BR112021009222A2

BR112021009222A2 - composições que contêm uma população expandida e enriquecida de células t exterminadoras de citocina superativadas e métodos para produção das mesmas

Info

Publication number: BR112021009222A2
Application number: BR112021009222-6A
Authority: BR
Inventors: Jian Qing XU; Xiao Yan ZHANG; Jing Wang; Ling Yan ZHU; Beverly W. Lubit
Original assignee: Cn.Usa Biotech Holdings, Inc.; Jian Qing Xu; Xiao Yan Zhang; Jing Wang; Ling Yan Zhu
Priority date: 2018-11-13
Filing date: 2019-11-13
Publication date: 2021-08-10
Also published as: JP2022520302A; EP3880794A1; US20210161955A2; EP3880794A4; CN114641561A; AU2019379140A1; US20200147139A1; WO2020102360A1

Abstract

COMPOSIÇÕES QUE CONTÊM UMA POPULAÇÃO EXPANDIDA E ENRIQUECIDA DE CÉLULAS T EXTERMINADORAS DE CITOCINA SUPERATIVADAS E MÉTODOS PARA PRODUÇÃO DAS MESMAS. A presente invenção refere-se uma composição farmacêutica que compreende um carreador farmaceuticamente aceitável e um produto celular que compreende uma população expandida e enriquecida de células T exterminadoras de citocina superativadas e métodos para a fabricação do produto celular.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “COMPO- SIÇÕES QUE CONTÊM UMA POPULAÇÃO EXPANDIDA E ENRI- QUECIDA DE CÉLULAS T EXTERMINADORAS DE CITOCINA SUPE- RATIVADAS E MÉTODOS PARA PRODUÇÃO DAS MESMAS”.

PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este Pedido reivindica o benefício e a prioridade do Pedido Provisório nº U.S. 62/760.077, depositado em 13 de novembro de 2018, cujo conteúdo está incorporado ao presente documento a título de refe- rência em sua totalidade.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] Os linfócitos são um tipo de glóbulo branco envolvido na re- gulação do sistema imunológico. Os linfócitos são muito mais comuns no sistema linfático e incluem células B, células T, células T extermina- doras e células exterminadoras naturais (NK). Existem duas grandes categorias de linfócitos, a saber, células T e células B. As células T são responsáveis pela imunidade mediada por células, enquanto as células B são responsáveis pela imunidade humoral (relacionada aos anticor- pos). As células T são assim chamadas devido ao fato de que esses linfócitos amadurecem no timo; As células B amadurecem na medula óssea. As células B produzem anticorpos que se ligam a patógenos para permitir sua destruição. As células T CD4 + (auxiliares) coordenam a resposta imunológica. As células T CD8 + (citotóxicas) e as células Ex- terminadoras Naturais (NK) têm a capacidade para exterminar células do corpo que são, por exemplo, infectadas por um vírus ou exibem uma sequência antigênica.

[003] A resposta imunológica aos patógenos invasores exige a ati- vação bem-sucedida da imunidade inata, que informa o desenvolvi- mento da resposta imunológica adaptativa subsequente.

[004] As células T exterminadoras naturais (NKT) são um subcon- junto heterogêneo de células T especializadas (Brennan et al., Nat Rev

Immunol. Fevereiro de 2013; 13(2):101-17). Essas células exibem uma característica inata semelhante à célula de resposta rápida à exposição antigênica em combinação com a precisão da célula adaptativa de re- conhecimento antigênico e diversas respostas efetoras (Salio et al., Annu Rev Immunol. 2014; 32():323-66). Como as células T convencio- nais, as células NKT passam por desenvolvimento e seleção tímica e possuem receptor de células T (TCR) para reconhecer antígenos (Ber- zins et al., Immunol Cell Biol. Junho de 2004; 82(3):269-75).

[005] A diversidade do gene de TCR é gerada pela reorganização dos segmentos de gene V e J durante o desenvolvimento de células T no timo. (Makino, Y., et al (1993) J. Exptl Med. 177: 1399-1408). Os segmentos de gene V e J de TCR, como genes Ig, possuem sinais de recombinação em que sequências de heptâmero e nonâmero, separa- das por um espaçador de 12/23 pb, são flanqueadas pelos segmentos de gene V e J de linhagem germinativa. Id.

[006] As células T exterminadoras naturais (NKT) representam uma pequena população de linfócitos T definida pela expressão de am- bos os receptores de células T αβ (TCR) e alguns marcadores de linha- gem de células NK. No entanto, ao contrário das células T convencio- nais, o TCR expresso por células NKT reconhece antígenos lipídicos apresentados pela molécula CD1d do tipo MHC classe 1 conservada e não polimórfica (Godfrey et al., Nat Immunol. Novembro de 2015; 16(11):1114-23). Além dos TCRs, as células NKT também possuem re- ceptores para citocinas, tais como IL-12, IL-18, IL-25 e IL-23 similares a células inatas, tais como células NK e linfoides inatas (Cohen et al., Nat Immunol. Janeiro de 2013; 14(1):90-9). Esses receptores de citocinas podem ser ativados pela expressão em estado estacionário dessas ci- tocinas inflamatórias, mesmo na ausência de sinais de TCR. Assim, as células NKT podem amalgamar sinais de estímulos mediados por TCR e citocinas inflamatórias para manifestar a liberação imediata de um ar- ranjo de citocinas (Kohlgruber et al., Immunogenetics. Agosto de 2016; 68(8):649-63). Essas citocinas podem, por sua vez, modular diferentes células imunes presentes no microambiente tumoral (TME), influenci- ando assim as respostas imunológicas do hospedeiro ao câncer.

[007] Conforme mostrado na Tabela 1, há uma série de subtipos de células NKT, que podem ser determinados através de seu uso de receptor de células T (TCR), produção de citocinas, expressão de mo- léculas de superfície específicas e reatividade. TABELA 1 Subconjunto de Células NKT Camundongo Ser humano Tipo I TCR Vα14-Jα18; Vβ8.2/7/2 Vα24-Jα18; Vβ11 Subconjuntos CD4+, DN CD4+, CD8+, DN Ligante αGalCer αGalCer Restrição CD1d CD1d Receptores NK NK1.1+/- CD161+/- Tipo II TCR Vα3.2-Jα9 ou Vα8; Vβ8 Diverso Subconjuntos CD4+, DN CD4+, CD8+ Ligante Sulfatida, lisossulfatida, lisofosfatidilcolina Sulfatida, lisossulfatida, lisofosfatidilcolina Restrição CD1d CD1d Receptores NK NK1.1+/- CD161+

CÉLULAS DO TIPO I NKT

[008] Em termos gerais, as células NKT restritas a CD1d podem ser divididas em dois subconjuntos principais com base em sua diversi- dade de TCR e especificidades de antígeno. O subtipo de células NKT mais extensamente caracterizado é o tipo I ou célula T exterminadora natural invariante (células iNKT) (Matsuda et al, Curr Opin Immunol, 20: 358-68, 2008). Células do tipo I NKT (invariantes) (células iNKT), assim chamadas por causa de seu repertório de TCR limitado, expressam uma cadeia α semi-invariante de TCR (iTCR) (Vα14-Jα18 em camundongos, Vα24-Jα18 em seres humanos) emparelhada com um repertório da ca- deia Vβ heterogêneo (Vβ2,7 ou 8.2 em camundongos e Vβ11 em seres humanos) (Brennan et al., Nat Rev Immunol. Fevereiro de 2013;

13(2):101-17; Salio et al., Annu Rev Immunol. 2014; 32():323-66). O an- tígeno prototípico para células do tipo I NKT é galactosilceramida (α- GalCer ou KRN 7000), que foi isolado de uma esponja marinha como parte de uma triagem antitumoral (Kawano et al., Science. 28 de novem- bro de 1997; 278(5343):1626-9). α-GalCer é um ativador potente de cé- lulas do tipo I NKT, induzindo-as a liberar grandes quantidades de inter- feron-γ (IFN-γ), o que ajuda a ativar células T CD8+ e células apresen- tadoras de antígenos (APCs) (Kronenberg, Nat Rev Immunol.

Agosto de 2002; 2(8):557-68). As técnicas primárias usadas para estudar células do tipo I NKT incluem manchamento e identificação de células do tipo I NKT com o uso de tetrâmeros de α-GalCer carregados com CD1d, ad- ministrando-se α-GalCer para ativar e estudar as funções de células do tipo I NKT e, finalmente, com o uso de camundongos com deficiência de CD1d (que não têm NKT do tipo I e do tipo II) ou camundongos com deficiência de Jα18 (que não têm apenas NKT do tipo I) (Berzins et al., Immunol Cell Biol.

Junho de 2004; 82(3):269-75). Foi relatado que ca- mundongos com deficiência de Jα18, além de terem deleção no seg- mento do gene Traj18 (essencial para o desenvolvimento de células do tipo I NKT), também exibiram um repertório de TCR geral mais baixo causado pela influência do transgene nas reorganizações de vários seg- mentos Jα a montante Traj18, complicando as interpretações dos dados obtidos dos camundongos com deficiência de Jα18 (Bedel et al., Nat Immunol. 19 de julho de 2012; 13(8):705-6). Para superar essa desvan- tagem, uma nova cepa de camundongos com deficiência de Jα18 sem células do tipo I NKT, mantendo o repertório geral de TCR, foi gerada para facilitar estudos futuros em células do tipo I NKT (Chandra et al., Nat Immunol.

Agosto de 2015; 16(8):799-80). As células do tipo I NKT podem ser subdivididas com base na expressão em superfície de CD4 e CD8 em subconjuntos CD4 + e CD4-CD8− (duplo-negativo ou DN) e uma pequena fração de células CD8+ encontradas em seres humanos

(Bendelac et al., Science, 25 de março de 1994; 263(5154):1774-8; Lee et al., J Exp Med. 4 de março de 2002; 195(5):637-41). As células do tipo I NKT estão presentes em diferentes tecidos tanto em camundon- gos quanto em seres humanos, mas a uma maior frequência em camun- dongos (Arrenberg et al., J Cell Physiol. Fevereiro de 2009; 218(2):246- 50).

[009] As células do tipo I NKT possuem reatividade dupla para li- pídios próprios e estranhos. Mesmo em estado estacionário, a célula do tipo I NKT tem um fenótipo ativado/de memória (Bendelac et al., Annu Rev Immunol. 2007; 25():297-336; Godfrey et al., Nat Immunol. Março de 2010; 11(3):197-206).

[010] Subconjuntos funcionalmente distintos de células NKT aná- logos aos subconjuntos Th1, Th2, Th17 e TFH de células T convencio- nais foram descritos. Esses subconjuntos expressam as citocinas, fato- res de transcrição e marcadores de superfície correspondentes de suas contrapartes de células T convencionais (Lee et al., Immunity. 15 de se- tembro de 2015; 43(3):566-78). As células do tipo I NKT têm um pro- grama de desenvolvimento exclusivo que é regulado por vários fatores de transcrição (Das et al., Immunol Rev. Novembro de 2010; 238(1):195-215). Transcricionalmente, um dos principais reguladores do desenvolvimento de células do tipo I NKT e do fenótipo de memória ati- vado é o fator de transcrição dedo de zinco da leucemia promielocítica (PLZF). Na verdade, camundongos com deficiência de PLZF apresen- tam profunda deficiência de células do tipo I NKT e produção de citoci- nas (Kovalovsky D, et al., Nat Immunol (2008) 9:1055–

64.10.1038/ni.164; Savage AK et al., Immunity (2008) 29:391–403). Ou- tros fatores de transcrição que são conhecidos por impactar a diferenci- ação de células do tipo I NKT são c-Myc (Dose et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 26 de maio de 2009; 106(21):8641-6), RORγt (Michel et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 16 de dezembro de 2008; 105(50):19845-50), c-

Myb (Hu et al., Nat Immunol. Maio de 2010; 11(5):435-41), Elf-1 (Choi et al., Blood. 10 de fevereiro de 2011; 117(6):1880-7) e Runx1 (Egawa et al., Immunity. Junho de 2005; 22(6):705-16). Além disso, os fatores de transcrição que controlam a diferenciação de células T convencio- nais, tais como o fator de transcrição específico para linhagem Th1 T- bet e o fator de transcrição específico para Th2 GATA-3, também podem afetar o desenvolvimento de células do tipo I NKT (Kim et al., J Immunol. 15 de novembro de 2006; 177(10):6650-9; Townsend et al., Immunity. Abril de 2004; 20(4):477-94). Além dos fatores de transcrição, a trajetó- ria de sinalização da proteína associada a SLAM (SAP) também pode controlar seletivamente a expansão e a diferenciação de células do tipo I NKT (Nichols et al., Nat Med. Março de 2005; 11(3):340-5). As células do tipo I NKT mostraram responder a glicoesfingolipídios (GSL), cera- midas e fosfolipídios próprios e estranhos ligados a α e β (Macho-Fer- nandez et al., Front Immunol. 2015; 6: 362). Foi relatado que as células do tipo I NKT auxiliam principalmente na montagem de uma resposta imunológica eficaz contra tumores (McEwen-Smith et al., Cancer Immu- nol Res. 2015 maio; 3(5):425-35; Robertson et al., Front Immunol. 2014; 5():543; Ambrosino et al., J Immunol. 15 de outubro de 2007; 179(8):5126-36).

CÉLULAS DO TIPO II NKT

[011] As células do tipo II NKT, também chamadas de células NKT diversas ou variantes, são células T restritas a CD1d que expressam TCRs alfa-beta mais diversos e não reconhecem α-GalCer (Cardell et al., J Exp Med. 1 de outubro de 1995; 182(4):993-1004). As células do tipo II NKT são um subconjunto principal em seres humanos, com maior frequência em comparação com as células do tipo I NKT. Devido à au- sência de marcadores específicos e antígenos agonísticos para identifi- car todas as células do tipo NKT II, a caracterização dessas células tem sido um desafio. Diferentes metodologias empregadas para caracterizar as células do tipo II NKT incluem, comparando as respostas imunológi- cas entre camundongos Jα18−/− (faltando apenas tipo I NKT) e CD1d−/− (sem ambos os tipos I e II NKT), usar 24 camundongos trans- gênicos αβ TCR (que superexpressam Vα3.2/Vβ9 TCR de hibridoma de células do tipo II NKT VIII24), usar um modelo de camundongo repórter de IL-4 com deficiência de Jα18, manchar com tetrâmero de CD1d car- regado com antígeno e avaliar a ligação a hibridomas tipo II NKT [revi- sado em Macho-Fernandez, Front Immunol. 2015; 6:362)].

[012] O primeiro principal antígeno identificado para células do tipo II NKT reativas ao autoglicolipídeo em camundongos foi o glicolipídeo sulfatídeo derivado de mielina (Arrenberg et al., J Cell Physiol. Fevereiro de 2009; 218(2):246-50; Jahng et al., J Exp Med. 17 de dezembro de 2001; 194(12):1789-99). Subsequentemente, foram relatadas células do tipo II NKT humanas restritas a CD1d reativas a sulfatídeo e lisossulfa- tídeo ((Shamshiev et al., J. Exp. Med. 2002;195:1013–1021; Blomqvist et al., Eur J Immunol. Julho de 2009; 39(7): 1726–1735.)). As células do tipo II NKT específicas para sulfatídeo exibem predominantemente um repertório de TCR oligoclonal (V α 3/V α 1-J α 7/J α 9 e V β 8.1/V β 3.1- J β 2.7) (Arrenberg et al., J Cell Physiol. Fevereiro de 2009; 218(2):246- 50). Outros autoglicolípidos, tais como β GlcCer e β GalCer, mostraram ativar células do tipo II NKT murinas (Rhost et al., Scand J Immunol. Setembro de 2012; 76(3):246-55; Nair et al., Blood. 19 de fevereiro de 2015; 125(8):1256-71). Foi relatado que os dois principais esfingolipí- dios acumulados na doença de Gaucher (GD), β-glucosilceramida (β GlcCer) e seu produto desacilado glucosilfingosina, são reconhecidos por células do tipo II NKT murinas e humanas (Nair et al., Blood., 19 de fevereiro de 2015; 125(8):1256-71). Em um estudo anterior, foi mostrado que a lisofosfatidilcolina (LPC), lisofosfolipídio acentuadamente regu- lado crescentemente em pacientes com mieloma, era um antígeno para células do tipo II NKT humanas (Chang et al., Blood. 15 de agosto de

2008; 112(4):1308-16).

[013] As células do tipo II NKT podem ser distinguidas das células do tipo I NKT por sua predominância em seres humanos versus camun- dongos, ligação de TCR e especificidades de antígeno distintas (J Immunol. 1 de fevereiro de 2017; 198(3):1015-1021).

[014] Estruturas cristalinas do complexo de TCR-sulfatídeo do tipo II NKT/CD1d e do complexo de TCR-α-GalCer do tipo I NKT/CD1d for- neceram informações sobre os mecanismos pelos quais os TCRs NKT reconhecem o antígeno (Girardi et al., Immunol Rev. Novembro de 2012; 250(1):167-79). O TCR do tipo I NKT revelou se ligar ao complexo de α-GalCer/CD1d em uma configuração paralela rígida envolvendo principalmente a cadeia α. Os principais resíduos nas alças de CDR2β, CDR3α e CDR1α do semi-iTCR de células do tipo I NKT foram determi- nados como estando envolvidos na detecção do complexo de α-Gal- Cer/CD1d (Pellicci et al, Immunity. 17 de julho de 2009; 31(1):47-59). Por outro lado, os TCRs do tipo II NKT entraram em contato com seus ligantes principalmente por meio de sua alça de CDR3β em vez de alças de CDR3 α de uma forma antiparalela muito semelhante à ligação ob- servada em algumas das células T convencionais restritas a MHC (Gri- ardi et al., Nat Immunol. Setembro de 2012; 13(9):851-6). A estrutura ternária de moléculas de TCR reativas a sulfatídeo revelou que a alça de CDR3 α entrou em contato principalmente com CD1d, e CDR3β de- terminou a especificidade do antígeno de sulfatídeo (Patel et al., Nat Immunol. Setembro de 2012; 13(9):857-63). A flexibilidade na ligação do TCR do tipo II NKT a seus antígenos semelhantes ao complexo de TCR-peptídeo-MHC ressoa com sua maior diversidade de TCR e capa- cidade para responder a uma ampla gama de ligantes.

[015] No entanto, apesar das diferenças marcantes entre os dois subconjuntos, semelhanças entre os dois subconjuntos também foram relatadas. Por exemplo, as células do tipo I e do tipo II NKT são autor- reativas e dependem dos reguladores transcricionais PLZF e SAP para o seu desenvolvimento (Rhost et al., Scand J Immunol. Setembro de 2012; 76(3):246-55). Embora muitas células do tipo II NKT pareçam ter fenótipo ativado/de memória como células do tipo I NKT, em outros es- tudos, um subconjunto de células do tipo II NKT também exibiu fenótipo de células T virgens (CD45RA+, CD45RO−, CD62alto e CD69−/baixo) (Arrenberg et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 15 de junho de 2010; 107(24):10984-9). As células do tipo II NKT são ativadas principalmente pela sinalização de TCR após o reconhecimento do complexo de lipí- dio/CD1d (Roy et al., J Immunol. 1 de março de 2008; 180(5):2942-50) independentemente de qualquer sinalização de TLR ou presença de IL- 12 (Zeissig et al., Ann NY Acad Sci. Fevereiro de 2012; 1250:14-24).

DESENVOLVIMENTO DE CÉLULAS T

[016] Na medida em que as células T se desenvolvem no timo, os sinais de TCR fornecem pontos de verificação críticos na medida em que as células transitam pelos vários estágios de maturação. (Consultar Huang, EY, et al, J. Immunol. (2003) 171: 2296-2304). Por exemplo, um sinal pré-TCR é necessário para o subconjunto de timócitos mais ima- turo, denominado duplo negativo (DN), para se desenvolver em timóci- tos duplo positivos (DP), expressando tanto CD4 quanto CD8. Id. A montagem e expressão de superfície de CD3, pré-Tα e uma cadeia de TCRβ funcionalmente reorganizada medeiam esse ponto de verificação, denominado seleção β. Id. Após a sinalização pré-TCR bem-sucedida, os timócitos DN passam por muitos ciclos de divisão e várias alterações fenotípicas. Id. Além dos genes que codificam componentes pré-TCR, vários outros genes, que afetam a sinalização pré-TCR indiretamente ou são exigidos para as inúmeras alterações celulares vistas durante a transição de DN para DP, regulam a maturação. Id.

DESENVOLVIMENTO DE CÉLULAS DO TIPO I NKT

[017] Tanto em camundongos quanto em seres humanos, as célu- las do tipo I NKT segregam das células T convencionais durante o de- senvolvimento no estágio de timócito duplo-positivo (CD4+CD8+, DP), coincidente com a expressão de TCR αβ (Godfrey DI, Berzins SP Nat Rev Immunol. Julho de 2007; 7(7):505-18). A geração do TCRα canô- nico usado por células do tipo I NKT é amplamente considerada um evento aleatório, pois embora os aminoácidos que definem a reorgani- zação de Vα14-Jα18 invariante nunca variem, a análise de sequencia- mento revelou que os nucleotídeos usados para codificar esses amino- ácidos ácidos são diversos (Lantz O, Bendelac AJ Exp Med. 1 de se- tembro de 1994; 180(3):1097-106). Devido a restrições estruturais nos eventos de recombinação no locus de TCRα, os inúmeros segmentos de gene Vα e Jα tornam-se acessíveis para recombinação como uma função de sua localização relativa no locus. Como um resultado, o seg- mento de gene Vα 14 só começa a se reorganizar com Jα18 dentro de uma janela de 24–48 h antes do nascimento (Hager E. et al. J Immunol. 15 de agosto de 2007; 179(4):2228-34). Isso explica o aparecimento re- lativamente tardio de células NKT no timo e é consistente com a geração aleatória da reorganização de Vα14-Jα18 canônica dentro de um agru- pamento de progenitores de células T comuns. Além disso, a frequência do precursor de célula NKT identificado mais cedo foi estimada como sendo 1 célula por 106 timócitos (Benlagha K. et al. J Exp Med. 15 de agosto de 2005; 202(4):485-92). Juntos, esses dados suportam a noção de que a reorganização de Vα14-Jα18 ocorre aleatoriamente a uma fre- quência muito baixa.

[018] Tal como acontece com as células T convencionais, o de- senvolvimento de células do tipo I NKT exige o reconhecimento de indi- vidualidade. O elemento de restrição CD1d é expresso tanto por timóci- tos DP quanto por células epiteliais no timo. No entanto, os primeiros estudos revelaram que as células do tipo I NKT são selecionadas no estágio DP pelas próprias células DP que expressam CD1d, em oposi- ção às células epiteliais que acionam a seleção de células T convenci- onais. Criou-se a hipótese de que tal modo de seleção confere o pro- grama de desenvolvimento exclusivo de células do tipo I NKT aos timó- citos selecionados. Recentemente, foi demonstrado que as interações homotípicas através da sinapse DP-DP geraram "segundos sinais" que são mediados pela ligação cooperativa dos receptores homofílicos de pelo menos dois membros da família da molécula de ativação linfocítica de sinalização (SLAM) (Slamf1 [SLAM] e Slamf6 [Ly108]) [8λλ–10λλ]. Tais engajamentos levam ao recrutamento a jusante da proteína asso- ciada a SLAM adaptadora (SAP) e da Src quinase Fyn, que foram ante- riormente reconhecidas como essenciais para a expansão e diferencia- ção da linhagem de células do tipo I NKT (Godfrey DI, 2007).

[019] Uma vez que as células do tipo I NKT foram selecionadas positivamente, as mesmas se expandem no timo e passam por um pro- cesso de maturação orquestrado que leva, por fim, à aquisição de seu fenótipo semelhante a NK ativado. Esse processo depende da expres- são apropriada de receptores de citocinas, moléculas de transdução de sinal (por exemplo, Fyn, SAP), fatores de transcrição (por exemplo, NFκB, T-bet, Ets1, Runx1, RORγ, Itk, Rlk, AP-1) (consultar Godfrey DI, 2007 para revisões), e moléculas coestimulatórias, tais como CD28 e ICOS (Hayakawa et al., J Immunol. 15 de maio de 2001; 166(10):6012- 8; Akbari et al., J Immunol. 15 de abril de 2008; 180 (8): 5448–5456). A maioria das células do tipo I NKT deixam o timo em um estágio imaturo (conforme definido pela ausência de expressão de receptores NK, tais como NK1.1) e cumprem sua maturação terminal na periferia (Benlagha K. et al., Science. 19 de abril de 2002; 296(5567):553-5; McNab FW et al., J Immunol. 15 de setembro de 2005; 175(6):3762-8). No entanto, uma fração dimensionável dessas células do tipo I NKT NK1.1 nos ór-

gãos periféricos não adquirem expressão de marcadores NK e, na ver- dade, representam células maduras que são funcionalmente distintas de sua contraparte tímica NK1.1+ (McNab et al., J Immunol. 2007;179:6630–6637).

[020] O egresso de células do tipo I NKT do timo para a periferia exige sinalização de linfotoxina (LT) αβ através do receptor LTβ ex- presso por células estromais tímicas (Franki AS et al., Proc Natl Acad Sci US A. 13 de junho de 2006; 103(24):9160-5). Essa sinalização, por sua vez, regula a secreção de quimiocina medular tímica (Zhu M. et al., J Immunol. 15 de dezembro de 2007; 179(12):8069-75). O estabeleci- mento da residência em tecido de células do tipo I NKT na periferia exige a expressão do receptor Esfingosina 1-Fosfato 1 (S1P1R) por células do tipo I NKT (Allende ML et al., FASEB J. janeiro de 2008; 22(1):307- 15) e mais especificamente a expressão de CxCR6 para localização no fígado (Geissmann F. et al., PLoS Biol. Abril de 2005; 3(4):e113).

[021] No entanto, muitas células do tipo I NKT permanecem no timo, amadurecem para o fenótipo NK1.1+ lá e se tornam residentes de longa vida (Berzins SP et al. J Immunol. 1 de abril de 2006; 176(7):4059- 65). Os mecanismos responsáveis pela exportação/retenção de células do tipo I NKT do timo em vários estágios de desenvolvimento são des- conhecidos.

ATIVIDADE DE CÉLULAS DO TIPO I NKT

[022] As células do tipo I NKT mostraram ter muitas atividades di- ferentes durante uma resposta imunológica. As mesmas não apenas têm a capacidade para produzir citocinas e quimiocinas de maneira rá- pida e robusta, como também, como seu nome sugere, para exterminar outras células. Além disso, as mesmas mostraram influenciar o compor- tamento de muitas outras células imunes. Nesta seção, a multiplicidade de propriedades funcionais que foram atribuídas às células do tipo I NKT é descrita.

PRODUÇÃO DE CITOCINAS E QUIMIOCINAS

[023] As células do tipo I NKT foram originalmente identificadas como uma população de células T incomum com marcadores NK que tinham a capacidade exclusiva para produzir IL-4 de forma rápida e ro- busta mediante a injeção de anticorpos anti-CD3 em camundongos. Es- tudos posteriores revelaram que, embora essa produção robusta de IL- 4 fosse uma assinatura das células NKT do tipo I, não era a única cito- cina que as células NKT do tipo I podem produzir. As células do tipo I NKT mostraram produzir IFN-γ e IL-4, bem como IL-2, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-17, IL-21, TNF -α, TGF-β e GM-CSF (Bendelac A. et al., Annu Rev Immunol. 2007; 25():297-336; Gumperz JE et al., J Exp Med. 4 de março de 2002; 195(5):625-36). As células do tipo I NKT também são conhecidas por produzirem um arranjo de quimiocinas (Chang YJ et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 19 de junho de 2007; 104(25):10299-304).

[024] A produção rápida e dupla de IL-4 e IFNγ por células do tipo I NKT in vivo após a administração do antígeno α-GalCer tornou-se uma característica de marca registrada das células do tipo I NKT. Na ver- dade, dentro de 2h de exposição in vivo ao antígeno, a análise intrace- lular de células do tipo I NKT ex vivo de camundongos naïve revelou que a maioria das células do tipo I NKT no fígado produziu IL-4 e IFNγ (Matsuda JL et al., J Exp Med. 4 de setembro de 2000; 192(5):741-54). Não está claro como as células do tipo I NKT de camundongos não sen- sibilizados produzem citocinas tão rapidamente quando ativadas. No en- tanto, a observação de que as células do tipo I NKT em repouso têm altos níveis de mRNAs de IL-4 e IFNγ fornece um mecanismo potencial (Matsuda JL et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 8 de julho de 2003; 100(14):8395-400; Stetson DB et al., J Exp Med. 6 de outubro de 2003; 198(7):1069-76).

[025] As células do tipo I NKT também regulam sua produção de citocinas no nível transcricional. Vários fatores de transcrição conheci- dos por regular a transcrição do gene de citocinas em células T conven- cionais (T-bet, GATA-3, NFκB], c-Rel, NFAT, AP-1, STATs, Itk) também foram implicados em células do tipo I NKT. Por exemplo, as células do tipo I NKT parecem coexpressar os fatores de transcrição T-bet e GATA- 3, levando à transcrição dos mRNAs de IFNγ e IL-4. Isto está em con- traste com as células T convencionais, em que T-bet mostrou reprimir a expressão de GATA-3 e vice-versa.

ATIVIDADE CITOLÍTICA DE CÉLULAS DO TIPO I NKT

[026] As células do tipo I NKT expressam altos níveis de granzima B, perforina e FasL, consistentes com uma função citolítica dessas cé- lulas. Ensaios in vitro demonstraram que as células do tipo I NKT têm a capacidade para exterminar APCs pulsadas com antígeno de uma ma- neira dependente de CD1d. Além disso, vários modelos de camundon- gos revelaram que as células NKT do tipo I desempenham um papel importante na vigilância do tumor e rejeição do tumor. Em alguns mode- los de tumor, a produção de IFNγ por células do tipo I NKT é instrumen- tal na ativação de células NK, que por sua vez montam uma resposta antitumoral robusta (Crowe NY et al., J Exp Med. 1 de julho de 2002; 196(1):119-27). Da mesma forma, foi demonstrado que as células do tipo I NKT reconhecem e respondem a antígenos bacterianos e partici- pam da depuração bacteriana (Mattner et al., Nature. 2005 Mar 24; 434(7032):525-9; Ranson et al., J Immunol. 15 de julho de 2005; 175(2):1137-44).

REGULAÇÃO DE OUTRAS CÉLULAS IMUNES

[027] Os primeiros estudos demonstraram que as citocinas deriva- das de células do tipo I NKT podem ativar vários outros tipos de células, incluindo células NK, células T CD4+ e CD8+ convencionais, macrófa- gos e células B e recrutar células dendríticas mieloides (Kronenberg M, Gapin L Nat Rev Immunol. Agosto de 2002; 2(8):557-68). As células do tipo I NKT também podem modular o recrutamento de neutrófilos por meio de sua secreção de IFNγ (Nakamatsu M. et al., Microbes Infect.

Março de 2007; 9(3):364-74). Além disso, a interação entre células T reguladoras (Treg) CD4+CD25+ e células do tipo I NKT foi descrita, em que células do tipo I NKT ativadas modulam quantitativa e qualitativa- mente a função de Treg por meio de um mecanismo dependente de IL- 2, enquanto Treg pode suprimir funções de células do tipo I NKT por mecanismos dependentes de contato de células (LaCava A. et al., Trends Immunol.

Julho de 2006; 27(7):322-7). Uma regulação cruzada semelhante entre células do tipo I NKT e outras células NKT restritas a CD1d que não expressam a cadeia de TCR-α invariante que caracteriza as células do tipo I NKT (células do tipo II NKT) também foi observada (Ambrosino E. et al., J Immunol., 15 de outubro de 2007; 179(8):5126- 36). Também foi relatado que as células do tipo I NKT apresentam si- nergia com células T γδ em um modelo de hiperresponsividade alérgica das vias aéreas (Jin N. et al., J Immunol. 1 de setembro de 2007; 179(5):2961-8). Finalmente, foi reconhecido há algum tempo que a ati- vação sistêmica de células do tipo I NKT por injeção de α-GalCer induz a ativação de células B de forma não específica.

