５ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約３５ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約４５ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約５５ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約６５ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約７５ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約８５ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、または約９５ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態によれば、ＩＬ－１２の濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ、約２５ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ、約３５ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ、約４５ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約５５ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ、約６５ｎｇ／ｍｌ、約７０ｎｇ／ｍｌ、約７５ｎｇ／ｍｌ、約８０ｎｇ／ｍｌ、約８５ｎｇ／ｍｌ、約９０ｎｇ／ｍｌ、約９５ｎｇ／ｍｌ、または約１００ｎｇ／ｍｌである。
いくつかの実施形態によれば、方法はさらに、培養系の培地を２～３日ごとに補充するステップを含む。いくつかの実施形態によれば、補充するステップには、培養系に対し、αＧａｌＣｅｒまたはその類似体もしくは機能的同等物を担持している新鮮な樹状細胞のパルスを加えることが含まれる。いくつかの実施形態によれば、ＣＤ１ｄ及びαＧａｌＣｅｒを含む細胞の新鮮集団のパルス回数は、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、または少なくとも１０回である。
いくつかの実施形態によれば、ステップ（ｃ）～（ｆ）は、Ｘ－ＶＩＶＯ－１５無血清培地、及び１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）または１０％自己血清のいずれかを含有するＲＰＭＩ １６４０培地から選択される培地中で行われる。
抗原提示細胞
いくつかの実施形態によれば、ＣＤ１ｄ及びアルファ－ガラクトシルセラミド（αＧａｌＣｅｒ）を含む細胞は、抗原提示細胞である。抗原提示細胞は、その表面に１つ以上の抗原を、免疫系の特定のエフェクター細胞が認識可能なペプチド－ＭＨＣ複合体の形態で提示し、それにより提示されている抗原（複数可）に対する効果的な細胞性免疫応答を誘導することができる細胞の一群である。プロフェッショナルＡＰＣの例は樹状細胞及びマクロファージであるが、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子を発現しているどの細胞もペプチド抗原を提示する可能性がある。いくつかの実施形態によれば、ＡＰＣは、１つ以上の抗原を提示するよう操作された細胞または細胞集団（すなわち、人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ））であり得る。
いくつかの実施形態によれば、抗原提示細胞は樹状細胞（ＤＣ）である。いくつかの実施形態によれば、樹状細胞は、αＧａｌＣｅｒを担持している。別の実施形態によれば、αＧａｌＣｅｒ担持樹状細胞はＭＣに由来し、かつ接着細胞である。αＧａｌＣｅｒ担持樹状細胞を調製するための方法における別の実施形態によれば、αＧａｌＣｅｒ担持樹状細胞は接着細胞である。
いくつかの実施形態によれば、αＧａｌＣｅｒ担持樹状細胞は、（ａ）単核球（ＭＣ）の集団を分離すること、（ｂ）ＭＣの集団を培養系で培養すること、（ｃ）培養系をＩＬ－４及びＧＭ－ＣＳＦと接触させることであって、ＭＣの樹状細胞への分化を誘導するのに十分である、接触させること（ｄ）培養系をαＧａｌＣｅｒと接触させることであって、樹状細胞にαＧａｌＣｅｒを担持させるのに十分である、接触させること、を含む方法により調製される。
αＧａｌＣｅｒ担持樹状細胞を調製するための方法のいくつかの実施形態によれば、培養が開始された際のＭＣの集団は、約１×１０5細胞／ｍｌ～約５×１０6細胞／ｍｌを含む。いくつかの実施形態によれば、ＭＣの集団は、約１×１０5細胞／ｍｌ、約１．５×１０5細胞／ｍｌ、約１×１０5細胞／ｍｌ、約１．５×１０5細胞／ｍｌ、約３×１０5細胞／ｍｌ、約３．５×１０5細胞／ｍｌ、約４×１０5細胞／ｍｌ、約４．５×１０5細胞／ｍｌ、約５×１０5細胞／ｍｌ、約５．５×１０5細胞／ｍｌ、約６×１０5細胞／ｍｌ、約６．５×１０5細胞／ｍｌ、約７×１０5細胞／ｍｌ、約７．５×１０5細胞／ｍｌ、約８×１０5細胞／ｍｌ、約８．５×１０5細胞／ｍｌ、約９×１０5細胞／ｍｌ、約９．５×１０5細胞／ｍｌ、約１×１０6細胞／ｍｌ、約１．５×１０6細胞／ｍｌ、約２×１０6細胞／ｍｌ、約２．５×１０6細胞／ｍｌ、約３×１０6細胞／ｍｌ、約３．５×１０6細胞／ｍｌ、約４×１０6細胞／ｍｌ、約４．５×１０6細胞／ｍｌ、または約５×１０6細胞／ｍｌである。
一実施形態によれば、ステップ（ｃ）でのＩＬ－４の濃度は約５００Ｕ／ｍｌである。一実施形態によれば、ＩＬ－４の濃度は、約４００～６００Ｕ／ｍｌの間、例えば、約４００Ｕ／ｍｌ、約４５０Ｕ／ｍｌ、約５００Ｕ／ｍｌ、約５５０Ｕ／ｍｌ、約６００Ｕ／ｍｌである。一実施形態によれば、ステップ（ｃ）でのＧＭ－ＣＳＦの濃度は約５０ｎｇ／ｍｌである。一実施形態によれば、ステップ（ｃ）でのＧＭ－ＣＳＦの濃度は、約４０～６０ｎｇ／ｍｌの間、例えば、約４０ｎｇ／ｍｌ、約４５ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約５５ｎｇ／ｍｌまたは約６０ｎｇ／ｍｌである。一実施形態によれば、ステップ（ｄ）は、ステップ（ｂ）の約５日～約７日後に行われる。一実施形態によれば、ステップ（ｄ）は、ステップ（ｂ）の約５日後に行われる。一実施形態によれば、ステップ（ｄ）は、ステップ（ｂ）の約６日後に行われる。一実施形態によれば、ステップ（ｄ）は、ステップ（ｂ）の約７日後に行われる。
いくつかの実施形態によれば、ステップ（ｃ）～（ｅ）は、１０％ＦＢＳまたは自己血清を含有するＲＰＭＩ １６４０培地から選択される培地中で行われる。
アルファ－ガラクトシルセラミド（αＧａｌＣｅｒ）及び類似体によるＣＫＴＣの刺激
一次刺激時、特に、非哺乳類のスフィンゴ糖脂質（ＧＳＬ）によるα－ガラクトシルセラミド（α－ＧａｌＣｅｒ）に応答して、Ｉ型ＮＫＴ細胞は大量のインターフェロン（ＩＦＮ）－γ及びインターロイキン（ＩＬ）－４を産生し、下流での、ＤＣ、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、及び通常型Ｔ細胞の活性化をもたらす。ＫＲＮ７０００としても知られるα－ＧａｌＣｅｒは、元は海綿Ａｇｅｌａｓ ｍａｕｒｉｔｉａｎｕｓから単離されたアゲラスフィン（ｇｅｌａｓｐｈｉｎ）（Ｋｏｂａｙａｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｓ．１９９５；７（１０－１１）：５２９）の糖脂質類似体の簡略名である。α－ＧａｌＣｅｒは、α結合したガラクトース、フィトスフィンゴシン及びアシル鎖で構成される。α－ＧａｌＣｅｒ－ＣＤ１ｄ複合体がＩ型ＮＫＴ細胞のＴＣＲにより認識されると、一連のサイトカイン分泌及び強力な免疫応答の開始がもたらされる。短いフィトスフィンゴシン鎖を持つα－ＧａｌＣｅｒ類似体であるＯＣＨは、Ｉ型ＮＫＴ細胞を刺激してＩＦＮ－γよりもＩＬ－４を多く分泌させ、Ｔｈ２に向けて免疫応答を誘発する（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１７，２４：２２）。α－ＧａｌＣｅｒよりも正確かつ予測可能なサイトカイン特性を誘導するよう化学的に修飾された合成糖脂質またはα－ＧａｌＣｅｒ類似体が合成され、試験されている。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＨｕｎｇ，Ｊ－Ｔ ｅｔ ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１７）２４：２２）では、いくつかのα－ＧａｌＣｅｒ類似体が記載されている。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第９，３６５，４９６号でも、以下の構造式を持つ様々なα－ＧａｌＣｅｒ類似体が記載されている。
Figure 2022520302000003
別のクラスのＩ型ＮＫＴ細胞アゴニストであるβ－ＭａｎＣｅｒが報告されている（Ｏ’Ｋｏｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１１ Ｆｅｂ；１２１（２）：６８３－９４）。この化合物は、α－ＧａｌＣｅｒ（ＫＲＮ７０００）のセラミド構造と同一のセラミド構造を有し、これが、ＣＤ１ｄとの結合、アルファ結合したガラクトースではなくベータ結合したマンノースとの結合に寄与する。当該分野では、アルファ結合した糖部分は、腫瘍免疫を誘発するα－ＧａｌＣｅｒの重要な特徴であると考えられていた。したがって、β－ＭａｎＣｅｒの比較的強い抗腫瘍活性の発見は予想外であった。β－ＭａｎＣｅｒにより誘導される防御はＩ型ＮＫＴ細胞依存的である一方、この防御はＩＦＮ－γとは独立しているが、ＴＮＦ－α及び一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）に依存的であった。さらに、異なる防御機序と一致して、α－ＧａｌＣｅｒとβ－ＭａｎＣｅｒは、最適以下の用量を使用した場合、相乗作用して腫瘍免疫を誘導した。さらに、β－ＭａｎＣｅｒは、Ｉ型ＮＫＴ細胞で長期アネルギーを誘導する能力がα－ＧａｌＣｅｒよりもはるかに弱い（Ｏ’Ｋｏｎｅｋ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１３ Ａｕｇ １５；１９（１６）：４４０４－１１）。α－ＧａｌＣｅｒ同様、β－ＭａｎＣｅｒは、腫瘍ワクチンの効果を増強させることができる（Ｍａｔｔａｒｏｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１２ Ｏｃｔ １１；１２０（１５）：３０１９－２９）。したがって、Ｉ型ＮＫＴ細胞は、それらが認識する抗原に依存的な複数の経路／機序を使用することができる。
いくつかの実施形態によれば、記載の発明のＣＫＴＣの集団は、ＣＤ３＋Ｔ細胞の亜集団を含む。いくつかの実施形態によれば、ＣＫＴＣの集団は、ＮＫＴ細胞の亜集団を含む。一実施形態によれば、ＮＫＴ細胞の亜集団は、ＣＤ３＋Ｖα２４＋細胞を含む。一実施形態によれば、ＮＫＴ細胞の亜集団は、ＣＤ３＋Ｖα２４－細胞を含む。一実施形態によれば、ＮＫＴ細胞の亜集団は、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞を含む。いくつかの実施形態によれば、ＮＫＴ細胞の亜集団は、１型ＮＫＴ細胞の亜集団を含む。いくつかの実施形態によれば、ＮＫＴ細胞の亜集団のＴ細胞受容体は、Ｖα２４－Ｊａ１８ ＴＣＲα鎖を含む。いくつかの実施形態によれば、ＮＫＴ細胞の亜集団のＴ細胞受容体は、Ｖα２４－Ｊａ１８ ＴＣＲα鎖を含む。いくつかの実施形態によれば、ＮＫＴ細胞の亜集団は、ＣＤ１ｄにより提示される糖脂質抗原を認識する。いくつかの実施形態によれば、糖脂質抗原は、αＧａｌＣｅｒまたはその類似体もしくは機能的同等物である。
ＣＫＴＣの増殖及び活性化
Ｉ型ＮＫＴ細胞がα－ＧａｌＣｅｒで刺激されると、それらの細胞はＩＦＮ－γを産生する。同時に、それらはＣＤ４０－ＣＤ４０Ｌ相互作用を介して抗原提示細胞（ＡＰＣ）を活性化し、特に、ＤＣが成熟して、ＣＤ８０及びＣＤ８６等の共刺激受容体を上方制御するよう誘導する。ＤＣはまた、Ｉ型ＮＫＴ細胞との相互作用時にＩＬ－１２を産生する。ＩＬ－１２は、他のＴ細胞による、より多くのＩＦＮ－γ産生を誘導し、ＩＦＮ－γと共に、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びγδＴ細胞等の下流のエフェクターの活性化において重要な役割を果たす（Ｐａｇｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２ Ａｐｒ １５；１８８（８）：３９２８－３９）。Ｉ型ＮＫＴ細胞とＡＰＣとの相互作用により、ＡＰＣに活性化シグナル（すなわち、ライセンシング）が与えられ、それらが、ＣＤ７０及びＣＣＬ１７の誘導を介してＣＤ８＋Ｔ細胞にクロスプライミングできるようにする（Ｔａｒａｂａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８ Ａｐｒ １；１８０（７）：４６１５－２０、Ｆｕｊｉｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２００７ Ｄｅｃ；２２０（）：１８３－９８）。
いくつかの実施形態によれば、ＣＫＴＣの集団を活性化させることには、ＣＫＴＣの集団によるサイトカインの分泌を誘導すること、ＣＫＴＣの集団の増殖を刺激すること、またはＣＫＴＣ細胞表面での１つ以上のマーカーの発現を調節すること、のうちの１つ以上を含むことができる。いくつかの実施形態によれば、発現が調節されるサイトカインは、ＩＦＮγ、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、またはＩＬ－１０からなる群から選択される１つ以上である。
ＣＫＴＣの集団の活性化及び増殖は、本明細書に記載される様々なアッセイによって測定することができる。測定され得る例示的活性としては、増殖誘導、ＣＫＴＣの集団での活性化マーカーの発現の誘導、ＣＫＴＣの集団によるサイトカイン分泌の誘導、ＣＫＴＣの集団でのシグナル伝達の誘導、及びＣＫＴＣの集団の細胞傷害活性の増大が挙げられる。
サイトカイン分泌
ＳＣＫＴＣを形成するためのＣＫＴＣの活性化は、ガンマインターフェロン（ＩＦＮγ）、インターロイキン４（ＩＬ－４）、インターロイキン５（ＩＬ－５）、インターロイキン６（ＩＬ－６）またはインターロイキン－１０（ＩＬ－１０）のうちの１つ以上が含まれる、サイトカインの分泌を決定することにより評価または測定され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＬＩＳＡを使用して、サイトカイン分泌、例えば、ガンマインターフェロン（ＩＦＮγ）、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６またはＩＬ－１０の分泌を決定する。本明細書に記載される方法に応答して所与のサイトカイン（例えば、ガンマインターフェロン（ＩＦＮγ））を分泌するＣＫＴＣ及びＳＣＫＴＣを検出するためにＥＬＩＳＰＯＴ（酵素免疫スポット）法が使用され得る。例えば、本明細書に記載される方法により産生されるＣＫＴＣまたはＳＣＫＴＣの集団が、抗ＩＦＮγ抗体でコート済みのウェル内で培養される培養系を準備することができる。分泌されたＩＦＮγはコート抗体で捕捉され、次いで、発色基質に結合させた二次抗体により明らかにされる。その位置で分泌されたサイトカイン分子はスポットを形成し、それぞれスポットは、１個のＩＦＮγ分泌細胞に相当する。スポットの数から、分析試料中のＩＦＮγ分泌細胞の頻度を決定することができる。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイはまた、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、及びグランザイムＢ分泌リンパ球の検出についても報告されている（Ｋｌｉｎｍａｎ Ｄ，Ｎｕｔｍａｎ Ｔ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．；１９９４．ｐｐ．６．１９．１－６．１９．８、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