Os dados mostram que as células do tipo I NKT purificadas de camundongos NZB/W F1 pro- pensos a lúpus podem aumentar espontaneamente a secreção de anti- corpos pelas células B-1 e B da zona marginal, mas não pelas células B da zona folicular (Takahashi T, Strober S Eur J Immunol.

Janeiro de 2008; 38(1):156-65). As interações diretas entre as células do tipo I NKT e os subconjuntos de células B foram necessárias, e o efeito poderia ser bloqueado por mAbs anti-CD1d e anti-CD40L (Takahashi T, 2008). Ca- mundongos C57BL/6 imunizados com proteínas e α-GalCer desenvol- veram títulos de anticorpos 1–2 logs maiores do que aqueles induzidos por proteínas sozinhas e aumentaram a frequência de células B de me- mória geradas (Galli G et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104:3984–

3989). O mecanismo foi mediado pela ação combinada de interações de CD40-CD40L e secreção de citocinas. A expressão de CD1d por cé- lulas B também é exigida para a resposta aprimorada de células do tipo I NKT, sugerindo interação cognata entre células do tipo I NKT e células B (Lang GA et al., Blood. 15 de fevereiro de 2008; 111(4):2158-62).

ANTÍGENOS RECONHECIDOS POR CÉLULAS DO TIPO I NKT

[028] O primeiro ligante de células do tipo I NKT descrito foi α-Ga- lactosilceramida (α-GalCer), que foi identificado a partir de um painel de extratos marinhos por sua atividade antitumoral (Kawano T. et al., Sci- ence. 28 de novembro de 1997; 278(5343):1626-9). Desde então, mui- tos mais antígenos de células do tipo I NKT foram revelados, incluindo antígenos endógenos e exógenos. Ao contrário dos antígenos de célu- las T convencionais que são predominantemente peptídeos apresenta- dos por moléculas de MHC, os antígenos de células do tipo I NKT têm um componente lipídico distinto. A maioria dos antígenos de células do tipo I NKT definidos até o momento compartilha uma estrutura comum: uma cauda lipídica que está enterrada em CD1d e um grupo principal açúcar que se projeta para fora de CD1d e faz contato com o TCR NKT. A principal exceção a isso é o antígeno tipo I NKT fosfatidiletanolamina, que não possui um grupo principal açúcar.

RECONHECIMENTO DE ANTÍGENOS POR CÉLULAS NKT

[029] A especificidade do antígeno exclusiva das células do tipo I NKT é ditada pela expressão do TCR semi-invariante. Como esse TCR, que era conhecido por ter uma estrutura geral semelhante a TCRs rea- tivos a peptídeo/MHC conhecidos, poderia, em vez disso, reconhecer antígenos glicolipídicos no contexto de Cd1d foi o objeto de constante especulação. O sucesso cristalográfico e as análises mutacionais expu- seram como esse TCR reconhece complexos de CD1d/glicolipídio. A estrutura cristalina de um TCR do tipo I NKT humano em complexo com CD1d/α-GalCer revelou uma estratégia de encaixe única que diferia das interações de TCR/MHC/peptídeo (Borg et al., Nature. 2007;448:44– 49). Em comparação com as interações convencionais de TCR-MHC, e, que o TCR engata à porção distal do MHC em uma orientação diagonal, o TCR do tipo I NKT ancorado no final e paralelo ao complexo de CD1d- α-Galcer. Na estrutura, a superfície de ligação entre o TCR do tipo I NKT e o complexo de CD1d-α-GalCer era composta principalmente por três das seis alças da região determinante de complementaridade (CDR): CDR1α, CDR3α e CDR2β̣, com a cadeia invariante de TCRα dominando a interação com o glicolipídeo e CD1d, enquanto o papel da cadeia de TCRα foi restrito à alça de CDR2β interagindo com a hélice α1 de CD1d. CDR3β, a única região hipervariável do TCR NKT tipo I, que geralmente medeia a especificidade do antígeno junto com CDR3α para TCR con- vencional, não fez qualquer contato com o antígeno. Assim, o reconhe- cimento de α-Galcer-CD1d pelo TCR do tipo I NKT é inteiramente me- diado pela superfície codificada por linhagem germinativa no TCR do tipo I NKT.

[030] Esses resultados foram confirmados e estendidos por meio de uma extensa análise mutacional de TCRs do tipo I NKT de camun- dongo e ser humano (Browne et al., Nat Immunol. 2007;8: 1105-1113). Os resultados confirmaram um 'ponto quente' energético formado por resíduos dentro das alças de CDR1α, CDR3α e CDR2β do TCR que foram críticos para o reconhecimento do complexo de α-GalCer-CD1d e forneceram a base para o repertório de TCR extremamente polarizado de células do tipo I NKT. No sistema de camundongo, este 'ponto quen- te' foi similarmente exigido para o reconhecimento de antígenos glicoli- pídicos estruturalmente diferentes, tais como α-GalCer e iGb3. Como o reconhecimento de diversos antígenos glicolipídicos usou os mesmos resíduos codificados por linhagem germinativa, essas observações su- gerem que o TCR do tipo I NKT funciona como um receptor de reconhe- cimento de padrão (Browne et al., Nat Immunol. 2007;8: 1105-1113).

Dessa forma, diferentes clones de células NKT têm especificidade de antígeno de sobreposição, apesar da diversidade na cadeia de TCRβ.

ATIVAÇÃO DE CÉLULAS DO TIPO I NKT RECONHECIMENTO COGNATO E ATIVAÇÃO DE CÉLULAS DO TIPO I NKT POR ANTÍGENO ESTRANHO

[031] Os glicolipídios microbianos apresentados como antígenos cognatos que ativam as células do tipo I NKT foram identificados. As células do tipo I NKT mostraram reconhecer diretamente glicoesfingoli- pídios α-ligados e antígenos de diacilglicerol que são expressos por bac- térias, tais como Sphingomonas, Ehrlichia e Borrelia burgdorferi, de uma maneira dependente de CD1d (Mattner J. et al., Nature. 24 de março de 2005; 434(7032):525-9; Kinjo Y. et al., Nature. 24 de março de 2005; 434(7032):520-5). A resposta biológica a esses antígenos glicolipídicos inclui a produção de IFNγ e IL-4 por células do tipo I NKT.

RECONHECIMENTO INDIRETO E ATIVAÇÃO DE CÉLULAS DO TIPO I NKT

[032] Embora nenhum antígeno glicolipídico cognato que seja re- conhecido por TCRs de células do tipo I NKT tenha sido encontrado nos principais patógenos bacterianos Gram-negativos e Gram-positivos que são proeminentes na doença humana, modos alternativos de ativação de células do tipo I NKT foram relatados para tais bactérias. Por exem- plo, bactérias positivas para LPS, como Salmonella ou Escherichia, mostraram ativar células do tipo I NKT indiretamente. Esses meios indi- retos de reconhecimento se enquadram em dois grupos principais: aqueles que dependem, pelo menos parcialmente, de CD1d/TCR inte- rações em conjunto com a ativação de células apresentadoras de antí- geno e aqueles que parecem ser independentes de CD1d.

[033] Primeiro, foi mostrado que bactérias Gram-negativas (tais como Salmonella typhimurium) ou bactérias Gram-positivas (tais como

Staphylococcus aureus) cultivadas com células dendríticas podem esti- mular células do tipo I NKT na ausência de glicolipídios cognatos estra- nhos específicos (Mattner J. et al., Nature, 24 de março de 2005; 434(7032):525-9; Brigl M et al., Nat Immunol.

Dezembro de 2003; 4(12):1230-7). Tal estimulação é bloqueada por mAbs anti-CD1d ou anti-IL-12 in vitro e in vivo.

Esses resultados sugerem que um vasto ar- ranjo de micro-organismos pode ter a capacidade para induzir a ativa- ção de NKT tipo I indiretamente por meio da estimulação de APC.

Esse mecanismo é dependente da ligação de TLR do APC, na medida em que células dendríticas derivadas de medula óssea derivadas do tipo selvagem expostas a S. typhimurium (DCs), mas não DCs com defici- ência em moléculas de sinalização de TLR, tiveram a capacidade para estimular células do tipo I NKT in vitro (Mattner J. et al., Nature. 24 de março de 2005; 434 (7032): 525-9). O mesmo é também provavelmente dependente do reconhecimento de um autoglicolipídeo pelo TCR do tipo I NKT devido ao fato de que as DCs com deficiência em CD1 não têm a capacidade para estimular células do tipo I NKT quando estimuladas de forma semelhante.

Além disso, a ativação de APC por ligantes de TLR mostrou modular a trajetória biossintética de lipídios e induzir a regula- ção crescente específica de ligante (ou ligantes) ligado a CD1d, con- forme demonstrado com o uso de TCRs do tipo I NKT multiméricos como um reagente de manchamento (Salio M. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104: 20490–20495). Em contraste com esses resultados, foi relatado que LPS de Escherichia coli induz a estimulação de células do tipo I NKT de uma maneira dependente de APC, mas independente de CD1d (Nagarajan NA.

Et al., J Immunol. 2007;178:2706–2716). Nes- ses experimentos, a produção de IFNγ por células do tipo I NKT não exigiu a apresentação mediada por CD1d de um antígeno endógeno, e a exposição a uma combinação de IL-12 e IL-18 foi suficiente para ativá- los.

[034] Finalmente, foi relatado que, além do sensor de detecção de LPS TLR4, a ativação dos sensores de ácido nucleico TLR7 e TLR9 em DCs também leva à estimulação de células do tipo I NKT, conforme me- dido por sua produção de IFNγ (Paget C. et al., Immunity. 2007;27:597– 609).

CÉLULAS DO TIPO I NKT EM DOENÇAS

[035] Embora as células do tipo I NKT representem uma frequên- cia relativamente baixa de células T do sangue periférico em seres hu- manos, sua diversidade limitada de TCR significa que as mesmas res- pondem a uma alta frequência após a ativação. Desse modo, as células do tipo I NKT estão posicionadas exclusivamente para conformar res- postas imunológicas adaptativas e demonstraram desempenhar um pa- pel modulatório em uma ampla variedade de doenças, tais como câncer, autoimunidade, distúrbios inflamatórios, distúrbios relacionados ao transplante de tecido e infecção (Terabe & Berzofsky, capítulo 8, Adv Cancer Res, 101: 277-348, 2008; Wu & van Kaer, Curr Mol Med, 9: 4- 14, 2009; Tessmer et al, Expert Opin Ther Targets, 13: 153-162, 2009). Por exemplo, camundongos com deficiência em células NKT são sus- cetíveis ao desenvolvimento de tumores induzidos quimicamente, en- quanto camundongos do tipo selvagem são protegidos (Guerra et al, Immunity 28: 571-80, 2008). Essas constatações experimentais se cor- relacionam aos dados clínicos que mostram que os pacientes com cân- cer avançado diminuíram o número de células do tipo I NKT no sangue periférico (Gilfillan et al, J Exp Med, 205: 2965-73, 2008).

[036] As células do tipo I NKT constituem < 0,1% do sangue peri- férico e < 1% de células T da medula óssea em seres humanos, mas, apesar de sua relativa escassez, a mesmas exercem regulação imuno- lógica potente por meio da produção de citocinas IL-2, do tipo Th1 (IFN- γ, TNF-α), do tipo Th2 (IL-4, IL-13), IL-10 e IL-17. (Lee et al, J Exp Med, 2002; 195: 637-641; Bendelac et al, Annu Rev Immunol, 2007; 178: 58-

66; Burrows et al, Nat Immunol, 2009; 10(7): 669-71). As células do tipo I NKT são caracterizadas por uma cadeia Vα de receptor de células T (TCR) altamente restrita (invariante) (Vα24 em seres humanos). Seu TCR é exclusivo pelo fato de que o mesmo reconhece glicolipídios alte- rados de membranas celulares apresentados no contexto de uma mo- lécula semelhante a HLA ubíqua, CD1d. (Zajonc & Kronenberg, Immu- nol Rev, 2009; 230 (1): 188-200). CD1d é expresso em altos níveis em muitos tecidos epiteliais e hematopoiéticos e em numerosos alvos tu- morais e é conhecido por se ligar especificamente apenas ao TCR do tipo I NKT. (Borg et al, Nature, 2007, 448: 44-49).

[037] Como as células NK, as células do tipo I NKT desempenham um papel importante na imunovigilância tumoral, por meio de citotoxici- dade direta mediada por perforina/Granzima B, Fas/FasL e trajetórias TRAIL. (Brutkiewicz & Sriram, Crit Rev Oncol Hematol, 2002; 41: 287- 298; Smyth et al, J. Exp. Med. 2002; 191: 661-8; Wilson & Delovitch, Nat Rev Immunol, 2003; 3: 211-222; Molling et al, Clinical Immunology, 2008; 129: 182-194; Smyth et al, J Exp Med, 2005; 201 (12):1973-1985; Godfrey et al, Nat Rev Immunol, 2004, 4: 231-237). Em camundongos, as células do tipo I NKT protegem contra GVHD, enquanto aumentam a citotoxicidade de muitas populações de células, incluindo células NK. Ao contrário das células NK, as células do tipo I NKT não são conheci- das por serem inibidas por ligantes, tais como MHC de Classe I, tor- nando-as adjuvantes úteis em configurações de escape de tumor da ci- totoxicidade NK por meio de regulação crescente de Classe I. (Brutkie- wicz & Sriram, Crit Rev Oncol Hematol, 2002; 41: 287-298; Smyth et al, J Exp Med 2002; 191: 661-8; Wilson & Delovitch, Nat Rev Immunol, 2003; 3: 211-222; Molling et al, Clinical Immunology, 2008; 129: 182- 194; Smyth et al, J Exp Med, 2005; 201 (12):1973-1985; Godfrey et al, Nat Rev Immunol, 2004, 4: 231-237).

[038] Evidências adicionais apoiando um papel para células do tipo I NKT na imunidade antitumoral são fornecidas em estudos que usam camundongos com knockout direcionados ao gene Jα18 que não tem exclusivamente células do tipo I NKT (Smyth et al, J Exp Med, 191: 661-668, 2000). Por exemplo, camundongos com deficiência de NKT do tipo I exibiram suscetibilidade significativamente aumentada a sarcomas induzidos por metilcolantreno e tumores de melanoma, um efeito rever- tido pela administração de células do tipo I NKT derivadas do fígado durante os estágios iniciais de crescimento do tumor (Crowe et al, J Exp Med, 196: 119-127, 2002).

[039] Pelo menos uma contribuição de células do tipo I NKT para a imunidade antitumoral ocorre indiretamente por meio da ativação de células do tipo I NKT por DCs. As células do tipo I NKT ativadas podem iniciar uma série de cascatas de citocinas - incluindo a produção de in- terferon gama (IFN-γ) - que ajuda a impulsionar a fase de preparação da resposta imunológica antitumoral (Terabe & Berzofsky, Capítulo 8, Adv Cancer Res, 101: 277-348, 2008). A produção de IFN-γ por células do tipo I NKT, bem como células NK e efetores CD8 +, mostrou ser im- portante na rejeição de tumor (Smyth et al, Blood, 99: 1259-1266, 2002). Os mecanismos subjacentes são bem caracterizados (Uemura et al, J Imm, 183: 201-208, 2009).

[040] Além disso, as células do tipo I NKT mostraram ter como alvo específico o extermínio de macrófagos associados a tumor (TAMs) po- sitivos para CD1d, um subconjunto altamente plástico de células infla- matórias derivadas de monócitos circulantes que realizam funções imu- nossupressoras (Sica & Bronte, J Clin Invest, 117: 1155-1166, 2007). TAMs são conhecidos por serem um produtor principal de interleucina- 6 (IL-6) que promove a proliferação de muitos tumores sólidos, incluindo neuroblastomas e carcinomas de mama e próstata (Song et al., J Clin Invest, 119: 1524-1536, 2009; Hong et al, Cancer, 110: 1911-1928, 2007). A atividade citotóxica direta dependente de CD1d de células do tipo I NKT contra TAMs sugere que existem importantes trajetórias indi- retas alternativas pelas quais células do tipo I NKT podem mediar a imu- nidade antitumoral, especialmente contra tumores sólidos que não ex- pressam CD1d.

[041] Em seres humanos, as células do tipo I NKT abrigam células de neuroblastoma (Metelitsa et al, J Exp Med 2004; 199 (9):1213-1221) e alvos de células B (Wilson & Delovitch, Nat Rev Immunol 2003; 3: 211- 222; Molling et al, Clinical Immunology, 2008; 129: 182-194) ambos os quais expressam altos níveis de CD1d. As citocinas de células do tipo I NKT podem aumentar a citotoxicidade de NK. IFN-γ aumenta a prolife- ração de células NK e citotoxicidade direta, enquanto IL-10 aumenta po- tentemente TIA-1, uma molécula dentro de grânulos citotóxicos NK que tem efeitos diretos de clivagem de DNA (Tian et al, Cell, 1991; 67 (3): 629-39) e pode regular o splicing de mRNA em alvos de células NK, favorecendo a expressão de Fas ligado à membrana em alvos. (Izquierdo et al, Mol Cell, 2005; 19 (4): 475-84). A IL-10 aumenta ainda mais a suscetibilidade de alvo tumoral à lise de NK induzindo a regula- ção decrescente de tumor de MHC Classe I, um ligante inibitório princi- pal para células NK. (Kundu & Fulton, Cell Immunol, 1997; 180:55-61).

[042] Evidências que sustentam um papel importante para as cé- lulas do tipo I NKT no tratamento de doenças inflamatórias e/ou doenças autoimunes vêm de estudos que usam modelos de doença autoimune murinos. Por exemplo, em modelos de camundongo de diabetes tipo I (M. Falcone et al, J Immunol, 172: 5908-5916, 2004; Mizuno et al, J Au- toimmun, 23: 293-300, 2004), artrite reumatoide (Kaieda et al , Arthritis and Rheumatism, 56: 1836-1845, 2007; Miellot-Gafsou et al, Immuno- logy, 130: 296-306, 2010), colite autoimune (doença de Crohn e mode- los de colite ulcerativa, colite induzida por DSS e colite mediada por cé- lulas T autoimune; Geremia et al., Autoimmun Rev. 13(1):3-10, 2014 doi:

10.1016/j.autrev.2013.06.004. Epub 15 de junho de 2013. Katsurada et al., PLoS One, 7(9):e44113, 2012; Fuss e Strober, Mucosal Immunol., 1 Supl 1:S31-3, 2008) e encefalite autoimune experimental (EAE) (van de Keere & Tonegawa, J Exp Med, 188: 1875-1882, 1998; Singh et al, J Exp Med, 194:1801-1811, 2001; Miyamoto et al, Nature, 413: 531-534, 2001), as células do tipo I NKT desempenharam papéis importantes no estabelecimento da tolerância imunológica e prevenção de patologia au- toimune.

[043] As células do tipo I NKT também são ativadas e participam das respostas ao tecido transplantado. Sem subscrever-se exclusiva- mente a nenhuma teoria, as evidências sustentam um papel importante para as células do tipo I NKT em distúrbios relacionados a transplante. Por exemplo, as células do tipo I NKT demonstraram se infiltrar em alo- enxertos cardíacos e cutâneos antes da rejeição e foram encontradas em números expandidos no tecido linfoide periférico após o transplante (Maier et al, Nat Med, 7: 557-62, 2001; Oh et al, J Immunol, 174: 2030- 6, 2005; Jiang et al, J Immunol, 175: 2051-5, 2005). As células do tipo I NKT não são apenas ativadas, mas também influenciam a resposta imu- nológica resultante (Jukes et al, Transplantation, 84: 679-81, 2007). Por exemplo, constatou-se consistentemente que os animais com deficiên- cia de células NKT totais ou células do tipo I NKT são resistentes à in- dução de tolerância por bloqueio de molécula coestimuladora/correcep- tora (Seino et al, Proc Natl Acad Sci USA, 98: 2577-81, 2001; Jiang et al, J Immunol, 175: 2051-5, 2005; Jiang et al, Am J Transplant, 7: 1482- 90, 2007). Notavelmente, a transferência adotiva de células NKT para tais camundongos restaura a tolerância, que é dependente do interferon (IFN) -γ, IL-10 e/ou CXCL16 (Seino et al, Proc Natl Acad Sci USA, 98: 2577-81, 2001; Oh et al, J Immunol, 174: 2030-6, 2005; Jiang et al, J Immunol, 175: 2051-5, 2005; Jiang et al, Am J Transplant, 7: 1482-90, 2007; Ikehara et al, J Clin Invest, 105: 1761-7, 2000). Além disso, as células do tipo I NKT provaram ser essenciais para a indução de tole- rância a aloenxertos da córnea e mostraram prevenir a doença do en- xerto contra hospedeiro de uma maneira dependente de IL-4 (Sonoda et al, J Immunol, 168: 2028-34, 2002; Zeng et al, J Exp Med, 189: 1073- 81 1999; Pillai et al, Blood. 2009; 113:4458-4467; Leveson-Gower et al, Blood, 117: 3220-9, 2011).

[044] As respostas de células do tipo I NKT podem depender do tipo de transplante realizado, por exemplo, após enxertos vasculariza- dos (coração) ou não vascularizados (pele), na medida em que o aloan- tígeno drena para as células do tipo I NKT que residem no baço ou lin- fonodos axilares, respectivamente. Além disso, as respostas de células do tipo I NKT podem ser manipuladas, por exemplo, manipulando-se células do tipo I NKT para liberar IL-10 através de múltiplas injeções de α-GalCer, o que pode prolongar a sobrevivência de enxerto de pele (Oh et al, J Immunol, 174: 2030-6, 2005).

[045] A obtenção da tolerância imunológica alogênica enquanto se mantém a atividade de enxerto contra tumor (GVT) permaneceu anteri- ormente um objetivo elusivo do transplante de células hematopoéticas alogênicas (HCT). Acredita-se que populações de células imunes regu- ladoras, incluindo células NKT e células T reguladoras (Treg) CD4+Foxp3+ desempenhem um papel fundamental na determinação da tolerância e GVT. Para essa finalidade, métodos de condicionamento de intensidade reduzida que enriquecem células NKT e Treg foram recen- temente aplicados com algum sucesso. Especificamente, um regime de irradiação linfoide total (TLI) e globulina antitimócito (ATG) resultou em enxerto e proteção da doença de enxerto contra hospedeiro (GVHD) em crianças e adultos (Lowsky et al, New England Journal of Medicine. 2005, 353:1321-1331; Kohrt et al, Blood. 2009; 114:1099-1109; Kohrt et al, European Journal of Immunology. 2010; 40:1862-1869; Pillai et al, Pediatric Transplantation. 2011; 15:628-634) e GVT parecia ser mantido em pacientes adultos cujas características da doença os colocaram em alto risco de recidiva (Lowsky et al, The New England Journal of Medi- cine. 2005, 353:1321-1331; Kohrt et al, Blood. 2009; 114:1099-1109; Kohrt et al, European Journal of Immunology. 2010; 40:1862-1869).

[046] A modelagem pré-clínica murina desse regime mostrou que a proteção de GVHD depende da secreção de IL-4 e da capacidade reguladora das células do tipo I NKT, e que essas células regulam GVHD enquanto mantêm GVT (Pillai et al, Journal of Immunology. 2007; 178:6242-6251). Além disso, os resultados de IL-4 derivados de NKT do tipo I podem acionar a potente expansão in vivo de células Treg CD4+CD25+Foxp3+ reguladoras, que por sua vez regulam células T CD8+ efetoras dentro do doador para prevenir GVHD aguda letal (Pillai et al, Blood. 2009; 113:4458-4467). Foi mostrado que o desvio imune dependente de células do tipo I NKT resulta no desenvolvimento e au- mento da função de células dendríticas mieloides reguladoras que, por sua vez, induzem a potente expansão in vivo de células Treg CD4+CD25+Foxp3+ reguladoras e aumentam ainda mais a proteção contra as respostas de células T deletérias (van der Merwe et al, J. Immunol., 2013; 4 de novembro de 2013).

[047] Em resposta à infecção, o sistema imunológico conta com uma complexa rede de sinais por meio da ativação de receptores para padrões moleculares associados a patógenos, tais como os receptores do tipo Toll (TLRs), expressos em células apresentadoras de antígenos (APC), promovendo consequentemente respostas de células T especí- ficas para antígeno (Medzhitov & Janeway Jr, Science 296: 298-300, 2002). Por exemplo, durante tais respostas, as células do tipo I NKT respondem por meio do reconhecimento de antígenos lipídicos deriva- dos de micro-organismos ou por meio de citocinas derivadas de APC após a ligação de TLR, em combinação com e sem a apresentação de lipídios autoderivados ou derivados de micróbios. Os antígenos bacteri- anos também podem estimular diretamente as células do tipo I NKT quando ligadas a CD1d, atuando independentemente da ativação de APC mediada por TLR (Kinjo et al, Nat Immunol, 7: 978-86, 2006; Kinjo et al, Nature, 434:520-5, 2005; Mattner et al, Nature, 434: 525-9, 2005; Wang et al, Proc Natl Acad Sci USA, 107: 1535-40, 2010).

[048] Além disso, camundongos com deficiência de células NKT (CD1d-/-) e do tipo I NKT (Jα18-/-) mostraram ser altamente suscetíveis à gripe em comparação com camundongos do tipo selvagem (De Santo et al, J Clin Invest, 118: 4036-48, 2008). Nesse modelo, as células do tipo I NKT revelaram suprimir a expansão de células supressoras deri- vadas de mieloide (MDSC) que foram expandidas em camundongos CD1d e Jα18-/- (Id.). De modo importante, embora o mecanismo exato da ativação de células do tipo I NKT não tenha sido determinado, os autores sugerem que as células do tipo I NKT exigiram interações de TCR-CD1d, na medida em que a transferência adotiva de células do tipo I NKT para camundongos Jα18-/-, mas não CD1d-/- suprimiu a expan- são de MDSC após infecção com PR8 (De Santo et al, J Clin Invest, 118:4036-48, 2008). Assim, outra aplicação de células do tipo I NKT é no aumento das respostas imunológicas a patógenos (por exemplo, pa- tógenos bacterianos, virais, protozoários e helmintos).

[049] Finalmente, as células do tipo I NKT mostraram desempe- nhar um papel crítico na regulação e/ou aumento da resposta imunoló- gica alérgica, tanto pela secreção de citocinas quanto pela modulação de outros subconjuntos imunes, incluindo células reguladoras Foxp3 +, APCs e células NK (Robinson, J Allergy Clin Immunol., 126(6):1081-91, 2010; Carvalho et al., Parasite Immunol., 28(10):525-34, 2006; Koh et al., Hum Immunol., 71(2):186-91, 2010). Isso inclui evidências em mo- delos de dermatite atópica (Simon et al., Allergy, 64(11):1681-4, 2009).

[050] No entanto, um grande obstáculo à aplicação de células do tipo I NKT reguladoras inatas humanas na imunoterapia é sua relativa escassez de produtos celulares de terapia celular comuns, incluindo sangue periférico humano (Berzins et al, Nature Reviews Immunology. 2011; 11:131-142; Exley et al, Current Protocols in Immunology, 2010; Capítulo 14: Unidade 14-11; Exley & Nakayama, Clinical Immunology, 2011; 140:117-118) e a falta de dados fenotípicos e funcionais claros sobre células do tipo I NKT humanas expandidas ex vivo para validar a aplicação potencial de células do tipo I NKT humanas pós-expansão te- rapeuticamente.

[051] Apesar da grande importância imunológica e potencial tera- pêutico das células do tipo I NKT, a arte carece de tecnologias neces- sárias para expandir de forma eficiente e/ou modular a atividade de cé- lulas do tipo I NKT ex vivo suficiente para permitir seu uso em métodos terapêuticos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[052] De acordo com um aspecto, a invenção descrita fornece uma composição farmacêutica que compreende um carreador farmaceutica- mente aceitável e um produto celular que compreendem células T ex- terminadores de citocina superativadas (SCKTCs) expandidas e enri- quecidas derivadas de uma população de células exterminadoras de ci- tocina, sendo que as SCKTCs são caracterizadas por duas ou mais den- tre uma secreção induzida de uma citocina, uma proliferação estimulada da população de SCKTCs, uma melhor citotoxicidade das SCKTCs e expressão modulada de um ou mais marcadores na superfície celular das SCKTCs, em comparação a uma população de controle de células T exterminadoras de citocina não estimulada e não ativada. De acordo com uma modalidade, a citocina, cuja expressão é modulada, é uma ou mais selecionadas do grupo que consiste em IL-4, IL-5, IL-6 ou IL-10 e IFNγ. De acordo com outra modalidade, a população expandida e enri-

quecida de SCKTCs compreende baixa expressão de uma ou mais ci- tocinas selecionadas do grupo que consiste em IL-4, IL-5, 1L-6 e IL-10, e alta expressão de IFNγ.

De acordo com outra modalidade, a produção de citocinas pela população expandida e enriquecida de SCKTCs é ca- racterizada como Il-5-, IL-6-, Il-10-, IL-4 baixo, IFNγ alto.

De acordo com outra modalidade, a quantidade de IFN-γ produzida pela população ex- pandida e enriquecida de SCKTCs é de cerca de 5000 pg/ml ou maior.

De acordo com outra modalidade, a quantidade de IL-4 produzida pela população expandida e enriquecida de SCKTCs é inferior a 5 pg/ml.

De acordo com outra modalidade, uma razão de IFNγ: IL-4 em sobrenadan- tes de cultura da população expandida e enriquecida de SCKTCs é igual ou superior a 1000. De acordo com outra modalidade, uma taxa de ex- termínio de uma célula-alvo pela população expandida e enriquecida de SCKTCs varia de cerca de 25% a cerca de 75%, inclusive.

De acordo com outra modalidade, a taxa de extermínio da população expandida e enriquecida de SCKTCs é pelo menos 1,5 vez maior do que a taxa de extermínio de células de controle de células T exterminadoras de cito- cina não expandidas e não ativadas.

De acordo com outra modalidade, uma razão de IFN-γ: IL-4 é de pelo menos 1000, e a taxa de extermínio é aumentada pelo menos 1,5 vez mais pela população expandida e en- riquecida de SCKTCs em comparação com a taxa de extermínio de cé- lulas de controle de células T exterminadoras de citocina não expandi- das e não ativadas.

De acordo com outra modalidade, a população ex- pandida e enriquecida de SCKTCs compreende uma subpopulação de SCKTCs que expressam marcadores de células NKT.

De acordo com outra modalidade, a população expandida e enriquecida de células SCKTCs compreende uma subpopulação de SCKTCs que compreende uma ou mais dentre células CD3+Vα24+, células CD3+Vα24- ou células CD3+CD56+. De acordo com outra modalidade, a população expandida e enriquecida de SCKTCs compreende uma subpopulação de SCKTCs que são CD3+ CD56+. De acordo com outra modalidade, a população expandida e enriquecida de SCKTCs compreende uma subpopulação de SCKTCs que expressam marcadores de células do tipo 1-NKT. De acordo com outra modalidade, os marcadores de células do tipo 1-NKT compreendem marcadores TCR Vα e TCR Vβ. De acordo com outra modalidade, a subpopulação de SCKTCs que expressam marcadores de células do tipo 1 NKT compreende células caracterizadas como CD3+Vα24+, CD3+Vα24- ou CD3+CD56+. De acordo com outra moda- lidade, a população expandida e enriquecida de SCKTCs derivadas de uma população de células T exterminadoras de citocina (CKTCs) cons- titui de cerca de 40% a cerca de 60% da população total de CKTC. De acordo com outra modalidade, a composição farmacêutica compreende uma quantidade estabilizadora de soro que é eficaz para a retenção da atividade efetora de células T pela população expandida e enriquecida de SCKTCs. De acordo com outra modalidade, a quantidade estabili- zante de soro é de pelo menos 10%. De acordo com outra modalidade, o soro é soro humano.

[053] De acordo com outro aspecto, a invenção descrita fornece um método para preparar uma composição farmacêutica que compre- ende uma população expandida e enriquecida de células T extermina- doras de citocinas superativadas (SCKTCs) que compreende, em or- dem

[054] (a) isolar uma população de células mononucleares (MCs) que compreende uma população de células T exterminadoras de cito- cina (CKTCs);

[055] (b) transportar, opcionalmente, a preparação de (a) para uma instalação de processamento sob condições estéreis;

[056] (c) cultivar a população de MCs em um sistema de cultura;

[057] (d) colocar o sistema de cultura da etapa (c) em contato com alfa-galactosilceramida (αGalCer), ou análogo ou equivalente funcional da mesma, e com uma população de células que compreende CD1d e αGalCer, ou análogo ou equivalente funcional dos mesmos, sendo que o contato é suficiente para estimular a expansão da população de CKTCs;

[058] (e) colocar o sistema de cultura da etapa (d) em contato com IL-2, IL-7, IL-15 e IL-12, em uma ordem e um tempo predeterminados de adição, juntamente com pulsos de uma população nova de células que compreende CD1d e αGalCer, sendo que o contato é suficiente para estimular a ativação de uma parte da população de CKTCs e for- mar a população expandida e enriquecida de SCKTCs;

[059] (f) coletar a população expandida e enriquecida de SCKTCs do sistema de cultura para formar um produto celular de SCKTC; em que o produto celular que compreende a população expandida e enri- quecida de SCKTCs da etapa (f) é caracterizado por uma ou mais dentre uma capacidade melhorada de secretar citocinas efetoras ou citotoxici- dade melhorada em comparação com a população de CKTCs da etapa (a); e

[060] (h) formular o produto celular com um carreador farmaceuti- camente aceitável para formar a composição farmacêutica.

[061] De acordo com uma modalidade, uma fonte de células mo- nonucleares (MCs) na etapa (a) é o sangue. De acordo com outra mo- dalidade, as MCs são derivadas de um ser humano. De acordo com outra modalidade, as MCs são isoladas do sangue total por centrifuga- ção em gradiente de Ficoll-Paque. De acordo com outra modalidade, o método compreende transportar, entre as etapas (e) e (f), a cultura da instalação de processamento para uma instalação de tratamento. De acordo com outra modalidade, a etapa de transporte é iniciada dentro de cerca de 1 hora a cerca de 24 horas após a adição de IL12. De acordo com outra modalidade, a etapa (c) compreende, opcionalmente,

a ressuspensão das MCs e o ajuste das MCs a uma faixa de concentra- ção de cerca de 5×105 células/ml a cerca de 3×106 células/ml antes de realizar a etapa (d). De acordo com outra modalidade, a etapa (e) com- preende a adição de pulsos de uma nova população de células que compreendem CD1d e αGalCer, ou análogo ou equivalente funcional dos mesmos, ao sistema de cultura.

De acordo com algumas modalida- des, o número de pulsos da nova população de células que compreen- dem CD1d e αGalCer é pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9 ou pelo menos 10. De acordo com outra modalidade, αGalCer, ou análogo ou equivalente funcional do mesmo, é mantido em uma concentração constante da etapa (d) à etapa (f). De acordo com outra modalidade, a concentração de αGalCer, ou análogo ou equiva- lente funcional do mesmo, está entre cerca de 50 ng/ml e cerca de 500 ng/ml.

De acordo com outra modalidade, a IL-2 é mantida em uma con- centração constante da etapa (e) à etapa (f). De acordo com outra mo- dalidade, a concentração de IL-2 está na faixa de cerca de 10 U/ml a cerca de 100 U/ml.

De acordo com outra modalidade, a IL-7 é mantida em uma concentração constante da etapa (e) à etapa (f). De acordo com outra modalidade, a concentração de IL-7 está na faixa de cerca de 20 ng/ml a 200 ng/ml.

De acordo com outra modalidade, IL-2 e IL-7 são adicionadas por volta do dia 7 de cultivo.

De acordo com outra modali- dade, a IL-15 é adicionada por volta do dia 14 de cultivo.

De acordo com outra modalidade, a IL-12 é adicionada por volta do dia 20 de cultivo.

De acordo com outra modalidade, a etapa (f) é realizada pelo menos cerca do dia 21 de cultivo.

De acordo com outra modalidade, a IL-15 é mantida em uma concentração constante da etapa (e) à etapa (f). De acordo com outra modalidade, a concentração de IL-15 está na faixa de cerca de 10 ng/ml a cerca de 100 ng/ml.

De acordo com outra modali- dade, a IL-12 é mantida em uma concentração constante da etapa (e) à etapa (f). De acordo com outra modalidade, a concentração de IL-12 está na faixa de cerca de 10 ng/ml a cerca de 100 ng/ml. De acordo com outra modalidade, o método compreende ainda uma etapa de caracte- rizar a expressão de marcadores de superfície celular pela população de SCKTCs por citometria de fluxo. De acordo com outra modalidade, uma subpopulação da população expandida e enriquecida de SCKTCs compreende uma ou mais dentre células CD3+Vα24+, células CD3+ Vα24- ou células CD3+CD56+. De acordo com outra modalidade, a sub- população compreende ainda células Vβ11+. De acordo com uma mo- dalidade, a população expandida e enriquecida de SCKTCs compre- ende uma subpopulação de células CD3+Vα24+Vβ11+, células CD3+Vα24- ou células CD3+CD56+.

[062] De acordo com outra modalidade, a população expandida e enriquecida de SCKTCs compreende de cerca de 40% a cerca de 60% da população total de CKTCs. De acordo com outra modalidade, IL-2 e IL-7 são adicionadas à cultura simultaneamente. De acordo com outra modalidade, IL-2, IL-7 e IL-15 são adicionadas à cultura simultanea- mente. De acordo com outra modalidade, a população de MCs na etapa (c) compreende de cerca de 5 × 105 células/ml a cerca de 3 × 106 célu- las/ml. De acordo com outra modalidade, a célula que compreende CD1d e alfa-galactosilceramida (αGalCer) é uma célula apresentadora de antígeno. De acordo com outra modalidade, a célula de apresenta- ção de antígeno é uma célula dendrítica (DC). De acordo com outra mo- dalidade, a célula dendrítica é carregada com αGalCer. De acordo com outra modalidade, a célula dendrítica carregada com αGalCer é deri- vada das MCs e é uma célula aderente. De acordo com outra modali- dade, a célula dendrítica carregada com αGalCer é preparada por um método que compreende: (a) isolar uma população de células mononu- cleares (MCs); (b) cultivar a população de MCs em um sistema de cul- tura; (c) colocar o sistema de cultura em contato com IL-4 e GM-CSF,

em que o contato é suficiente para induzir a diferenciação das MCs em células dendríticas; e (d) colocar o sistema de cultura em contato com αGalCer, em que o contato é suficiente para carregar as células dendrí- ticas com αGalCer. De acordo com outra modalidade no método para preparar a célula dendrítica carregada com αGalCer, a célula dendrítica carregada com αGalCer é uma célula aderente. De acordo com outra modalidade, no método para preparar a célula dendrítica carregada com αGalCer, a concentração de IL-4 é de 500 U/ml. De acordo com outra modalidade no método para preparar a célula dendrítica carregada com αGalCer, a concentração de GM-CSF é de 50 ng/ml. De acordo com outra modalidade, no método para preparar a célula dendrítica carre- gada com αGalCer, a etapa (d) é realizada de cerca de 5 dias a cerca de 7 dias após a etapa (b). De acordo com outra modalidade, no método para preparar a célula dendrítica carregada com αGalCer, a população de MCs na etapa (b) compreende cerca de 1×105 células/ml a cerca de 5×106 células/ml. De acordo com outra modalidade no método para pre- parar a célula dendrítica carregada com αGalCer, as etapas (b) - (d) são realizadas em um meio de cultura selecionado a partir do meio RPMI 1640 que contém 10% de soro fetal bovino ou 10% de soro autólogo.

[063] De acordo com outra modalidade, o método para preparar a composição compreende ainda reabastecer o meio de cultura no sis- tema de cultura a cada 2 a 3 dias. De acordo com outra modalidade, as etapas (c) - (f) são realizadas em um meio de cultura selecionado a partir do meio isento de soro X-VIVO-15 e do meio RPMI 1640 que contém 10% de soro fetal bovino ou 10% de soro autólogo.

[064] De acordo com outro aspecto, a invenção descrita fornece uma composição farmacêutica que compreende um carreador farma- ceuticamente aceitável e um produto celular que compreende uma po- pulação melhorada e enriquecida de células T exterminadoras de cito-

cina superativadas (SCKTCs) produzidas pelo método descrito e reivin- dicado. De acordo com uma modalidade da composição farmacêutica produzida pelo método descrito no presente documento, a população expandida e enriquecida de SCKTCs compreende uma subpopulação de células CD3+Vα24+Vβ11+, células CD3+Vα24- ou células CD3+CD56+. De acordo com outra modalidade, a subpopulação com- preende ainda células Vβ11+. De acordo com uma modalidade, a popu- lação expandida e enriquecida de SCKTCs compreende uma subpopu- lação de células CD3+Vα24+Vβ11+, células CD3+Vα24- ou células CD3+CD56+.

[065] De acordo com algumas modalidades, a composição farma- cêutica compreende ainda um agente terapêutico adicional selecionado do grupo que consiste em um agente quimioterápico, um agente modi- ficador de resposta biológica e um agente imunoterapêutico.

[066] De acordo com alguma modalidade, o agente imunoterapêu- tico é um anticorpo. De acordo com algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal, um anticorpo humanizado, um anticorpo hu- mano ou um anticorpo quimérico.

[067] As composições e os métodos descritos pela presente divul- gação fornecem uma série de vantagens em relação às imunoterapias atuais. Por exemplo, embora a terapia com CAR-T seja uma promessa para o tratamento de vários cânceres, a terapia com CAR-T apresenta uma série de desvantagens. A terapia com células CAR T pode desen- cadear uma série de efeitos colaterais, muitos dos quais começam su- tilmente, mas podem piorar rapidamente. Uma complicação particular- mente grave é a síndrome de liberação de citocinas (SRC), também co- nhecida como tempestade de citocinas. Uma vez que as células CAR-T entram no corpo, as mesmas iniciam uma liberação massiva de citoci- nas, que convocam outros elementos do sistema imunológico para se juntarem ao ataque às células tumorais. A SRC é caracterizada por fe- bre, hipotensão e insuficiência respiratória associadas a citocinas séri- cas elevadas, incluindo interleucina-6 (IL-6) (Davila et al., Sci. Transl. Med. 6, 224ra25 (2014); a SRC usualmente ocorre alguns dias após a infusão de células T no pico da expansão das células CAR T. A afecção tende a ser especialmente grave em pacientes com cânceres extensos.

[068] As composições e os métodos da presente invenção contor- nam vantajosamente o problema da SRC, devido ao fato de que o pro- duto celular infundido é próprio e a tempestade de citocinas foi enviada para a cultura celular.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[069] A Figura 1A e a Figura 1B mostram os resultados de experi- mentos de citometria de fluxo para determinar a proporção de células- alvo SCKTC na população expandida de CTKCs no Exemplo 3; a Figura 1A mostra a proporção de células que expressam marcadores de célu- las CD3+CD56+. A Figura 1B mostra a proporção de células que ex- pressam marcadores de células do tipo I NKT.

[070] As Figuras 2A-D mostram o efeito do tempo de adição de citocinas IL-12 e IL-7 na proporção de células que expressam marcado- res de células do tipo I NKT na população expandida de CTKCs no Exemplo 4. A citometria de fluxo foi usada para determinar a presença de células que expressam os marcadores de TCR Vα24 (Va24) e TCR Vβ11 (Vb11), em que uma porta foi definida com base em células Va24+Vb11+. A Figura 2A mostra os resultados para o Grupo A, em que IL-2 foi adicionada no início da cultura. A Figura 2B mostra os resultados para o Grupo B, em que IL-2 e IL-7 foram adicionadas simultaneamente no início da cultura. A Figura 2C mostra os resultados para o Grupo C, em que IL-2 e IL-7 foram adicionadas no dia 3 de cultura. A Figura 2D mostra os resultados para o Grupo D, em que IL-2 e IL-7 foram adicio- nados no dia 7 de cultura.

[071] As Figuras 3A-D mostram o efeito do tempo de adição de citocinas IL-15 na proporção de células que expressam marcadores de células do tipo I NKT na população expandida de CTKCs no Exemplo 5. Citometria de fluxo foi usada para determinar a presença de células que expressam TCR Vα24 (Va24) e TCR Vβ11 (Vb11), em que uma porta foi definida com base em células Va24+Vb11+. A Figura 3A mostra os resultados para o Grupo A, em que IL-2 e IL-7 foram adicionadas simul- taneamente no dia 7 de cultura, e IL-15 não foi adicionada. A Figura 3B mostra os resultados para o Grupo B, em que IL-2 e IL-7 foram adicio- nadas simultaneamente no dia 7 de cultura, e IL-15 foi adicionada no começo da cultura. A Figura 3C mostra os resultados para o Grupo C, em que IL-2 e IL-7 foram adicionadas simultaneamente no dia 7 de cul- tura, e IL-15 foi adicionada no dia 7 da cultura. A Figura 3D mostra os resultados para o Grupo D, em que IL-2 e IL-7 foram adicionadas simul- taneamente no dia 7 de cultura, e IL-15 foi adicionada no dia 14 da cul- tura.

[072] As Figuras 4A-D mostram o efeito do tempo de adição de citocinas IL-12 na proporção de células que expressam marcadores de células do tipo I NKT na população expandida de CTKCs no Exemplo 5. Citometria de fluxo foi usada para determinar a presença de células que expressam TCR Vα24 (Va24) e TCR Vβ11 (Vb11), em que uma porta foi definida com base em células Va24+Vb11+. A Figura 4A mostra os resultados para o Grupo A, em que IL-2 e IL-7 foram adicionadas simul- taneamente no dia 7 da cultura, IL-15 foi adicionada no dia 14 da cultura, e nenhuma IL-12 foi adicionada. A Figura 4B mostra os resultados para o Grupo B, em que IL-2 e IL-7 foram adicionadas simultaneamente no dia 7 da cultura, IL-15 foi adicionada no dia 14 da cultura, e IL-12 foi adicionada no começo da cultura. A Figura 4C mostra os resultados para o Grupo C, em que IL-2 e IL-7 foram adicionadas simultaneamente no dia 7 da cultura, IL-15 foi adicionada no dia 14 da cultura, e IL-12 foi adicionada no dia 7 da cultura. A Figura 4D mostra os resultados para o Grupo D, em que IL-2 e IL-7 foram adicionadas simultaneamente no dia 7 da cultura, IL-15 foi adicionada no dia 14 da cultura, e IL-12 foi adicio- nada no dia 20 da cultura.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[073] A presente divulgação é baseada, em parte, na revelação de um método ex vivo para preparar uma composição farmacêutica que compreende um produto celular que compreende uma população ex- pandida e enriquecida de células T exterminadoras de citocinas supera- tivadas (SCKTCs) com uma capacidade melhorada para secretar citoci- nas efetoras e citotoxicidade melhorada. Assim, a presente divulgação fornece métodos in vitro para geração de um grande número de SCKTCs funcionais, que podem ser adicionalmente usados para trans- ferências adotivas.

[074] Antes de as presentes composições e métodos serem des- critos, deve-se entender que esta divulgação não está limitada às molé- culas, composições e metodologias particulares descritas, na medida em que as mesmas podem variar. Deve-se, ainda, entender que a ter- minologia usada na descrição é para o propósito de, apenas, descrever versões ou modalidades particulares e não se destina a limitar o escopo da presente divulgação que será limitado apenas pelas reivindicações anexas. Deve ser entendido que essas modalidades não são limitadas à metodologia, protocolos e linhagens celulares, vetores e reagentes particulares descritos, na medida em que os mesmos podem variar. Deve ser entendido também que a terminologia usada no presente do- cumento tem o propósito de apenas descrever modalidades particulares e não é destinada a limitar o escopo das presentes modalidades e rei- vindicações. Além disso, os termos primeiro, segundo, terceiro e simila- res na descrição e nas reivindicações são usados para distinguir entre elementos simulares e não necessariamente para descrever uma ordem cronológica sequencial. Deve-se entender que os termos assim usados são intercambiáveis sob circunstâncias apropriadas e que as modalida- des da divulgação descritas no presente documento têm a capacidade para operação em outras sequências além das descritas ou ilustradas no presente documento.

DEFINIÇÕES

[075] A menos que definido de outra forma, todos os termos técni- cos e científicos usados no presente documento têm os mesmos signi- ficados conforme comumente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles descritos no presente documento possam ser usados na prática ou teste de modalidades da presente divulgação, os métodos, dispositivos e materiais preferenciais são agora descritos. To- das as publicações mencionadas no presente documento são incorpo- radas a título de referência. Nenhum aspecto no presente documento deve ser interpretado como uma suposição de que a divulgação não é autorizada a antedatar tal divulgação em virtude da divulgação anterior.

[076] Conforme usado no relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “uma”, “o” e “a” incluem referentes plurais a menos que o contexto indique claramente o contrário.

[077] O termo "cerca de", conforme usado no presente documento, ao se referir a um valor mensurável, tal como uma quantidade, uma du- ração de tempo e similares, destina-se a abranger variações de ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, ±0,9%, ±0,8%, ±0,7%, ±0,6%, ±0,5%, ±0,4%, ±0,3%, ±0,2% ou ±0,1% do valor especificado, na medida em que essas varia- ções são apropriadas para realizar os métodos divulgados.

[078] O sintagma "e/ou", conforme usado no presente documento no relatório descritivo e nas reivindicações, deve ser entendido como significando "qualquer um ou ambos" os elementos assim ligados, isto é, elementos que estão conjuntivamente presentes em alguns casos e desconjuntivamente presentes em outros casos. Outros elementos po- dem estar opcionalmente presentes diferentes dos elementos especifi- camente identificados pela cláusula "e/ou", relacionados ou não relaci- onados àqueles elementos especificamente identificados a não ser que indicado claramente ao contrário. Assim, como um exemplo não limi- tante, uma referência a “A e/ou B”, quando usado em conjunto com uma linguagem aberta, tal como “que compreende” pode se referir. De acordo com uma modalidade, a A sem B (opcionalmente incluindo ele- mentos diferentes de B). Em algumas modalidades, a B sem A (opcio- nalmente incluindo elementos diferentes de A); em ainda outra modali- dade, a A e B (opcionalmente incluindo outros elementos); etc.

[079] Conforme usado no presente documento no relatório descri- tivo e nas reivindicações, "ou" deve ser entendido como tendo o mesmo significado de "e/ou" conforme definido acima. Por exemplo, ao se se- parar itens em uma lista, "ou" ou "e/ou" deve ser interpretado como sendo inclusivo, isto é, a inclusão de pelo menos um, mas também in- cluindo mais do que um, dentre um número ou uma lista de elementos e, opcionalmente, itens adicionais não listados. Somente os termos cla- ramente indicados em contrário, tais como "apenas um dentre" ou "exa- tamente um dente" ou, quando usados nas reivindicações, "consistindo em", irão se referir à inclusão de exatamente um elemento de um nú- mero ou lista de elementos. Em geral, o termo "ou" conforme usado no presente documento somente deverá ser interpretado como indicando alternativas exclusivas (isto é, "um ou outro, mas não ambos") quando precedido por termos de exclusividade, “ou”, “um dentre”, “apenas um dentre” ou "exatamente um dentre”. “Consistir essencialmente em”, quando usado nas reivindicações, deve ter seu significado comum con- forme usado no campo das leis de patente.

[080] Conforme usado no presente documento, o sintagma "nú- mero inteiro de X a Y" significa qualquer número inteiro que inclui os pontos finais. Isto é, quando uma faixa é divulgada, cada número inteiro na faixa incluindo os pontos finais é divulgado. Por exemplo, o sintagma "número inteiro de X a Y" divulga 1, 2, 3, 4 ou 5, bem como a faixa de 1 a 5.

[081] Conforme usado no presente documento, quando usados para definir produtos, composições e métodos, o termo "compreender" (e qualquer forma de compreender, tal como "compreendem" e "com- preende"), "ter" (e qualquer forma de ter, tal como "têm" e "tem"), "in- cluir" (e qualquer forma de incluir, tal como "inclui" e "incluem") ou "con- ter" (e qualquer forma de conter, tal como "contém" e "contêm") são abertos e não excluem elementos ou etapas de métodos não citadas adicionais. Assim, um polipeptídeo "compreende" uma sequência de aminoácidos quando a sequência de aminoácidos pode ser parte da se- quência de aminoácidos final do polipeptídeo. Tal polipeptídeo pode ter até diversas centenas de resíduos de aminoácidos adicionais (por exemplo, peptídeos de alvejamento e etiqueta conforme mencionado no presente documento). "Consistir essencialmente em" significa excluir outros componentes ou etapas de qualquer significado essencial. As- sim, uma composição que consiste essencialmente nos componentes citados não excluiria contaminantes vestigiais e carreadores farmaceu- ticamente aceitáveis. Um polipeptídeo "consiste essencialmente em" uma sequência de aminoácidos quando tal sequência de aminoácidos está presente com, eventualmente, apenas alguns resíduos de aminoá- cidos adicionais. “Consistir em” significa excluir mais do que elementos vestigiais de outros componentes ou etapas. Por exemplo, um polipep- tídeo "consiste em" uma sequência de aminoácidos quando o polipeptí- deo não contém nenhum aminoácido, mas a sequência de aminoácidos citada.

[082] Conforme usado no presente documento, "substancialmente igual" significa dentro de uma faixa conhecida por estar correlacionada a uma faixa anormal ou normal em uma determinada métrica medida. Por exemplo, se uma amostra de controle for de um paciente doente, substancialmente igual está dentro de uma faixa anormal. Se uma amostra de controle for de um paciente conhecido por não ter a afecção sendo testada, substancialmente igual está dentro de uma faixa normal para esta determinada métrica.

[083] A menos que definido de outro modo, todos os termos técni- cos e científicos usados no presente documento têm o mesmo signifi- cado conforme comumente entendido por aquele com habilidade co- mum na técnica ao qual a invenção pertence. Embora quaisquer méto- dos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos na presente invenção possam ser também usados na prática ou testagem da pre- sente invenção, os materiais e métodos preferenciais são descritos no presente documento.

[084] Conforme usado no presente documento, os termos "ativar", "estimular", "melhorar", "aumentar" e/ou "induzir" (e termos semelhan- tes) são usados de maneira intercambiável para se referir de modo geral ao ato de melhorar ou aumentar, direta ou indiretamente, uma concen- tração, nível, função, atividade ou comportamento relativo ao natural, esperado ou médio ou relativo a uma condição de controle. "Ativar" re- fere-se a uma resposta primária induzida pela ligação de uma porção química de superfície celular. Por exemplo, no contexto de receptores, tal estimulação envolve a ligação de um receptor e um evento de trans- dução de sinal subsequente. Além disso, o evento de estimulação pode ativar uma célula e regular crescente ou decrescentemente a expressão ou secreção de uma molécula. Assim, a ligação das porções químicas de superfície celular, mesmo na ausência de um evento de transdução de sinal direto, pode resultar na reorganização das estruturas de citoe- squeleto ou na coalescência das porções químicas de superfície celular,

cada uma das quais pode servir para aumentar, modificar ou alterar res- postas celulares subsequentes.

[085] Conforme usado no presente documento, os termos "ati- vando ou ativar células T exterminadoras de citocina" ou "ativação de CKTCl" referem-se a um processo que causa ou resulta em uma ou mais respostas celulares de CKTCs, incluindo: proliferação, diferencia- ção, secreção de citocinas, liberação de moléculas efetoras citotóxicas, atividade citotóxica e expressão de marcadores de ativação. Conforme usado no presente documento, uma "célula T assassina de citocina ati- vada" refere-se a uma célula T exterminadora de citocina que recebeu um sinal de ativação e, assim, demonstra uma ou mais respostas celu- lares, incluindo proliferação, diferenciação, secreção de citocina, libera- ção de molécula efetora citotóxica, atividade citotóxica e expressão de marcadores de ativação. A ativação da CKTC pode compreender um ou mais dentre induzir a secreção de uma citocina da CKTC, estimular a proliferação da CKTC e regular crescentemente a expressão de um marcador de superfície celular na CKTC. A citocina pode ser uma ou mais dentre IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-15, TNF-α, TNF-β e IFN -γ. De acordo com certas modalidades, a ativação de uma CKTC pode compreender a secreção de uma ou mais dentre IL-4, IL-5, Il-6, IL- 10 ou IFN-γ. Ensaios adequados para medir a ativação de CKTC são conhecidos na técnica e são descritos no presente documento.

[086] O termo "ativo" refere-se ao ingrediente, componente ou constituinte das composições farmacêuticas da invenção descrita res- ponsáveis por um efeito terapêutico pretendido.

[087] Conforme usado no presente documento, o termo "adminis- tração" e suas várias formas gramaticais, conforme se aplica a um ma- mífero, célula, tecido, órgão ou fluido biológico, referem-se sem limita- ção ao contato de um ligante exógeno, reagente, placebo, pequena mo- lécula, agente farmacêutico, agente terapêutico, agente de diagnóstico ou composição ao sujeito, célula, tecido, órgão ou fluido biológico e se- melhantes. "Administração" pode se referir, por exemplo, a métodos te- rapêuticos, farmacocinéticos, diagnósticos, de pesquisa, placebos e ex- perimentais. “Administração” também abrange tratamentos in vitro e ex vivo, por exemplo, de uma célula, por uma composição de reagente, diagnóstico, ligação ou por outra célula.

[088] Conforme usado no presente documento, o termo "terapia celular adaptativa" ou "transferência adaptativa" refere-se a um trata- mento usado para ajudar o sistema imunológico a combater doenças pelas quais as células T coletadas de um paciente são expandidas (cul- tivadas em um laboratório em cultura) para aumentar o número de cé- lulas T com capacidade para combater a doença. Essas células T são então devolvidas ao paciente.

[089] Conforme usado no presente documento, o termo "anti- corpo" é usado no sentido mais amplo e abrange várias estruturas de anticorpo, incluindo, porém sem limitação, anticorpos monoclonais, an- ticorpos policlonais, fragmentos de anticorpos, anticorpos quiméricos e anticorpos totalmente sintético contanto que os mesmos exibam a ativi- dade de ligação a antígeno desejada. Na natureza, os anticorpos são proteínas séricas cujas moléculas possuem pequenas áreas de sua su- perfície que são complementares a pequenos agrupamentos químicos em seus alvos. Essas regiões complementares (denominadas sítios de combinação de anticorpos ou sítios de ligação a antígeno), das quais há pelo menos duas por molécula de anticorpo e, em alguns tipos de mo- léculas de anticorpo, dez, oito ou, em algumas espécies, tanto quanto 12, podem reagir com sua região complementar correspondente em um antígeno (o determinante antigênico ou epítopo) para ligar várias molé- culas de antígeno multivalente umas às outras para formar uma treliça. A unidade estrutural básica de uma molécula de anticorpo inteira con-

siste em quatro cadeias de polipeptídeo, duas cadeias leves (L) idênti- cas (cada uma contendo cerca de 220 aminoácidos) e duas cadeias pe- sadas (H) idênticas (cada uma contendo usualmente cerca de 440 ami- noácidos). As duas cadeias pesadas e duas cadeias leves são mantidas juntas por uma combinação de ligações (de dissulfeto) não covalentes e covalentes. A molécula é composta por duas metades idênticas, cada uma com um sítio de ligação a antígeno idêntico composto pela região N-terminal de uma cadeia leve e a região N-terminal de uma cadeia pe- sada. Ambas as cadeias leve e pesada usualmente cooperam para for- mar a superfície de ligação a antígeno.

[090] Os anticorpos humanos mostram dois tipos de cadeias leves, κ e λ; moléculas individuais de imunoglobulina geralmente são apenas uma ou outra. Em mamíferos, existem cinco classes de anticorpos, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, cada um com sua própria classe de cadeia pesada. Todas as cinco classes de imunoglobulinas diferem de outras proteínas séricas por apresentarem uma ampla gama de mobilidade eletroforética e não serem homogêneas. Essa heterogeneidade - que as moléculas individuais de IgG, por exemplo, diferem umas das outras em carga lí- quida - é uma propriedade intrínseca das imunoglobulinas.

[091] O princípio da complementaridade, que muitas vezes é com- parado ao encaixe de uma chave em uma fechadura, envolve forças de ligação relativamente fracas (ligações hidrofóbicas e de hidrogênio, for- ças de van der Waals e interações iônicas), que têm a capacidade para atuar efetivamente apenas quando as duas moléculas reagentes podem se aproximar muito umas das outras e, na verdade, tão próximas que os átomos ou grupos de átomos constituintes que se projetam de uma molécula podem se encaixar em depressões ou reentrâncias comple- mentares na outra. As interações de antígeno-anticorpo mostram um alto grau de especificidade, que se manifesta em vários níveis. Redu-

zida ao nível molecular, a especificidade significa que os sítios de com- binação de anticorpos para um antígeno têm uma complementaridade nada semelhante aos determinantes antigênicos de um antígeno não relacionado. Sempre que determinantes antigênicos de dois antígenos diferentes têm alguma semelhança estrutural, pode ocorrer algum grau de ajuste de um determinante no sítio de combinação de alguns anticor- pos para o outro, e esse fenômeno dá origem a reações cruzadas. As reações cruzadas são de grande importância para a compreensão da complementaridade ou especificidade das reações de antígeno-anti- corpo. A especificidade ou complementaridade imunológica torna pos- sível a detecção de pequenas quantidades de impurezas/contamina- ções dentre antígenos.

[092] Os anticorpos monoclonais (mAbs) podem ser gerados fun- dindo-se células de baço de camundongo de um doador imunizado a uma linhagem de células de mieloma de camundongo para produzir clo- nes de hibridoma de camundongo estabelecidos que crescem em meio seletivo. Uma célula de hibridoma é uma célula híbrida imortalizada re- sultante da fusão in vitro de uma célula B secretora de anticorpos com uma célula de mieloma. A imunização in vitro, que se refere à ativação primária de células B específicas para antígeno em cultura, é outro meio bem estabelecido de produção de anticorpos monoclonais de camun- dongo.

[093] Diversas bibliotecas de genes variáveis de cadeia pesada (VH) e leve (Vκ e Vλ) de imunoglobulina de linfócitos de sangue perifé- rico também podem ser amplificadas por amplificação por reação em cadeia de polimerase (PCR). Os genes que codificam cadeias de poli- peptídeo únicas em que os domínios variáveis de cadeia pesada e leve estão ligados por um espaçador polipeptídico (Fv ou scFv de cadeia simples) podem ser produzidos combinando-se aleatoriamente os ge- nes V de cadeias pesada e leve com o uso de PCR. Uma biblioteca combinatória pode então ser clonada para exibição na superfície do bac- teriófago filamentoso pela fusão a uma proteína de revestimento menor na ponta do fago.

[094] A técnica de seleção guiada é baseada no embaralhamento de gene V de imunoglobulina humana com os genes V de imunoglobu- lina de roedor. O método envolve (i) embaralhar um repertório de ca- deias VL humanas com o domínio de região variável de cadeia pesada (VH) de um anticorpo monoclonal de camundongo reativo com um antí- geno de interesse; (ii) selecionar Fabs meio-humanos nesse antígeno (iii) usar os genes de VL selecionados como "domínios de fixação" para uma biblioteca de cadeias pesadas humanas em um segundo embara- lhamento para isolar fragmentos Fab de clones que têm genes de ca- deia leve humana; (v) transfectar células de mieloma de camundongo por eletroporação com vetores de expressão de células de mamíferos contendo os genes; e (vi) expressar os genes V do Fab reativo com o antígeno como uma molécula de anticorpo IgG1 completa no mieloma de camundongo.

[095] Conforme usado no presente documento, o termo "apresen- tação de antígeno" refere-se à exibição de antígeno na superfície de uma célula na forma de fragmentos de peptídeo ligados a moléculas de MHC.