培養上清中のサイトカイン含有量を測定するために細胞内サイトカインのフローサイトメトリー解析が使用され得るが、実際にサイトカインを分泌するＮＫＴ細胞の数に関する情報は得られない。リンパ球をモネンシンまたはブレフェルジンＡ等の分泌阻害剤で処理すると、リンパ球は活性化時にその細胞質内部にサイトカインを蓄積させる。固定化及び透過処理の後、細胞内サイトカインはサイトメトリーで定量することができる。この手法により、産生されたサイトカイン、これらのサイトカインを産生する細胞の種類、及び、細胞ごとの産生されたサイトカインの量について決定が可能になる。
いくつかの実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの濃縮された集団によるサイトカイン産生は、ＩＬ－４ ｌｏｗ、ＩＬ－５ ｌｏｗ、ＩＬ－６ ｌｏｗ、ＩＬ－１０ ｌｏｗ、ＩＦＮγ ｈｉｇｈとして特徴付けられる。
一実施形態によれば、細胞の集団により産生されるＩＦＮ－γの量は約５０００ｐｇ／ｍｌ以上である。
いくつかの実施形態によれば、細胞の集団により産生されるＩＬ－４の量は約５ｐｇ／ｍｌである。一実施形態によれば、細胞の集団により産生されるＩＬ－４の量は約４．５ｐｇ／ｍｌである。一実施形態によれば、細胞の集団により産生されるＩＬ－４の量は約４ｐｇ／ｍｌである。一実施形態によれば、細胞の集団により産生されるＩＬ－４の量は約３．５ｐｇ／ｍｌである。一実施形態によれば、細胞の集団により産生されるＩＬ－４の量は約３ｐｇ／ｍｌである。一実施形態によれば、細胞の集団により産生されるＩＬ－４の量は約２．５ｐｇ／ｍｌである。一実施形態によれば、細胞の集団により産生されるＩＬ－４の量は約２ｐｇ／ｍｌである。一実施形態によれば、細胞の集団により産生されるＩＬ－４の量は約１．５ｐｇ／ｍｌである。一実施形態によれば、細胞の集団により産生されるＩＬ－４の量は約１ｐｇ／ｍｌである。一実施形態によれば、細胞の集団により産生されるＩＬ－４の量は、約１．０～約５ｐｇ／ｍｌの間である。一実施形態によれば、細胞の集団により産生されるＩＬ－４の量は、約１．５～約５ｐｇ／ｍｌの間である。一実施形態によれば、細胞の集団により産生されるＩＬ－４の量は、約２．０～約５ｐｇ／ｍｌの間である。一実施形態によれば、細胞の集団により産生されるＩＬ－４の量は、約２．５～約５ｐｇ／ｍｌの間である。一実施形態によれば、細胞の集団により産生されるＩＬ－４の量は、約３．０～約５ｐｇ／ｍｌの間である。一実施形態によれば、細胞の集団により産生されるＩＬ－４の量は、約３．５～約５ｐｇ／ｍｌの間である。一実施形態によれば、細胞の集団により産生されるＩＬ－４の量は、約４．０～約５ｐｇ／ｍｌの間である。一実施形態によれば、細胞の集団により産生されるＩＬ－４の量は、約４．５～約５ｐｇ／ｍｌの間である。
いくつかの実施形態によれば、ＩＦＮγとＩＬ－４の比は、ＣＫＴＣ及びＳＣＫＴＣの、１つ以上のＴ細胞エフェクター機能（細胞殺傷及び細胞活性化等）の指標である。いくつかの実施形態によれば、方法は、少なくとも１０００のＩＦＮガンマ：ＩＬ４比、対照ＣＴＫＣ細胞に対し少なくとも１．５倍の殺傷率増大、または両方を達成するのに有効である。
一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は１０００以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は１２００以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は１３００以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は１４００以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は１５００以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は１５５０以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は１６００以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は１６５０超である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は１７００以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は１７５０以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は１８００以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は１８５０以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は１９００以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は１９５０超である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２０００以上である。一実施形態によれば、ＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２０５０以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２１００以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２１５０以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２２００以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２２５０以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２３００以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２３５０以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２４００以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２４５０以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２５００以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２５５０以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２６００以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２６５０以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２７００以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２７５０以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２８００以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２８５０以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２９００以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２９５０以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は３０００以上である。
細胞傷害性
ＳＣＫＴＣを形成するためのＣＫＴＣの活性化は、記載されている方法の各ステップで、ＣＫＴＣの細胞傷害活性のアッセイを行うことにより評価され得る。
細胞傷害活性は、当業者に公知の任意の好適な手法により評価され得る。例えば、本明細書に記載される方法により産生されるＣＫＴＣまたはＳＣＫＴＣの集団を含む試料は、適切な期間の経過後に標準的細胞傷害性アッセイで細胞傷害活性についてアッセイすることができる。そのようなアッセイとしては、当該技術分野で公知のクロム放出ＣＴＬアッセイ及びＡＬＡＭＡＲ ＢＬＵＥ蛍光アッセイが挙げられ得るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態によれば、細胞の集団を遠心分離により回収し、Ｋ５６２細胞（慢性骨髄性白血病患者に由来する、未分化性の高い顆粒球系）に対する細胞傷害性を評価する。慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）患者に由来し、Ｂ３Ａ２ ｂｃｒ－ａｂｌハイブリッド遺伝子を発現するＫ５６２細胞株は、アポトーシス死に特に抵抗性であることが知られている。（Ｌｕｃｈｅｔｔｉ，Ｆ．ｅｔ ａｌ，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ（１９９８）８３：９７４－９８０）。一実施形態によれば、Ｋ５６２標的細胞及びＳＣＫＴＣは、１つ以上の、エフェクター：標的比、例えば、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１または２０：１にてウェルに割り付けられる。インキュベーション後、酵素結合免疫吸着測定法のリーダーにより吸光度を検出し、殺傷率を算出することができる。他の実施形態によれば、同じアッセイを行うことができ、その場合、Ｊｕｒｋａｔ細胞（急性Ｔ白血病）に対する細胞傷害性を評価する（Ｓｏｍａｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ １０（１０）：ｅ０１４１０７４．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１４１０７４）。
いくつかの実施形態によれば、殺傷率は、以下の式により表すことができる：
Figure 2022520302000004
いくつかの実施形態によれば、ＳＣＫＴＣを含むＣＫＴＣ集団の殺傷率は、約２５％～約７５％の両端を含めた範囲である。いくつかの実施形態によれば、ＳＣＫＴＣを含むＣＫＴＣ集団の殺傷率は、約５０％～約７５％の両端を含めた範囲である。いくつかの実施形態によれば、ＳＣＫＴＣを含むＣＫＴＣ集団の殺傷率は、約２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、または７５％である。
いくつかの実施形態によれば、記載されている本発明の方法により調製されるＳＣＫＴＣを含むＣＫＴＣ集団の殺傷率は、対照細胞に対し少なくとも１．５倍増大する（例えば、ステップ（ｃ）～（ｅ）に記載される特定の方法の対象とならない細胞）。いくつかの実施形態によれば、本発明の方法により調製されるＳＣＫＴＣを含むＣＫＴＣ集団の殺傷率は、対照細胞に対し少なくとも２倍増大する（例えば、ステップ（ｃ）～（ｅ）に記載される特定の方法の対象とならない細胞）。いくつかの実施形態によれば、本発明の方法により調製されるＳＣＫＴＣを含むＣＫＴＣ集団の殺傷率は、対照細胞に対し少なくとも３倍増大する（例えば、ステップ（ｃ）～（ｅ）に記載される特定の方法の対象とならない細胞）。いくつかの実施形態によれば、本発明の方法により調製されるＳＣＫＴＣを含むＣＫＴＣ集団の殺傷率は、対照細胞に対し少なくとも３．５倍増大する（例えば、ステップ（ｃ）～（ｅ）に記載される特定の方法の対象とならない細胞）。いくつかの実施形態によれば、本発明の方法により調製されるＳＣＫＴＣを含むＣＫＴＣ集団の殺傷率は、対照細胞に対し少なくとも４倍増大する（例えば、ステップ（ｃ）～（ｅ）に記載される特定の方法の対象とならない細胞）。いくつかの実施形態によれば、本発明の方法により調製されるＳＣＫＴＣを含むＣＫＴＣ集団の殺傷率は、対照細胞に対し少なくとも４．５倍増大する（例えば、ステップ（ｃ）～（ｅ）に記載される特定の方法の対象とならない細胞）。いくつかの実施形態によれば、本発明の方法により調製されるＳＣＫＴＣを含むＣＫＴＣ集団の殺傷率は、対照細胞に対し少なくとも５倍増大する（例えば、ステップ（ｃ）～（ｅ）に記載される特定の方法の対象とならない細胞）。
増殖（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）／増殖（Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）
記載されている本発明の方法がＳＣＫＴＣの増殖（Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を誘導する能力は、蛍光細胞染色色素のカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）を使用する染色により評価することができる。初期の細胞増殖率を比較するため、細胞をＣＦＳＥで染色して、記載されている方法の様々なステップ（すなわち、ステップ（ｂ）～（ｅ））によりＳＣＫＴＣの増殖（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）がどの程度良好に誘導されたかを決定する。ＣＦＳＥ染色では、定量的エンドポイントが得られ、増殖した細胞の同時表現型検査が可能になる。毎日、刺激後に、細胞のアリコートを各培養から取り除き、フローサイトメトリーで分析する。ＣＦＳＥ染色により細胞が高蛍光性になる。細胞分裂と同時に、蛍光は半減し、そのため、細胞が分裂する回数が多いほど蛍光は少なくなる。記載されている方法がＳＣＫＴＣの増殖を誘導する能力は、１回、２回、３回等、分裂した細胞数を測定することにより定量化される。
記載されている方法がＳＣＫＴＣの長期増殖をどの程度良好に促進するかを決定するため、細胞増殖曲線を作成することができる。これらの実験は、前述のＣＦＳＥ実験のように準備されるが、ＣＦＳＥは使用しない。培養の２～３日ごとに、細胞をそれぞれの培養から取り除き、存在する細胞の数及び細胞の平均容積を測定するコールター・カウンターを使用して計数する。平均細胞容積は、細胞を再刺激した場合の最良の予測因子である。さらに、増殖した細胞の表現型を明らかにして、特定のサブセットが選択的に増殖されるのかどうかを決定することができる。