[096] Conforme usado no presente documento, o termo “célula apresentadora de antígeno (APC)” refere-se a uma classe de células com a capacidade para exibir em sua superfície (“apresentar”) um ou mais antígenos na forma de complexo de peptídeo-MHC reconhecível por células efetoras específicas do sistema imunológico, e induzindo, assim, uma resposta imunológica celular eficaz contra o antígeno ou antígenos sendo apresentados. Os exemplos de APCs profissionais são células dendríticas e macrófagos, embora qualquer célula que expresse moléculas MHC de Classe I ou II possa apresentar potencialmente o antígeno de peptídeo. Uma APC pode ser uma "APC artificial", que se refere a uma célula que é geneticamente modificada para apresentar um ou mais antígenos. Antes que uma célula T possa reconhecer uma proteína estranha, a proteína tem que ser processada dentro de uma célula apresentadora de antígeno ou célula-alvo para que possa ser exi- bida como complexos de peptídeo-MHC na superfície celular.

[097] Conforme usado no presente documento, o termo "proces- samento de antígeno" refere-se à degradação intracelular de proteínas estranhas em peptídeos que podem se ligar a moléculas de MHC para apresentação às células T.

[098] Conforme usado no presente documento, o termo "autólogo" refere-se a ser derivado do mesmo indivíduo. Conforme usado no pre- sente documento, o termo "alogênico" refere-se a ser derivado de dois indivíduos geneticamente diferentes.

[099] Conforme usado no presente documento, o termo "autofa- gia" refere-se à digestão e quebra por uma célula de suas próprias or- ganelas e proteínas em lisossomas.

[100] Conforme usado no presente documento, o termo "biomar- cador" (ou "bioassinatura") refere-se a um peptídeo, proteína, ácido nu- cleico, anticorpo, gene, metabólito ou qualquer outra substância usada como um indicador de um estado biológico. O mesmo uma caracterís- tica que é medida objetivamente e avaliada como um indicador celular ou molecular de processos biológicos normais, processos patogênicos ou respostas farmacológicas a uma intervenção terapêutica. O termo "indicador", conforme usado no presente documento, refere-se a qual- quer substância, número ou razão derivada de uma série de fatos ob- servados que podem revelar mudanças relativas como uma função de tempo; ou um sinal, signo, marca, nota ou sintoma que é visível ou evi- dência de sua existência ou presença. Uma vez que um biomarcador proposto foi validado, o mesmo pode ser usado para diagnosticar o risco de doença, a presença de doença em um indivíduo ou para personalizar tratamentos para a doença em um indivíduo (opções de tratamento com fármaco ou regimes de administração). Na avaliação de potenciais tera- pias com fármaco, um biomarcador pode ser usado como substituto para um ponto final natural, tal como sobrevivência ou morbidade irre- versível. Se um tratamento alterar o biomarcador e essa alteração tiver uma conexão direta à saúde melhorada, o biomarcador pode servir como um ponto final substituto para avaliar o benefício clínico. Os pon- tos finais clínicos são variáveis que podem ser usadas para medir como os pacientes se sentem, funcionam ou sobrevivem. Os pontos finais substitutos são biomarcadores que se destinam a substituir um ponto final clínico; esses biomarcadores demonstraram prever um ponto final clínico com um nível de confiança aceitável para os reguladores e a co- munidade clínica.

[101] Conforme usado no presente documento, o termo "câncer" refere-se a doenças em que células anormais se dividem sem controle e têm a capacidade para invadir outros tecidos. Existem mais de 100 tipos diferentes de câncer. A maioria dos cânceres recebe o nome do órgão ou tipo de célula no qual se inicia - por exemplo, o câncer que começa no cólon é chamado de câncer de cólon; o câncer que começa nos melanócitos da pele é chamado melanoma. Os tipos de câncer po- dem ser agrupados em categorias mais amplas. As principais categorias de câncer incluem: carcinoma (ou seja, um câncer que começa na pele ou em tecidos que revestem ou cobrem órgãos internos e seus subtipos, incluindo adenocarcinoma, carcinoma de células basais, carcinoma de células escamosas e carcinoma de células transicionais); sarcoma (ou seja, um câncer que começa no osso, cartilagem, gordura, músculo, va- sos sanguíneos ou outro tecido conjuntivo ou de suporte); leucemia (ou seja, um câncer que começa no tecido formador de sangue (por exem-

plo, medula óssea) e faz com que um grande número de células san- guíneas anormais sejam produzidas e entrem no sangue; linfoma e mi- eloma (ou seja, cânceres que começam nas células do sistema imuno- lógico) e cânceres do sistema nervoso central (ou seja, cânceres que começam nos tecidos do cérebro e da medula espinhal). O termo "sín- drome mielodisplásica" refere-se a um tipo de câncer em que a medula óssea não produz células sanguíneas saudáveis suficientes (glóbulos brancos, glóbulos vermelhos e plaquetas) e existem células anormais no sangue e/ou medula óssea. A síndrome mielodisplásica pode se tor- nar leucemia mieloide aguda (LMA).

[102] Conforme usado no presente documento, o termo "CD1d" re- fere-se a uma família de glicoproteínas transmembranares, que estão estruturalmente relacionadas às proteínas de MHC e formam heterodí- meros com beta-2-microglobulinas que medeiam a apresentação de an- tígenos principalmente lipídicos e glicolipídicos de origem microbiana ou própria às células T.

[103] Conforme usado no presente documento, o termo "quimio- cina" refere-se a uma classe de citocinas quimiotáticas que sinalizam aos leucócitos para se moverem em uma direção específica.

[104] Conforme usado no presente documento, o termo "compo- nente" refere-se a uma parte, elemento ou ingrediente constituinte.

[105] Conforme usado no presente documento, o termo "composi- ção" refere-se a um material formado por uma mistura de duas ou mais substâncias.

[106] O termo "afecção", conforme usado no presente documento, refere-se a uma variedade de estados de saúde e deve incluir distúrbios ou doenças causadas por qualquer mecanismo ou distúrbio subjacente.

[107] Conforme usado no presente documento, o termo "contato" e suas várias formas gramaticais referem-se a um estado ou condição de contato ou de proximidade imediata ou local. O contato de uma com- posição com um destino-alvo pode ocorrer por qualquer meio de admi- nistração conhecido pelo versado na técnica.

[108] Conforme usado no presente documento, o termo "molécula coestimuladora" refere-se a um ou dois ou mais grupos de átomos liga- dos uns aos outros que são exibidos na superfície celular de uma APC que têm um papel na ativação de uma célula T virgem para se tornar uma célula efetora. Por exemplo, as proteínas MHC, que apresentam antígenos estranhos ao receptor de célula T, também exigem proteínas coestimulatórias que se ligam a receptores complementares na superfí- cie da célula T para resultar na ativação da célula T.

[109] Conforme usado no presente documento, o termo "receptor coestimulador" refere-se a um receptor de superfície celular em linfóci- tos virgens, através do qual os mesmos recebem sinais adicionais àque- les recebidos através do receptor de antígeno e que são necessários para a ativação completa do linfócito. Os exemplos são CD30 e CD40 em células B e CD27 e CD28 em células T.

[110] Conforme usado no presente documento, o termo "ajuda cognata" refere-se a um processo que ocorre de forma mais eficiente no contexto de uma interação íntima com uma célula T auxiliar.

[111] Conforme usado no presente documento, o termo "cultura" e suas outras formas gramaticais referem-se a um processo pelo qual uma população de células é cultivada e proliferada em um substrato em um meio artificial.

[112] Conforme usado no presente documento, o termo "citocina" refere-se a pequenas substâncias de proteína solúveis secretadas por células que têm uma variedade de efeitos em outras células. As citoci- nas medeiam muitas funções fisiológicas importantes, incluindo o cres- cimento, desenvolvimento, cicatrização de feridas e a resposta imuno- lógica. As mesmas atuam ligando-se aos seus receptores específicos para célula localizados na membrana celular, o que permite que uma cascata de transdução de sinal distinta comece na célula, o que even- tualmente levará a alterações bioquímicas e fenotípicas em células-alvo. As citocinas podem atuar tanto local quanto distantemente de um sítio de liberação. As mesmas incluem as citocinas do tipo I, que abrangem muitas das interleucinas, bem como vários fatores de crescimento he- matopoiéticos; citocinas do tipo II, incluindo os interferons e interleucina- 10; moléculas relacionadas ao fator de necrose tumoral ("TNF"), inclu- indo TNF-α e linfotoxina; membros da superfamília de imunoglobulinas, incluindo interleucina 1 ("IL-1"); e as quimiocinas, uma família de molé- culas que desempenham um papel crítico em uma ampla variedade de funções imunes e inflamatórias. A mesma citocina pode ter efeitos dife- rentes em uma célula, dependendo do estado da célula. As citocinas frequentemente regulam a expressão de e desencadeiam cascatas de outras citocinas. Exemplos não limitantes de citocinas incluem, por exemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL -11, IL- 12/IL-23 P40, IL13, IL-15, IL-15/IL15-RA, IL-17, IL-18, IL-21, IL-23, TGF- β, IFNγ, GM-CSF, Groα, MCP-1 e TNF-α.

[113] Conforme usado no presente documento, o termo "célula dendrítica" ou "DC" descreve uma população diversa de tipos de células morfologicamente semelhantes encontrados em uma variedade de teci- dos linfoides e não linfoides que apresentam antígenos estranhos às células T, consultar Steinman, Ann. Rev. Immunol. 9:271-296 (1991). Conforme usado no presente documento, o termo "derivado de" se des- tina a abranger qualquer método para receber, obter ou modificar algo de uma fonte de origem.

[114] Conforme usado no presente documento, o termo "marcador detectável" se refere a marcadores selecionáveis e marcadores de en- saio. O termo "marcadores selecionáveis" refere-se a uma variedade de produtos de gene para os quais as células transformadas com um cons- truto de expressão podem ser selecionadas ou triadas, incluindo marca- dores de resistência a fármacos, marcadores antigênicos úteis na clas- sificação de células ativadas por fluorescência, marcadores de aderên- cia, tais como receptores para ligantes de aderência permitindo aderên- cia seletiva e semelhantes.

[115] Conforme usado no presente documento, o termo "resposta detectável" refere-se a qualquer sinal ou resposta que pode ser detec- tada em um ensaio, que pode ser realizado com ou sem um reagente de detecção. As respostas detectáveis incluem, porém sem limitação, decaimento radioativo e emissão de energia (por exemplo, fluorescente, ultravioleta, infravermelho, visível), absorção, polarização, fluorescên- cia, fosforescência, transmissão, reflexão ou transferência de ressonân- cia. As respostas detectáveis também incluem mobilidade cromatográ- fica, turbidez, mobilidade eletroforética, espectro de massa, espectro ul- travioleta, espectro infravermelho, espectro de ressonância magnética nuclear e difração de raios-x. Alternativamente, uma resposta detectável pode ser o resultado de um ensaio para medir uma ou mais proprieda- des de um material biológico, tais como ponto de fusão, densidade, con- dutividade, ondas acústicas de superfície, atividade catalítica ou com- posição elementar. Um "reagente de detecção" é qualquer molécula que gera uma resposta detectável indicativa da presença ou ausência de uma substância de interesse. Os reagentes de detecção incluem qual- quer uma dentre uma variedade de moléculas, tais como anticorpos, sequências de ácidos nucleicos e enzimas. Para facilitar a detecção, um reagente de detecção pode compreender um marcador.

[116] Os termos "doença" ou "distúrbio", conforme usados no pre- sente documento, referem-se a um comprometimento da saúde ou uma afecção de funcionamento anormal.

[117] Conforme usado no presente documento, o termo "dose" re- fere-se à quantidade de uma substância terapêutica prescrita para ser tomada de uma vez. O termo "dose máxima tolerada", conforme usado no presente documento, refere-se à dose mais alta de um fármaco ou tratamento que não cause efeitos colaterais inaceitáveis.

[118] O termo “endógeno”, conforme usado no presente docu- mento, refere-se a qualquer material de ou produzido dentro de um or- ganismo, célula, tecido ou sistema.

[119] Conforme usado no presente documento, o termo "enrique- cer" refere-se ao aumento da proporção de uma substância desejada, por exemplo, para aumentar a frequência relativa de um subtipo de cé- lula em comparação com sua frequência natural em uma população de células. Seleção positiva, seleção negativa ou ambas são geralmente consideradas necessárias para qualquer esquema de enriquecimento. Os métodos de seleção incluem, sem limitação, separação magnética e FACS. Independentemente da tecnologia específica usada para enri- quecimento, os marcadores específicos usados no processo de seleção são críticos, uma vez que estágios de desenvolvimento e respostas es- pecíficas para ativação podem alterar o perfil antigênico de uma célula.

[120] Conforme usado no presente documento, os termos "expan- dir de uma população de células T exterminadoras de citocinas (CKTCs)" ou "expansão de células T exterminadoras de citocinas (CKTC)" referem-se a um processo em que uma população de células T exterminadoras de citocinas sofre uma série de células divisões e, portanto, se expande em número de células (por exemplo, por cultura in vitro). O termo "células T exterminadoras de citocinas superativadas ex- pandidas" refere-se a células T exterminadoras de citocinas superativa- das obtidas através da expansão celular.

[121] Conforme usado no presente documento, o termo "expres- são" se destina a abranger a produção de um fenótipo observável por um gene, usualmente direcionando-se a síntese de uma proteína. O mesmo inclui a biossíntese de mRNA, biossíntese de polipeptídeo, ati- vação de polipeptídeo, por exemplo, por modificação pós-tradução ou uma ativação da expressão alterando-se a localização subcelular ou por recrutamento para cromatina.

[122] Conforme usado no presente documento, o termo "Fas" re- fere-se a uma proteína de membrana do tipo 2 encontrada em linfócitos que pertence à superfamília de TNF. Em células que expressam Fas, a ligação do receptor de morte celular Fas pelo ligante Fas (FasL) resulta em morte celular apoptótica, mediada pela ativação da caspase.

[123] Conforme usado no presente documento, o termo "citometria de fluxo" refere-se a uma ferramenta para interrogar o fenótipo e as ca- racterísticas das células. A mesma detecta células ou partículas na me- dida em que as mesmas se movem em uma corrente líquida por meio de um laser (amplificação de luz por emissão estimulada de radia- ção)/feixe de luz além de uma área de detecção. A dispersão de luz relativa e a fluorescência discriminada por cor das partículas microscó- picas são medidas. A análise de fluxo e a diferenciação das células são baseadas no tamanho, granularidade e se uma célula está carregando moléculas fluorescentes na forma de anticorpos ou corantes. Conforme a célula passa através do feixe de laser, a luz é espalhada em todas as direções, e a luz espalhada na direção para frente em ângulos baixos (0,5-10º) do eixo geométrico é proporcional ao quadrado do raio de uma esfera e assim ao tamanho da célula ou partícula. A luz pode entrar na célula; assim, a dispersão de luz de 90º (ângulo reto, lateral) pode ser marcada com anticorpos ligados a fluorocromo ou manchada com mem- brana fluorescente, citoplasmática ou corantes nucleares. Assim, a dife- renciação de tipos de células, a presença de receptores e antígenos de membrana, potencial de membrana, pH, atividade enzimática e conte-

údo de DNA podem ser facilitados. Os citômetros de fluxo são multipa- râmetros, registrando várias medições em cada célula; portanto, é pos- sível identificar uma subpopulação homogênea dentro de uma popula- ção heterogênea (Marion G. Macey, Flow cytometry: principles and ap- plications, Humana Press, 2007). A seleção de células ativadas por flu- orescência (FACS), que permite o isolamento de populações de células distintas muito semelhantes em características físicas para serem sepa- radas por tamanho ou densidade, usa etiquetas fluorescentes para de- tectar proteínas de superfície que são expressas diferencialmente, per- mitindo que sejam feitas distinções finas entre populações de células fisicamente homogêneas.

[124] Conforme usado no presente documento, os termos "formu- lação" e "composição" são usados de maneira intercambiável no pre- sente documento para se referir a um produto da presente invenção que compreende todos os ingredientes ativos e inertes. Os termos "formula- ção farmacêutica" ou "composição farmacêutica", conforme usado no presente documento, referem-se a uma formulação ou composição que é empregada para prevenir, reduzir em intensidade, curar ou tratar de outra forma uma afecção ou doença alvo.

[125] Conforme usado no presente documento, o termo “equiva- lente funcional” ou “funcionalmente equivalente” é usado de forma inter- cambiável no presente documento para se referir a substâncias, molé- culas, polinucleotídeos, proteínas, peptídeos ou polipeptídeos que têm efeitos ou uso similar ou idêntico.

[126] Conforme usado no presente documento, o termo "cresci- mento celular" é o processo pelo qual as células acumulam massa e aumentam em tamanho físico. Existem muitos exemplos diferentes na natureza de como as células podem crescer. Em alguns casos, o tama- nho da célula é proporcional ao conteúdo de DNA. Por exemplo, a repli- cação contínua do DNA na ausência de divisão celular (chamada de endorreplicação) resulta em tamanho de célula aumentado. Os mega- carioblastos, que amadurecem em megacariócitos granulares, as célu- las produtoras de plaquetas da medula óssea, tipicamente crescem dessa maneira. Por uma estratégia diferente, os adipócitos podem cres- cer até aproximadamente 85 a 120 μm, acumulando-se lipídios intrace- lulares. Em contraste com a endorreplicação ou acúmulo de lipídios, al- gumas células diferenciadas terminalmente, tais como neurônios e cé- lulas do músculo cardíaco, param de se dividir e crescem sem aumentar seu conteúdo de DNA. Essas células aumentam proporcionalmente seu conteúdo de macromoléculas (principalmente proteínas) até um ponto necessário para realizar suas funções especializadas. Isso envolve a coordenação entre indicadores extracelulares de nutrientes e fatores de crescimento e redes de sinalização intracelular responsáveis por con- trolar a disponibilidade de energia celular e a síntese macromolecular. Talvez o crescimento celular mais firmemente regulado ocorra nas cé- lulas em divisão, em que o crescimento celular e a divisão celular são processos claramente separáveis. As células em divisão geralmente de- vem aumentar de tamanho com cada passagem através do ciclo de di- visão celular para garantir que um tamanho de célula médio consistente seja mantido. Para uma célula de mamífero em divisão típica, o cresci- mento ocorre na fase G1 do ciclo celular e é fortemente coordenado com a fase S (síntese de DNA) e a fase M (mitose). A influência combi- nada de fatores de crescimento, hormônios e disponibilidade de nutri- entes fornece os indicadores externos para o crescimento das células. Guertin, DA, Sabatini, DM, "Cell Growth", em The Molecular Basis of Cancer (4ª Edição) Mendelsohn, J. et al Eds, Saunders (2015), 179-190.

[127] Conforme usado no presente documento, o termo "prolifera- ção celular" refere-se ao processo que resulta em um aumento do nú- mero de células e é definido pelo equilíbrio entre as divisões celulares e a perda celular por meio da morte ou diferenciação celular.

[128] Conforme usado no presente documento, o termo “fator es- timulador de colônias de granulócitos-macrófagos” (GM-CSF) refere-se a uma citocina que promove a proliferação e diferenciação de células progenitoras hematopoiéticas e a geração de neutrófilos, eosinófilos e macrófagos. Em sinergia com outras citocinas, tais como fator de célu- las-tronco, IL-3, eritropoietina e trombopoietina, o mesmo também esti- mula células progenitoras eritroides e de megacariócitos (Barreda, DR, et al, Developmental & Comparative Immunol. (2004) 28 (50: 509-554). O GM-CSF é produzido por vários tipos de células, incluindo células do estroma, células de Paneth, macrófagos, células dendríticas (DCs), cé- lulas endoteliais, células do músculo liso, fibroblastos, condrócitos e cé- lulas T Th1 e Th17 (Francisco-Cruz, A. et al, Medical Oncology (2014) 31: 774 et al.).

[129] Conforme usado no presente documento, os termos "res- posta imunológica" e "mediada imunologicamente" são usados de forma intercambiável no presente documento e se referem a qualquer expres- são funcional do sistema imunológico de um sujeito, contra antígenos estranhos ou próprios, quer as consequências dessas reações sejam benéficas ou prejudiciais ao sujeito.

[130] Conforme usado no presente documento, os termos "imuno- modulador", "modulador imune" e "modulatório imune" são usados de forma intercambiável no presente documento para se referir a uma substância, agente ou célula que tem a capacidade para aumentar ou diminuir as respostas imunológicas direta ou indiretamente expres- sando-se quimiocinas, citocinas e outros mediadores de respostas imu- nológicas.

[131] O termo "inflamação", conforme usado no presente docu- mento, refere-se ao processo fisiológico pelo qual os tecidos vasculari- zados respondem à lesão. Consultar, por exemplo, FUNDAMENTAL

IMMUNOLOGY, 4ª Edição, William E. Paul, ed. Lippincott-Raven Publi- shers, Philadelphia (1999) em 1051-1053, incorporado ao presente do- cumento a título de referência. Durante o processo inflamatório, as cé- lulas envolvidas na desintoxicação e no reparo são mobilizadas para o local comprometido por meio de mediadores inflamatórios. A inflamação frequentemente é caracterizada por uma forte infiltração de leucócitos no sítio da inflamação, particularmente de neutrófilos (células polimorfo- nucleares). Essas células promovem dano ao tecido pela liberação de substâncias tóxicas na parede vascular ou no tecido sem lesão. Tradi- cionalmente, a inflamação foi dividida em respostas agudas e crônicas.

[132] O termo "inflamação aguda", conforme usado no presente documento, refere-se à resposta rápida, breve (de minutos a dias), re- lativamente uniforme à lesão aguda caracterizada por acúmulos de flu- ido, proteínas plasmáticas e leucócitos neutrofílicos. Os exemplos de agentes danosos que causam inflamação aguda incluem, porém sem limitação, patógenos (por exemplo, bactérias, vírus, parasitas), corpos estranhos de fontes exógenas (por exemplo, asbestos) ou endógenas (por exemplo, cristais de urato, complexos imunológicos) e agentes físi- cos (por exemplo, queimaduras) ou químicos (por exemplo, cáusticos).

[133] O termo "inflamação crônica", conforme usado no presente documento, refere-se a uma inflamação que possui uma duração mais longa e que tem uma terminação vaga e indefinida. A inflamação crônica assume quando uma inflamação aguda persiste, pela liberação incom- pleta do agente inflamatório inicial ou como um resultado de vários eventos agudos que ocorrem na mesma localização. A inflamação crô- nica, que inclui o influxo de linfócitos e macrófagos e o crescimento de fibroblastos, pode resultar na cicatrização do tecido em sítios de ativi- dade inflamatória repetida ou prolongada.

[134] Conforme usado no presente documento, o termo "interferon gama" (IFN-γ) refere-se a uma citocina solúvel que é um membro da classe de interferon do tipo II, que é secretada por células dos sistemas imunológicos inato e adaptativo. A proteína ativa é um homodímero que se liga ao receptor de interferon gama, que desencadeia uma resposta celular a infecções virais e microbianas.

[135] Conforme usado no presente documento, o termo "interleu- cina-2" (IL-2) refere-se a um tipo de citocina produzida por um tipo de linfócito T que aumenta o crescimento e a atividade de outros linfócitos T e linfócitos B e afeta o desenvolvimento do sistema imunológico. A IL- 2 produzida em laboratório é chamada de aldesleucina.

[136] Conforme usado no presente documento, o termo "interleu- cina 4" (IL-4) é uma citocina pleiotrópica cujas ações são geralmente antagônicas àquelas do interferon gama. Como a IL-4R é amplamente expressa, a IL-4 influencia quase todos os tipos de células. Em células T, IL-4 é crucial para a diferenciação e crescimento do subconjunto Th2. Desse modo, a IL-4 promove o estabelecimento da resposta humoral necessária para combater patógenos que vivem e se reproduzem extra- celularmente. Em células B, a IL-4 estimula o crescimento e a diferenci- ação e induz a regulação crescente de MHC de classe II e FcɛRII (CD23). IL-4 também promove a troca de isotipo em células B murinas para IgG1 e IgE, mas inibe a troca para IgG2a, IgG2b e IgG3. A IL-4 é um fator de crescimento para os mastócitos e desempenha um papel regulador importante nas respostas alérgicas, uma vez que envolvem a desgranulação de mastócitos mediada por IgE. A IL-4 também é impor- tante para a defesa contra vermes helmínticos porque a produção de IgE promovida pela IL-4 permite que os eosinófilos portadores de FcɛRIIB realizem ADCC eficiente. Em macrófagos, IL-4 inibe a secreção de quimiocinas pró-inflamatórias e citocinas, tais como TNF e IL-1β, pre- judica a capacidade dessas células para produzir intermediários reati- vos de oxigênio e nitrogênio e bloqueia a expressão induzida por IFNγ de moléculas de adesão celular, tais como ICAM e E-selectina. No en- tanto, a IL-4 também pode induzir DCs e macrófagos a regular crescen- temente sua síntese de IL-12, fornecendo um mecanismo de retroali- mentação negativo para regular a resposta de Th2. Mak, TW, Saunders, ME, Capítulo 17, “Cytokines and Cytokine Receptors,” em The Immune Response, Basic and Clinical Principles (2006), Academic Press, páginas 463-516).

[137] Conforme usado no presente documento, os termos "inter- leucina-7" (IL-7) ou linfopoietina-1) referem-se a um tipo de citocina pro- duzida por células que cobrem e sustentam órgãos, glândulas e outras estruturas no corpo que causam o crescimento de linfócitos T e linfócitos B.

[138] Conforme usado no presente documento, o termo "interleu- cina-12" (IL-12) refere-se a um tipo de citocina produzida principalmente por linfócitos B e macrófagos que faz com que outras células imunes produzam citocinas e aumentem o crescimento de linfócitos T. A mesma também pode bloquear o crescimento de novos vasos sanguíneos.

[139] Conforme usado no presente documento, o termo "interleu- cina-15" (IL-15) refere-se a um tipo de citocina que atua através de seu receptor específico, IL-15Rα, que é expresso em células dendríticas apresentadoras de antígeno, monócitos e macrófagos. A IL-15 regula a ativação e proliferação de células T e exterminadoras naturais. IL-15 e IL-2 compartilham muitas atividades biológicas. As mesmas se ligam a subunidades de receptores de hematopoietina comuns e podem com- petir pelo mesmo receptor e, assim, regular negativamente a atividade uma da outra. O número de células de memória CD8+ mostrou ser con- trolado por um equilíbrio entre IL-15 e IL2. A IL-15 induz a ativação de JAK quinases, bem como a fosforilação e ativação dos ativadores de transcrição STAT3, STAT5 e STAT6. Estudos da contraparte de camun- dongo sugeriram que a IL-15 pode aumentar a expressão do inibidor de apoptose BCL2L1/BCL-x(L), possivelmente através da atividade de ati- vação de transcrição de STAT6 e, assim, prevenir a apoptose.

[140] Conforme usado no presente documento, o termo "isolado" refere-se à separação de células de uma população por meio de um ou mais métodos de isolamento, tais como, porém sem limitação, separa- ção mecânica ou cultivo seletivo. Uma população “isolada” de células não precisa ser pura. Outros tipos de células podem estar presentes. De acordo com algumas modalidades, a população isolada de um tipo de célula particular refere-se a mais do que 10% pura, mais do que 20% pura, mais do que 30% pura, mais do que 40% pura, mais do que 50% pura, mais do que 60% pura, mais que 70% pura, mais que 80% pura, mais que 90% pura ou mais que 95% pura.

[141] O termo "plotagem de Kaplan Meier" ou "curva de sobrevi- vência de Kaplan Meier", conforme usado no presente documento, re- fere-se à plotagem de probabilidade de sujeitos de estudo clínico sobre- viverem em um determinado período de tempo, considerando-se o tempo em muitos intervalos pequenos. A plotagem de Kaplan Meier as- sume que: (i) em qualquer momento, os sujeitos que são censurados (isto é, perdidos) têm as mesmas perspectivas de sobrevivência que os sujeitos que continuam a ser acompanhados; (ii) as probabilidades de sobrevivência são as mesmas para os sujeitos recrutados no início e no final do estudo; e (iii) o evento (por exemplo, morte) acontece no tempo especificado. As probabilidades de ocorrência do evento são computa- das em um determinado ponto de tempo com probabilidades sucessivas multiplicadas por quaisquer probabilidades computadas anteriormente para obter uma estimativa final. A probabilidade de sobrevivência em qualquer momento específico é calculada como o número de sujeitos sobreviventes dividido pelo número de sujeitos em risco. Os indivíduos que morreram, abandonaram ou foram censurados do estudo não são considerados como estando em risco.

[142] Conforme usado no presente documento, o termo "marca- ção" refere-se a um processo de distinguir um composto, estrutura, pro- teína, peptídeo, anticorpo, célula ou componente celular introduzindo- se um constituinte rastreável. Constituintes rastreáveis comuns incluem, porém sem limitação, um anticorpo fluorescente, um fluoróforo, um co- rante ou um corante fluorescente, uma mancha ou uma mancha fluores- cente, um marcador, um marcador fluorescente, uma mancha química, uma mancha diferencial, um identificador diferencial e um radioisótopo.

[143] Conforme usado no presente documento, os termos "marca- dor" ou "marcador de superfície celular" são usados de forma intercam- biável o presente documento para se referir a um determinante antigê- nico ou epítopo encontrado na superfície de um tipo específico de cé- lula. Os marcadores de superfície celular podem facilitar a caracteriza- ção de um tipo de célula, sua identificação e, eventualmente, seu isola- mento. As técnicas de seleção celular são baseadas em biomarcadores celulares em que um marcador (ou marcadores) de superfície celular pode ser usado para seleção positiva ou seleção negativa, isto é, para inclusão ou exclusão, de uma população de células.

[144] Conforme usado no presente documento, o termo "molécula de MHC (complexo principal de histocompatibilidade)" refere-se a uma dentre uma grande família de glicoproteínas de superfície celular ubí- quas codificadas por genes do complexo principal de histocompatibili- dade (MHC). As mesmas se ligam a fragmentos de peptídeos de antí- genos estranhos e os apresentam às células T para induzir uma res- posta imunológica. As moléculas de MHC de classe I, que são codifica- das por uma série de genes altamente polimórficos, estão presentes em quase todos os tipos de células e apresentam peptídeos virais na su- perfície das células infectadas por vírus, em que as mesmas são reco- nhecidas por células T citotóxicas. No mecanismo de MHC de classe I, os peptídeos estranhos são endocitados para transporte dentro de uma célula apresentadora de antígeno. Então, pelo menos parte da proteína estranha é proteolisada pelo proteassoma citosólico para formar peptí- deos curtos, que são transportados para o lúmen do retículo endoplas- mático da célula apresentadora de antígeno. Ali, os peptídeos estranhos são carregados em moléculas de MHC de classe I e transportados por vesículas para a superfície celular da célula apresentadora de antígeno para reconhecimento por células T citotóxicas CD8+. A expressão de MHC I em células cancerosas é exigida para detecção e destruição por células T, e linfócitos T citotóxicos (CTLs, CD8+) exigem apresentação do antígeno tumoral na célula-alvo por moléculas de MHC Classe I para delinear o próprio do não próprio. Um dos meios mais comuns pelos quais os tumores evadem a resposta imunológica do hospedeiro é pela regulação decrescente da expressão de molécula de MHC de Classe I por células tumorais, de modo que o tumor tenha baixa expressão de MHCI, tornando assim quaisquer respostas de células T antitumorais endógenas ou terapêuticas ineficazes (Haworth et al., Pediatr Blood Cancer. Abril de 2015; 62 (4): 571–576). Na maioria das vezes, a perda de expressão de MHC nas células tumorais é mediada por eventos epi- genéticos e regulação decrescente da transcrição do locus de MHC e/ou a maquinaria de processamento de antígenos. A falta de um antígeno peptídico processado leva à expressão de MHC diminuída, uma vez que as moléculas de MHC vazias não são estáveis na superfície celular.