各再刺激の前に、増殖中の細胞集団の表現型解析を実施して、ＳＣＫＴＣ集団を定義する特定のマーカーの存在を決定する。いくつかの実施形態によれば、各再刺激の前に、細胞のアリコートを各培養から取り除き、リンパ球が無傷なリンパ球集団をビットマップに表す前方散乱光（ＦＳ：Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ）対９０°散乱光（Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒ）を使用して、フローサイトメトリーで分析する。このビットマップにゲーティング（長方形）し、ＣＤ５６対ＣＤ３を測定した。ダブルポジティブにゲーティングし、Ｖα２４対Ｖβ１１を測定した。パーフォリン及びグランザイムＢの細胞内染色を使用して肉眼的測定を実施し、細胞溶解の可能性を推定することができる。
いくつかの実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの集団は、開始ＣＫＴＣ細胞の集団に基づき、約１００～約１，０００，０００倍、または約１，０００～約１，０００，０００倍、例えば、約１，０００倍～約１００，０００倍、すなわち、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１０００倍、少なくとも約２０００倍、少なくとも約３０００倍、少なくとも約４０００倍、少なくとも約５０００倍、少なくとも約６０００倍、少なくとも約７０００倍、少なくとも約８０００倍、少なくとも約９０００倍、少なくとも約１０，０００倍、少なくとも約１１，０００倍、少なくとも約１２，０００倍、少なくとも約１３，０００倍、少なくとも約１４，０００倍、少なくとも約１５，０００倍、少なくとも約１６，０００倍、少なくとも約１７，０００倍、少なくとも約１８，０００倍、少なくとも約１９，０００倍、少なくとも約２０，０００倍、少なくとも約２１，０００倍、少なくとも約２２，０００倍、少なくとも約２３，０００倍、少なくとも約２４，０００倍、少なくとも約２５，０００倍、少なくとも約２６，０００倍、少なくとも約２７，０００倍、少なくとも約２８，０００倍、少なくとも約２９，０００倍、少なくとも約３０，０００倍、少なくとも約３１，０００倍、少なくとも約３２，０００倍、少なくとも約３３，０００倍、少なくとも約３４，０００倍、少なくとも約３５，０００倍、少なくとも約３６，０００倍、少なくとも約３７，０００、少なくとも約３８，０００倍、少なくとも約３９，０００倍、少なくとも約４０，０００倍、少なくとも約４１，０００倍、少なくとも約４２，０００倍、少なくとも約４３，０００倍、少なくとも約４４，０００倍、少なくとも約４４，０００倍、少なくとも約４５，０００倍、少なくとも約４６，０００倍、少なくとも約４７，０００倍、少なくとも約４８，０００倍、少なくとも約４９，０００倍、少なくとも約５０，０００倍、少なくとも約５１，０００倍、少なくとも約５２，０００倍、少なくとも約５３，０００倍、少なくとも約５４，０００倍、少なくとも約５５，０００倍、少なくとも約５６，０００倍、少なくとも約５７，０００倍、少なくとも約５８，０００倍、少なくとも約５９，０００倍、少なくとも約６０，０００倍、少なくとも約６１，０００倍、少なくとも約６２，０００倍、少なくとも約６３，０００倍、少なくとも約６４，０００倍、少なくとも約６５，０００倍、少なくとも約６６，０００倍、少なくとも約６７，０００倍、少なくとも約６８，０００倍、少なくとも約６９，０００倍、少なくとも約７０，０００、少なくとも約７１，０００倍、少なくとも約７２，０００倍、少なくとも約７３，０００倍、少なくとも約７４，０００倍、少なくとも約７５，０００倍、少なくとも約７６，０００倍、少なくとも約７７，０００倍、少なくとも約７８，０００倍、少なくとも約７９，０００倍、少なくとも約８０，０００倍、少なくとも約８１，０００倍、少なくとも約８２，０００倍、少なくとも約８３，０００倍、少なくとも約８４，０００倍、少なくとも約８５，０００倍、少なくとも約８６，０００倍、少なくとも約８７，０００倍、少なくとも約８８，０００倍、少なくとも約８９，０００倍、少なくとも約９０，０００倍、少なくとも約９１，０００倍、少なくとも約９２，０００倍、少なくとも約９３，０００倍、少なくとも約９４，０００倍、少なくとも約９５，０００倍、少なくとも約９６，０００倍、少なくとも約９７，０００倍、少なくとも約９８，０００倍、少なくとも約９９，０００倍、少なくとも約１００，０００倍、少なくとも約２００，０００倍、少なくとも約３００，０００倍、少なくとも約４００，０００倍、少なくとも約５００，０００倍、少なくとも約６００，０００倍、少なくとも約７００，０００倍、少なくとも約８００，０００倍、少なくとも約９００，０００倍、または少なくとも約１，０００，０００倍に増殖される。
マーカー
本発明のいくつかの実施形態によれば、本明細書に記載される方法を使用するＳＣＫＴＣの増殖は、ＳＣＫＴＣを特徴付けるマーカーの存在を評価して、それにより細胞集団中のＳＣＫＴＣの割合を決定することによって決定され得る。いくつかの実施形態によれば、リンパ球が無傷なリンパ球集団をビットマップに表す前方散乱光（ＦＳ：Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ）対９０°散乱光（Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒ）フローサイトメトリーを使用して、ＮＫＴ細胞マーカーを発現しているＮＫＴ細胞の亜集団の存在を決定することができる。このビットマップにゲーティング（長方形）し、ＣＤ５６対ＣＤ３を測定した。ダブルポジティブにゲーティングし、Ｖα２４対Ｖβ１１を測定した。いくつかの実施形態によれば、ＮＫＴ細胞の亜集団は、ＣＤ３及びＣＤ５６マーカーの存在（ＣＤ３＋ＣＤ５６＋ＮＫＴ細胞）によって決定され得る。一実施形態によれば、第１の蛍光標識（例えば、抗ＣＤ３－ｐａｃｉｆｉｃ ｂｌｕｅ（ＰＢ）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、クローン＃ＳＰ３４－２）等の市販の蛍光標識済み抗ＣＤ３抗体で標識した抗ＣＤ３抗体と、第２の蛍光標識（例えば、抗ＣＤ５６－フィコエリスリン（ＰＥ）－Ｃｙ７（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、クローン＃ＮＣＡＭ１６．２）等の市販の蛍光標識済み抗ＣＤ５６抗体で標識した抗ＣＤ５６抗体）との結合を使用して、細胞集団におけるＣＤ３及びＣＤ５６の発現を決定することができ、その場合、抗体の結合をフローサイトメトリーで、例えば、ＰＢ蛍光またはＰＥ蛍光について測定し、ゲートは、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞に基づいて設定する。
いくつかの実施形態によれば、Ｉ型ＮＫＴ細胞の亜集団は、ＴＣＲ Ｖαマーカー及びＴＣＲ Ｖβマーカーの存在によって決定され得る。一実施形態によれば、第１の蛍光標識（例えば、抗ＴＣＲ Ｖα－ＰＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、クローン＃Ｃ１５）等の市販の蛍光標識済み抗ＴＣＲ Ｖα抗体）で標識した抗ＴＣＲ Ｖα抗体と、第２の蛍光標識（例えば、抗ＴＣＲ Ｖβ－フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、クローン＃Ｃ２１）等の市販の蛍光標識済み抗ＴＣＲ Ｖβ抗体）で標識した抗ＴＣＲ Ｖβ抗体との結合を使用して、細胞集団におけるＶα及びＶβの発現を決定することができ、その場合、抗体の結合をフローサイトメトリーで、例えば、ＰＥ蛍光またはＦＩＴＣ蛍光について測定し、ゲートは、Ｖα＋Ｖβ＋細胞に基づいて設定する。
いくつかの実施形態によれば、ＮＫＴ細胞の亜集団は、ＣＤ３＋Ｖα２４＋マーカーの発現を特徴とし得る。いくつかの実施形態によれば、Ｉ型ＮＫＴ細胞の亜集団は、マーカーＣＤ３＋Ｖα２４－の発現を特徴とする。いくつかの実施形態によれば、Ｉ型ＮＫＴ細胞の亜集団には、マーカーＣＤ３＋ＣＤ５６＋を特徴とする細胞が含まれる。いくつかの実施形態によれば、Ｉ型ＮＫＴ細胞の亜集団には、マーカーＣＤ３＋Ｖα２４＋、ＣＤ３＋Ｖα２４－、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋及びそれらの混合の発現を特徴とする細胞が含まれる。
いくつかの実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの濃縮された集団は、総ＣＫＴＣ集団の約４０％～約６０％、すなわち、方法から得られる総細胞集団の約４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％または６０％を構成する。したがって、方法のステップ（ｃ）でのＭＣの数（５ｘ１０5／ｍｌ～３×１０6／ｍｌ）、増殖の程度（１００～１，０００，０００倍）、及びＣＴＫＣの総集団におけるＳＣＫＴＣの提示（４０～６０％）に基づき、いくつかの実施形態によれば、増殖、活性化させＳＣＫＴＣが濃縮された集団中のＳＣＫＴＣの数は、約２×１０7細胞／ｍｌ～約１．８×１０12細胞／ｍｌの範囲である。
使用方法
対象
本明細書に記載される方法は、これらの方法の利益を経験し得る、あらゆる対象での使用が意図される。したがって、「対象」、「患者」、及び「個体」（同じ意味で使用される）には、ヒトならびに非ヒト対象、特に家畜動物が含まれる。
いくつかの実施形態によれば、対象及び／または動物は、哺乳類、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ウサギ、ヒツジ、またはサル、チンパンジー、もしくはヒヒ等の非ヒト霊長類であるである。他の実施形態では、対象及び／または動物は非哺乳類である。いくつかの実施形態によれば、対象及び／または動物はヒトである。いくつかの実施形態によれば、ヒトは小児である。他の実施形態によれば、ヒトは成人である。他の実施形態によれば、ヒトは高齢者である。他の実施形態によれば、ヒトは、患者と呼ばれ得る。
特定の実施形態によれば、ヒトは、年齢が約０か月～約６か月、約６～約１２か月、約６～約１８か月、約１８～約３６か月、約１～約５歳、約５～約１０歳、約１０～約１５歳、約１５～約２０歳、約２０～約２５歳、約２５～約３０歳、約３０～約３５歳、約３５～約４０歳、約４０～約４５歳、約４５～約５０歳、約５０～約５５歳、約５５～約６０歳、約６０～約６５歳、約６５～約７０歳、約７０～約７５歳、約７５～約８０歳、約８０～約８５歳、約８５～約９０歳、約９０～約９５歳または約９５～約１００歳の範囲である。
いくつかの実施形態によれば、対象は非ヒト動物であり、したがって、開示は動物用に関する。いくつかのそのような実施形態によれば、非ヒト動物は家庭内のペットである。いくつかのそのような実施形態によれば、非ヒト動物は家畜動物である。
投与
本開示の細胞製品を含む医薬組成物は、治療対象の疾患に適切な様態で投与され得る。量及び投与頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の種類及び重症度のような因子によって決定されるが、適切な用量は臨床試験によって決定され得る。
細胞製品を含有する医薬組成物の投与は、特定の疾患に適切な任意の方法で行われ得、これには、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、植え込みまたは移植によるものが含まれ得る。本開示の医薬組成物は、非経口的に、例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内（ｉ．ｖ．）への注射によるか、または腹腔内投与で患者に投与され得る。
いくつかの実施形態によれば、記載の発明の医薬組成物はまた、所望部位への直接注射または全身投与により対象に投与することができる。例えば、医薬組成物は、腫瘍またはリンパ節内に直接注射され得る。
本明細書で使用される場合、医薬組成物の「非経口投与」には、対象の組織を物理的に破損すること及び組織内の破損を介した医薬組成物の投与を特徴とする、任意の投与経路が含まれる。したがって、非経口投与としては、医薬組成物の投与を、組成物の注射、外科的切開を介した組成物の適用、組織穿通性非外科的創傷等を介した組成物の適用により行うことが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、非経口投与には、限定するわけではないが、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内注射、及び腎臓の透析による注入手法が含まれることが意図される。
いくつかの実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの集団を含有する医薬組成物は、患者に連日投与することができる。いくつかの実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの集団を含有する医薬組成物は、持続注入により患者に投与することができる。いくつかの実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの集団を含有する医薬組成物は、患者に連日投与することができる。いくつかの実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの集団を含有する医薬組成物は、患者に１日２回以上投与することができる。いくつかの実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの集団を含有する医薬組成物は、患者に隔日投与することができる。いくつかの実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの集団を含有する医薬組成物は、患者に週２回投与することができる。いくつかの実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの集団を含有する医薬組成物は、患者に２週間に１回投与することができる。いくつかの実施形態によれば、ＳＣＫＴＣのｔ集団を含有する医薬組成物は、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、または６か月ごとに患者に投与することができる。
いくつかの実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの集団を含有する細胞製品を含む医薬組成物は、２週間から１年またはそれ以上、例えば、１か月から１年またはそれ以上、例えば、少なくとも２週間、４週間、６週間、８週間、３か月、６か月、１年、２年という期間にわたり患者の血流で投与ＳＣＫＴＣの機能を維持するのに十分な投与レジメン（投与用量及び定期投与）で患者に投与することができる。
必要用量の頻度は当業者には容易に明らかとなり、限定するわけではないが、治療される疾患の種類及び重症度、動物の種類及び年齢等のような任意の数の因子によって異なる。
ＳＣＫＴＣの集団を含有する細胞製品を含む医薬組成物は、様々な追加治療剤、例えば、数ある中でも特に、サイトカイン、化学療法薬、チェックポイント阻害剤及び／または抗ウイルス薬）と同時投与され得る。別法として、追加治療剤（複数可）は、医薬組成物より１時間前、１日前、１週間前、１か月前、もしくはそれ以上前に投与されるか、またはそれらの任意の並べ替え順で投与されてもよい。さらに、追加治療剤（複数可）は、医薬組成物の投与の１時間後、１日後、１週間後、もしくはそれ以上経過後に、投与されるか、またはそれらの任意の並べ替え順で投与されてもよい。頻度及び投与レジメンは当業者には容易に明らかとなり、限定するわけではないが、治療される疾患の種類及び重症度、動物の年齢及び健康状態、追加治療剤もしくは投与される薬剤の同一性、投与経路ならびにＳＣＫＴＣの集団を含む医薬組成物等のような任意の数の因子によって異なる。
いくつかの態様によれば、本開示では、免疫細胞活性化に感受性である対象の免疫細胞を刺激する方法を提供し、免疫細胞集団をインビボで、免疫細胞集団を刺激するための有効量で本明細書に記載されるＳＣＫＴＣを含有する細胞製品を含む医薬組成物と接触させることを含む。一実施形態によれば、免疫細胞集団は、樹状細胞集団を含む。一実施形態によれば、免疫細胞集団は、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団である。一実施形態によれば、免疫細胞集団は、ＮＫ細胞集団である。一実施形態によれば、免疫細胞集団は、ＭＨＣ拘束性Ｔ細胞集団を含む。
いくつかの実施形態によれば、対象は、本開示の細胞製品を含有する医薬組成物を投与することを含む免疫療法を含む治療に感受性である障害を有する。
例示的実施形態としては、がん、前がん状態の（がんになる場合があるか、またはその可能性の高い状態を意味する）、個体自身の組織から生じ、それに対して向けられる細胞及び／または抗体を含む自己免疫性の疾患及び障害、炎症性の疾患または障害、組織移植関連障害（体の機能（複数可）回復を目的とした、ドナーからレシピエントへのヒトの細胞、組織、もしくは臓器の移植（ｔｒａｎｓｆｅｒ）（生着）、（移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ））に関連した障害を意味する）、移植後リンパ増殖性障害、アレルギー性障害、ならびに感染症（疾患を引き起こす可能性のある生物による体内侵入を意味する）が挙げられる。例えば、治療的量の記載の発明のＳＣＫＴＣの集団を含有する細胞製品を含む医薬組成物は、ＭＨＣ Ｉ低提示を特徴とする状態を治療するために使用され得る。いくつかの実施形態によれば、ＳＣＫＴＣ細胞製品を含有する医薬組成物は、化学療法を受けることができない、疾患が進行した対象を治療するため、例えば、患者が化学療法に反応しないか、または重症のために化学療法の好適な治療濃度域を有することができない場合（例えば、用量またはレジメンを制限するような副作用を極めて多く経験している対象）に使用され得る。
いくつかの実施形態によれば、用語「治療的有効量」または用量とは、必ずしも直ちに治療的に有効という量を意味するわけではないが、治療効果を提供するようインビボ（投与後）での増殖能のある用量が含まれる。
したがって、治療量以下の用量であるにもかかわらず、インビボでのＳＣＫＴＣの増殖及び活性化後に治療的有効量となって、所望の治療効果を提供する用量を患者に投与する方法が提供される。いくつかの実施形態によれば、治療量以下の用量は、治療的有効量より少ない量である。
超活性化サイトカインキラーＴ細胞の増殖及び濃縮された集団を含有する細胞製品を含む医薬組成物
別の態様によれば、記載の発明は、超活性化サイトカインキラーＴ細胞（ＳＣＫＴＣ）の増殖させ濃縮された集団を治療的量にて活性成分として含有する細胞製品を含む医薬組成物を提供する。そのような医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体に加え、治療的有効用量のＳＣＫＴＣ集団を、対象への投与に好適な形態で含有し得る。記載の発明の医薬組成物には、記載の発明の細胞製品により提供される作用に加えて別の薬学的作用のある組成物を提供することを目的とした、１つ以上の適合性のある活性成分がさらに含まれ得る。本明細書で使用される場合、「適合性のある」は、そのような組成物の活性成分は、通常の使用条件下で各活性成分または組成物の有効性を実質的に低下させるような相互作用がないような様態で、互いに組み合わせることができることを意味する。
いくつかの実施形態によれば、サイトカインキラーＴ細胞（ＳＣＫＴＣ）の増殖させ濃縮された超活性化集団は、サイトカインの分泌調節、ＳＣＫＴＣ集団の刺激増殖、ＳＣＫＴＣの細胞表面上の１つ以上のマーカーの調節発現または標的細胞集団に対するＳＣＫＴＣによる細胞傷害活性の増大、のうちの１つ以上を特徴とする。
サイトカイン分泌
いくつかの実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団は、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、またはＩＬ－１０またはＩＦＮγからなる群から選択される１つ以上のサイトカインの発現調節を特徴とする。いくつかの実施形態によれば、ＳＣＫＴＣ細胞の増殖させ濃縮された集団は、サイトカインの発現プロファイルが、ＩＬ－４、ＩＬ－５、１Ｌ－６、及びＩＬ－１０からなる群から選択される１つ以上のサイトカインの低発現ならびにＩＦＮγの高発現を含む細胞を含む。いくつかの実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの濃縮された集団によるサイトカイン産生は、ＩＬ－５－、ＩＬ－６－、ＩＬ－、ＩＦＮ－４ ｌｏｗ、及びＩＦＮγ ｈｉｇｈとして特徴付けられる。
いくつかの実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団により産生されるＩＦＮ－γの量は、約５０００ｐｇ／ｍｌ以上である。
いくつかの実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団により産生されるＩＬ－４の量は、約５ｐｇ／ｍｌである。一実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団により産生されるＩＬ－４の量は、約４．５ｐｇ／ｍｌである。一実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団により産生されるＩＬ－４の量は、約４ｐｇ／ｍｌである。一実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団により産生されるＩＬ－４の量は、約３．５ｐｇ／ｍｌである。一実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団により産生されるＩＬ－４の量は、約３ｐｇ／ｍｌである。一実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団により産生されるＩＬ－４の量は、約２．５ｐｇ／ｍｌである。一実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団により産生されるＩＬ－４の量は、約２ｐｇ／ｍｌである。一実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団により産生されるＩＬ－４の量は、約１．５ｐｇ／ｍｌである。一実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団により産生されるＩＬ－４の量は、約１ｐｇ／ｍｌである。一実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団により産生されるＩＬ－４の量は、約１．０～約５ｐｇ／ｍｌの間である。一実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団により産生されるＩＬ－４の量は、約１．５～約５ｐｇ／ｍｌの間である。一実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団により産生されるＩＬ－４の量は、約２．０～約５ｐｇ／ｍｌの間である。一実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団により産生されるＩＬ－４の量は、約２．５～約５ｐｇ／ｍｌの間である。一実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団により産生されるＩＬ－４の量は、約３．０～約５ｐｇ／ｍｌの間である。一実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団により産生されるＩＬ－４の量は、約３．５～約５ｐｇ／ｍｌの間である。一実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団により産生されるＩＬ－４の量は、約４．０～約５ｐｇ／ｍｌの間である。一実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団により産生されるＩＬ－４の量は、約４．５～約５ｐｇ／ｍｌの間である。
いくつかの実施形態によれば、ＩＦＮγとＩＬ－４の比は、ＣＫＴＣの対照集団及びＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団の、１つ以上のＴ細胞エフェクター機能（細胞殺傷及び細胞活性化等）の指標である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は１０００以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は１２００以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は１３００以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は１４００以上である。一実施形態によれば、ＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の培養上清中の比は１５００以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は１５５０以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は１６００以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は１６５０超である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は１７００以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は１７５０以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は１８００以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は１８５０以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は１９００以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は１９５０超である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２０００以上である。一実施形態によれば、ＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２０５０以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２１００以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２１５０以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２２００以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２２５０以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２３００以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２３５０以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２４００以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２４５０以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２５００以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２５５０以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２６００以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２６５０以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２７００以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２７５０以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２８００以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２８５０以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２９００以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は２９５０以上である。一実施形態によれば、培養上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は３０００以上である。
ＳＣＴＫＣの濃縮された集団
記載されている本発明の方法が、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団の増殖を誘導する能力は、蛍光細胞染色色素のカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）を使用する染色により評価することができる。初期の細胞増殖率を比較するため、ＣＫＴＣをＣＦＳＥで染色して、記載されている方法の様々なステップ（すなわち、ステップ（ｃ）～（ｅ））によりＳＣＫＴＣの増殖がどの程度良好に誘導されたかを決定する。ＣＦＳＥ染色では、定量的エンドポイントが得られ、増殖した細胞の同時表現型検査が可能になる。毎日、刺激後に、細胞のアリコートを各培養から取り除き、フローサイトメトリーで分析する。ＣＦＳＥ染色により細胞が高蛍光性になる。細胞分裂と同時に、蛍光は半減し、そのため、細胞が分裂する回数が多いほど蛍光は少なくなる。記載されている方法がＳＣＫＴＣの増殖を誘導する能力は、１回、２回、３回等、分裂した細胞数を測定することにより定量化される。
記載されている方法がＳＣＫＴＣの長期増殖をどの程度良好に促進するかを決定するため、細胞増殖曲線を作成することができる。これらの実験は、前述のＣＦＳＥ実験のように準備されるが、ＣＦＳＥは使用しない。培養の２～３日ごとに、細胞をそれぞれの培養から取り除き、存在する細胞の数及び細胞の平均容積を測定するコールター・カウンターを使用して計数する。平均細胞容積は、細胞を再刺激した場合の最良の予測因子である。さらに、増殖した細胞の表現型を明らかにして、特定のサブセットが選択的に増殖されるのかどうかを決定することができる。
各再刺激の前に、増殖中の細胞集団の表現型解析を実施して、ＳＣＫＴＣ集団を定義する特定のマーカーの存在を決定する。いくつかの実施形態によれば、各再刺激の前に、細胞のアリコートを各培養から取り除き、リンパ球が無傷なリンパ球集団をビットマップに表す前方散乱光（ＦＳ：Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ）対９０°散乱光（Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒ）を使用して、フローサイトメトリーで分析する。このビットマップにゲーティング（長方形）し、ＣＤ５６対ＣＤ３を測定した。ダブルポジティブにゲーティングし、Ｖα２４対Ｖβ１１を測定した。パーフォリン及びグランザイムＢの細胞内染色を使用して肉眼的測定を実施し、細胞溶解の可能性を推定することができる。