[145] Uma molécula de MHC de classe II, que está presente em células apresentadoras de antígenos profissionais, apresenta peptídeos estranhos às células T auxiliares. Peptídeos estranhos são endocitados e degradados no ambiente ácido do endossomo, o que significa que os peptídeos nunca são apresentados no citosol e permanecem em um compartimento subcelular topologicamente equivalente ao espaço ex- tracelular. Os peptídeos se ligam a proteínas MHC de classe II pré-mon- tadas em um compartimento endossômico especializado, e a molécula de MHC de classe II carregada é então transportada para a membrana plasmática da célula apresentadora de antígeno para apresentação às células T auxiliares CD4+. (Alberts et al. Molecular Biology of the Cell 4ª Edição, Garland Science, Nova York (2002) página 1407). Os antígenos também podem ser carregados em células apresentadoras de antíge- nos por aquisição de moléculas MHC de classe II da superfície das cé- lulas do doador. A transferência de peptídeo-MHC (“cross-dressing”) en- volve a geração de complexos de peptídeo-MHC de classe II dentro da célula do doador e sua transferência subsequente para células apresen- tadoras de antígeno do receptor, que têm então a capacidade para apre- sentar os complexos de peptídeo-MHC de classe II intactos e ampla- mente não processados a células T auxiliares. (Campana, S. et al., Immunol. Letters (2015) 168(2): 349-54). Os antígenos endógenos tam- bém podem ser apresentados por MHC de classe II quando são degra- dados por autofagia (Schmid, D. et al. (2007) Immunity 26(1): 79-92).

[146] Conforme usado no presente documento, os termos "modifi- car" ou "modular" e suas várias formas gramaticais se referem a regular, alterar, adaptar ou ajustar a uma determinada medida ou proporção. No que diz respeito a uma resposta imunológica às células tumorais, esses termos se referem à mudança da forma ou caráter da resposta imuno- lógica às células tumorais por meio de uma ou mais técnicas de DNA recombinante, de modo que as células imunes tenham a capacidade para reconhecer e exterminar células tumorais.

[147] Conforme usado no presente documento, o termo "células exterminadoras naturais (NK)" refere-se a linfócitos da mesma família das células T e B, classificados como linfócitos inatos do grupo I. Os mesmos têm a capacidade de exterminar células tumorais sem qualquer preparação ou ativação anterior, em contraste com as células T citotó- xicas, que precisam de preparação por células apresentadoras de antí- genos. As células NK secretam citocinas, tais como IFNγ e TNFα, que atuam em outras células imunes, como macrófagos e células dendríti- cas, para potencializar a resposta imunológica.

Os receptores ativado- res na superfície das células NK reconhecem moléculas expressas na superfície das células cancerosas e células infectadas e ativam as cé- lulas NK.

Os receptores inibitórios atuam como uma verificação do ex- termínio de células NK.

A maioria das células saudáveis normais ex- pressa receptores de MHCI, que as marcam como "próprias". Os recep- tores inibitórios na superfície de célula NK reconhecem o MHCI cognato, que desativa a célula NK, impedindo-a de exterminar.

Uma vez tomada a decisão de exterminar, a célula NK libera grânulos citotóxicos con- tendo perforina e granzimas, o que leva à lise da célula-alvo.

A reativi- dade exterminadora natural, incluindo a secreção de citocinas e citoto- xicidade, é controlada por um equilíbrio de vários receptores inibitórios e ativadores codificados por linhagem germinativa, tais como receptores do tipo imunoglobulina de célula exterminadora (KIRs) e receptores na- turais de citotoxicidade (NCRs). A presença da molécula de MHC de classe I nas células-alvo serve como um ligante inibitório para recepto- res específicos para MHC de classe I, o receptor do tipo imunoglobulina de célula exterminadora (KIR), em células NK.

A ligação de receptores KIR bloqueia a ativação de NK e, paradoxalmente, preserva sua capa- cidade para responder a encontros sucessivos disparando-se sinais de inativação.

Portanto, se um KIR tiver a capacidade para se ligar sufici- entemente ao MHC Classe I, essa ligação pode substituir o sinal para exterminar e permitir que a célula-alvo viva.

Em contraste, se a célula NK não tiver a capacidade para se ligar suficientemente ao MHC de Classe I na célula-alvo, o extermínio da célula-alvo pode prosseguir.

Consequentemente, aqueles tumores que expressam MHC de classe I baixo e que se acredita terem a capacidade para evitar um ataque me- diado por células T podem ser suscetíveis a uma resposta imunológica mediada por células NK em vez disso.

[148] Conforme usado no presente documento, o termo "célula T exterminadora natural" ou "NKT" refere-se a células T exterminadoras naturais invariantes (iNKT), também conhecidas como células do tipo I NKT, bem como todos os subconjuntos de não invariantes (Vα24- e Vα24+) células T exterminadoras naturais, que expressam CD3 e um receptor de células T αβ (TCR) (denominado no presente documento "células T αβ exterminadoras naturais") ou γΔ TCR (denominado no pre- sente documento "células T γΔ exterminadoras naturais"), todos os quais demonstraram capacidade para responder a antígenos não pro- teicos apresentados por antígenos CD1. As células NKT não invariantes abrangidas pelos métodos da invenção descrita compartilham em co- mum com as células NKT do tipo I a expressão de receptores de super- fície comumente atribuídos a células exterminadoras naturais (NK), bem como um TCR de reorganização/recombinação de locus de gene TCR αβ ou γΔ.

[149] Conforme usado no presente documento, o termo "célula T exterminadora natural invariante" é usado de forma intercambiável com o termo "iNKT" e se refere um subconjunto de células que expressam o receptor de células T (TCR) α que expressam um repertório de TCR restrito que, em seres humanos, é composto por uma cadeia de Vα24- Ja18 TCRα, que é, por exemplo, acoplada a uma cadeia de Vβ11 TCRβ. O mesmo abrange todos os subconjuntos de células do tipo I NKT CD3+Vα24+ Vβ11+ (CD3+CD4+CD8-Vα24+ Vβ11+, CD3+CD4- CD8+Vα24+ Vβ11+ e CD3+CD4-CD8-Vα24+ Vβ11+) bem como aque- las células que podem ser confirmadas como células do tipo I NKT por expressão gênica ou outra perfilagem imunológica, mas têm expressão de superfície regulada decrescentemente de Vα24 (CD3+Vα24-). Isso inclui células que expressam ou não expressam o fator regulador de transcrição FOXP3. Ao contrário das células T convencionais, que reco-

nhecem principalmente antígenos peptídicos apresentados por molécu- las de MHC, as células iNKT reconhecem antígenos glicolipídicos apre- sentados pelo Cd1d do tipo MHC de classe 1 não polimórfico.

[150] Conforme usado no presente documento, o termo "recepto- res de reconhecimento de padrão" ou "PRRs" refere-se a receptores que estão presentes na superfície celular para reconhecer patógenos extracelulares; nos endossomos, onde detectam invasores intracelula- res e, finalmente, no citoplasma. Os mesmos reconhecem estruturas moleculares conservadas de patógenos, denominadas padrões molecu- lares associados a patógenos (PAMPs), específicos para o micro-orga- nismo e essenciais para sua viabilidade. Os PRRs são divididos em qua- tro famílias: receptores do tipo toll (TLR); receptores de oligomerização de nucleotídeos (NLR); receptores de leptina do tipo C (CLR) e recepto- res do tipo RIG-1 (RLR).

[151] Conforme usado no presente documento, o termo "células NKT" refere-se a uma população de células que inclui células NKT CD3+Vα24+, células NKT CD3+Vα24-, células NKT CD3+Vα24- CD56+, células NKT CD3+Vα24-CD161+, células T CD3+γδ-TCR+ e misturas das mesmas.

[152] Conforme usado no presente documento, o termo "não ex- pandido" se refere a uma população de células que não foi cultivada em cultura (in vitro) para aumentar o número de células na população de células.

[153] Conforme usado no presente documento, o termo "sobrevi- vência global" (OS) refere-se ao período de tempo a partir da data do diagnóstico ou do início do tratamento de uma doença, tal como o cân- cer, em que os pacientes diagnosticados com a doença ainda estão vi- vos.

[154] Conforme usado no presente documento, o termo "parente- ral" e suas outras formas gramaticais referem-se à administração de uma substância que ocorre no corpo diferente de pela boca ou canal alimentar. Por exemplo, o termo "parenteral" conforme usado no pre- sente documento refere-se à introdução no corpo por meio de injeção (isto é, administração por injeção), incluindo, por exemplo, por via sub- cutânea (isto é, uma injeção sob a pele), via intramuscular (isto é, uma injeção em um músculo), via intravenosa (isto é, uma injeção em uma veia), via intratecal (isto é, uma injeção no espaço ao redor da medula espinhal ou sob a membrana aracnoide do cérebro) ou técnicas de infu- são.

[155] Conforme usado no presente documento, o termo "perforina" refere-se a uma molécula que pode se inserir na membrana das células- alvo e promover a lise dessas células-alvo. A lise mediada por perforina é intensificada por enzimas chamadas granzimas.

[156] Conforme usado no presente documento, uma "célula mono- nuclear de sangue periférico" ou "PBMC" refere-se a uma célula imune com um núcleo redondo encontrado no sangue periférico que perma- nece na interface superior menos densa da camada Ficoll, muitas vezes denominada camada leucocitária, e são as células coletadas quando o método de fracionamento Ficoll é usado. Essas células consistem em linfócitos (células T, células B, células NK) e monócitos. Em seres hu- manos, os linfócitos constituem a maioria da população de PBMC, se- guidos por monócitos e apenas uma pequena porcentagem de células dendríticas.

[157] Conforme usado no presente documento, o termo "composi- ção farmacêutica" refere-se a uma composição que compreende um in- grediente ativo e um carreador farmaceuticamente aceitável que é em- pregado para prevenir, reduzir em intensidade, curar ou tratar de outra forma uma afecção, síndrome, distúrbio ou doença alvo.

[158] Conforme usado no presente documento, o termo "carreador farmaceuticamente aceitável" refere-se a qualquer carreador substanci- almente não tóxico convencionalmente utilizável para administração de compostos farmacêuticos em que o produto celular da presente inven- ção permanecerá estável e biodisponível. O carreador farmaceutica- mente aceitável deve ser de uma pureza suficientemente alta e de uma toxicidade suficientemente baixa para torná-lo adequado para adminis- tração ao mamífero a ser tratado. O mesmo manter ainda a estabilidade e biodisponibilidade de um agente ativo. O carreador farmaceutica- mente aceitável pode ser líquido ou sólido e é selecionado, com a forma de administração planejada em mente, para fornecer o volume, consis- tência, etc. desejados, quando combinado com um agente ativo e outros componentes de uma determinada composição farmacêutica.

[159] Conforme usado no presente documento, o termo "sal far- maceuticamente aceitável", conforme usado no presente documento, refere-se àqueles sais que são, dentro do escopo do julgamento médico sólido, adequados para uso em contato com os tecidos de seres huma- nos e animais inferiores sem toxicidade indevida, irritação, resposta alérgica e similares e são proporcionais a uma relação risco/benefício razoável. Quando usados em medicina, os sais devem ser farmaceuti- camente aceitáveis, mas sais não farmaceuticamente aceitáveis podem ser usados convenientemente para preparar sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos. Tais sais incluem, porém sem limitação, aque- les preparados a partir dos seguintes ácidos: clorídrico, bromídrico, sul- fúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, p-toluenossulfônico, tartárico, cítrico, metanossulfônico, fórmico, malônico, succínico, nafta- leno-2-sulfônico e benzeno sulfônico. Além disso, tais sais podem ser preparados como sais de metais alcalinos ou alcalino-terrosos, tais como sais de sódio, potássio ou cálcio do grupo ácido carboxílico. Por "sal farmaceuticamente aceitável", entende-se aqueles sais que são, dentro do escopo do julgamento médico sólido, adequados para uso em contato com os tecidos de seres humanos e animais inferiores sem to- xicidade indevida, irritação, resposta alérgica e similares e são propor- cionais a uma relação risco/benefício razoável.

Os sais farmaceutica- mente aceitáveis são bem conhecidos na técnica.

Por exemplo, P.

H.

Stahl, et al. descrevem sais farmaceuticamente aceitáveis em detalhes em "Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use" (Wiley VCH, Zurich, Suíça: 2002). Os sais podem ser preparados in situ durante o isolamento e a purificação finais dos compostos descritos na presente invenção ou separadamente reagindo-se uma função de base livre com um ácido orgânico adequado.

Os sais de adição de ácido re- presentativos incluem, porém sem limitação, acetato, adipato, alginato, citrato, aspartato, benzoato, benzenossulfonato, bissulfato, butirato, canforato, canforsulfonato, digluconato, glicerofosfato, hemissulfato, heptanoato, hexanoato, fumarato, hidrocloreto, hidrobrometo, hidroio- deto, 2-hidroxietansulfonato (isetionato), lactato, malato, metanossulfo- nato, nicotinato, 2-naftalenossulfonato, oxalato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartarato, tiocianato, fosfato, glutamato, bicarbonato, p-toluenossulfo- nato e undecanoato.

Além disso, os grupos contendo nitrogênio básicos podem ser quaternizados com tais agentes como haletos de alquila in- ferior, tais como cloretos, brometos e iodetos de metila, etila, propila e butila; sulfatos de dialquila como sulfatos de dimetila, dietila, dibutila e diamila; haletos de cadeia longa, tais como cloretos brometos e iodetos de decila, laurila, miristila e estearila; haletos de arilalquila como brome- tos de benzila e fenetila e outros.

Produtos solúveis ou dispersíveis em água ou óleo são assim obtidos.

Exemplos de ácidos que podem ser empregues para formar sais de adição ácidos farmaceuticamente acei- táveis incluem tais ácidos inorgânicos como ácido clorídrico, ácido bro- mídrico, ácido sulfúrico e ácido fosfórico, e tais ácidos orgânicos como ácido oxálico, ácido maleico, ácido succínico e ácido cítrico.

Os sais de adição básicos podem ser preparados in situ durante o isolamento e purificação finais de compostos descritos na invenção por reação de uma fração contendo ácido carboxílico com uma base adequada tal como hidróxido, carbonato ou bicarbonato de um cátion de metal farma- ceuticamente aceitável ou com amônia ou uma amina primária, secun- dária ou terciária orgânica. Os sais farmaceuticamente aceitáveis po- dem incluir, porém sem limitação, cátions baseados em metais alcalinos e metais alcalino-terrosos, tais como sais de lítio, sódio, potássio, cálcio, magnésio e alumínio e similares, e cátions de amina e amônia quater- nárias não tóxicos incluindo amônio, tetrametilamônio, tetraetilamônio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, dietilamina, etila- mina e similares. Outras aminas orgânicas representativas úteis para a formação de sais de adição de base incluem etilenodiamina, etanola- mina, dietanolamina, piperidina, piperazina e similares. Os sais farma- ceuticamente aceitáveis podem também ser obtidos com o uso de pro- cedimentos padrão bem conhecidos na técnica, por exemplo, reagindo- se um composto suficientemente básico, tal como uma amina, com um ácido adequado rendendo um ânion fisiologicamente aceitável. Sais de metal alcalino (por exemplo, sódio, potássio ou lítio) ou metal alcalino- terroso (por exemplo, cálcio ou magnésio) de ácidos carboxílicos podem também ser feitos.

[160] Conforme usado no presente documento, os termos "poli- peptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usados de forma intercambiável no presente documento para referência a um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos se aplicam a polímeros de aminoácido em que um ou mais resíduos de aminoácidos são um análogo químico artificial de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, assim como a polímeros de aminoácido de ocorrência natural. A natureza essencial de tais análogos de aminoácidos de ocorrência natural é que, quando in- corporados em uma proteína, essa proteína é especificamente reativa a anticorpos produzidos para a mesma proteína, mas consistindo inteira- mente de aminoácidos de ocorrência natural.

[161] Conforme usado no presente documento, os termos “poli- peptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são também inclusivos de modifica- ções incluindo, porém sem limitação, glicosilação, ligação de lipídio, sul- fatação, gama-carboxilação de resíduos de ácido glutâmico, hidroxila- ção e ADP-ribosilação. Será entendido, conforme é bem conhecido e conforme observado acima, que polipeptídeos podem não ser inteira- mente lineares. Por exemplo, os polipeptídeos podem ser ramificados como um resultado da ubiquitinação, e os mesmos podem ser circula- res, com ou sem ramificação, geralmente como um resultado de eventos pós-tradução, incluindo evento de processamento natural e eventos ocasionados por manipulação humana que não ocorrem naturalmente. Polipeptídeos circulares, ramificados e ramificados circulares podem ser sintetizados por processo natural de não tradução e por métodos intei- ramente sintéticos também. De acordo com algumas modalidades, o peptídeo tem qualquer comprimento ou tamanho.

[162] Conforme usado no presente documento, o termo "purificar" se refere à liberação de elementos estranhos ou indesejáveis.

[163] Conforme usado no presente documento, o termo "reincidên- cia" em relação a um câncer refere-se a um câncer reapareceu (voltou), geralmente após um período de tempo durante o qual o câncer não pôde ser detectado. O câncer pode voltar ao mesmo lugar que o tumor original (primário) ou a outro lugar no corpo.

[164] Conforme usado no presente documento, o termo "câncer resistente" refere-se a um câncer que não responde a um tratamento no início de tal tratamento ou em algum momento durante tal tratamento.

[165] Conforme usado no presente documento, o termo "secreção" e suas várias formas gramaticais referem-se à produção por uma célula de uma substância fisiologicamente ativa e seu movimento para fora da célula na qual é formada.

[166] Conforme usado no presente documento, o termo "estimular" em qualquer uma das suas formas gramaticais, conforme usado no pre- sente documento, refere-se à indução da ativação ou ao aumento da atividade.

[167] Conforme usado no presente documento, o termo "suficiente para estimular a expansão de células NKT" refere-se a uma quantidade ou nível de um evento de sinalização ou estímulo, por exemplo, uma quantidade de alfa-galactosilceramida (αGalCer), ou um análogo ou equivalente funcional da mesma, que promove a expansão preferencial de uma célula do tipo I NKT.

[168] Conforme usado no presente documento, o termo "suficiente para estimular a ativação de células NKT" refere-se a uma quantidade ou nível de um evento de sinalização ou estímulo, por exemplo, uma quantidade de IL-2, IL-7, IL-15 e IL-12, que promove secreção de citoci- nas ou atividade de extermínio de célula de uma célula do tipo I NKT.

[169] Conforme usado no presente documento, os termos "sujeito" ou "indivíduo" ou "paciente" são usados de forma intercambiável para se referir a um membro de uma espécie animal de origem mamífera, incluindo seres humanos.

[170] Conforme usado no presente documento, o sintagma "sujeito que precisa do mesmo" refere-se a um paciente que (i) receberá uma composição imunogênica (por exemplo, uma população de células do tipo I NKT) de acordo com a invenção descrita, (ii) está recebendo uma composição imunogênica (por exemplo, uma população de células do tipo I NKT) de acordo com a invenção descrita; ou (iii) recebeu uma composição imunogênica (por exemplo, uma população de células do tipo I NKT) de acordo com a invenção descrita, a menos que o contexto e o uso do sintagma indiquem de outro modo.

[171] Conforme usado no presente documento, o termo "células T exterminadoras de citocinas superativadas" (ou SCKTCs) refere-se a células derivadas de células T exterminadoras de citocinas (CKTCs) co- locando-se CKTCs in vitro em contato com citocinas IL-2, IL-7, IL-15 e IL- 12 em uma ordem e tempo de adição predeterminados.

[172] Conforme usado no presente documento, o termo "receptor de células T" (TCR) refere-se a um complexo de proteínas de membrana integral que participam da ativação de células T em resposta a um antí- geno. O TCR expresso pela maioria das células T consistindo nas ca- deias α e β. Um pequeno grupo de células T expressa receptores feitos de cadeias γ e δ. Dentre as células T α/β estão duas sub-linhagens: aquelas que expressam a molécula correceptora CD4 (células CD4+) e aquelas que expressam CD8 (células CD8+). Essas células diferem na forma como reconhecem o antígeno e em suas funções efetoras e re- guladoras.

[173] As células T CD4 convencionais virgens podem se diferen- ciar em quatro populações de células T distintas, um processo que é determinado pelo padrão de sinais que as mesmas recebem durante sua interação inicial com o antígeno. Essas 4 populações de células T são Th1, Th2, Th17 e células T reguladoras induzidas (iTreg). As células Th1, que são indutores eficazes de respostas imunológicas celulares, medeiam as respostas imunológicas contra patógenos intracelulares e são responsáveis pela indução de algumas doenças autoimunes. Seus principais produtos de citocinas são IFNγ (que melhora vários mecanis- mos importantes na ativação de macrófagos para aumentar sua ativi- dade microbicida), linfotoxina α (LTα) e IL-2, que é importante para a memória de células T CD4. As células Th2, que são eficazes em ajudar as células B a se desenvolverem em células produtoras de anticorpos, medeiam a defesa do hospedeiro contra parasitas extracelulares, são importantes na indução e persistência de asma e outras doenças alér- gicas e produzem IL-4, IL-5, IL-9 , IL-10 (que suprime a proliferação de células Th1 e pode suprimir função de célula dendrítica), IL-13, IL-25 (sinalizando através de IL-17RB, aumenta a produção de IL-4, IL-5 e IL- 13 por uma população de não linfócitos c-kit- FcεRI-, serve como um fator de iniciação, bem como um fator de amplificação para respostas de Th2) e anfirregulina. IL-4 e IL-10 produzidas pelas células Th2 blo- queiam a produção de IFNγ por células Th1. As células Th17 produzem IL-17a, IL-17f, IL-21 e IL-22. IL-17a pode induzir muitas citocinas infla- matórias, IL6, bem como quimiocinas, tais como IL-8, e desempenha um papel importante na indução de respostas inflamatórias. As células Tregs desempenham um papel crítico na manutenção da autotolerância e na regulação de respostas imunológicas. As mesmas exercem sua função supressora por meio de vários mecanismos, alguns dos quais exigem contato célula-célula. A base molecular da supressão em alguns casos é por meio da produção de citocinas, incluindo TGFβ, IL-10 e IL-

35. O TGFβ produzido por células T reg também pode resultar na indu- ção de células iTreg de células T CD4 virgens. As células T CD4+ por- tam receptores em sua superfície específicos para o complexo de classe II das células B/peptídeo. A ativação da célula B depende não apenas da ligação da célula T por meio de seu receptor de célula T (TCR), mas essa interação também permite que um ligante de ativação na célula T (ligante de CD40) se ligue ao seu receptor na célula B (CD40) sinali- zando a ativação de células B. Zhu, J. e Paul, WE, Blood (2008) 112: 1557-69). Células T CD8+ virgens em repouso, quando preparadas por células apresentadoras de antígenos que adquiriram antígenos dos ma- crófagos infectados por meio de infecção direta ou apresentação cru- zada em órgãos linfoides secundários, tais como linfonodos e baço, re- agem aos patógenos por expansão maciça e diferenciação em células T efetoras de linfócitos citotóxicas que migram para todas as partes do corpo para eliminar a infecção. Na maioria das infecções virais, entre- tanto, a ativação das células T CD8 exige que as células T efetoras CD4 ajudem a ativar as células dendríticas para que se tornem capazes de estimular uma resposta completa das células T CD8. As células T CD4 que reconhecem antígenos relacionados apresentados pela APC po- dem amplificar a ativação de células T CD8 virgens, ativando ainda mais a APC. B7 expresso pela célula dendrítica ativa primeiramente as célu- las T CD4 para expressar IL-2 e ligante de CD40. O ligante de CD40 liga o CD40 na célula dendrítica, entregando um sinal adicional que au- menta a expressão de B7 e 4-1BBL pela célula dendrítica, o que, por sua vez, fornece coestimulação adicional à célula T CD8 virgem. A IL-2 produzida por células T CD4 ativadas também atua promovendo a dife- renciação das células T CD efetoras.

[174] O CD3 (complexo de TCR) é um complexo proteico com- posto por quatro cadeias distintas. Em mamíferos, o complexo contém uma cadeia CD3γ, uma cadeia CD3δ e duas cadeias CD3ε, que se as- sociam ao receptor de células T (TCR) e à cadeia ζ para gerar um sinal de ativação em linfócitos T. Juntos, o TCR, a cadeia ζ e as moléculas de CD3 compreendem o complexo de TCR. As caudas intracelulares das moléculas de CD3 contêm um motivo conservado conhecido como o motivo de ativação baseado em tirosina imunorreceptora (ITAM), que é essencial para a capacidade de sinalização do TCR. Após a fosforila- ção do ITAM, a cadeia de CD3 pode se ligar à ZAP70 (proteína associ- ada a zeta), uma quinase envolvida na cascata de sinalização da célula T.

[175] Conforme usado no presente documento, o termo "agente terapêutico" refere-se a um fármaco, molécula, ácido nucleico, proteína, metabólito, composição ou outra substância que fornece um efeito tera- pêutico. O termo "ativo", conforme usado no presente documento, re- fere-se ao ingrediente, componente ou constituinte das composições farmacêuticas da invenção descrita responsáveis por um efeito terapêu- tico pretendido. Os termos "agente terapêutico" e "agente ativo" são usados de forma intercambiável no presente documento. O termo "com- ponente terapêutico", conforme usado no presente documento, refere- se a uma dosagem terapeuticamente eficaz (isto é, dose e frequência de administração) que elimina, reduz ou evita a progressão de uma ma- nifestação de doença particular em uma porcentagem de uma popula- ção. Um exemplo de um componente terapêutico comumente usado é o ED50 que descreve a dose em uma dosagem particular que é tera- peuticamente eficaz para uma manifestação de doença particular em 50% de uma população.

[176] Conforme usado no presente documento, os termos “quanti- dade terapêutica", "quantidade terapeuticamente eficaz", uma "quanti- dade eficaz" ou "quantidade farmaceuticamente eficaz" de um agente ativo são de forma intercambiável para se referir a uma quantidade su- ficiente para fornecer o benefício de tratamento pretendido. Entretanto, os níveis de dosagem são baseados em uma variedade de fatores, in- cluindo o tipo de lesão, a idade, peso, sexo, condição médica do paci- ente, a gravidade da afecção, a via de administração e o agente ativo particular empregado. Assim, a posologia pode variar amplamente, mas pode ser determinada rotineiramente por um médico com o uso de mé- todos convencionais. Além disso, os termos "quantidade terapêutica", "quantidades terapeuticamente eficazes" e "quantidades farmaceutica- mente eficazes" incluem quantidades profiláticas ou preventivas das composições da invenção descrita. Em aplicações profiláticas ou pre- ventivas da invenção descrita, composições farmacêuticas ou medica- mentos são administrados a um paciente suscetível a, ou de outra forma em risco de, uma doença, distúrbio ou afecção em uma quantidade su- ficiente para eliminar ou reduzir o risco, diminuir a gravidade ou atrasar o início da doença, distúrbio ou afecção, incluindo sintomas bioquími- cos, histológicos e/ou comportamentais da doença, distúrbio ou afec- ção, suas complicações e fenótipos patológicos intermediários que se apresentam durante o desenvolvimento da doença, distúrbio ou afec- ção. É preferencial, em geral, que uma dose máxima seja usada, isto é, a dose segura mais alta de acordo com julgamento médico sensato. Os termos "dose" e "dosagem" são usados de maneira intercambiável no presente documento.

[177] Conforme usado no presente documento, o termo "efeito te- rapêutico" refere-se a uma consequência do tratamento, cujos resulta- dos são considerados desejáveis e benéficos. Um efeito terapêutico pode incluir, direta ou indiretamente, a interrupção, redução ou elimina- ção de uma manifestação de doença. Um efeito terapêutico também pode incluir, direta ou indiretamente, a interrupção, redução ou elimina- ção da progressão de uma manifestação de doença.

[178] Para qualquer agente terapêutico descrito no presente docu- mento, a quantidade eficaz pode ser inicialmente determinada a partir de estudos preliminares in vitro e/ou modelos animais. Uma dose tera- peuticamente eficaz também pode ser determinada a partir de dados humanos. A dose aplicada pode ser ajustada com base na biodisponi- bilidade relativa e na potência do composto administrado. Ajustar a dose para atingir eficácia máxima com base nos métodos descritos acima e outros métodos conhecidos está bem dentro das capacidades da pes- soa de habilidade comum na técnica.

[179] Os princípios gerais para determinar a eficácia terapêutica, que podem ser encontrados no Capítulo 1 de The Pharmacological Ba- sis of Therapeutics de Goodman e Gilman, 10ª edição, McGraw-Hill (Nova York) (2001), incorporados ao presente documento a título de re- ferência, são resumidos abaixo.

[180] Os princípios farmacocinéticos fornecem uma base para mo- dificar um regime de dosagem para obter um grau desejado de eficácia terapêutica com um mínimo de efeitos adversos inaceitáveis. Nas situ- ações em que a concentração plasmática do fármaco pode ser medida e relacionada à janela terapêutica, orientação adicional para modifica- ção de dosagem pode ser obtida.

[181] Os produtos farmacêuticos são considerados equivalentes farmacêuticos se contiverem os mesmos ingredientes ativos e forem idênticos em força ou concentração, forma de dosagem e via de admi- nistração. Dois produtos farmacêuticos farmaceuticamente equivalentes são considerados bioequivalentes quando as taxas e extensões de bio- disponibilidade do ingrediente ativo nos dois produtos não são significa- tivamente diferentes sob condições de teste adequadas.

[182] Conforme usado no presente documento, o termo “trata- mento” inclui revogar, inibir substancialmente, retardar ou reverter a pro- gressão de uma afecção, melhorar substancialmente os sintomas clíni- cos de uma condição ou impedir substancialmente o aparecimento de sintomas clínicos de uma condição. O tratamento refere-se ainda à rea- lização de um ou mais dos seguintes: (a) redução da gravidade do dis- túrbio; (b) limitação do desenvolvimento de sintomas característicos do distúrbio (ou distúrbios) sendo tratado; (c) limitação da piora de sintomas característicos do distúrbio (ou distúrbios) sendo tratado; (d) limitação da reincidência do distúrbio (ou distúrbios) em pacientes que tiveram anteriormente o distúrbio (ou distúrbios); e (e) limitação da reincidência dos sintomas em pacientes que eram anteriormente assintomáticos para o distúrbio (ou distúrbios).

[183] De acordo com a invenção descrita, podem ser empregadas técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia e DNA re- combinante dentro da habilidade da arte. Tais técnicas são explicadas por completo na literatura. Consultar, por exemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (no presente documento “Sambrook et al., 1989”); DNA Cloning: A prac- tical Approach, Volumes I e II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide

Synthesis (M J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985); Transcription and Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, (1986); B. Perbal, A practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994); dentre outros. MÉTODOS PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊU- TICA QUE COMPREENDE UM PRODUTO CELULAR QUE COMPRE- ENDE UMA POPULAÇÃO EXPANDIDA E ENRIQUECIDA DE CÉLU-

LAS T EXTERMINADORAS DE CITOCINA SUPERATIVADAS (SCKTCS)

[184] De acordo com um aspecto, a presente divulgação descreve um método para preparar uma composição farmacêutica que compre- ende uma população enriquecida de células T exterminadoras de cito- cinas superativadas (SCKTCs) que compreende, em ordem

[185] (a) isolar uma população de células mononucleares (MCs) que compreende uma população de células T exterminadoras de cito- cina (CKTCs);

[186] (b) transportar, opcionalmente, a preparação de (a) para uma instalação de processamento sob condições estéreis;

[187] (c) cultivar a população de MCs em um sistema de cultura;

[188] (d) colocar o sistema de cultura da etapa (c) em contato com alfa-galactosilceramida (αGalCer), ou análogo ou equivalente funcional da mesma; uma primeira população de células que compreende CD1d e αGalCer, ou análogo ou equivalente funcional dos mesmos ou ambos, sendo que o contato é suficiente para estimular a expansão de CKTC;

[189] (e) colocar o sistema de cultura da etapa (d) em contato com IL-2, IL-7, IL-15 e IL-12, em uma ordem predeterminada e tempo de adi- ção, em que o contato é suficiente para estimular a ativação de CKTC e formar a população enriquecida de células SCKTC;

[190] (f) coletar a população enriquecida de células SCKTC do sis- tema de cultura para formar um produto celular de SCKTC; em que a população enriquecida de SCKTCs de (f) é caracterizada por uma ou mais dentre uma capacidade melhorada de secretar citocinas efetoras ou uma citotoxicidade melhorada em comparação com a população de CKTCs da etapa (a); e

[191] (g) formular o produto celular com um carreador farmaceuti- camente aceitável para formar a composição farmacêutica.

[192] De acordo com algumas modalidades, uma fonte das células mononucleares é o sangue. De acordo com algumas dessas modalida- des, o sangue é sangue periférico, e as MCs são MCs de sangue peri- férico (PBMCs). De acordo com algumas modalidades, as PBMCs são derivadas de um sujeito humano. De acordo com algumas modalidades, as MCs são isoladas de uma fração de gradiente Ficoll-Paque.

[193] De acordo com algumas modalidades, a cultura em (c) é por até 1 dia, até 2 dias, até 3 dias, até 4 dias, até 5 dias, até 6 dias, até 7 dias, até 8 dias, até 9 dias, até 10 dias, até 11 dias, até 12 dias, até 13 dias, até 14 dias, até 15 dias, até 16 dias, até 17 dias, até 18 dias, até 19 dias, até 20 dias, até 21 dias ou mais. De acordo com algumas mo- dalidades, a cultura em (c) é por um tempo eficaz para a aderência de pelo menos algumas das CTKCs a uma superfície do sistema de cultura. De acordo com algumas modalidades, a etapa (c) compreende opcio- nalmente ressuspender as MCs e ajustar a concentração de MCs a uma faixa de cerca de 5×105 células/ml a cerca de 3×106 células/ml, inclu- sive, antes de realizar a etapa (d). De acordo com uma modalidade, a etapa (c) compreende opcionalmente a ressuspensão das MCs e o ajuste da concentração de MCs a cerca de 5 ×105 células/ml, cerca de 5,1 ×105 células/ml, cerca de 5,2 ×105 células/ml, cerca de 5,3 ×105 cé- lulas/ml, cerca de 5,4 ×105 células/ml, cerca de 5,5 ×105 células/ml,

cerca de 5,6 ×105 células/ml, cerca de 5,7 ×105 células/ml, cerca de 5,8 ×105 células/ml, cerca de 5,9 ×105 células/ml, cerca de 6 ×105 célu- las/ml, cerca de 6,1 ×105 células/ml, cerca de 6,2 ×105 células/ml, cerca de 6,3 ×105 células/ml, cerca de 6,4 ×105 células/ml, cerca de 6,5 ×105 células/ml, cerca de 6,6 ×105 células/ml, cerca de 6,7 ×105 células/ml, cerca de 6,8 ×105 células/ml, cerca de 6,9 ×105 células/ml, cerca de 7 ×105 células/ml, cerca de 7,1 ×105 células/ml, cerca de 7,2 ×105 célu- las/ml, cerca de 7,3 ×105 células/ml, cerca de 7,4 ×105 células/ml, cerca de 7,5 ×105 células/ml, cerca de 7,6 ×105 células/ml, cerca de 7,7 ×105 células/ml, cerca de 7,8 ×105 células/ml, cerca de 7,9 ×105 células/ml, cerca de 8 ×105 células/ml, cerca de 8,1 ×105 células/ml, cerca de 8,2 ×105 células/ml, cerca de 8,3 ×105 células/ml, cerca de 8,4 ×105 célu- las/ml, cerca de 8,5 ×105 células/ml, cerca de 8,6 ×105 células/ml, cerca de 8,7 ×105 células/ml, cerca de 8,8 ×105 células/ml, cerca de 8,9 ×105 células/ml, cerca de 9 ×105 células/ml, cerca de 9,1 ×105 células/ml, cerca de 9,2 ×105 células/ml, cerca de 9,3 ×105 células/ml, cerca de 9,4 ×105 células/ml, cerca de 9,5 ×105 células/ml, cerca de 9,6 ×105 célu- las/ml, cerca de 9,7 ×105 células/ml, cerca de 9,8 ×105 células/ml, cerca de 9,9 ×105 células/ml, cerca de 1 ×106 células/ml, cerca de 1,1 ×105 células/ml, cerca de 1,2 ×105 células/ml, cerca de 1,3 ×105 células/ml, cerca de 1,4 ×105 células/ml, cerca de 1,5 ×106 células/ml, cerca de 1,6 ×105 células/ml, cerca de 1,7 ×105 células/ml, cerca de 1,8 ×105 célu- las/ml, 1,9 ×105 células/ml, cerca de 2 ×106 células/ml, cerca de 2,1 ×105 células/ml, cerca de 2,2 ×105 células/ml, cerca de 2,3 ×105 células/ml, 2,4 ×105 células/ml, cerca de 2,5 ×106 células/ml, cerca de 2,6 ×105 cé- lulas/ml, cerca de 2,7 ×105 células/ml, 2,8 ×105 células/ml, 2,9 ×105 cé- lulas/ml, ou cerca de 3 ×106 células/ml antes de realizar a etapa (c).

[194] De acordo com algumas modalidades, a αGalCer, ou um análogo ou equivalente funcional da mesma, é OCH. De acordo com uma modalidade, a αGalCer, ou um análogo ou equivalente funcional da mesma, é um análogo de α-GalCer de fórmula estrutural: .

[195] De acordo com algumas modalidades, αGalCer, ou análogo ou equivalente funcional do mesmo, é mantido em uma concentração constante da etapa (c) à etapa (f). Em outra modalidade, a concentração de αGalCer, ou um análogo ou equivalente funcional da mesma, varia de cerca de 50 ng/ml a cerca de 500 ng/ml, de cerca de 100 ng/ml a cerca de 500 ng/ml, de cerca de 150 ng/ml a cerca de 500 ng/ml, de cerca de 200 ng/ml a cerca de 500 ng/ml, de cerca de 250 ng/ml a cerca de 500 ng/ml, de cerca de 300 ng/ml a cerca de 500 ng/ml, de cerca de 350 ng/ml a cerca de 500 ng/ml, de cerca de 400 ng/ml a cerca de 500 ng/ml, ou de cerca de 450 ng/ml a cerca de 500 ng/ml. De acordo com algumas modalidades, a concentração de αGalCer, ou um análogo ou equivalente funcional da mesma, é mantida a uma concentração de cerca de 50 ng/ml, cerca de 60 ng/ml, cerca de 70 ng/ml, cerca de 80 ng/ml, cerca de 90 ng/ml, cerca de 100 ng/ml, cerca de 110 ng/ml, cerca de 120 ng/ml, cerca de 130 ng/ml, cerca de 140 ng/ml, cerca de 150 ng/ml, cerca de 160 ng/ml, cerca de 170 ng/ml, cerca de 180 ng/ml, cerca de 190 ng/ml, cerca de 200 ng/ml, cerca de 210 ng/ml, cerca de 220 ng/ml, cerca de 230 ng/ml, cerca de 240 ng/ml, cerca de 250 ng/ml, cerca de 260 ng/ml, cerca de 270 ng/ml, cerca de 280 ng/ml, cerca de 290 ng/ml, cerca de 300 ng/ml, cerca de 310 ng/ml, cerca de 320 ng/ml, cerca de 330 ng/ml, cerca de 340 ng/ml, cerca de 350 ng/ml, cerca de 360 ng/ml, cerca de 370 ng/ml, cerca de 380 ng/ml, cerca de 390 ng/ml, cerca de 400 ng/ml, cerca de 410 ng/ml, cerca de 420 ng/ml, cerca de 430 ng/ml, cerca de 440 ng/ml, cerca de 450 ng/ml, cerca de 460 ng/ml, cerca de 470 ng/ml, cerca de 480 ng/ml, cerca de 490 ng/ml, ou cerca de 500 ng/ml.

[196] De acordo com algumas modalidades dos métodos descritos no presente documento, IL-2 é mantida em uma concentração constante da etapa (e) à etapa (f). De acordo com algumas modalidades, a con- centração de IL-2 está entre cerca de 10 U/ml a cerca de 100 U/ml, por exemplo, entre cerca de 10 U/ml a cerca de 100 U/ml, cerca de 15 U/ml a cerca de 100 U/ml, cerca de 20 U/ml a cerca de 100 U/ml, cerca de 25 U/ml a cerca de 100 U/ml, cerca de 30 U/ml a cerca de 100 U/ml, cerca de 35 U/ml a cerca de 100 U/ml, cerca de 40 U/ml a cerca de 100 U/ml, cerca de 45 U/ml a cerca de 100 U/ml, cerca de 50 U/ml a cerca de 100 U/ml, cerca de 55 U/ml a cerca de 100 U/ml, cerca de 60 U/ml a cerca de 100 U/ml, cerca de 65 U/ml a cerca de 100 U/ml, cerca de 70 U/ml a cerca de 100 U/ml, cerca de 75 U/ml a cerca de 100 U/ml, cerca de 80 U/ml a cerca de 100 U/ml, cerca de 85 U/ml a cerca de 100 U/ml, cerca de 90 U/ml a cerca de 100 U/ml, ou cerca de 95 U/ml a cerca de 100 U/ml. De acordo com algumas modalidades, a concentração de IL-2 é de cerca de 10 U/ml, Cerca de 15 U/ml, cerca de 20 U/ml, cerca de 25 U/ml, Cerca de 30 U/ml, cerca de 35 U/ml, cerca de 40 U/ml, cerca de 45 U/ml, Cerca de 50 U/ml, cerca de 55 U/ml, cerca de 60 U/ml, cerca de 65 U/ml, cerca de 70 U/ml, cerca de 75 U/ml, cerca de 80 U/ml, cerca de 85 U/ml, cerca de 90 U/ml, cerca de 95 U/ml, ou cerca de 100 U/ml.

[197] De acordo com algumas modalidades dos métodos descritos no presente documento, IL-7 é mantida em uma concentração constante da etapa (e) à etapa (f). De acordo com algumas modalidades, a con- centração de IL-7 está entre cerca de 10 ng/ml a cerca de 200 ng/ml, por exemplo, entre cerca de 10 ng/ml a cerca de 200 ng/ml, cerca de 20 ng/ml a cerca de 200 ng/ml, cerca de 30 ng/ml a cerca de 200 ng/ml, cerca de 40 ng/ml a cerca de 200 ng/ml, cerca de 50 ng/ml a cerca de 200 ng/ml, cerca de 60 ng/ml a cerca de 200 ng/ml, cerca de 70 ng/ml a cerca de 200 ng/ml, cerca de 80 ng/ml a cerca de 200 ng/ml, cerca de

90 ng/ml a cerca de 200 ng/ml, cerca de 100 ng/ml a cerca de 200 ng/ml, cerca de 110 ng/ml a cerca de 200 ng/ml, cerca de 120 ng/ml a cerca de 200 ng/ml, cerca de 130 ng/ml a cerca de 200 ng/ml, cerca de 140 ng/ml a cerca de 200 ng/ml, cerca de 150 ng/ml a cerca de 200 ng/ml, cerca de 160 ng/ml a cerca de 200 ng/ml, cerca de 170 ng/ml a cerca de 200 ng/ml, cerca de 180 ng/ml a cerca de 200 ng/ml, ou cerca de 190 ng/ml a cerca de 200 ng/ml. De acordo com algumas modalidades, a concentração de IL-7 é de cerca de 10 ng/ml, Cerca de 15 ng/ml, cerca de 20 ng/ml, cerca de 25 ng/ml, Cerca de 30 ng/ml, cerca de 35 ng/ml, cerca de 40 ng/ml, cerca de 45 ng/ml, Cerca de 50 ng/ml, cerca de 55 ng/ml, cerca de 60 ng/ml, cerca de 65 ng/ml, cerca de 70 ng/ml, cerca de 75 ng/ml, cerca de 80 ng/ml, cerca de 85 ng/ml, cerca de 90 ng/ml, cerca de 95 ng/ml, cerca de 100 ng/ml, cerca de 110 ng/ml, Cerca de 15 ng/ml, cerca de 120 ng/ml, cerca de 125 ng/ml, cerca de 130 ng/ml, cerca de 135 ng/ml, cerca de 140 ng/ml, cerca de 145 ng/ml, cerca de 150 ng/ml, cerca de 155 ng/ml, cerca de 160 ng/ml, cerca de 165 ng/ml, cerca de 170 ng/ml, cerca de 175 ng/ml, cerca de 180 ng/ml, cerca de 185 ng/ml, cerca de 190 ng/ml, cerca de 195 ng/ml, ou cerca de 200 ng/ml.

[198] De acordo com algumas modalidades, IL-2 é adicionada na etapa (e) entre cerca do dia 6 e do dia 8 de cultura. De acordo com algumas modalidades, IL-2 é adicionada na etapa (e) aproximadamente no dia 6 de cultura. De acordo com algumas modalidades, IL-2 é adici- onada na etapa (e) aproximadamente no dia 7 de cultura. De acordo com algumas modalidades, IL-2 é adicionada na etapa (e) aproximada- mente no dia 8 de cultura.

[199] De acordo com algumas modalidades, IL-7 é adicionada na etapa (e) entre cerca do dia 6 e do dia 8 de cultura. De acordo com algumas modalidades, IL-7 é adicionada na etapa (e) aproximadamente no dia 6 de cultura. De acordo com algumas modalidades, IL-7 é adici- onada na etapa (e) aproximadamente no dia 7 de cultura. De acordo com algumas modalidades, IL-7 é adicionada na etapa (e) aproximada- mente no dia 8 de cultura.

[200] De acordo com algumas modalidades, IL-2 e IL-7 são adici- onadas simultaneamente. De acordo com algumas modalidades, IL-2 e IL-7 são adicionadas simultaneamente no dia 7.

[201] De acordo com algumas modalidades, IL-15 é adicionada na etapa (e) entre cerca do dia 13 e do dia 15 de cultura. De acordo com algumas modalidades, IL-15 é adicionada na etapa (e) aproximada- mente no dia 13 de cultura. De acordo com algumas modalidades, IL- 15 é adicionada na etapa (e) aproximadamente no dia 14 de cultura. De acordo com algumas modalidades, IL-15 é adicionada na etapa (e) apro- ximadamente no dia 15 de cultura.

[202] De acordo com algumas modalidades, IL-15 é adicionada na etapa (e) entre cerca do dia 19 e do dia 21 de cultura. De acordo com algumas modalidades, IL-12 é adicionada na etapa (e) aproximada- mente no dia 19 de cultura. De acordo com algumas modalidades, IL- 12 é adicionada na etapa (e) aproximadamente no dia 20 de cultura. De acordo com algumas modalidades, IL-12 é adicionada na etapa (e) apro- ximadamente no dia 21 de cultura.

[203] De acordo com algumas modalidades, a etapa (f) é realizada pelo menos no dia 21. De acordo com algumas modalidades, a etapa (f) é realizada no dia 21. De acordo com algumas modalidades, a etapa (f) é realizada no dia 22. De acordo com algumas modalidades, a etapa (f) é realizada no dia 23. De acordo com algumas modalidades, a etapa (f) é realizada no dia 24.

[204] De acordo com algumas modalidades dos métodos descritos no presente documento, IL-15 é mantida em uma concentração cons- tante da etapa (e) à etapa (f). De acordo com algumas modalidades, a concentração de IL-15 está entre cerca de 10 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, por exemplo, entre cerca de 10 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, cerca de 15 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, cerca de 20 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, cerca de 25 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, cerca de 30 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, cerca de 35 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, cerca de 40 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, cerca de 45 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, cerca de 50 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, cerca de 55 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, cerca de 60 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, cerca de 65 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, cerca de 70 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, cerca de 75 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, cerca de 80 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, cerca de 85 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, cerca de 90 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, ou cerca de 95 ng/ml a cerca de 100 ng/ml. De acordo com algumas modalidades, a concentração de IL-15 é de cerca de 10 ng/ml, cerca de 15 ng/ml, cerca de 20 ng/ml, cerca de 25 ng/ml, cerca de 30 ng/ml, cerca de 35 ng/ml, cerca de 40 ng/ml, cerca de 45 ng/ml, cerca de 50 ng/ml, cerca de 55 ng/ml, cerca de 60 ng/ml, cerca de 65 ng/ml, cerca de 70 ng/ml, cerca de 75 ng/ml, cerca de 80 ng/ml, cerca de 85 ng/ml, cerca de 90 ng/ml, cerca de 95 ng/ml, ou cerca de 100 ng/ml.

[205] De acordo com algumas modalidades dos métodos descritos no presente documento, IL-12 é mantida em uma concentração cons- tante da etapa (e) à etapa (f).

[206] De acordo com algumas modalidades, o método compre- ende ainda uma etapa entre as etapas (e) e (f) de transportar a cultura da instalação de processamento para uma instalação de tratamento. De acordo com algumas modalidades, a etapa de transporte é iniciada em pelo menos 1 hora, pelo menos 2 horas, pelo menos 3 horas, pelo me- nos 4 horas, pelo menos 5 horas, pelo menos 6 horas, pelo menos 7 horas, pelo menos 8 horas , pelo menos 9 horas, pelo menos 10 horas, pelo menos 11 horas, pelo menos 12 horas, pelo menos 13 horas, pelo menos 14 horas, pelo menos 15 horas, pelo menos 16 horas, pelo me- nos 17 horas, pelo menos 18 horas , pelo menos 19 horas, pelo menos 20 horas, pelo menos 21 horas, pelo menos 22 horas, pelo menos 23 horas, ou pelo menos 24 horas da adição de IL-12.

[207] De acordo com algumas modalidades, a concentração de IL- 12 está entre cerca de 10 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, por exemplo, entre cerca de 10 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, cerca de 15 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, cerca de 20 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, cerca de 25 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, cerca de 30 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, cerca de 35 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, cerca de 40 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, cerca de 45 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, cerca de 50 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, cerca de 55 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, cerca de 60 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, cerca de 65 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, cerca de 70 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, cerca de 75 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, cerca de 80 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, cerca de 85 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, cerca de 90 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, ou cerca de 95 ng/ml a cerca de 100 ng/ml. De acordo com algumas modalidades, a concen- tração de IL-12 é de cerca de 10 ng/ml, cerca de 15 ng/ml, cerca de 20 ng/ml, cerca de 25 ng/ml, cerca de 30 ng/ml, cerca de 35 ng/ml, cerca de 40 ng/ml, cerca de 45 ng/ml, cerca de 50 ng/ml, cerca de 55 ng/ml, cerca de 60 ng/ml, cerca de 65 ng/ml, cerca de 70 ng/ml, cerca de 75 ng/ml, cerca de 80 ng/ml, cerca de 85 ng/ml, cerca de 90 ng/ml, cerca de 95 ng/ml, ou cerca de 100 ng/ml.

[208] De acordo com algumas modalidades, o método compre- ende ainda uma etapa de reabastecer o meio de cultura no sistema de cultura a cada 2 a 3 dias. De acordo com algumas modalidades, a etapa de reabastecimento inclui a adição de pulsos de novas células dendríti- cas carregadas com αGalCer ou um análogo ou equivalente funcional da mesma ao sistema de cultura. De acordo com algumas modalidades, o número de pulsos da nova população de células que compreendem

CD1d e αGalCer é pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9 ou pelo menos 10.

[209] De acordo com algumas modalidades, as etapas (c) – (f) são realizadas em um meio de cultura selecionado dentre o meio isento de soro X-VIVO-15 e meio RPMI 1640 contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) ou 10% de soro autólogo.

CÉLULAS APRESENTADORAS DE ANTÍGENO

[210] De acordo com algumas modalidades, a célula que compre- ende CD1d e alfa-galactosilceramida (αGalCer) é uma célula apresen- tadora de antígeno. Uma célula apresentadora de antígeno é uma classe de células com a capacidade para exibir em sua superfície um ou mais antígenos na forma de um complexo de peptídeo-MHC reco- nhecível por células efetoras específicas do sistema imunológico, e in- duzindo, assim, uma resposta imunológica celular eficaz contra o antí- geno ou antígenos sendo apresentados. Os exemplos de APCs profis- sionais são células dendríticas e macrófagos, embora qualquer célula que expresse moléculas MHC de Classe I ou moléculas MHC de Classe II possa apresentar potencialmente o antígeno de peptídeo. De acordo com algumas modalidades, uma APC pode ser uma célula ou população de células que é geneticamente modificada para apresentar um ou mais antígenos (isto é, um\ APC artificial (aAPC).

[211] De acordo com algumas modalidades, a célula de apresen- tação de antígeno é uma célula dendrítica (DC). De acordo com algu- mas modalidades, a célula dendrítica é carregada com αGalCer. De acordo com outra modalidade, a célula dendrítica carregada com αGal- Cer é derivada das MCs e é uma célula aderente. De acordo com outra modalidade no método para preparar a célula dendrítica carregada com αGalCer, a célula dendrítica carregada com αGalCer é uma célula ade- rente.

[212] De acordo com algumas modalidades, a célula dendrítica carregada com αGalCer é preparada por um método que compreende: (a) isolar uma população de células mononucleares (MCs); (b) cultivar a população de MCs em um sistema de cultura; (c) colocar o sistema de cultura em contato com IL-4 e GM-CSF, em que o contato é suficiente para induzir a diferenciação das MCs em células dendríticas; (d) colocar o sistema de cultura em contato com αGalCer, em que o contato é sufi- ciente para carregar as células dendríticas com αGalCer.

[213] De acordo com algumas modalidades do método para pre- parar células dendríticas carregadas com αGalCer, a população de MCs quando as culturas são iniciadas compreende entre cerca de 1×105 cé- lulas/ml e cerca de 5×106 células/ml. De acordo com algumas modali- dades, a população de MCs é de cerca de 1×105 células/ml, cerca de 1,5×105 células/ml, cerca de 1×105 células/ml, cerca de 1,5×105 célu- las/ml, cerca de 3×105 células/ml, cerca de 3,5×105 células/ml, cerca de 4×105 células/ml, cerca de 4,5×105 células/ml, cerca de 5×105 célu- las/ml, cerca de 5,5×105 células/ml, cerca de 6×105 células/ml, cerca de 6,5×105 células/ml, cerca de 7×105 células/ml, cerca de 7,5×105 célu- las/ml, cerca de 8×105 células/ml, cerca de 8,5×105 células/ml, cerca de 9×105 células/ml, cerca de 9,5×105 células/ml, cerca de 1×106 célu- las/ml, cerca de 1,5×106 células/ml, cerca de 2×106 células/ml, cerca de 2,5×106 células/ml, cerca de 3×106 células/ml, cerca de 3,5×106 célu- las/ml, cerca de 4×106 células/ml, cerca de 4,5×106 células/ml, ou cerca de 5×106 células/ml.

[214] De acordo com uma modalidade, a concentração de IL-4 na etapa (c) é de cerca de 500 U/ml. De acordo com uma modalidade, a concentração de IL-4 está entre cerca de 400-600 U/ml, por exemplo, cerca de 400 U/ml, cerca de 450 U/ml, cerca de 500 U/ml, cerca de 550 U/ml, cerca de 600 U/ml. De acordo com uma modalidade, a concentra- ção de GM-CSF na etapa (c) é de cerca de 50 ng/ml. De acordo com uma modalidade, a concentração de GM-CSF na etapa (c) está entre cerca de 40-60 ng/ml, por exemplo, cerca de 40 ng/ml, cerca de 45 ng/ml, cerca de 50 ng/ml, cerca de 55 ng/ml ou cerca de 60 ng/ml. De acordo com uma modalidade, a etapa (d) é realizada de cerca de 5 dias a cerca de 7 dias após a etapa (b). De acordo com uma modalidade, a etapa (d) é realizada a cerca de 5 dias após a etapa (b). De acordo com uma modalidade, a etapa (d) é realizada a cerca de 6 dias após a etapa (b). De acordo com uma modalidade, a etapa (d) é realizada a cerca de 7 dias após a etapa (b).

[215] De acordo com algumas modalidades, as etapas (c) - (e) são realizadas em um meio de cultura selecionado dentre o meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS ou soro autólogo. ESTIMULAÇÃO DAS CKTCS COM ALFA-GALACTOSILCERAMIDA (ΑGALCER) E ANÁLOGOS

[216] Após a estimulação primária, em particular em resposta a uma α-galactosilceramida (α-GalCer) por um glicoesfingolipídio não ma- mífero (GSL), as células do tipo I NKT produzem grandes quantidades de interferon (IFN)-γ e interleucina (IL)-4, que leva à ativação a jusante de DCs, células NK, células B e células T convencionais. α-GalCer, tam- bém conhecida como KRN7000, é um análogo glicolipídico simplificado da agelasfina, que foi originalmente isolado de uma esponja marinha Agelas mauritianus (Kobayahi et al., Oncol Res. 1995;7(10–11):529). α- GalCer é composta por uma galactose α-ligada, uma fitoesfingosina e uma cadeia de acila. O reconhecimento do complexo de α-GalCer-CD1d pelo TCR de célula do tipo I NKT resulta na secreção de uma variedade de citocinas e no início de uma resposta imunológica poderosa. OCH, um análogo de α-GalCer com uma cadeia de fitoesfingosina mais curta, estimula as células do tipo I NKT a secretar maiores quantidades de IL- 4 do que IFN-γ, desencadeando a resposta imunológica para Th2 (Jour-

nal of Biomedical Science 2017, 24:22). Glicolípidios sintéticos ou aná- logos de α-GalCer quimicamente modificados para induzir um perfil de citocinas mais preciso e previsível do que α-GalCer foram sintetizados e testados. Hung, JT et al. (Journal of Biomedical Science (2017) 24:22), incorporado a título de referência em sua totalidade ao presente docu- mento, descreve uma série de análogos de α-GalCer. A Patente nº U.S.

9.365.496, incorporada a título de referência em sua totalidade no pre- sente documento, também descreve vários análogos de α-GalCer com a fórmula estrutural:

[217] Outra classe de agonista de células do tipo I NKT, β-ManCer, foi descrita (O'Konek et al., J Clin Invest. Fevereiro de 2011; 121(2):683- 94). Esse composto tem uma estrutura de ceramida idêntica à esta da α-GalCer (KRN7000), o que contribui para a ligação a CD1d, com uma manose beta-ligada em vez de galactose alfa-ligada. Acreditava-se no campo que a porção química de açúcar alfa-ligada era um recurso crí- tico da α-GalCer para induzir imunidade a tumor. Portanto, a revelação da atividade antitumoral relativamente forte de β-ManCer foi inesperada. Embora a proteção induzida por β-ManCer tenha sido dependente de células do tipo I NKT, a proteção era independente de IFN-γ, mas de- pendente de TNF-α e óxido nítrico sintase (NOS). Além disso, consis- tente com o mecanismo distinto de proteção, α-GalCer e β-ManCer si- nergizaram-se para induzir imunidade tumoral quando doses subótimas foram usadas. Além disso, β-ManCer tem uma capacidade muito mais fraca para induzir anergia de longo prazo em células do tipo I NKT do que α-GalCer (O'Konek et al, Clin Cancer Res. 15 de agosto de 2013; 19(16):4404-11). Semelhante à α-GalCer, β-ManCer pode aumentar o efeito de uma vacina contra tumor (Mattarollo et al., Blood. 11 de outubro de 2012; 120(15):3019-29). Assim, as células do tipo I NKT podem usar várias trajetórias/mecanismos dependentes dos antígenos que os mes- mos reconhecem.

[218] De acordo com algumas modalidades, a população de CKTCs da invenção descrita compreende uma subpopulação de células T CD3+. De acordo com algumas modalidades, a população de CKTCs compreende uma subpopulação de células NKT. De acordo com uma modalidade, a subpopulação de células NKT compreende células CD3+Vα24+. De acordo com uma modalidade, a subpopulação de cé- lulas NKT compreende células CD3+Vα24-. De acordo com uma moda- lidade, a subpopulação de células NKT compreende células CD3+CD56+. De acordo com algumas modalidades, a subpopulação de células NKT compreende uma subpopulação de células do tipo 1 NKT. De acordo com algumas modalidades, o receptor de células T da sub- população de células NKT compreende uma cadeia de Vα24-Ja18 TCRα. De acordo com algumas modalidades, o receptor de células T da subpopulação de células NKT compreende uma cadeia de Vα24-Ja18 TCRα e uma cadeia de Vβ11 β. De acordo com algumas modalidades, a subpopulação de células NKT reconhece antígenos glicolipídicos apresentados por CD1d. De acordo com algumas modalidades, o antí- geno glicolipídico é αGalCer ou um análogo ou equivalente funcional do mesmo.

EXPANSÃO E ATIVAÇÃO DE CKTC

[219] Quando as células do tipo I NKT são estimuladas com α-Gal- Cer, as mesmas produzem IFN-γ. Simultaneamente, as mesmas ativam células apresentadoras de antígeno (APCs) por meio da interação de CD40-CD40L, especialmente induzindo DCs a amadurecerem e regula- rem crescentemente receptores coestimuladores, tais como CD80 e CD86. As DCs também produzem IL-12 após sua interação com células do tipo I NKT. IL-12 induz mais produção de IFN-γ por outras células T e desempenha um papel crítico junto com IFN-γ na ativação de efetores a jusante, tais como células NK, células T CD8+ e células T γδ (Paget et al., J Immunol. 15 de abril de 2012; 188(8):3928-39). A interação de células do tipo I NKT com APCs oferece sinais de ativação para (isto é, licenças) APCs para tornar as mesmas capazes de preparação cruzada a células T CD8+ por meio da indução de CD70 e CCL17 (Taraban et al., J Immunol. 2008 Abr. 1; 180(7):4615-20; Fujii et al., Immunol Rev. Dezembro de 2007; 220():183-98).

[220] De acordo com algumas modalidades, a ativação da popula- ção de CKTCs pode compreender um ou mais dentre induzir a secreção de uma citocina pela população de CKTCs, estimular a proliferação da população de CKTCs ou modular a expressão de um ou mais marcado- res na superfície celular das CKTCs. De acordo com algumas modali- dades, a citocina, cuja expressão é modulada, é uma ou mais selecio- nadas do grupo que consiste em IFNγ, IL-4, IL-5, IL-6 ou IL-10.

[221] A ativação e expansão da população de CKTCs podem ser medidas por vários ensaios, conforme descrito no presente documento. Atividades exemplares que podem ser medidas incluem a indução da proliferação, a indução da expressão de marcadores de ativação na po- pulação de CKTCs, a indução da secreção de citocinas pela população de CKTCs, a indução de sinalização na população de CKTCs e um au- mento na atividade citotóxica da população de CKTCs.

SECREÇÃO DE CITOCINAS

[222] A ativação de CKTCs para formar SCKTCs pode ser avali- ada ou medida determinando-se a secreção de citocinas, incluindo um ou mais dentre interferon gama (IFNγ), interleucina 4 (IL-4), interleucina 5 (IL-5), interleucina 6 (IL- 6) ou interleucina-10 (IL-10). De acordo com algumas modalidades, o ELISA é usado para determinar a secreção de citocinas, por exemplo, secreção de interferon gama (IFNγ), IL-4, IL-5, IL-6 ou IL-10. A técnica ELISPOT (immunospot ligado à enzima) pode ser usada para detectar CKTCs e SCKTCs que secretam uma determi- nada citocina (por exemplo, interferon gama (IFNγ)) em resposta aos métodos descritos no presente documento. Por exemplo, um sistema de cultura pode ser estabelecido pelo qual uma população de CKTCs ou SCKTCs produzida pelos métodos descritos no presente documento é cultivada em poços que foram revestidos com anticorpos anti-IFNγ. O IFNγ secretado é capturado pelo anticorpo revestido e então revelado com um segundo anticorpo acoplado a um substrato cromogênico. As moléculas de citocinas secretadas localmente formam manchas, com cada mancha correspondendo a uma célula secretora de IFNγ. O nú- mero de manchas permite determinar a frequência de células secretoras de IFNγ na amostra analisada. O ensaio ELISPOT também foi descrito para a detecção do fator de necrose tumoral alfa (TNFα), IL-4, IL-5, IL- 6, IL-10, IL-12, fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) e linfócitos secretores de granzima B (Klinman D, Nutman T. Current protocol in immunology. Nova York, N.Y: John Wiley & Sons, Inc.; 1994. páginas 6.19.1–6.19.8, incorporado a título de referência em sua totalidade no presente documento).