いくつかの実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの集団は、開始ＣＫＴＣ細胞の集団に基づき、約１００～約１，０００，０００倍、または約１，０００～約１，０００，０００倍、例えば、約１，０００倍～約１００，０００倍、すなわち、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１０００倍、少なくとも約２０００倍、少なくとも約３０００倍、少なくとも約４０００倍、少なくとも約５０００倍、少なくとも約６０００倍、少なくとも約７０００倍、少なくとも約８０００倍、少なくとも約９０００倍、少なくとも約１０，０００倍、少なくとも約１１，０００倍、少なくとも約１２，０００倍、少なくとも約１３，０００倍、少なくとも約１４，０００倍、少なくとも約１５，０００倍、少なくとも約１６，０００倍、少なくとも約１７，０００倍、少なくとも約１８，０００倍、少なくとも約１９，０００倍、少なくとも約２０，０００倍、少なくとも約２１，０００倍、少なくとも約２２，０００倍、少なくとも約２３，０００倍、少なくとも約２４，０００倍、少なくとも約２５，０００倍、少なくとも約２６，０００倍、２７，０００倍、少なくとも約２８，０００倍、２９，０００倍、３０，０００倍、少なくとも約３１，０００倍、少なくとも約３２，０００倍、少なくとも約３３，０００倍、少なくとも約３４，０００倍、少なくとも約少なくとも約３５，０００倍、少なくとも約３６，０００倍、少なくとも約３７，０００倍、少なくとも約３８，０００倍、少なくとも約３９，０００倍、少なくとも約４０，０００倍、少なくとも約４１，０００倍、少なくとも約４２，０００倍、少なくとも約４３，０００倍、少なくとも約４４，０００倍、少なくとも約４４，０００倍、少なくとも約４５，０００倍、少なくとも約４６，０００倍、少なくとも約４７，０００倍、少なくとも約４８，０００倍、少なくとも約４９，０００倍、５少なくとも約０，０００倍、少なくとも約５１，０００倍、少なくとも約５２，０００倍、少なくとも約５３，０００倍、少なくとも約５４，０００倍、少なくとも約５５，０００倍、少なくとも約５６，０００倍、少なくとも約５７，０００倍、少なくとも約５８，０００倍、少なくとも約５９，０００倍、少なくとも約６０，０００倍、少なくとも約６１，０００倍、少なくとも約６２，０００倍、少なくとも約６３，０００倍、少なくとも約６４，０００倍、少なくとも約６５，０００倍、少なくとも約６６，０００倍、少なくとも約６７，０００倍、少なくとも約６８，０００倍、少なくとも約６９，０００倍、少なくとも約７０，０００倍、少なくとも約７１，０００倍、少なくとも約７２，０００倍、少なくとも約７３，０００倍、少なくとも約７４，０００倍、少なくとも約７５，０００倍、７少なくとも約７６，０００倍、少なくとも約７７，０００倍、少なくとも約７８，０００倍、少なくとも約７９，０００倍、少なくとも約８０，０００倍、少なくとも約８１，０００倍、少なくとも約８２，０００倍、少なくとも約８３，０００倍、少なくとも約８４，０００倍、少なくとも約８５，０００倍、少なくとも約８６，０００倍、少なくとも約８７，０００倍、少なくとも約８８，０００倍、少なくとも約８９，０００倍、少なくとも約９０，０００倍、少なくとも約９１，０００倍、少なくとも約９２，０００倍、少なくとも約９３，０００倍、少なくとも約９４，０００倍、少なくとも約９５，０００倍、少なくとも約９６，０００倍、少なくとも約９７，０００倍、少なくとも約９８，０００倍、少なくとも約９９，０００倍、少なくとも約１００，０００倍、少なくとも約２００，０００倍、少なくとも約３００，０００倍、少なくとも約４００，０００倍、少なくとも約５００，０００倍、少なくとも約６００，０００倍、少なくとも約７００，０００倍、少なくとも約８００，０００倍、少なくとも約９００，０００倍、または少なくとも約１，０００，０００倍に増殖される。
刺激増殖に関して、いくつかの実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団は、総ＣＴＫＣ細胞集団の約４０％～約６０％、すなわち、総ＣＴＫＣ細胞集団の約４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％または６０％を構成する。いくつかの実施形態によれば、ＳＣＫＴＣが濃縮された増殖させた集団中のＳＣＫＴＣ数は、約２×１０7細胞／ｍｌ～約１．８×１０12細胞／ｍｌの範囲である。
マーカー発現
いくつかの実施形態によれば、フローサイトメトリーでは、（例えば、リンパ球が無傷なリンパ球集団をビットマップに表す前方散乱光（ＦＳ：Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ）対９０°散乱光（Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒ）を使用する。このビットマップにゲーティング（長方形）し、ＣＤ５６対ＣＤ３を測定した。ダブルポジティブにゲーティングし、Ｖα２４対Ｖβ１１を測定した。）を使用して、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団による細胞マーカーの発現を特徴付けることができる。いくつかの実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団は、ＮＫＴ細胞マーカーを発現する細胞亜集団含む。いくつかのそのような実施形態によれば、ＮＫＴマーカーを発現する細胞の亜集団は、ＣＤ３及びＣＤ５６マーカーの存在によって決定され得る。いくつかの実施形態によれば、第１の蛍光標識（例えば、抗ＣＤ３－ｐａｃｉｆｉｃ ｂｌｕｅ（ＰＢ）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、クローン＃ＳＰ３４－２）等の市販の蛍光標識済み抗ＣＤ３抗体で標識した抗ＣＤ３抗体）と、第２の蛍光標識（例えば、抗ＣＤ５６－フィコエリスリン（ＰＥ）－Ｃｙ７（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、クローン＃ＮＣＡＭ１６．２）等の市販の蛍光標識済み抗ＣＤ５６抗体で標識した抗ＣＤ５６抗体）との結合を使用して、増殖させ濃縮されたＳＣＫＴＣ集団でのＣＤ３及びＣＤ５６の発現を決定することができ、その場合、抗体の結合をフローサイトメトリーで、例えば、ＰＢ蛍光またはＰＥ蛍光について測定し、ゲートは、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞に基づいて設定する。
いくつかの実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団は、Ｉ型ＮＫＴマーカーを発現する細胞の亜集団を含む。いくつかのそのような実施形態によれば、１型ＮＫＴマーカーを発現する細胞の亜集団は、ＴＣＲ Ｖαマーカー及びＴＣＲ Ｖβマーカーの存在によって決定され得る。いくつかの実施形態によれば、第１の蛍光標識（例えば、抗ＴＣＲ Ｖα－ＰＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、クローン＃Ｃ１５）等の市販の蛍光標識済み抗ＴＣＲ Ｖα抗体）で標識した抗ＴＣＲ Ｖα抗体と、第２の蛍光標識（例えば、抗ＴＣＲ Ｖβ－フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、クローン＃Ｃ２１）等の市販の蛍光標識済み抗ＴＣＲ Ｖβ抗体）で標識した抗ＴＣＲ Ｖβ抗体との結合を使用して、細胞集団におけるＶα及びＶβの発現を決定することができ、その場合、抗体の結合をフローサイトメトリーで、例えば、ＰＥ蛍光またはＦＩＴＣ蛍光について測定し、ゲートは、Ｖα＋Ｖβ＋細胞に基づいて設定する。
いくつかの実施形態によれば、Ｉ型ＮＫＴ細胞マーカーを発現する細胞の亜集団は、マーカーＣＤ３＋Ｖα２４＋の発現を特徴とする細胞を含むことができる。いくつかの実施形態によれば、１型ＮＫＴ細胞マーカーを発現する細胞の亜集団は、マーカーＣＤ３＋Ｖα２４－の発現を特徴とする細胞を含む。いくつかの実施形態によれば、１型ＮＫＴ細胞マーカーを発現する細胞の亜集団には、マーカーＣＤ３＋ＣＤ５６＋を特徴とする細胞が含まれる。いくつかの実施形態によれば、１型ＮＫＴ細胞マーカーを発現する細胞の亜集団には、マーカーＣＤ３＋Ｖα２４＋、ＣＤ３＋Ｖα２４－、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋及びそれらの混合の発現を特徴とする細胞が含まれる。
細胞傷害活性
細胞傷害活性は、当業者に公知の任意の好適な手法により評価され得る。例えば、本明細書に記載されるＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団を含有する細胞製品を含む医薬組成物は、標準的細胞傷害性アッセイで適切な期間における細胞傷害活性についてアッセイすることができる。そのようなアッセイとしては、当該技術分野で公知のクロム放出ＣＴＬアッセイ及びＡＬＡＭＡＲ ＢＬＵＥ蛍光アッセイが挙げられ得るが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態によれば、エフェクターＴ細胞集団の試料を遠心分離により回収し、標的Ｋ５６２細胞（慢性骨髄性白血病患者に由来する、未分化性の高い顆粒球系）に対する試料の細胞傷害性を評価する。慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）患者に由来し、Ｂ３Ａ２ ｂｃｒ－ａｂｌハイブリッド遺伝子を発現するＫ５６２細胞株は、アポトーシス死に特に抵抗性であることが知られている。（Ｌｕｃｈｅｔｔｉ，Ｆ．ｅｔ ａｌ，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ（１９９８）８３：９７４－９８０）。一実施形態によれば、Ｋ５６２標的細胞及び記載されている本発明の方法に従って調製されるエフェクターＳＣＫＴＣの複製試料は、１つ以上の、エフェクター：標的比、例えば、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１または２０：１にてウェルに割り付けられる。インキュベーション後、酵素結合免疫吸着測定法のリーダーにより吸光度を検出し、殺傷率を算出することができる。他の実施形態によれば、同じアッセイを行うことができ、その場合、Ｊｕｒｋａｔ細胞（急性Ｔ白血病）に対する細胞傷害性を評価する（Ｓｏｍａｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ １０（１０）：ｅ０１４１０７４．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１４１０７４）。
いくつかの実施形態によれば、殺傷率は、以下の式により表すことができる。
Figure 2022520302000005
いくつかの実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団の殺傷率は、約２５％～約７５％の両端を含めた範囲である。いくつかの実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団の殺傷率は、約５０％～約７５％の両端を含めた範囲である。いくつかの実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団の殺傷率は、約２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、または７５％である。
いくつかの実施形態によれば、記載されている本発明の方法により調製されるＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団の殺傷率は、対照ＣＫＴＣに対し少なくとも１．５倍増大する（例えば、ステップ（ｃ）～（ｅ）に記載される特定の方法の対象とならない細胞）。いくつかの実施形態によれば、本発明の方法により調製されるＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団の殺傷率は、対照ＣＴＫＣに対し少なくとも２倍増大する（例えば、ステップ（ｃ）～（ｅ）に記載される特定の方法の対象とならない細胞）。いくつかの実施形態によれば、本発明の方法により調製されるＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団の殺傷率は、対照ＣＴＫＣに対し少なくとも３倍増大する（例えば、ステップ（ｃ）～（ｅ）に記載される特定の方法の対象とならない細胞）。いくつかの実施形態によれば、本発明の方法により調製されるＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団の殺傷率は、対照ＣＫＴＣに対し少なくとも３．５倍増大する（例えば、ステップ（ｃ）～（ｅ）に記載される特定の方法の対象とならない細胞）。いくつかの実施形態によれば、本発明の方法により調製されるＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団の殺傷率は、対照ＣＫＴＣに対し少なくとも４倍増大する（例えば、ステップ（ｃ）～（ｅ）に記載される特定の方法の対象とならない細胞）。いくつかの実施形態によれば、本発明の方法により調製されるＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団の殺傷率は、対照ＣＫＴＣに対し少なくとも４．５倍増大する（例えば、ステップ（ｃ）～（ｅ）に記載される特定の方法の対象とならない細胞）。いくつかの実施形態によれば、本発明の方法により調製されるＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団の殺傷率は、対照ＣＫＴＣに対し少なくとも５倍増大する（例えば、ステップ（ｃ）～（ｅ）に記載される特定の方法の対象とならない細胞）。
いくつかの実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団は、少なくとも１０００のＩＦＮガンマ：ＩＬ４比、対照細胞に対し少なくとも１．５倍の殺傷率増大、または両方を特徴とする。
非経口投与に好適な医薬組成物の製剤は、滅菌水または滅菌等張生理食塩水等の薬学的に許容される担体と組み合わせて活性成分を含む。例示的担体溶液はまた、緩衝剤、希釈剤及び他の好適な添加物を含有することができる。本明細書で使用される用語「緩衝液」とは、その化学組成がｐＨを大幅に変化させずに酸または塩基を中和する溶液または液体を指す。記載の発明で想定される緩衝液の例には、限定することなく、ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、リンゲル液、５％デキストロース含有水（Ｄ５Ｗ）、通常／生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）が含まれる。いくつかの実施形態では、注入溶液は対象の組織と等張である。
記載の発明の例示的医薬組成物は、無毒の非経口的に許容される希釈剤または溶媒への細胞の懸濁液または分散液を含み得る。溶液は一般に、２つ以上の物質の均一な混合物と見なされ、必ずというわけではないが、多くの場合は液体である。溶液中、溶質分子（または溶解物質）は、溶媒の分子の間で均一に分布している。分散液は二相系であり、一相（例えば、粒子）は第２相または連続相に分布している。懸濁液は、細粒化された種が別の種と合わせられた分散液であり、前者は非常に細粒化されて混合されているため急速には沈降しない。許容できるビヒクル及び溶媒のうち、使用され得るものは、水、リンゲル液、及び等張塩化ナトリウム（生理食塩水）溶液である。
本発明の追加の組成物は、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｏｒ １９ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎｓ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ ｏｆ Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．に記載のような、当該技術分野で公知の技術を使用して容易に調製することができる。
医薬組成物の製剤は、ボーラス投与または連続投与に好適な形態で調製、包装、または販売され得る。注射用製剤は、アンプル、または保存剤を含有する複数回用量容器のような単位剤形で、調製、包装、または販売され得る。非経口投与用製剤としては、懸濁液、溶液、油性もしくは水性のビヒクルへのエマルジョン、ペースト、及び埋め込み型徐放性製剤または生分解性製剤が挙げられるが、これらに限定されない。そのような製剤はさらに、懸濁剤、安定化剤、または分散剤が含まれるがこれらに限定されない、１つ以上の追加成分を含み得る。
本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、公知であるかまたは今後薬理学技術分野で開発される任意の方法により調製され得る。一般に、そのような調製方法としては、活性成分を担体または１つ以上の他の副成分と会合させるステップ、及び、必要または所望に応じ、その後に製品を所望の単回単位または多回投与単位に成形または包装することが含まれる。
本明細書で提供される医薬組成物は、主に、医療としてのヒトへの投与に好適な医薬組成物を対象とするが、そのような組成物は一般に、あらゆる種類の動物への投与に好適であることは当業者には理解されるであろう。組成物が様々な動物への投与に好適になるようにするための、ヒトへの投与に好適な医薬組成物の変更は十分に理解されており、通常の技量を有する獣医薬理学者は、そのような変更を、実験を用いるとしても通常の実験だけで設計及び実施することができる。
開示の方法で有用な医薬組成物は、経口、直腸、膣、非経口、局所、肺、鼻腔内、病変内、口腔、眼、静脈内、器官内、または別の投与経路に好適な製剤で調製／製剤化、包装、または販売され得る。他の意図される製剤には、推定されるナノ粒子、リポソーム製剤、活性成分を含有する再密封赤血球、及び免疫学的製剤が含まれる。
いくつかの実施形態によれば、記載の発明の医薬組成物は、最初に投与され、その後、さらなる投与で維持され得る。例えば、いくつかの実施形態によれば、記載の発明の医薬組成物は、ある注射方法で投与され、その後、同じかまたは異なる方法でさらに投与され得る。
開示の医薬組成物は、単一単位用量として、または複数の単一単位用量として、バルクで調製、包装、または販売され得る。本明細書で使用される場合、「単位用量」は、所定量の活性成分、すなわち、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団を含む細胞製品を含む医薬組成物の個々の量である。活性成分の量は一般に、対象に投与される活性成分の投与量と等しいか、またはそのような投与量の好都合な量、例えば、そのような投与量の２分の１または３分の１である。
開示の医薬組成物における活性成分、薬学的に許容される担体、及び任意の追加成分の相対的な量は、治療される対象の同一性、体格、及び状態によって異なり、さらに、組成物が投与されるべき経路によって異なる。例として、組成物は、０．１％～１００％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
いくつかの実施形態によれば、活性成分に加え、開示の医薬組成物はさらに、１つ以上の追加の薬学的活性物質、例えば、数ある中でも特に、サイトカイン、化学療法薬、チェックポイント阻害剤及び／または抗ウイルス薬を含み得る。
いくつかの実施形態によれば、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団を含む細胞製品に、製造後、タンパク質安定化剤、例えば、安定化剤として作用し得るアルブミンを加えることができる。いくつかの実施形態によれば、アルブミンはヒトアルブミンである。いくつかの実施形態によれば、アルブミンは組換え型ヒトアルブミンである。いくつかの実施形態によれば、製剤で使用されるアルブミンの最小量は、約０．５％～約２５ｗ／ｗ％、すなわち、約０．５ｗ／ｗ％、約１．０ｗ／ｗ％、約２．０ｗ／ｗ％、約３ｗ／ｗ％、約４ｗ／ｗ％、約５ｗ／ｗ％、約６ｗ／ｗ％、約７ｗ／ｗ％、約８ｗ／ｗ％、約９ｗ／ｗ％、約１０ｗ／ｗ％、約１１ｗ／ｗ％、約１２ｗ／ｗ％、約１３ｗ／ｗ％、約１４ｗ／ｗ％、約１５ｗ／ｗ％、約１６ｗ／ｗ％、約１７ｗ／ｗ％、約１８ｗ／ｗ％、約１９ｗ／ｗ％、約２０ｗ／ｗ％、約２１ｗ／ｗ％、約２２ｗ／ｗ％、約２３ｗ／ｗ％、約２４ｗ／ｗ％、約２５ｗ／ｗ％であり得、約１２．５ｗ／ｗ％等の中間値が含まれる。
いくつかの実施形態によれば、医薬組成物は、安定化量の血清を含む。本明細書で使用される用語「安定化量」とは、濃縮されたＳＣＫＴＣを含む記載の発明の医薬組成物の製剤中に含めた場合に、これらの細胞がそのＴ細胞エフェクター活性を保持できるようにする血清の量を指す。いくつかの実施形態によれば、血清は、ヒト患者にとって自己のヒト血清である。いくつかの実施形態によれば、血清は、合成血清である。いくつかの実施形態によれば、血清の安定化量は、少なくとも約１０％（ｖ／ｖ）である。
いくつかの実施形態によれば、本発明の方法は、薬学的に許容される添加剤、特に、本明細書に記載される添加剤、例えば、希釈剤、安定化剤及び／または保存剤を加えることにより医薬組成物を調製するさらなるステップを含む。
本明細書で使用される場合、用語「添加剤」は、生物学的または生理学的機能を有していない、ＳＣＫＴＣ集団に加えられるすべての成分を包含する総称であり、それらは無毒であり、かつ他の構成要素と相互作用しない。
医薬組成物の最終製剤は、調製された後、好適な容器、例えば、輸液バッグまたはクリオバイアルに充填される。
いくつかの実施形態によれば、本開示による方法は、ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団を含有する細胞製品を含む医薬組成物、またはその医薬製剤を、輸液バッグ等の好適な容器に充填するステップ、及びそれを、細胞製品を形成するために密封するステップという、さらなるステップを含む。
いくつかの実施形態によれば、本開示のＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団を含む細胞製品を含む医薬組成物が充填された容器を含む製品は、保管及び輸送用に、例えば液体窒素の気相で、例えば約－１３５℃にて凍結される。いくつかのそのような実施形態によれば、製剤はまた、ＤＭＳＯ等の凍結保存剤を含有し得る。ＤＭＳＯの量は一般に、約２０ｖ／ｖ％以下、例えば、約１０ｖ／ｖ％、１１ｖ／ｖ％、１２ｖ／ｖ％、１３ｖ／ｖ％、１４ｖ／ｖ％、１５ｖ／ｖ％、１６ｖ／ｖ％、１７ｖ／ｖ％、１８ｖ／ｖ％、１９ｖ／ｖ％、または２０ｖ／ｖ％である。
いくつかの実施形態によれば、本開示の工程は、医薬組成物、または本開示のＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団を含む細胞製品を凍結するさらなるステップを含む。一実施形態によれば、凍結は、制御された速度の凍結方法により、例えば、形成される結晶が小さく、細胞構造を破壊しないことを保証するため、温度を１分間に１℃ずつ下げることにより行われる。この方法は、試料が約－１００℃に達するまで継続され得る。
開示の医薬組成物の制御放出製剤または徐放性製剤は、他の従来の技術を適応させて作られ得る。本明細書で使用される用語「薬物放出制御｜制御放出」は、製剤からの薬物放出の様態及びプロファイルが制御される任意の薬物含有製剤を指すことが意図される。これには、即放性製剤及び非即放性製剤が含まれ、非即放性製剤としては、徐放性及び遅延放出型の製剤が含まれるが、これらに限定されない。用語「徐放性」（「拡張型放出」とも呼ばれる）は、本明細書ではその従来の意味で使用され、長期間にわたる薬物の段階的放出を提供し、好ましくは、必ずというわけではないが、長期間にわたる実質的に一定レベルの薬物をもたらす製剤を指す。用語「遅延放出型」は、本明細書ではその従来の意味で使用され、製剤の投与と、製剤からの薬物の放出との間に時間遅延がある製剤を指す。「遅延放出型」は、薬物の長期にわたる段階的放出を伴っても伴わなくてもよく、したがって、「徐放性」である場合とそうでない場合がある。本明細書で使用される場合、用語「長期」放出は、製剤が、治療的レベルの活性成分を長期、例えば、数日にわたり送達するよう構築及び構成されていることを意味する。
医薬組成物は、無菌注射用の水性もしくは油性懸濁液または溶液の形態で調製、包装、または販売され得る。この懸濁液または溶液は、公知の技術に従って製剤化され得、活性成分に加え、本明細書に記載される分散剤、湿潤剤、または懸濁剤等の追加の成分を含み得る。そのような無菌注射用製剤は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒、例えば、水または１，３－ブタンジオール等を使用して調製され得る。他の許容される希釈剤及び溶媒としては、リンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液、及び合成モノグリセリドまたはジグリセリド等の不揮発性油が挙げられるが、これらに限定されない。非経口的に投与が可能な他の製剤には、活性成分を、微結晶形態で含むもの、リポソーム製剤に含むもの、または生分解性ポリマー系の成分として含むものが含まれ得る。徐放性または植え込みのための組成物は、エマルジョン、イオン交換樹脂、やや不溶性のポリマー、またはやや不溶性の塩等の薬学的に許容される高分子または疎水性の材料を含み得る。非経口適用では、好適なビヒクルは、溶液、例えば、油性溶液もしくは水溶液、及び懸濁液、エマルジョン、またはインプラントからなる。水性懸濁液は、懸濁液の粘度を増大させる物質を含有し得、それらには、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／またはデキストランが含まれる。
いくつかの実施形態によれば、本開示は、本開示によるＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団を含む細胞製品を、製造場所または好都合な集荷場所から治療施設まで輸送する方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、そのような輸送中、細胞製品の温度は維持される。いくつかの実施形態によれば、例えば、医薬組成物は、運送中、０℃未満、例えば、－１３５℃で保管することができる。いくつかの実施形態によれば、医薬組成物の温度変動は、保管及び／または輸送の間モニターされる。
本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示のみを目的として提供されており、それぞれ参照によりその全体が組み込まれる。本明細書のいかなる記載も、記載の発明が先行発明を理由としてそのような刊行物に先行する権利がないことを承認するものと解釈すべきではない。さらに、記載の刊行日は実際の刊行日と異なる可能性があり、実際の刊行日を個別に確認する必要がある可能性がある。
本明細書に記載される本発明の多くの変更及び他の実施形態は、前述の説明及び関連図面に記載されている教示の利益を有する、これらの発明が関する技術分野の当業者により容易に想定される。したがって、本発明は、開示されている具体的な実施形態に限定されないこと、ならびに、変更及び他の実施形態は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されると理解されるべきである。本明細書では具体的な用語が使用されているが、それらは、包括的かつ説明的な意味でのみ使用され、制限を目的としていない。
以下の例は、本発明の作製及び使用方法についての完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示するものであり、発明者らが自身の発明であると見なす範囲を限定することも、また、下記実験が、実施したすべてまたは唯一の実験であると表すことも意図しない。使用する数字（例えば、量、温度等）に関し、正確さを保証するべく試みがなされたが、実験上の一部の誤差及び偏差を考慮するべきである。特に指定しない限り、部は重量部、分子量は重量平均分子量、温度はセ氏温度、及び圧力は大気圧または大気圧近傍圧である。
実施例１．末梢血からの単核球（ＭＣ）の分離
以下の手順では、ヒト対象の血液、より具体的には末梢血からのＭＣの分離を記載する。
１．３０ｍｌ～５０ｍｌのヘパリン抗凝固処理済みヒト末梢血を取得し、遠沈管に入れた。末梢血を生理食塩水で１：１の割合で希釈し、均一になるまで混合した。
２．新たな５０ｍＬ遠沈管に１５ｍｌのリンパ球分離溶液（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ）を充填した。その後、均一に希釈した血液を、フィコール：希釈血液比を１：２にして管壁に沿って加えることによりリンパ球分離溶液上にゆっくりと層状に乗せ、層間に透明な層を形成させ、混合物を３０００ｒｐｍで３０分間、遠心分離した。
３．遠心分離完了後、血漿とＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ間の層の界面の単核球を回収し、新たな５０ｍｌ遠沈管に入れ、３０ｍｌのＸ－ＶＩＶＯ－１５培地ですすぎ、８００ｇで５分間、遠心分離した。その後、上清を除去した。
４．混合物を２０ｍｌのＸ－ＶＩＶＯ－１５培地に加え、ピペット操作で均一に混合し、室温下、２００ｇで１０分間遠心分離した後、上清を除去した。細胞を１０ｍｌのＸ－ＶＩＶＯ－１５培地に再懸濁させ、計数した。
実施例２．末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の樹状細胞（ＤＣ）への分化誘導
以下の手順では、ＰＢＭＣの樹状細胞への分化の誘導のための工程を記載する。
１．ＰＢＭＣの濃度を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ １６４０培地で１×１０6細胞／ｍｌに調整し、細胞をＴ２５培養びんに播種し、５％のＣＯ2、３７℃で１時間静置培養した。
２．非接着細胞を含有する上清を培養びんから除去した。残りの細胞を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ １６４０培地で２回ですすぎ、その後、サイトカインＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４をそれぞれ、５００Ｕ／ｍｌ及び５０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した、１０％ＦＢＳを含有する５ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培地に移した。