[223] As análises de citocinas de fluxo de citocinas intracelulares podem ser usadas para medir o teor de citocina em sobrenadantes de cultura, mas não fornecem nenhuma informação sobre o número de cé- lulas NKT que realmente secretam a citocina. Quando os linfócitos são tratados com inibidores da secreção, tais como monensina ou brefeldina A, os mesmos acumulam citocinas dentro de seu citoplasma mediante ativação. Após a fixação e permeabilização, as citocinas intracelulares podem ser quantificadas por citometria. Essa técnica permite a determi- nação das citocinas produzidas, o tipo de células que produzem essas citocinas e a quantidade de citocina produzida por célula.

[224] De acordo com algumas modalidades, a produção de citoci- nas pela população enriquecida de SCKTCs é caracterizada como IL-4 baixo, IL-5 baixo, IL-6 baixo, IL-10 baixo, IFNγ alto.

[225] De acordo com uma modalidade, a quantidade de IFN-γ pro- duzida pela população de células é de cerca de 5000 pg/ml ou maior.

[226] De acordo com algumas modalidades, a quantidade de IL-4 produzida pela população de células é de cerca de 5 pg/ml. De acordo com uma modalidade, a quantidade de IL-4 produzida pela população de células é de cerca de 4,5 pg/ml. De acordo com uma modalidade, a quantidade de IL-4 produzida pela população de células é de cerca de 4 pg/ml. De acordo com uma modalidade, a quantidade de IL-4 produ- zida pela população de células é de cerca de 3,5 pg/ml. De acordo com uma modalidade, a quantidade de IL-4 produzida pela população de cé- lulas é de cerca de 3 pg/ml. De acordo com uma modalidade, a quanti- dade de IL-4 produzida pela população de células é de cerca de 2,5 pg/ml. De acordo com uma modalidade, a quantidade de IL-4 produzida pela população de células é de cerca de 2 pg/ml. De acordo com uma modalidade, a quantidade de IL-4 produzida pela população de células é de cerca de 1,5 pg/ml. De acordo com uma modalidade, a quantidade de IL-4 produzida pela população de células é de cerca de 1 pg/ml. De acordo com uma modalidade, a quantidade de IL-4 produzida pela po- pulação de células está entre cerca de 1,0 e cerca de 5 pg/ml. De acordo com uma modalidade, a quantidade de IL-4 produzida pela população de células está entre cerca de 1,5 e cerca de 5 pg/ml. De acordo com uma modalidade, a quantidade de IL-4 produzida pela população de cé- lulas está entre cerca de 2,0 e cerca de 5 pg/ml. De acordo com uma modalidade, a quantidade de IL-4 produzida pela população de células está entre cerca de 2,5 e cerca de 5 pg/ml. De acordo com uma moda- lidade, a quantidade de IL-4 produzida pela população de células está entre cerca de 3,0 e cerca de 5 pg/ml. De acordo com uma modalidade, a quantidade de IL-4 produzida pela população de células está entre cerca de 3,5 e cerca de 5 pg/ml. De acordo com uma modalidade, a quantidade de IL-4 produzida pela população de células está entre cerca de 4,0 e cerca de 5 pg/ml. De acordo com uma modalidade, a quanti- dade de IL-4 produzida pela população de células está entre cerca de 4,5 e cerca de 5 pg/ml.

[227] De acordo com algumas modalidades, a razão entre IFNγ e IL-4 é um indicador de uma ou mais funções efetoras de células T (como extermínio celular e ativação celular), das CKTCs e SCKTCs. De acordo com algumas modalidades, o método é eficaz para alcançar uma razão de IFN gama:IL4 de pelo menos 1000, uma taxa de extermínio aumen- tou pelo menos 1,5 vez em relação às células CTKC de controle, ou ambos.

[228] De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 1000. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 1200. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 1300. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 1400. De acordo com uma modalidade, a razão em sobrenadantes de cultura de IFN-γ:IL-4 é igual ou superior a 1500. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em so- brenadantes de cultura é igual ou superior a 1550. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 1600. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN- γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é superior a 1650. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 1700. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 1750. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 1800. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 1850. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em so- brenadantes de cultura é igual ou superior a 1900. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é su- perior a 1950. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 2000. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 é igual ou superior a 2050. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 2100. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 2150. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em so- brenadantes de cultura é igual ou superior a 2200. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 2250. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN- γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 2300. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 2350. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 2400. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em so- brenadantes de cultura é igual ou superior a 2450. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 2500. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN- γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 2550. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 2600. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 2650. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em so- brenadantes de cultura é igual ou superior a 2700. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 2750. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN- γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 2800. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 2850. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 2900. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em so- brenadantes de cultura é igual ou superior a 2950. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 3000.

CITOTOXICIDADE

[229] A ativação de CKTCs para formar SCKTCs pode ser avali- ada pelo ensaio da atividade citotóxica das CKTCs em cada etapa do método descrito.

[230] A atividade citotóxica pode ser avaliada por qualquer técnica adequada conhecida pelos versados na técnica. Por exemplo, uma amostra que compreende uma população de CKTCs ou SCKTCs pro- duzidas pelos métodos descritos no presente documento pode ser ava- liada quanto à atividade citotóxica após um período de tempo apropri- ado, em um ensaio citotóxico padrão. Tais ensaios podem incluir, porém sem limitação, o ensaio de CTL de liberação de cromo e o ensaio de fluorescência ALAMAR BLUE conhecido na técnica.

[231] De acordo com algumas modalidades, uma população de cé- lulas é coletada por centrifugação, e a citotoxicidade contra células K562 (altamente indiferenciadas e da série granulocítica, derivadas de um pa- ciente com leucemia mieloide crônica) é avaliada. A linhagem celular K562, derivada de um paciente com leucemia mieloide crônica (CML) e que expressa o gene híbrido B3A2 bcr-abl, é conhecida por ser particu- larmente resistente à morte apoptótica. (Luchetti, F. et al, Haematolo- gica (1998) 83: 974-980). De acordo com uma modalidade, as células- alvo K562 e SCKTCs são alocadas em poços em uma ou mais razões de efetoras: alvo, por exemplo, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1 ou 20:1.. Após a incubação, a absorbância é detectada por um leitor de ensaio de imunossorvente li- gado à enzima, e a taxa de extermínio pode ser calculada. De acordo com outras modalidades, o mesmo ensaio pode ser realizado, em que a citotoxicidade contra células Jurkat (leucemia T aguda) é avaliada (So- manchi et al., PLoS ONE 10(10): e0141074. https://doi.org/10.1371/jour- nal.pone.0141074).

[232] De acordo com algumas modalidades, a taxa de extermínio pode ser representada pela seguinte fórmula: Taxa de extermínio: (%) = (OD490 poço experimental - OD490 poço negativo) x 100% (OD490 poço positivo - OD490 poço negativo)

[233] De acordo com algumas modalidades, a taxa de extermínio da população CKTC que compreende SCKTCs varia de cerca de 25% a cerca de 75%, inclusive. De acordo com algumas modalidades, a taxa de extermínio da população CKTC que compreende SCKTCs varia de cerca de 50% a cerca de 75%, inclusive. De acordo com algumas mo- dalidades, a taxa de extermínio da população de CKTC que compre- ende SCKTCs é de cerca de 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74% ou 75%.

[234] De acordo com algumas modalidades, a taxa de extermínio da população de CKTC que compreende SCKTCs preparadas pelos métodos descritos da invenção é aumentada pelo menos 1,5 vez em relação às células de controle (por exemplo, células não submetidas aos métodos particulares descritos nas etapas (c) - (e)). De acordo com al- gumas modalidades, a taxa de extermínio da população de CKTC que compreende SCKTCs preparadas pelos métodos da invenção é aumen- tada pelo menos 2 vezes em relação às células de controle (por exem-

plo, células não submetidas aos métodos particulares descritos nas eta- pas (c) - (e)). De acordo com algumas modalidades, a taxa de extermí- nio da população de CKTC que compreende SCKTCs preparadas pelos métodos da invenção é aumentada pelo menos 3 vezes em relação às células de controle (por exemplo, células não submetidas aos métodos particulares descritos nas etapas (c) - (e)). De acordo com algumas mo- dalidades, a taxa de extermínio da população de CKTC que compre- ende SCKTCs preparadas pelos métodos da invenção é aumentada pelo menos 3,5 vezes em relação às células de controle (por exemplo, células não submetidas aos métodos particulares descritos nas etapas (c) - (e)). De acordo com algumas modalidades, a taxa de extermínio da população de CKTC que compreende SCKTCs preparadas pelos méto- dos da invenção é aumentada pelo menos 4 vezes em relação às célu- las de controle (por exemplo, células não submetidas aos métodos par- ticulares descritos nas etapas (c) - (e)). De acordo com algumas moda- lidades, a taxa de extermínio da população de CKTC que compreende SCKTCs preparadas pelos métodos da invenção é aumentada pelo me- nos 4,5 vezes em relação às células de controle (por exemplo, células não submetidas aos métodos particulares descritos nas etapas (c) - (e)). De acordo com algumas modalidades, a taxa de extermínio da popula- ção de CKTC que compreende SCKTCs preparadas pelos métodos da invenção é aumentada pelo menos 5 vezes em relação às células de controle (por exemplo, células não submetidas aos métodos particulares descritos nas etapas (c) - (e)). PROLIFERAÇÃO/EXPANSÃO

[235] A capacidade dos métodos descritos da invenção para indu- zir a expansão das SCKTCs pode ser avaliada por manchamento com o uso do corante de manchamento de célula fluorescente éster succini- midílico de carboxifluoresceína (CFSE). Para comparar a taxa inicial de expansão celular, as células são manchadas com CFSE para determi- nar quão bem as várias etapas do método descrito (isto é, as etapas (b) - (e)) induziram a proliferação das SCKTCs. O manchamento com CFSE fornece um ponto final quantitativo e permite a fenotipagem simultânea das células expandidas. Todos os dias após a estimulação, uma alí- quota de células é retirada de cada cultura e analisada por citometria de fluxo. O manchamento com CFSE torna as células altamente fluores- centes. Mediante divisão celular, a fluorescência é reduzida à metade e, assim, quanto mais vezes uma célula se divide, menos fluorescente a mesma se torna. A capacidade do método descrito para induzir a proli- feração das SCKTCs é quantificada medindo-se o número de células que se dividiram uma, duas, três vezes e assim por diante.

[236] Para determinar o quão bem o método descrito promove o crescimento de longo prazo das SCKTCs, curvas de crescimento celular podem ser geradas. Esses experimentos são configurados como os ex- perimentos de CFSE anteriores, mas nenhum CFSE é usado. A cada 2- 3 dias de cultura, as células são removidas das respectivas culturas e contadas com o uso de um contador Coulter, que mede quantas células estão presentes e o volume médio das células. O volume celular médio é o melhor preditor de quando reestimular as células. Além disso, os fenótipos das células que são expandidas podem ser caracterizados para determinar se um subconjunto particular é preferencialmente ex- pandido.

[237] Antes de cada reestimulação, uma análise fenotípica das po- pulações de células em expansão é realizada para determinar a pre- sença de marcadores específicos que definem a população de SCKTC. De acordo com algumas modalidades, antes de cada reestimulação, uma alíquota de células é removida de cada cultura e analisada por ci- tometria de fluxo, com o uso de bitmap de Dispersão Direta (FS) versus

Dispersão de Luz de 90º da população de linfócitos intactos. A comuta- ção (retangular) nesse bitmap, CD56 versus CD3, foi medida. A comu- tação nos positivos duplos, Vα24 versus Vβ11 foi medida. O mancha- mento intracelular com perforina e Granzima B pode ser usado para re- alizar uma medida bruta para estimar o potencial citolítico.

[238] De acordo com algumas modalidades, a população de SCKTCs é expandida de cerca de 100 a cerca de 1000000 vezes, ou de cerca de 1000 a cerca de 1000000 vezes, por exemplo, de cerca de 1000 vezes a cerca de 100000 vezes com base na população de células CKTC iniciais, isto é, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 200, pelo menos cerca de 300, pelo menos cerca de 400, pelo menos cerca de 500, pelo menos cerca de 600, pelo menos cerca de 700, pelo menos cerca de 800, pelo menos cerca de 900, pelo menos cerca de 1000, pelo menos cerca de 2000, pelo menos cerca de 3000, pelo me- nos cerca de 4000, pelo menos cerca de 5000, pelo menos cerca de 6000, pelo menos cerca de 7000, pelo menos cerca de 8000, pelo me- nos cerca de 9000, pelo menos cerca de 10000, pelo menos cerca de 11000, pelo menos cerca de 12000, pelo menos cerca de 13000, pelo menos cerca de 14000, pelo menos cerca de 15000, pelo menos cerca de 16000, pelo menos cerca de 17000, pelo menos cerca de 18000, pelo menos cerca de 19000, pelo menos cerca de 20000, pelo menos cerca de 21000, pelo menos cerca de 22000, pelo menos cerca de 23000, pelo menos cerca de 24000, pelo menos cerca de 25000, pelo menos cerca de 26000, pelo menos cerca de 27000, pelo menos cerca de 28000, pelo menos cerca de 29000, pelo menos cerca de 30000, pelo menos cerca de 31000, pelo menos cerca de 32000, pelo menos cerca de 33000, pelo menos cerca de 34000, pelo menos cerca de 35000, pelo menos cerca de 36000, pelo menos cerca de 37000, pelo menos cerca de 38000, pelo menos cerca de 39000, pelo menos cerca de 40000, pelo menos cerca de 41000, pelo menos cerca de 42000,

pelo menos cerca de 43000, pelo menos cerca de 44000, pelo menos cerca de 44000, pelo menos cerca de 45000, pelo menos cerca de 46000, pelo menos cerca de 47000, pelo menos cerca de 48000, pelo menos cerca de 49000, pelo menos cerca de 50000, pelo menos cerca de 51000, pelo menos cerca de 52000, pelo menos cerca de 53000, pelo menos cerca de 54000, pelo menos cerca de 55000, pelo menos cerca de 56000, pelo menos cerca de 57000, pelo menos cerca de 58000, pelo menos cerca de 59000, pelo menos cerca de 60000, pelo menos cerca de 61000, pelo menos cerca de 62000, pelo menos cerca de 63000, pelo menos cerca de 64000, pelo menos cerca de 65000, pelo menos cerca de 66000, pelo menos cerca de 67000, pelo menos cerca de 68000, pelo menos cerca de 69000, pelo menos cerca de 70000, pelo menos cerca de 71000, pelo menos cerca de 72000, pelo menos cerca de 73000, pelo menos cerca de 74000, pelo menos cerca de 75000, pelo menos cerca de 76000, pelo menos cerca de 77000, pelo menos cerca de 78000, pelo menos cerca de 79000, pelo menos cerca de 80000, pelo menos cerca de 81000, pelo menos cerca de 82000, pelo menos cerca de 83000, pelo menos cerca de 84000, pelo menos cerca de 85000, pelo menos cerca de 86000, pelo menos cerca de 87000, pelo menos cerca de 88000, pelo menos cerca de 89000, pelo menos cerca de 90000, pelo menos cerca de 91000, pelo menos cerca de 92000, pelo menos cerca de 93000, pelo menos cerca de 94000, pelo menos cerca de 95000, pelo menos cerca de 96000, pelo menos cerca de 97000, pelo menos cerca de 98000, pelo menos cerca de 99000, pelo menos cerca de 100000, pelo menos cerca de 200000, pelo menos cerca de 300000, pelo menos cerca de 400000, pelo menos cerca de 500000, pelo menos cerca de 600000, pelo menos cerca de 700000, pelo menos cerca de 800000, pelo menos cerca de 900000 ou pelo menos cerca de 1000000 vezes.

MARCADORES

[239] De acordo com algumas modalidades da presente invenção, a expansão das SCKTCs com o uso dos métodos descritos no presente documento pode ser determinada avaliando-se a presença de marca- dores que caracterizam as SCKTCs e, assim, determinando a porcen- tagem das SCKTCs na população de células. De acordo com algumas modalidades, a citometria de fluxo pode ser usada para determinar a presença de uma subpopulação de células NKT que expressam marca- dores de células NKT com o uso de bitmap de Dispersão Direta (FS) versus Dispersão de Luz de 90º da população de linfócitos intactos. A comutação (retangular) nesse bitmap, CD56 versus CD3, foi medida. A comutação nos positivos duplos, Vα24 versus Vβ11 foi medida. De acordo com algumas modalidades, uma subpopulação de células NKT pode ser determinada pela presença de marcadores de CD3 e CD56 (células NKT CD3+CD56+). De acordo com uma modalidade, a ligação de um anticorpo anti-CD3 marcado com um primeiro marcador fluores- cente (por exemplo, um anticorpo anti-CD3 marcado com fluorescência disponível comercialmente, tal como azul anti-CD3-pacífico (PB) (BD Pharmingen, clone nº SP34-2) e um anticorpo anti-CD56 marcado com um segundo marcador fluorescente (por exemplo, um anticorpo anti- CD56 marcado com fluorescência disponível comercialmente, tal como anti-CD56-Ficoeritrina (PE)-Cy7 (BD Pharmingen, clone nº NCAM16.2)) pode ser usada para determinar a expressão de CD3 e CD56 na popu- lação de células, em que a ligação do anticorpo é medida por citometria de fluxo quanto, por exemplo, à fluorescência PB ou fluorescência PE, e uma porta é definida com base em células CD3+CD56+.

[240] De acordo com algumas modalidades, uma subpopulação de células do tipo I NKT pode ser determinada pela presença de marcado- res de TCR Vα e TCR Vβ. De acordo com uma modalidade, a ligação de um anticorpo anti-TCR Vα marcado com um primeiro marcador fluo-

rescente (por exemplo, um anticorpo anti-TCR Vα marcado com fluores- cência disponível comercialmente, tal como anti-TCR Vα-PE (Beckman Coulter, clone nº C15)) e um anticorpo anti-TCR Vβ marcado com um segundo marcador fluorescente (por exemplo, um anticorpo anti-TCR Vβ marcado com fluorescência comercialmente disponível, tal como anti-TCR Vβ-Isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Beckman Coulter, clone nº C21)) pode ser usada para determinar a expressão de Vα e Vβ na população de células, em que a ligação do anticorpo é medida por citometria de fluxo quanto, por exemplo, à fluorescência PE ou fluores- cência FITC, e uma porta é definida com base em células Vα+Vβ+.

[241] De acordo com algumas modalidades, uma subpopulação de células NKT pode ser caracterizada pela expressão dos marcadores CD3+Vα24+. De acordo com algumas modalidades, uma subpopulação de células do tipo I NKT é caracterizada pela expressão dos marcadores CD3+Vα24-. De acordo com algumas modalidades, a subpopulação de células do tipo I NKT inclui células caracterizadas pelos marcadores CD3+CD56+. De acordo com algumas modalidades, a subpopulação de células do tipo I NKT inclui células caracterizadas pela expressão dos marcadores CD3+Vα24+, CD3+Vα24-, CD3+CD56+ e misturas dos mesmos.

[242] De acordo com algumas modalidades, a população enrique- cida de SCKTCs constitui de cerca de 40% a cerca de 60% da popula- ção total de CKTC, isto é, cerca de 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% ou 60% da população total de células que resulta do método. Portanto, com base no número de MCs na etapa (c) do método (5 x105/ml - 3 x 106/ml), no grau de expansão (100 a 1000000 vezes) e na representação de SCKTCs na população total de CTKCs (40-60%), de acordo com algumas modalidades, o número de SCKTCs na população expandida e ativada enriquecida para SCKTCs varia de cerca de 2 x 107 células/ml a cerca de 1,8 x 1012 células/ml.

MÉTODOS DE USO INDIVÍDUOS

[243] Os métodos descritos no presente documento são destina- dos ao uso com qualquer sujeito que possa experimentar os benefícios desses métodos. Assim, “sujeitos”, “pacientes” e “indivíduos” (usados de forma intercambiável) incluem seres humanos, bem como sujeitos não humanos, particularmente animais domesticados.

[244] Em algumas modalidades, o sujeito e/ou animal é um mamí- fero, por exemplo, um ser humano, camundongo, rato, porquinho-da- índia, cão, gato, cavalo, vaca, porco, coelho, ovelha ou primata não hu- mano, tal como um macaco, chimpanzé ou babuíno. Em outras modali- dades, o sujeito e/ou animal é um não mamífero. De acordo com algu- mas modalidades, o sujeito e/ou animal é um ser humano. De acordo com algumas modalidades, o ser humano é um ser humano pediátrico. De acordo com outras modalidades, o ser humano é um ser humano adulto. De acordo com outras modalidades, o ser humano é um ser hu- mano geriátrico. De acordo com outras modalidades, o ser humano pode ser denominado como um paciente.

[245] De acordo com determinadas modalidades, o ser humano tem uma idade em uma faixa de cerca de 0 meses a cerca de 6 meses de idade, de cerca de 6 a cerca de 12 meses de idade, de cerca de 6 a cerca de 18 meses de idade, de cerca de 18 a cerca de 36 meses de idade, de cerca de 1 a cerca de 5 anos de idade, de cerca de 5 a cerca de 10 anos de idade, de cerca de 10 a cerca de 15 anos de idade, de cerca de 15 a cerca de 20 anos de idade, de cerca de 20 a cerca de 25 anos de idade, de cerca de 25 a cerca de 30 anos de idade, de cerca de 30 a cerca de 35 anos de idade, de cerca de 35 a cerca de 40 anos de idade, de cerca de 40 a cerca de 45 anos de idade, de cerca de 45 a cerca de 50 anos de idade, de cerca de 50 a cerca de 55 anos de idade,

de cerca de 55 a cerca de 60 anos de idade, de cerca de 60 a cerca de 65 anos de idade, de cerca de 65 a cerca de 70 anos de idade, de cerca de 70 a cerca de 75 anos de idade, de cerca de 75 a cerca de 80 anos de idade, de cerca de 80 a cerca de 85 anos de idade, de cerca de 85 a cerca de 90 anos de idade, de cerca de 90 a cerca de 95 anos de idade ou de cerca de 95 a cerca de 100 anos de idade.

[246] Em outras modalidades, o sujeito é um animal não humano e, portanto, a divulgação pertence ao uso veterinário. De acordo com algumas tais modalidades, o animal não humano é um animal domés- tico. De acordo com algumas tais modalidades, o animal não humano é um animal de gado.

ADMINISTRAÇÃO

[247] As composições farmacêuticas que compreendem o produto celular da presente divulgação podem ser administradas de uma ma- neira apropriada à doença a ser tratada. A quantidade e a frequência de administração serão determinadas por tais fatores como a condição do paciente, e o tipo e a gravidade da doença do paciente, embora dosa- gens adequadas possam ser determinadas por testes clínicos.

[248] A administração das composições farmacêuticas contendo o produto celular pode ser realizada de qualquer maneira apropriada à doença particular, incluindo por inalação de aerossol, injeção, ingestão, transfusão, implantação ou transplante. As composições farmacêuticas da presente divulgação podem ser administradas a um paciente por via parenteral, por exemplo, por via subcutânea, intradérmica, intramuscu- lar, por injeção intravenosa (i.v.) ou por via intraperitoneal.

[249] De acordo com algumas modalidades, as composições far- macêuticas da invenção descrita também podem ser administradas a um sujeito por injeção direta em um sítio desejado ou sistemicamente. Por exemplo, as composições farmacêuticas podem ser injetadas dire- tamente em um tumor ou linfonodo.

[250] Conforme usado no presente documento, a "administração parenteral" de uma composição farmacêutica inclui qualquer via de ad- ministração caracterizada por rompimento físico de um tecido de um su- jeito e administração da composição farmacêutica através da ruptura no tecido. A administração parenteral, assim, inclui, porém sem limitação, a administração de uma composição farmacêutica por injeção da com- posição, por aplicação da composição através de uma incisão cirúrgica, por aplicação da composição através de um ferimento não cirúrgico que penetra o tecido e similares. Por exemplo, a administração parenteral é contemplada incluindo, porém sem limitação, subcutânea, intraperito- neal, intramuscular, injeção intraesternal e técnicas de infusão dialítica renal.

[251] De acordo com algumas modalidades, a composição farma- cêutica contendo a população de SCKTCs pode ser administrada a um paciente diariamente. De acordo com algumas modalidades, a compo- sição farmacêutica contendo a população de SCKTCs pode ser admi- nistrada a um paciente por infusão contínua. De acordo com algumas modalidades, a composição farmacêutica contendo a população de SCKTCs pode ser administrada a um paciente duas vezes ao dia. De acordo com algumas modalidades, a composição farmacêutica con- tendo a população de SCKTCs pode ser administrada a um paciente mais do que duas vezes ao dia. De acordo com algumas modalidades, a composição farmacêutica contendo a população de SCKTCs pode ser administrada a um paciente em dias alternados. De acordo com algu- mas modalidades, a composição farmacêutica contendo a população de SCKTCs pode ser administrada a um paciente duas vezes por semana. De acordo com algumas modalidades, a composição farmacêutica con- tendo a população de SCKTCs pode ser administrada a um paciente em semanas alternadas. De acordo com algumas modalidades, a composi-

ção farmacêutica contendo a população de SCKTCs pode ser adminis- trada a um paciente a cada 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 meses.

[252] De acordo com algumas modalidades, a composição farma- cêutica que compreende um produto celular contendo a população de SCKTCs pode ser administrada a um paciente em um regime de dosa- gem (dose e periodicidade de administração) suficiente para manter a função das SCKTCs administradas na corrente sanguínea do paciente durante um período de 2 semanas a um ano ou mais, por exemplo, um mês a um ano ou mais, por exemplo, pelo menos 2 semanas, 4 sema- nas, 6 semanas, 8 semanas, 3 meses, 6 meses, um ano, 2 anos.

[253] A frequência da dose exigida será facilmente percebida pelo versado na técnica e dependerá de qualquer número de fatores, tais como, porém sem limitação, o tipo e a gravidade da doença que é tra- tada, o tipo e a idade do animal, etc.

[254] A composição farmacêutica que compreende o produto ce- lular contendo a população de SCKTCs pode ser coadministrada com vários agentes terapêuticos adicionais, por exemplo, citocinas, drogas quimioterápicas, inibidores de ponto de verificação e/ou fármacos anti- virais, dentre muitos outros). Alternativamente, o agente (ou agentes) terapêutico adicional pode ser administrado uma hora, um dia, uma se- mana, um mês, ou até mais, antes das composições farmacêuticas, ou qualquer permutação das mesmas. Além disso, o agente (ou agentes) terapêutico adicional pode ser administrado uma hora, um dia, uma se- mana, ou até mais, após a administração da composição farmacêutica, ou qualquer permutação dos mesmos. A frequência e o regime de ad- ministração serão prontamente evidentes para o versado na técnica e dependerão de qualquer número de fatores, tais como, porém sem limi- tação, o tipo e a gravidade da doença sendo tratada, a idade e o estado de saúde do animal, a identidade do agente ou agentes terapêuticos adicionais sendo administrados, a via de administração e a composição farmacêutica que compreende a população de SCKTCs e semelhantes.

[255] De acordo com alguns aspectos, a presente divulgação for- nece um método para estimular as células imunes de um sujeito susce- tível à ativação de células imunes que compreende colocar uma popu- lação de células imunes in vivo em contato com a composição farma- cêutica que compreende um produto celular contendo as SCKTCs des- critas no presente documento, em uma quantidade eficaz para estimular a população de células imunes. De acordo com uma modalidade, a po- pulação de células imunes compreende uma população de células den- dríticas. De acordo com uma modalidade, a população de células imu- nes é uma população de células T CD8+. De acordo com uma modali- dade, a população de células imunes é uma população de células NK. De acordo com uma modalidade, a população de células imunes com- preende uma população de células T restritas a MHC.

[256] De acordo com algumas modalidades, o sujeito tem um dis- túrbio suscetível ao tratamento que compreende uma imunoterapia que compreende a administração da composição farmacêutica contendo o produto celular da presente divulgação.

[257] As modalidades exemplificativas incluem um câncer, uma afecção pré-cancerosa (ou seja, uma afecção que pode ou provavel- mente irá se tornar câncer), uma doença autoimune e distúrbio que com- preende células e/ou anticorpos decorrentes de e direcionados contra os próprios tecidos de um indivíduo, uma doença ou distúrbio inflamató- rio, um distúrbio relacionado ao transplante de tecido (ou seja, um dis- túrbio relacionado à transferência (enxerto) de células, tecidos ou ór- gãos humanos de um doador para um receptor com o objetivo de res- taurar função (ou funções) no corpo (transplante), um distúrbio linfopro- liferativo pós-transplante, um distúrbio alérgico e uma infecção (ou seja, invasão do corpo com organismos que têm o potencial de causar doen-

ças). Por exemplo, a composição farmacêutica que compreende o pro- duto celular contendo uma quantidade terapêutica da população de SCKTCs da invenção descrita pode ser usada para tratar uma afecção caracterizada por baixa apresentação de MHC I. De acordo com algu- mas modalidades, a composição farmacêutica contendo o produto ce- lular de SCKTC pode ser usada para tratar um sujeito com doença avan- çada que não pode receber quimioterapia, por exemplo, o paciente não responde à quimioterapia ou está doente demais para ter uma janela terapêutica adequada para quimioterapia (por exemplo, um sujeito que está experimentando muitos efeitos colaterais limitantes de dose ou re- gime).

[258] De acordo com algumas modalidades, o termo "uma quanti- dade terapeuticamente eficaz" ou dose não significa necessariamente uma quantidade que é imediatamente terapeuticamente eficaz, mas in- clui uma dose que tem a capacidade para se expandir in vivo (após a administração) para fornecer um efeito terapêutico.

[259] Assim, é fornecido um método para administrar a um paci- ente uma dose subterapêutica que, no entanto, se torna uma quantidade terapeuticamente eficaz após a expansão e ativação de SCKTCs in vivo para fornecer o efeito terapêutico desejado. De acordo com algumas modalidades, uma dose subterapêutica é uma quantidade que é inferior à quantidade terapeuticamente eficaz.

UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA QUE COMPREENDE UM PRODUTO CELULAR CONTENDO UMA POPULAÇÃO EXPANDIDA E ENRIQUECIDA DE CÉLULAS T EXTERMINADORAS DE CITOCINA SUPERATIVADAS

[260] De acordo com outro aspecto, a invenção descrita fornece uma composição farmacêutica que compreende um produto celular con- tendo uma quantidade terapêutica de uma população expandida e enri- quecida de células T exterminadoras de citocinas superativadas

(SCKTCs) como um ingrediente ativo. Tal composição farmacêutica pode conter uma dose terapeuticamente eficaz da população de SCKTCs em uma forma adequada para administração a um sujeito, além de um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis. As composições farmacêuticas da invenção descrita podem ainda incluir um ou mais ingredientes ativos compatíveis que se destinam a fornecer à composição outro efeito farmacêutico além daquele fornecido pelo produto celular da invenção descrita. "Compatível", Conforme usado no presente documento, significa que os ingredientes ativos de tal compo- sição têm a capacidade para serem combinados uns com os outros de tal maneira que não haja nenhuma interação que reduziria substancial- mente a eficácia de cada ingrediente ativo ou da composição sob con- dições de uso comuns.

[261] De acordo com algumas modalidades, a população supera- tivada expandida e enriquecida de células T exterminadoras de citocinas (SCKTCs) é caracterizada por uma ou mais dentre uma modulação da secreção de uma citocina, proliferação estimulada da população de SCKTCs, expressão modulada de um ou mais marcadores na superfície celular das SCKTCs ou atividade citotóxica aumentada das SCKTCs contra uma população de células-alvo.