３．４日目、培養系に、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－４を前記作業濃度（５０ｎｇ／ｍｌ）で含有する３ｍｌの培地を添加した。
４．６日目、アルファ－ＧａｌＣｅｒを、作業濃度が１００ｎｇ／ｍｌになるまで培養系に加えた。このステップを実施して樹状細胞にアルファ－ＧａｌＣｅｒを担持させた。
５．７日目、アルファ－ＧａｌＣｅｒを担持している樹状細胞を回収した。
実施例３．殺傷活性の高いサイトカインキラーＴ細胞（ＣＫＴＣ）のインビトロ増幅（増殖の意）
以下の手順では、高い殺傷活性を有する超活性化ＣＫＴＣを形成させる、サイトカインキラーＴ細胞（ＣＫＴＣ）のインビトロ増幅のための工程を記載する。
１．ＰＢＭＣの濃度をＸ－ＶＩＶＯ－１５培地で３×１０6細胞／ｍｌに調整した。アルファ－ＧａｌＣｅｒを、作業濃度が１００ｎｇ／ｍｌになるまで培養系に加え、細胞を６ウェルプレートに播種した。
２．３日目、培養系の培地を交換し、アルファ－ＧａｌＣｅｒを作業濃度が１００ｎｇ／ｍｌになるまで加えた。
３．７日目、実施例２で得た、アルファ－ＧａｌＣｅｒを担持している樹状細胞（約１×１０5細胞）を、ＣＫＴＣの集団を含む培養系に加え、以下の刺激因子を以下の作業濃度で加えた：１００ｎｇ／ｍｌのアルファ－ＧａｌＣｅｒ、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２及び２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７。樹状細胞への分化を誘導するために、ＰＢＭＣの管を回収し、実施例２に記載のように同じ方法でＣＫＴＣの二次刺激に供した。
４．１０日目、培養系の培地を補充し、アルファ－ＧａｌＣｅｒ、ＩＬ－２及びＩＬ－７を、それぞれの作業濃度になるまで加えた（１００ｎｇ／ｍｌのアルファ－ＧａｌＣｅｒ、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２及び２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７）。
５．１４日目、アルファ－ＧａｌＣｅｒを担持している樹状細胞をＣＫＴＣ細胞培養系に再び加え、刺激因子アルファ－ＧａｌＣｅｒ、ＩＬ－２及びＩＬ－７をそれぞれの作業濃度になるまで添加し、ＩＬ－１５を培養系に２０ｎｇ／ｍｌまで加えた。
６．１７日目、培養系の培地を補充し、アルファ－ＧａｌＣｅｒ、ＩＬ－２、ＩＬ－７及びＩＬ－１５を、それぞれの作業濃度になるまで加えた（１００ｎｇ／ｍｌのアルファ－ＧａｌＣｅｒ、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２及び２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７）。
７．２０日目、培養系の培地を補充し、アルファ－ＧａｌＣｅｒ、ＩＬ－２、ＩＬ－７及びＩＬ－１５を、それぞれの作業濃度になるまで加え（１００ｎｇ／ｍｌのアルファ－ＧａｌＣｅｒ、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２及び２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７）、ＩＬ－１２を作業濃度が２０ｎｇ／ｍｌになるまで加えた。
８．２１日目、細胞を回収した。１００μｌの増殖させた超活性化ＣＴＫＣ細胞製品を除去し、以下の蛍光抗体に移した：抗ＴＣＲ Ｖα－ＰＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、クローン＃Ｃ１５）、抗ＴＣＲ Ｖβ－ＦＩＴＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、クローン＃Ｃ２１）、抗ＣＤ３－ＰＢ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、クローン＃ＳＰ３４－２）、抗ＣＤ５６－ＰＥ－Ｃｙ７（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、クローン＃ＮＣＡＭ１６．２）。４℃で３０分間のインキュベーション後、標的とする、１型ＮＫＴ細胞マーカーを発現している増殖させた超活性化ＣＫＴＣの割合を、リンパ球が無傷なリンパ球集団をビットマップに表す前方散乱光（ＦＳ：Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ）対９０°散乱光（Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒ）を使用するフローサイトメトリーで測定した。このビットマップにゲーティング（長方形）し、ＣＤ５６対ＣＤ３を測定した。ダブルポジティブにゲーティングし、Ｖα２４対Ｖβ１１を測定した。図１に示されるように、増殖させた超活性化ＣＫＴＣ産物は、ＮＫＴマーカーＣＤ３＋ＣＤ５６＋を発現する細胞集団を含み、最高５６．８％の細胞が１型ＮＫＴマーカーを発現する。
以上をまとめると、ＳＣＫＴＣの集団の約９０％はＣＤ３＋Ｔ細胞を含み、ＳＣＫＴＣの集団の約５０％は１型ＮＫＴ細胞を含む（データ図示せず）。
実施例４．サイトカインＩＬ－２及びＩＬ－７の添加時間のＣＫＴＣ増幅／増殖に対する影響
同一培養条件下（３７℃、５％のＣＯ2濃度）、ＩＬ－２、ＩＬ－７、またはＩＬ－２とＩＬ－７の両方が、異なる工程Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤで培養されたＣＫＴＣに与える影響を検討し、その際、アルファ－ＧａｌＣｅｒは、培養開始時に加えられ、培養完了まで維持された。群Ａでは、ＩＬ－２を培養開始時に同時に加え、群Ｂでは、ＩＬ－２及びＩＬ－７を培養開始時に同時に加え、群Ｃでは、ＩＬ－２及びＩＬ－７を３日目に加え、群Ｄでは、ＩＬ－２及びＩＬ－７を７日目に加えた。
２１日目、工程Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤにより増殖させた１００μｌのＣＫＴＣを除去し、以下の蛍光抗体でそれぞれインキュベートした：ＴＣＲ Ｖα－ＰＥ及びＴＣＲ Ｖβ－ＦＩＴＣ。４℃で３０分間のインキュベーション後、標的細胞の割合を、リンパ球が無傷なリンパ球集団をビットマップに表す前方散乱光（ＦＳ：Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ）対９０°散乱光（Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒ）を使用するフローサイトメトリーで測定した。このビットマップにゲーティング（長方形）し、ＣＤ５６対ＣＤ３を測定した。ダブルポジティブにゲーティングし、Ｖα２４対Ｖβ１１を測定した。図２に示されるように、群Ａから群ＤのＣＫＴＣにおけるＩ型ＮＫＴ細胞マーカーを発現するＣＫＴＣ細胞の割合は徐々に増大した。結果から、７日目のサイトカインＩＬ－２及びＩＬ－７の添加は、Ｉ型ＮＫＴ細胞マーカーを発現するＣＫＴＣ細胞の選択的増殖を引き起こすことができること、及び、ＣＫＴＣ細胞の増殖させた集団におけるこの細胞集団の純度が顕著に改善したことが示された。
実施例５．サイトカインＩＬ－１５の添加時間の増殖ＣＫＴＣの割合に対する影響
同一培養条件下（３７℃、５％のＣＯ2濃度）、ＩＬ－１５が、異なる工程Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤで培養されたＣＫＴＣに与える影響を検討し、その際、アルファ－ＧａｌＣｅｒを培養開始時に加え、ＩＬ－２及びＩＬ－７を７日目に加え、培養完了までそのままにした。群Ａでは、ＩＬ－１５は加えず、群Ｂでは、ＩＬ－１５を培養開始時に同時に加え、群Ｃでは、ＩＬ－１５を７日目に加え、群Ｄでは、ＩＬ－１５を１４日目に加えた。
２１日目、工程Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤにより増殖させた１００μｌのＣＫＴＣ集団を除去し、以下の蛍光抗体でそれぞれインキュベートした：抗ＴＣＲ Ｖα－ＰＥ、抗ＴＣＲ Ｖβ－ＦＩＴＣ、抗ＣＤ３－ＰＢ及び抗ＣＤ５６－ＰＥ－Ｃｙ７。４℃で３０分間のインキュベーション後、各群において１型ＮＫＴ細胞マーカーを発現しているＣＫＴＣ細胞の割合を、リンパ球が無傷なリンパ球集団をビットマップに表す前方散乱光（ＦＳ：Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ）対９０°散乱光（Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒ）を使用するフローサイトメトリーで測定した。このビットマップにゲーティング（長方形）し、ＣＤ５６対ＣＤ３を測定した。ダブルポジティブにゲーティングし、Ｖα２４対Ｖβ１１を測定した。図３に示されるように、群ＤのＣＫＴＣ集団においてＩ型ＮＫＴ細胞マーカーを発現する細胞の割合は、他の３群で１型ＮＫＴ細胞マーカーを発現している細胞の割合よりも優れている。
実施例６．サイトカインＩＬ－１５の添加時間の、ＣＴＫＣ細胞の増幅／増殖集団のサイトカイン分泌能に対する影響
増殖ＣＴＫＣ細胞集団のエフェクター機能を評価するための指標として、増殖ＣＴＫＣ細胞集団の上清中のＩＦＮ－γとＩＬ－４の比を使用した。
ＣＢＡ（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ）を使用して、実施例５の培養上清４群それぞれにおけるＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比を測定し、それにより、ＮＫＴマーカーを発現する増殖ＣＫＴＣがエフェクターサイトカインを分泌する能力を評価した。結果を表２に示す。
表２．サイトカインＩＬ－１５の添加時間の、ＮＫＴマーカーを発現する増幅ＣＫＴＣ集団のサイトカイン分泌能に対する影響
Figure 2022520302000006
結果は、培養１４日目でのＩＬ－１５の添加（群Ｄ）では、増殖させたＣＴＫＣ集団の上清中のＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比が顕著に増加し、増殖させたＣＴＫＣ集団がエフェクターサイトカインを分泌する能力が対照群と比較して改善されていることを示している。
実施例７．サイトカインＩＬ－１５の添加時間の、増殖させたＣＴＫＣ集団の殺傷能に対する影響
乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）は安定な細胞質酵素であり、これは、細胞の溶解時に細胞外環境へ放出され得、基質でテトラゾリウム塩（ＩＮＴ）を触媒して赤色生成物を生成させ、その量は細胞溶解物の量と比例する。本実施例では、殺傷系でのＩＮＴ量を測定することにより、増殖させたＣＴＫＣ集団が標的細胞を殺傷する活性を評価した。測定には、ＬＤＨキット（＃ＣＫ１２、ＤＯＪＩＮＤＯ）を製造者またはサプライヤーから提供された指示書に従って使用した。
Ｋ５６２標的細胞を取得して遠心分離し、標的細胞の密度を１×１０5細胞／ｍＬに調整した。上記工程Ａ及びＤで培養されたＣＴＫＣエフェクター細胞の増殖及び活性化させた集団を遠心分離により回収し、エフェクター：標的の比を５：１、１０：１及び２０：１に調整した。各群について、二連でウェルを作製した。３７℃、５％のＣＯ2での４時間のインキュベーション、及び沈殿物の十分な溶解に続き、酵素結合免疫吸着測定法のリーダーにより吸光度を検出し、殺傷率を算出した。殺傷率は、以下の式を使用して決定される：殺傷率（％）＝（ＯＤ４９０実験ウェル－ＯＤ４９０陰性ウェル）／（ＯＤ４９０陽性ウェル－ＯＤ４９０陰性ウェル）×１００％。結果を表３に示す。
表３．サイトカインＩＬ－１５の、増殖、活性化させたＣＫＴＣの殺傷能に対する影響
Figure 2022520302000007
結果から、培養１４日目でのＩＬ－１５の添加（群Ｄ）では、増殖させ活性化させたＣＫＴＣ集団の殺傷能が顕著に改善されたことが示された。
実施例８．サイトカインＩＬ－１２の添加時間の、増殖させたＣＫＴＣ集団におけるＩ型ＮＫＴ細胞マーカー発現ＣＫＴＣの割合に対する影響
同一培養条件下（３７℃、５％のＣＯ2濃度）、群Ａ、群Ｂ、群Ｃ及び群Ｄの異なる工程により培養されたＣＫＴＣのエフェクター機能を検討し、その際、アルファ－ＧａｌＣｅｒを培養開始時に加え、ＩＬ－２及びＩＬ－７を７日目に加え、ＩＬ－１５を１４日目に加え、培養完了までそのままにした。群Ａでは、ＩＬ－１２は加えず、群Ｂでは、ＩＬ－１２を培養開始時に同時に加え、群Ｃでは、ＩＬ－１２を７日目に加え、群Ｄでは、ＩＬ－１２を２０日目に加えた。
２１日目、工程Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤにより増殖させた１００μｌのＣＫＴＣ集団を除去し、以下の蛍光抗体にそれぞれ加えた：ＴＣＲ Ｖα－ＰＥ及びＴＣＲ Ｖβ－ＦＩＴＣ。４℃で３０分間のインキュベーション後、細胞生成物中の標的細胞の割合を、リンパ球が無傷なリンパ球集団をビットマップに表す前方散乱光（ＦＳ：Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ）対９０°散乱光（Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒ）を使用するフローサイトメトリーで測定した。このビットマップにゲーティング（長方形）し、ＣＤ５６対ＣＤ３を測定した。ダブルポジティブにゲーティングし、Ｖα２４対Ｖβ１１を測定した。図４に示されるように、群ＤのＩ型ＮＫＴマーカーを発現するＣＴＫＣ細胞の割合は、他の３群より優れており、ＩＬ－１２の早期添加は、割合を低下させたようであった。ＩＬ－１２の添加を要する場合は後半の段階で加えてよい。
実施例９．サイトカインＩＬ－１２の添加時間の、増殖させたＣＫＴＣ集団の殺傷能に対する影響
Ｋ５６２標的細胞を取り出し、実施例８での群Ａ及び群Ｄにおける増殖ＣＫＴＣ細胞の殺傷能を測定するために使用した。結果を表４に示す。
表４．サイトカインＩＬ－１２の、増殖させたＣＴＫＣ集団の殺傷能に対する影響
Figure 2022520302000008

結果は、培養２０日目でのＩＬ－１２の添加（群Ｄ）では、増殖させたＣＴＫＣ集団の殺傷能が顕著に改善されたことを示している。
実施例１０．Ａ５４９ヒト非小細胞肺癌細胞に対するインビトロでの細胞傷害性
本明細書に記載される方法に従って産生される、エキソビボで増殖させ活性化させたＣＫＴＣの細胞傷害性を、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）標的に対して特徴付けする。簡単に言えば、上記方法に記載されるようにＣＫＴＣを増殖させ活性化させる。Ａ５４９（ＡＴＣＣ番号 ＣＣＬ－１８５）ＮＳＣＬＣ腫瘍細胞を標準的培養条件に従って培養する。Ａ５４９細胞を回収してＰＢＳに１×１０6細胞／ｍＬで再懸濁させる。生細胞蛍光色素ＣＭＦＤＡ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．）を１μＭの最終濃度にて加え、４℃で１０分間インキュベートした。腫瘍細胞を洗浄し、９６ウェルプレートに約１×１０4細胞／ウェルで播種した。事前に標的細胞が播種されているウェルにＣＫＴＣ細胞を、エフェクターと標的の比を５：１、１０：１または２０：１にして加える。各実験は三連で行われる。エフェクター細胞と標的細胞を２４時間共培養した後、各群の残存細胞を回収し、７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）で標識する。４℃で１０分間のインキュベーション後、標識された標的細胞中の７－ＡＡＤ陽性細胞と総細胞の比をフローサイトメトリーで検出し、エフェクター細胞の標的細胞に対する殺傷を決定する。
本発明をその具体的な実施形態を参照にして記載してきたが、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく様々な変更及び均等物での置き換えを行ってよいことを当業者は理解するべきである。さらに、特定の状況、材料、物質組成、工程、工程ステップ（複数可）を本発明の客観的な趣旨及び範囲に適応させるために、多数の変更を行ってよい。そのような修正はいずれも、本明細書に添付の請求の範囲内であることが意図される。

Claims (64)

  1. 超活性化サイトカインキラーＴ細胞（ＳＣＫＴＣ）の増殖させ濃縮された集団を含有する細胞製品を含む医薬組成物を調製するための方法であって、
    （ａ）サイトカインキラーＴ細胞（ＣＫＴＣ）の集団を含む単核球（ＭＣ）の集団を分離すること、
    （ｂ）任意選択で、（ａ）の調製物を無菌条件下で処理施設に輸送すること、
    （ｃ）前記ＭＣの集団を培養系で培養すること、
    （ｄ）ステップ（ｃ）の培養系を、アルファ－ガラクトシルセラミド（αＧａｌＣｅｒ）、またはその類似体もしくは機能的同等物と接触させること、及びＣＤ１ｄと、αＧａｌＣｅｒまたはその類似体もしくは機能的同等物とを含む細胞の集団と接触させることであって、前記ＣＫＴＣの集団の増殖を刺激するのに十分である、前記触させること、
    （ｅ）ステップ（ｄ）の培養系を、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５及びＩＬ－１２に、ＣＤ１ｄと、αＧａｌＣｅｒまたはその類似体もしくは機能的同等物とを含む細胞の新鮮集団と共に所定の添加順序と添加時間で接触させることであって、前記増殖させたＣＴＫＣの集団の一部の活性化を刺激し、前記ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団を形成させるのに十分である、前記接触させること、及び
    （ｆ）ＳＣＫＴＣ細胞製品を形成するために、前記ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団を前記培養系から回収することであって、
    （ｆ）のＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団を含む前記細胞製品は、（ａ）のＣＫＴＣの集団と比較してエフェクターサイトカイン分泌能改善または細胞傷害性改善のうちの１つ以上を特徴とする、前記回収すること、及び
    （ｇ）前記ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団を含む前記細胞製品を含む医薬組成物を形成するために、（ｆ）のＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団を含む前記細胞製品を薬学的に許容される担体と共に製剤化すること、を順に含む、前記方法。
  2. （ａ）における前記単核球（ＭＣ）供給源は血液である、請求項１に記載の方法。
  3. ステップ（ｅ）と（ｆ）の間に、前記培養物を前記処理施設から治療施設まで輸送することを含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記輸送ステップは、ＩＬ１２添加後約１時間～約２４時間以内に開始される、請求項３に記載の方法。
  5. ステップ（ｃ）は、任意選択で、ステップ（ｄ）を実施する前に、前記ＭＣを再懸濁させること、及び前記ＭＣを約５×１０5細胞／ｍｌ～約３×１０6細胞／ｍｌの範囲の濃度に調節することを含む、請求項１に記載の方法。
  6. ステップ（ｅ）が、ＣＤ１ｄ及びαＧａｌＣｅｒ ｔまたはその類似体もしくは機能的同等物を含む細胞の新鮮集団を前記培養系に加えることを含む、請求項１に記載の方法。
  7. 前記αＧａｌＣｅｒ、またはその類似体もしくは機能的同等物は、ステップ（ｄ）からステップ（ｆ）まで一定濃度で維持される、請求項１に記載の方法。
  8. αＧａｌＣｅｒ、またはその類似体もしくは機能的同等物の濃度は、約５０ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌの間である、請求項７に記載の方法。
  9. ＩＬ－２は、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）まで一定濃度で維持される、請求項１に記載の方法。
  10. ＩＬ－２の濃度は、約１０Ｕ／ｍｌ～約１００Ｕ／ｍｌの範囲である、請求項９に記載の方法。
  11. 前記ＩＬ－７は、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）まで一定濃度で維持される、請求項１に記載の方法。
  12. ＩＬ－７の濃度は、約２０ｎｇ／ｍｌ～２００ｎｇ／ｍｌの範囲である、請求項１１に記載の方法。
  13. ＩＬ－２及びＩＬ－７は、培養の約７日目に加えられる、請求項１に記載の方法。
  14. ＩＬ－１５は、培養の約１４日目に加えられる、請求項１に記載の方法。
  15. 前記ＩＬ－１２は、培養の約２０日目に加えられる、請求項１に記載の方法。
  16. ステップ（ｆ）は、培養の少なくとも約２１日目に行われる、請求項１に記載の方法。
  17. 前記ＩＬ－１５は、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）まで一定濃度で維持される、請求項１に記載の方法。
  18. ＩＬ－１５の濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌの範囲である、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記ＩＬ－１２は、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）まで一定濃度で維持される、請求項１に記載の方法。
  20. ＩＬ－１２の濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌの範囲である、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団による細胞表面マーカーの発現をフローサイトメトリーによって特徴付けるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  22. 前記ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団の亜集団は、ＣＤ３＋Ｖα２４＋Ｖβ１１細胞、ＣＤ３＋Ｖα２４－細胞またはＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞のうちの１つ以上を含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記ＳＣＫＴＣの亜集団はさらにＶβ１１＋細胞を含む、請求項２１に記載の方法。
  24. 前記ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団は、総ＣＫＴＣ集団の約４０％～約６０％を構成する、請求項１に記載の方法。
  25. ＩＬ－２及びＩＬ－７は、前記培養物に同時に加えられる、請求項１に記載の方法。
  26. ＩＬ－２、ＩＬ－７及びＩＬ－１５は、前記培養物に同時に加えられる、請求項１に記載の方法。
  27. ステップ（ｃ）のＭＣの集団は、約５×１０5細胞／ｍｌ～約３×１０6細胞／ｍｌを含む、請求項１に記載の方法。
  28. ＣＤ１及びアルファ－ガラクトシルセラミド（αＧａｌＣｅｒ）を含む前記細胞は、抗原提示細胞である、請求項１に記載の方法。
  29. 前記抗原提示細胞は樹状細胞（ＤＣ）である、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記樹状細胞は、αＧａｌＣｅｒを担持している、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記αＧａｌＣｅｒ担持樹状細胞は前記ＭＣに由来し、かつ接着細胞である、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記αＧａｌＣｅｒ担持樹状細胞は、
    （ａ）単核球（ＭＣ）の集団を分離すること、
    （ｂ）前記ＭＣの集団を培養系で培養すること、
    （ｃ）前記培養系をＩＬ－４及びＧＭ－ＣＳＦと接触させることであって、前記ＭＣの樹状細胞への分化を誘導するのに十分である、前記接触させること、
    （ｄ）前記培養系をαＧａｌＣｅｒと接触させることであって、前記樹状細胞にαＧａｌＣｅｒを担持させるのに十分である、前記接触させること、を含む方法により調製される、請求項３０に記載の方法。
  33. ＩＬ－４の濃度は５００Ｕ／ｍｌである、請求項３２に記載の方法。
  34. ＧＭ－ＣＳＦの濃度は５０ｎｇ／ｍｌである、請求項３２に記載の方法。
  35. ステップ（ｄ）は、ステップ（ｂ）の約５日～約７日後に行われる、請求項３２に記載の方法。
  36. ステップ（ｂ）のＭＣの集団は、約１×１０5細胞／ｍｌ～約５×１０6細胞／ｍｌを含む、請求項３２に記載の方法。
  37. ステップ（ｂ）～（ｄ）は、１０％ウシ胎児血清または１０％自己血清を含有するＲＰＭＩ １６４０培地から選択される培地中で行われる、請求項３２に記載の方法。
  38. 前記培養系の前記培地を２～３日ごとに補充するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  39. 前記ＭＣはヒト対象に由来する、請求項１に記載の方法。
  40. 前記ＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ勾配遠心分離により全血から分離される、請求項２に記載の方法。
  41. ステップ（ｃ）～（ｆ）は、Ｘ－ＶＩＶＯ－１５無血清培地、１０％ウシ胎児血清または１０％自己血清を含有するＲＰＭＩ １６４０培地から選択される培地中で行われる、請求項１に記載の方法。
  42. 薬学的に許容される担体と、請求項１に記載の方法により産生される超活性化サイトカインキラーＴ細胞（ＳＣＫＴＣ）の増強させ濃縮された集団とを含む医薬組成物。
  43. 前記ＳＣＫＴＣの増強及び濃縮された集団は、ＣＤ３＋Ｖα２４＋Ｖβ１１細胞、ＣＤ３＋Ｖα２４－、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞のうちの１つ以上の亜集団を含む、請求項４２に記載の医薬組成物。
  44. 前記亜集団はさらにＶβ１１＋細胞を含む、請求項４３に記載の医薬組成物。
  45. 薬学的に許容される担体と、サイトカインキラーＴ細胞（ＣＫＴＣ）の集団に由来する超活性化サイトカインキラーＴ細胞（ＳＣＫＴＣ）の増殖、活性化させ濃縮された集団を含む細胞製品とを含む医薬組成物であって、前記ＳＣＫＴＣは、未刺激かつ未活性化サイトカインキラーＴ細胞対照集団と比較して、サイトカインの誘導分泌、前記ＳＣＫＴＣの刺激増殖、前記ＳＣＫＴＣの細胞傷害性改善、及び前記ＳＣＫＴＣの表面での１つ以上のマーカーの調節発現、のうちの２つ以上により特徴付けられる、前記医薬組成物。
  46. 発現が調節される前記サイトカインは、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、またはＩＬ－１０及びＩＦＮγからなる群から選択される１つ以上である、請求項４５に記載の医薬組成物。
  47. ＩＬ－４、ＩＬ－５、１Ｌ－６、及びＩＬ－１０からなる群から選択される１つ以上のサイトカインの低発現ならびにＩＦＮγの高発現を含む、請求項４６に記載の医薬組成物。
  48. 前記ＳＣＫＴＣの濃縮された集団によるサイトカイン産生は、ＩＬ－５－、ＩＬ－６－、ＩＬ－１０－、ＩＬ－４ ｌｏｗ、ＩＦＮγ ｈｉｇｈとして特徴付けられる、請求項４６に記載の医薬組成物。
  49. 前記ＳＣＫＴＣ集団により産生されるＩＦＮ－γの量は約５０００ｐｇ／ｍｌ以上である、請求項４８に記載の医薬組成物。
  50. 前記ＳＣＫＴＣ集団により産生されるＩＬ－４の量は５ｐｇ／ｍｌ未満である、請求項４８に記載の医薬組成物。
  51. 培養上清中のＩＦＮγ：ＩＬ－４の比は１０００以上である、請求項４８に記載の医薬組成物。
  52. 前記ＳＣＫＴＣの濃縮された集団による標的細胞の殺傷率は、約２５％～約７５％の両端を含めた範囲である、請求項４５に記載の医薬組成物。
  53. 前記ＳＣＫＴＣ集団の殺傷率は、非増殖かつ非活性化サイトカインキラーＴ細胞の対照細胞の殺傷率より少なくとも１．５倍高い、請求項４５に記載の医薬組成物。
  54. ＩＦＮ－γ：ＩＬ－４の比は少なくとも１０００であり、殺傷率が、非増殖かつ非活性化サイトカインキラーＴ細胞の対照細胞の殺傷率より少なくとも１．５倍高く増加する、請求項４５に記載の医薬組成物。
  55. 前記ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団は、ＮＫＴ細胞マーカーを発現するＳＣＫＴＣの亜集団を含む、請求項４５に記載の医薬組成物。
  56. 前記ＳＣＫＴＣ細胞の増殖させ濃縮された集団は、ＣＤ３＋Ｖα２４＋細胞、ＣＤ３＋Ｖα２４－細胞またはＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞のうちの１つ以上を含む亜集団を含む、請求項５５に記載の医薬組成物。
  57. 前記ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団は、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋であるＳＣＫＴＣの亜集団を含む、請求項５５に記載の医薬組成物。
  58. 前記ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団は、１型ＮＫＴ細胞マーカーを発現するＳＣＫＴＣの亜集団を含む、請求項５５に記載の医薬組成物。
  59. 前記１型ＮＫＴ細胞マーカーは、ＴＣＲ Ｖαマーカー及びＴＣＲ Ｖβマーカーを含む、請求項５８に記載の医薬組成物。
  60. 前記１型ＮＫＴ細胞マーカーを発現するＳＣＫＴＣの亜集団は、ＣＤ３＋Ｖα２４＋、ＣＤ３＋Ｖα２４－、またはＣＤ３＋ＣＤ５６＋のうちの１つ以上のマーカーの発現を特徴とする細胞集団を含む、請求項５８に記載の医薬組成物。
  61. 前記サイトカインキラーＴ細胞（ＣＫＴＣ）の集団に由来するＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団は、総ＣＫＴＣ集団の約４０％～約６０％を構成する、請求項４５に記載の医薬組成物。
  62. 前記医薬組成物は、前記ＳＣＫＴＣの増殖させ濃縮された集団によるそれら自身のＴ細胞エフェクター活性の保持に有効な、安定化量の血清を含む、請求項４５に記載の医薬組成物。
  63. 前記安定化量の血清は少なくとも１０％である、請求項６２に記載の医薬組成物。
  64. 前記血清はヒト血清である、請求項６２に記載の医薬組成物。
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