SECREÇÃO DE CITOCINAS

[262] De acordo com algumas modalidades, a população expan- dida e enriquecida de SCKTCs é caracterizada pela modulação da ex- pressão de uma ou mais citocinas selecionadas do grupo que consiste em IL-4, IL-5, IL-6 ou IL-10 ou IFNγ. De acordo com algumas modalida- des, a população expandida e enriquecida de células SCKTC compre- ende células com um perfil de expressão de citocinas que compreende baixa expressão de uma ou mais citocinas selecionadas do grupo que consiste em IL-4, IL-5, 1L-6 e IL -10 e alta expressão de IFNγ. De acordo com algumas modalidades, a produção de citocinas pela população en- riquecida de SCKTCs é caracterizada como IL-5-, IL-6-, IL-, IFN-4 baixo e IFNγ alto.

[263] De acordo com algumas modalidades, a quantidade de IFN- γ produzida pela população expandida e enriquecida de SCKTCs é de cerca de 5000 pg/ml ou maior.

[264] De acordo com algumas modalidades, a quantidade de IL-4 produzida pela população expandida e enriquecida de SCKTCs é de cerca de 5 pg/ml. De acordo com uma modalidade, a quantidade de IL- 4 produzida pela população expandida e enriquecida de SCKTCs é de cerca de 4,5 pg/ml. De acordo com uma modalidade, a quantidade de IL-4 produzida pela população expandida e enriquecida de SCKTCs é de cerca de 4 pg/ml. De acordo com uma modalidade, a quantidade de IL-4 produzida pela população expandida e enriquecida de SCKTCs é de cerca de 3,5 pg/ml. De acordo com uma modalidade, a quantidade de IL-4 produzida pela população expandida e enriquecida de SCKTCs é de cerca de 3 pg/ml. De acordo com uma modalidade, a quantidade de IL-4 produzida pela população expandida e enriquecida de SCKTCs é de cerca de 2,5 pg/ml. De acordo com uma modalidade, a quantidade de IL-4 produzida pela população expandida e enriquecida de SCKTCs é de cerca de 2 pg/ml. De acordo com uma modalidade, a quantidade de IL-4 produzida pela população expandida e enriquecida de SCKTCs é de cerca de 1,5 pg/ml. De acordo com uma modalidade, a quantidade de IL-4 produzida pela população expandida e enriquecida de SCKTCs é de cerca de 1 pg/ml. De acordo com uma modalidade, a quantidade de IL-4 produzida pela população expandida e enriquecida de SCKTCs está entre cerca de 1,0 e cerca de 5 pg/ml. De acordo com uma moda- lidade, a quantidade de IL-4 produzida pela população expandida e en- riquecida de SCKTCs está entre cerca de 1,5 e cerca de 5 pg/ml. De acordo com uma modalidade, a quantidade de IL-4 produzida pela po- pulação expandida e enriquecida de SCKTCs está entre cerca de 2,0 e cerca de 5 pg/ml. De acordo com uma modalidade, a quantidade de IL- 4 produzida pela população expandida e enriquecida de SCKTCs está entre cerca de 2,5 e cerca de 5 pg/ml. De acordo com uma modalidade, a quantidade de IL-4 produzida pela população expandida e enriquecida de SCKTCs está entre cerca de 3,0 e cerca de 5 pg/ml. De acordo com uma modalidade, a quantidade de IL-4 produzida pela população ex- pandida e enriquecida de SCKTCs está entre cerca de 3,5 e cerca de 5 pg/ml. De acordo com uma modalidade, a quantidade de IL-4 produzida pela população expandida e enriquecida de SCKTCs está entre cerca de 4,0 e cerca de 5 pg/ml. De acordo com uma modalidade, a quanti- dade de IL-4 produzida pela população expandida e enriquecida de SCKTCs está entre cerca de 4,5 e cerca de 5 pg/ml.

[265] De acordo com algumas modalidades, a razão entre IFNγ e IL-4 é um indicador de uma ou mais funções efetoras de células T (como extermínio celular e ativação celular), da população de controle de CKTCs e da população expandida e enriquecida de SCKTCs. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cul- tura é igual ou superior a 1000. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 1200. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadan- tes de cultura é igual ou superior a 1300. De acordo com uma modali- dade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou su- perior a 1400. De acordo com uma modalidade, a razão em sobrena- dantes de cultura de IFN-γ:IL-4 é igual ou superior a 1500. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cul- tura é igual ou superior a 1550. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 1600.

De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadan- tes de cultura é superior a 1650. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a

1700. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobre- nadantes de cultura é igual ou superior a 1750. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 1800. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN- γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 1850. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 1900. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é superior a 1950. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadan- tes de cultura é igual ou superior a 2000. De acordo com uma modali- dade, a razão de IFN-γ:IL-4 é igual ou superior a 2050. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 2100. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 2150. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 2200. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 2250. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em so- brenadantes de cultura é igual ou superior a 2300. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 2350. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN- γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 2400. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 2450. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 2500. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em so- brenadantes de cultura é igual ou superior a 2550. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 2600. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN- γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 2650. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 2700. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 2750. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em so- brenadantes de cultura é igual ou superior a 2800. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 2850. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN- γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 2900. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 2950. De acordo com uma modalidade, a razão de IFN-γ:IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 3000.

POPULAÇÃO ENRIQUECIDA DE SCTKCS

[266] A capacidade dos métodos descritos da invenção para indu- zir a expansão da população expandida e enriquecida de SCKTCs pode ser avaliada por manchamento com o uso do corante de manchamento de célula fluorescente éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE). Para comparar a taxa inicial de expansão celular, as CKTCs são manchadas com CFSE para determinar quão bem as várias etapas do método descrito (isto é, as etapas (c) - (e)) induziram a proliferação das SCKTCs. O manchamento com CFSE fornece um ponto final quan- titativo e permite a fenotipagem simultânea das células expandidas. To- dos os dias após a estimulação, uma alíquota de células é retirada de cada cultura e analisada por citometria de fluxo. O manchamento com CFSE torna as células altamente fluorescentes. Mediante divisão celu- lar, a fluorescência é reduzida à metade e, assim, quanto mais vezes uma célula se divide, menos fluorescente a mesma se torna. A capaci- dade do método descrito para induzir a proliferação das SCKTCs é quantificada medindo-se o número de células que se dividiram uma, duas, três vezes e assim por diante.

[267] Para determinar o quão bem o método descrito promove o crescimento de longo prazo das SCKTCs, curvas de crescimento celular podem ser geradas. Esses experimentos são configurados como os ex- perimentos de CFSE anteriores, mas nenhum CFSE é usado. A cada 2- 3 dias de cultura, as células são removidas das respectivas culturas e contadas com o uso de um contador Coulter, que mede quantas células estão presentes e o volume médio das células. O volume celular médio é o melhor preditor de quando reestimular as células. Além disso, os fenótipos das células que são expandidas podem ser caracterizados para determinar se um subconjunto particular é preferencialmente ex- pandido.

[268] Antes de cada reestimulação, uma análise fenotípica das po- pulações de células em expansão é realizada para determinar a pre- sença de marcadores específicos que definem a população de SCKTC. De acordo com algumas modalidades, antes de cada reestimulação, uma alíquota de células é removida de cada cultura e analisada por ci- tometria de fluxo, com o uso de bitmap de Dispersão Direta (FS) versus Dispersão de Luz de 90º da população de linfócitos intactos. A comuta- ção (retangular) nesse bitmap, CD56 versus CD3, foi medida. A comu- tação nos positivos duplos, Vα24 versus Vβ11 foi medida. O mancha- mento intracelular com perforina e Granzima B pode ser usado para re- alizar uma medida bruta para estimar o potencial citolítico.

[269] De acordo com algumas modalidades, a população de SCKTCs é expandida de cerca de 100 a cerca de 1000000 vezes, ou de cerca de 1000 a cerca de 1000000 vezes, por exemplo, de cerca de 1000 vezes a cerca de 100000 vezes com base na população de células

CKTC iniciais, isto é, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 200, pelo menos cerca de 300, pelo menos cerca de 400, pelo menos cerca de 500, pelo menos cerca de 600, pelo menos cerca de 700, pelo menos cerca de 800, pelo menos cerca de 900, pelo menos cerca de 1000, pelo menos cerca de 2000, pelo menos cerca de 3000, pelo me- nos cerca de 4000, pelo menos cerca de 5000, pelo menos cerca de 6000, pelo menos cerca de 7000, pelo menos cerca de 8000, pelo me- nos cerca de 9000, pelo menos cerca de 10000, pelo menos cerca de 11000, pelo menos cerca de 12000, pelo menos cerca de 13000, pelo menos cerca de 14000, pelo menos cerca de 15000, pelo menos cerca de 16000, pelo menos cerca de 17000, pelo menos cerca de 18000, pelo menos cerca de 19000, pelo menos cerca de 20000, pelo menos cerca de 21000, pelo menos cerca de 22000, pelo menos cerca de 23000, pelo menos cerca de 24000, pelo menos cerca de 25000, pelo menos cerca de 26000, 27000, pelo menos cerca de 28000, pelo menos cerca de 29000, 30000, pelo menos cerca de 31000, pelo menos cerca de 32000, pelo menos cerca de 33000, pelo menos cerca de 34000, pelo menos cerca de 35000, pelo menos cerca de 36000, pelo menos cerca de 37000, pelo menos cerca de 38000, pelo menos cerca de 39000, pelo menos cerca de 40000, pelo menos cerca de 41000, pelo menos cerca de 42000, pelo menos cerca de 43000, pelo menos cerca de 44000, pelo menos cerca de 44000, pelo menos cerca de 45000, pelo menos cerca de 46000, pelo menos cerca de 47000, pelo menos cerca de 48000, pelo menos cerca de 49000, pelo menos cerca de 50000, pelo menos cerca de 51000, pelo menos cerca de 52000, pelo menos cerca de 53000, pelo menos cerca de 54000, pelo menos cerca de 55000, pelo menos cerca de 56000, pelo menos cerca de 57000, pelo menos cerca de 58000, pelo menos cerca de 59000, pelo menos cerca de 60000, pelo menos cerca de 61000, pelo menos cerca de 62000, pelo menos cerca de 63000, pelo menos cerca de 64000, pelo menos cerca de 65000, pelo menos cerca de 66000, pelo menos cerca de 67000, pelo menos cerca de 68000, pelo menos cerca de 69000, pelo menos cerca de 70000, pelo menos cerca de 71000, pelo menos cerca de 72000, pelo menos cerca de 73000, pelo menos cerca de 74000, pelo menos cerca de 75000, pelo menos cerca de 76000, pelo menos cerca de 77000, pelo menos cerca de 78000, pelo menos cerca de 79000, pelo menos cerca de 80000, pelo menos cerca de 81000, pelo menos cerca de 82000, pelo menos cerca de 83000, pelo menos cerca de 84000, pelo menos cerca de 85000, pelo menos cerca de 86000, pelo menos cerca de 87000, pelo menos cerca de 88000, pelo menos cerca de 89000, pelo menos cerca de 90000, pelo menos cerca de 91000, pelo menos cerca de 92000, pelo menos cerca de 93000, pelo menos cerca de 94000, pelo menos cerca de 95000, pelo menos cerca de 96000, pelo menos cerca de 97000, pelo menos cerca de 98000, pelo menos cerca de 99000, pelo menos cerca de 100000, pelo menos cerca de 200000, pelo menos cerca de 300000, pelo menos cerca de 400000, pelo menos cerca de 500000, pelo menos cerca de 600000, pelo menos cerca de 700000, pelo menos cerca de 800000, pelo menos cerca de 900000 ou pelo menos cerca de 1000000 vezes.

[270] Em relação à proliferação estimulada, de acordo com algu- mas modalidades, a população expandida e enriquecida de SCKTCs constitui de cerca de 40% a cerca de 60% da população total de células CTKC, isto é, cerca de 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% ou 60% da população total de células CTKC. De acordo com algumas mo- dalidades, o número de SCKTCs na população expandida enriquecida para SCKTCs varia de cerca de 2 x 107 células/ml a cerca de 1,8 x 1012 células/ml.

EXPRESSÃO DE MARCADOR

[271] De acordo com algumas modalidades, a citometria de fluxo

(por exemplo, com o uso de bitmap de Dispersão Direta (FS) versus Dispersão de Luz de 90º da população de linfócitos intactos. A comuta- ção (retangular) nesse bitmap, CD56 versus CD3, foi medida. A comu- tação nos positivos duplos, Vα24 versus Vβ11 foi medida e pode ser usada para caracterizar a expressão de marcadores celulares pela po- pulação expandida e enriquecida de SCKTCs. De acordo com algumas modalidades, a população expandida e enriquecida de SCKTCs com- preende uma subpopulação de células que expressam marcadores de células NKT. De acordo com algumas dessas modalidades, a subpopu- lação de células que expressam marcadores NKT pode ser determinada pela presença de marcadores de CD3 e CD56. De acordo com algumas modalidades, a ligação de um anticorpo anti-CD3 marcado com um pri- meiro marcador fluorescente (por exemplo, um anticorpo anti-CD3 mar- cado com fluorescência disponível comercialmente, tal como azul anti- CD3-pacífico (PB) (BD Pharmingen, clone nº SP34-2))) e um anticorpo anti-CD56 marcado com um segundo marcador fluorescente (por exem- plo, um anticorpo anti-CD56 marcado com fluorescência disponível co- mercialmente, tal como anti-CD56-Ficoeritrina (PE)-Cy7 (BD Pharmin- gen, clone nº NCAM16.2)) pode ser usada para determinar a expressão de CD3 e CD56 na população expandida e enriquecida de SCKTC, em que a ligação do anticorpo é medida por citometria de fluxo quanto, por exemplo, à fluorescência PB ou fluorescência PE, e uma porta é definida com base em células CD3+CD56+.

[272] De acordo com algumas modalidades, a população expan- dida e enriquecida de SCKTCs compreende uma subpopulação de cé- lulas que expressam marcadores do tipo I NKT. De acordo com algumas dessas modalidades, a subpopulação de células que expressam mar- cadores do tipo 1 NKT pode ser determinada pela presença de marca- dores de TCR Vα e TCR Vβ. De acordo com algumas modalidades, a ligação de um anticorpo anti-TCR Vα marcado com um primeiro marca- dor fluorescente (por exemplo, um anticorpo anti-TCR Vα marcado com fluorescência disponível comercialmente, tal como anti-TCR Vα-PE (Beckman Coulter, clone nº C15)) e um anticorpo anti-TCR Vβ marcado com um segundo marcador fluorescente (por exemplo, um anticorpo anti-TCR Vβ marcado com fluorescência comercialmente disponível, tal como anti-TCR Vβ-Isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Beckman Coul- ter, clone nº C21)) pode ser usada para determinar a expressão de Vα e Vβ na população de células, em que a ligação do anticorpo é medida por citometria de fluxo quanto, por exemplo, à fluorescência PE ou fluo- rescência FITC, e uma porta é definida com base em células Vα+Vβ+.

[273] De acordo com algumas modalidades, a subpopulação de células que expressam marcadores de células do tipo I NKT pode com- preender células caracterizadas pela expressão dos marcadores CD3+Vα24+. De acordo com algumas modalidades, a subpopulação de células que expressam marcadores de células do tipo 1 NKT compre- ende células caracterizadas pela expressão dos marcadores CD3+Vα24-. De acordo com algumas modalidades, a subpopulação de células que expressam marcadores de células do tipo 1 NKT inclui cé- lulas que são caracterizadas pelos marcadores CD3+CD56+. De acordo com algumas modalidades, a subpopulação de células que expressam marcadores de células do tipo 1 NKT inclui células que são caracteriza- das pela expressão dos marcadores CD3+Vα24+, CD3+Vα24-, CD3+CD56+ e misturas dos mesmos.

ATIVIDADE CITOTÓXICA

[274] A atividade citotóxica pode ser avaliada por qualquer técnica adequada conhecida pelos versados na arte. Por exemplo, a composi- ção farmacêutica que compreende um produto celular contendo uma população expandida e enriquecida de SCKTCs, conforme descrito no presente documento, pode ser avaliada quanto à atividade citotóxica em um período de tempo apropriado em um ensaio citotóxico padrão. Tais ensaios podem incluir, porém sem limitação, o ensaio de CTL de libera- ção de cromo e o ensaio de fluorescência ALAMAR BLUE conhecido na técnica.

[275] De acordo com algumas modalidades, uma amostra de uma população de células T efetoras é coletada por centrifugação, e sua ci- totoxicidade avaliada contra células-alvo K562 (altamente indiferencia- das e da série granulocítica, derivadas de um paciente com leucemia mieloide crônica). A linhagem celular K562, derivada de um paciente com leucemia mieloide crônica (CML) e que expressa o gene híbrido B3A2 bcr-abl, é conhecida por ser particularmente resistente à morte apoptótica. (Luchetti, F. et al, Haematologica (1998) 83: 974-980). De acordo com uma modalidade, amostras replicadas de células-alvo K562 e SCKTCs efetoras preparadas de acordo com os métodos descritos da invenção são alocadas em poços em uma ou mais razões de efetoras: alvo, por exemplo, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1 ou 20:1. Após a incubação, a absorbância é detectada por um leitor de ensaio de imunossorvente ligado à enzima, e a taxa de extermínio pode ser calculada. De acordo com outras mo- dalidades, o mesmo ensaio pode ser realizado, em que a citotoxicidade contra células Jurkat (leucemia T aguda) é avaliada (Somanchi et al., PLoS ONE 10(10): e0141074. https://doi.org/10.1371/jour- nal.pone.0141074).

[276] De acordo com algumas modalidades, a taxa de extermínio pode ser representada pela seguinte fórmula: Taxa de Extermínio: (%) = (OD490 poço experimental - OD490 poço negativo) x 100% (OD490 poço positivo - OD490 poço negativo)

[277] De acordo com algumas modalidades, a taxa de extermínio da população expandida e enriquecida de SCKTCs varia de cerca de 25% a cerca de e 75%, inclusive. De acordo com algumas modalidades,

a taxa de extermínio da população expandida e enriquecida de SCKTCs varia de cerca de 50% a cerca de e 75%, inclusive. De acordo com al- gumas modalidades, a taxa de extermínio da população expandida e enriquecida de SCKTCs é de cerca de 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74% ou 75%.

[278] De acordo com algumas modalidades, a taxa de extermínio da população expandida e enriquecida de SCKTCs preparadas pelos métodos descritos da invenção é aumentada pelo menos 1,5 vez em relação às CKTCs de controle (por exemplo, células não submetidas aos métodos particulares descritos nas etapas (c) – (e)). De acordo com algumas modalidades, a taxa de extermínio da população expandida e enriquecida de SCKTCs preparadas pelos métodos da invenção é au- mentada pelo menos 2 vezes em relação às CTKCs de controle (por exemplo, células não submetidas aos métodos particulares descritos nas etapas (c) – (e)). De acordo com algumas modalidades, a taxa de extermínio da população expandida e enriquecida de SCKTCs prepara- das pelos métodos da invenção é aumentada pelo menos 3 vezes em relação às CTKCs de controle (por exemplo, células não submetidas aos métodos particulares descritos nas etapas (c) – (e)). De acordo com algumas modalidades, a taxa de extermínio da população expandida e enriquecida de SCKTCs preparadas pelos métodos da invenção é au- mentada pelo menos 3,5 vezes em relação às CKTCs de controle (por exemplo, células não submetidas aos métodos particulares descritos nas etapas (c) – (e)). De acordo com algumas modalidades, a taxa de extermínio da população expandida e enriquecida de SCKTCs prepara- das pelos métodos da invenção é aumentada pelo menos 4 vezes em relação às CKTCs de controle (por exemplo, células não submetidas aos métodos particulares descritos nas etapas (c) – (e)). De acordo com algumas modalidades, a taxa de extermínio da população expandida e enriquecida de SCKTCs preparadas pelos métodos da invenção é au- mentada pelo menos 4,5 vezes em relação às CKTCs de controle (por exemplo, células não submetidas aos métodos particulares descritos nas etapas (c) – (e)). De acordo com algumas modalidades, a taxa de extermínio da população expandida e enriquecida de SCKTCs prepara- das pelos métodos da invenção é aumentada pelo menos 5 vezes em relação às CKTCs de controle (por exemplo, células não submetidas aos métodos particulares descritos nas etapas (c) – (e)).

[279] De acordo com algumas modalidades, a população expan- dida e enriquecida de SCKTCs é caracterizada por uma razão de IFN gama:IL4 de pelo menos 1000, uma taxa de extermínio aumentou pelo menos 1,5 vez em relação às células de controle, ou ambos.

[280] As formulações da composição farmacêutica adequadas para administração parenteral compreendem o ingrediente ativo combi- nado com um carreador farmaceuticamente aceitável, tal como água es- téril ou solução salina isotônica estéril. As soluções carreadoras exem- plificativas também podem conter tampões, diluentes e outros aditivos adequados. O termo "tampão", conforme usado no presente docu- mento, refere-se a uma solução ou líquido cuja constituição química neutraliza ácidos ou bases sem uma alteração significativa no pH. Os exemplos de tampões previstos pela invenção descrita incluem, sem li- mitação, solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (PBS), so- lução de Ringer, dextrose 5% em água (D5W), solução salina normal/fi- siológica (0,9% NaCl). Em algumas modalidades, a solução de infusão é isotônica para os tecidos em questão.

[281] As composições farmacêuticas exemplificativas da invenção descrita podem compreender uma suspensão ou dispersão de células em um diluente ou solvente não tóxico parenteralmente aceitável. Uma solução geralmente é considerada como uma mistura homogênea de duas ou mais substâncias; a mesma é frequentemente, embora não ne- cessariamente, um líquido. Em uma solução, as moléculas do soluto (ou substância dissolvida) são distribuídas uniformemente entre aquelas do solvente. Uma dispersão é um sistema de duas fases, em que uma fase (por exemplo, partículas) é distribuída em uma segunda fase ou fase contínua. Uma suspensão é uma dispersão em que uma espécie fina- mente dividida é combinada com outra espécie, com a primeira sendo dividida finamente e misturada de modo a não assentar rapidamente. Entre os veículo e solventes aceitáveis que podem ser empregados es- tão água, solução de Ringer e solução (salina) isotônica de cloreto de sódio.

[282] Composições adicionais da presente invenção podem ser prontamente preparadas com o uso de tecnologia que é conhecida na técnica, tal como descrita em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª ou 19ª edições, publicado pela Mack Publishing Company de Eas- ton, Pa., que está incorporado ao presente documento a título de refe- rência.

[283] Formulações da composição farmacêutica podem ser prepa- radas, embaladas e/ou vendidas em uma forma adequada para admi- nistração de bolus ou para administração contínua. As formulações in- jetáveis podem ser preparadas, embaladas ou vendidas na forma de dosagem unitária, como em ampolas ou em recipientes de múltiplas do- ses contendo um conservante. As formulações para administração pa- renteral incluem, porém sem limitação, suspensões, soluções, emul- sões em veículos oleosos ou aquosos, pastas e formulações implantá- veis de liberação sustentada ou biodegradáveis. Tais formulações po- dem compreender ainda um ou mais ingredientes adicionais incluindo, porém sem limitação, agentes de suspensão, estabilização ou disper- são.

[284] As formulações das composições farmacêuticas descritas no presente documento podem ser preparadas por qualquer método co- nhecido ou posteriormente desenvolvido na técnica da farmacologia. Geralmente, tais métodos preparatórios incluem a etapa de colocar o ingrediente ativo em associação a um carreador ou um ou mais outros ingredientes acessórios e, então, se necessário ou desejável, conformar ou embalar o produto em uma unidade de dose única ou múltiplas do- ses.

[285] Embora as descrições de composições farmacêuticas forne- cidas no presente documento sejam principalmente direcionadas a com- posições farmacêuticas que são adequadas para administração ética a seres humanos, será entendido pelo versado na técnica que tais com- posições são, de modo geral, adequadas para administração a animais de todos os tipos. A modificação das composições farmacêuticas ade- quadas para a administração a humanos a fim de tornar as composições adequadas para a administração a vários animais é bem entendida, e o farmacêutico veterinário de habilidade comum na técnica pode projetar e realizar tal modificação com apenas experimentação comum, se hou- ver.

[286] As composições farmacêuticas que são úteis nos métodos da divulgação podem ser preparadas/formuladas, embaladas ou vendi- das em formulações adequadas para administração oral, retal, vaginal, parenteral, tópica, pulmonar, intranasal, intralesional, bucal, oftálmica, intravenosa, intraórgão ou outra via de administração. Outras formula- ções contempladas incluem nanopartículas projetadas, preparações li- possômicas, eritrócitos resselados contendo o ingrediente ativo e for- mulações imunologicamente baseadas.

[287] De acordo com algumas modalidades, as composições far- macêuticas da invenção descrita podem ser inicialmente administradas e, posteriormente, mantidas por outras administrações. Por exemplo, de acordo com algumas modalidades, as composições farmacêuticas da invenção descrita podem ser administradas por um método de injeção e, posteriormente, administradas ainda pelo mesmo método ou por um método diferente.

[288] A composição farmacêutica da divulgação pode ser prepa- rada, embalada ou vendida a granel, como uma dose unitária única, ou como uma pluralidade de doses unitárias. Conforme usado no presente documento, uma "dose unitária" é uma quantidade distinta da composi- ção farmacêutica que compreende o produto celular que compreende uma quantidade predeterminada do ingrediente ativo, isto é, a popula- ção expandida e enriquecida de SCKTCs. A quantidade do ingrediente ativo é geralmente igual à dosagem do ingrediente ativo que seria ad- ministrada a um sujeito ou uma fração conveniente de tal dosagem, tal como, por exemplo, metade ou um terço de tal dosagem.

[289] As quantidades relativas dos ingredientes ativo, o carreador farmaceuticamente aceitável e quaisquer ingredientes adicionais em uma composição farmacêutica da divulgação variarão, dependendo da identidade, tamanho e condição do indivíduo tratado e dependendo adi- cionalmente da via pela qual a composição deve ser administrada. A título de exemplo, a composição pode compreender entre 0,1% e 100% (em p/p) de ingrediente ativo.

[290] Além do ingrediente ativo, de acordo com algumas modali- dades, uma composição farmacêutica da divulgação pode compreender ainda um ou mais agentes farmaceuticamente ativos adicionais, por exemplo, citocinas, fármacos quimioterápicos, inibidores de ponto de verificação e/ou fármacos antivirais, dentre muitos outros.

[291] De acordo com algumas modalidades, um agente estabiliza- dor de proteína pode ser adicionado ao produto celular que compreende a população expandida e enriquecida de SCKTCs após fabricar, por exemplo, albumina, que pode atuar como um agente estabilizador. De acordo com algumas modalidades, a albumina é albumina humana. De acordo com algumas modalidades, a albumina é albumina humana re- combinante. De acordo com algumas modalidades, as quantidades mí- nimas de albumina empregadas na formulação podem ser cerca de 0,5% a cerca de 25% em peso/peso, isto é, cerca de 0,5%, cerca de 1,0%, cerca de 2,0, cerca de 3%, cerca de 4%, cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14%, cerca de 15%, cerca de 16%, cerca de 17%, cerca de 18%, cerca de 19%, cerca de 20%, cerca de 21%, cerca de 22%, cerca de 23%, cerca de 24%, cerca de 25% em peso/peso, incluindo valores intermediários, tais como cerca de 12,5% em peso/peso.

[292] De acordo com algumas modalidades, a composição farma- cêutica compreende uma quantidade estabilizadora de soro. O termo "quantidade estabilizadora", conforme usado no presente documento, refere-se à quantidade de soro que, quando incluída na formulação da composição farmacêutica da invenção descrita que compreende SCKTCs enriquecidas, permite que essas células retenham sua ativi- dade efetora de células T. De acordo com algumas modalidades, o soro é soro humano autólogo a um paciente humano. De acordo com algu- mas modalidades, o soro é soro sintético. De acordo com algumas mo- dalidades, a quantidade estabilizadora de soro é de pelo menos cerca de 10% (em v/v).

[293] De acordo com algumas modalidades, os métodos da pre- sente invenção compreendem a etapa adicional de preparar a composi- ção farmacêutica adicionando-se um excipiente farmaceuticamente aceitável, em particular um excipiente conforme descrito no presente documento, por exemplo, um diluente, estabilizador e/ou conservante.

[294] O termo "excipiente", conforme empregado no presente do-

cumento, é um termo genérico para cobrir todos os ingredientes adicio- nados à população de SCKTC que não têm uma função biológica ou fisiológica, que não são tóxicos e não interagem com outros componen- tes.

[295] Uma vez que a formulação final da composição farmacêutica tiver sido preparada, a mesma será colocada em um recipiente ade- quado, por exemplo, uma bolsa de infusão ou criotubo.

[296] De acordo com algumas modalidades, os métodos de acordo com a presente divulgação compreendem a etapa adicional de preen- cher a composição farmacêutica que compreende o produto celular con- tendo a população expandida e enriquecida de SCKTCs ou uma formu- lação farmacêutica da mesma em um recipiente adequado, tal como uma bolsa de infusão e vedar a mesma para formar o produto celular.

[297] De acordo com algumas modalidades, o produto que com- preende o recipiente preenchido com a composição farmacêutica que compreende o produto celular que compreende a população expandida e enriquecida de SCKTCs da presente divulgação é congelado para ar- mazenamento e transporte, por exemplo, a cerca de -135 ºC, por exem- plo, na fase de vapor do nitrogênio líquido. De acordo com algumas des- sas modalidades, a formulação também pode conter um crioconser- vante, tal como DMSO. A quantidade de DMSO é geralmente cerca de 20% ou menos, tal como cerca de 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ou 20% em v/v.

[298] De acordo com algumas modalidades, o processo da pre- sente divulgação compreende a etapa adicional de congelar a composi- ção farmacêutica ou o produto celular que compreende a população ex- pandida e enriquecida de SCKTCs da presente divulgação. De acordo com uma modalidade, o congelamento ocorre por um processo de con- gelamento de taxa controlada, por exemplo, reduzindo a temperatura em 1 ºC por minuto para garantir que os cristais formados sejam peque- nos e não rompam a estrutura celular. Esse processo pode ser continu- ado até que a amostra ter atingido cerca de -100ºC.

[299] As formulações de liberação controlada ou sustentada da composição farmacêutica da divulgação podem ser produzidas adap- tando-se tecnologia de outra forma convencional. O termo "liberação controlada", conforme usado no presente documento, refere-se a qual- quer formulação contendo fármaco em que a maneira e o perfil da libe- ração de fármaco da formulação são controlados. Isso inclui formula- ções de liberação imediata bem como não imediata, com as formula- ções de liberação não imediata incluindo, porém sem limitação, formu- lações de liberação sustentada e liberação retardada. O termo "libera- ção sustentada" (também denominada "liberação prolongada") é usado no presente documento no seu sentido convencional para se referir a uma formulação de fármaco que fornece liberação gradual de um fár- maco durante um período prolongado de tempo e que, de preferência, embora não necessariamente, resulta em níveis substancialmente constantes de um fármaco durante um período de tempo prolongado. O termo "liberação retardada" é usado no presente documento no seu sen- tido convencional para se referir a uma formulação de fármaco na qual existe um atraso de tempo entre a administração da formulação e a li- beração do fármaco a partir da mesma. "Liberação retardada" pode en- volver ou não a liberação gradual de fármacos durante um período pro- longado de tempo e, portanto, pode ser "liberação sustentada" ou não. O termo liberação de "longo prazo", conforme usado no presente docu- mento, significa que a formulação de fármaco é construída e disposta para entregar níveis terapêuticos do ingrediente ativo ao longo de um período de tempo prolongado, por exemplo, dias.

[300] As composições farmacêuticas podem ser preparadas, em- baladas ou vendidas na forma de uma suspensão ou solução aquosa ou oleosa injetável estéril. Essa suspensão ou solução pode ser formu- lada de acordo com a técnica conhecida e pode compreender, além do ingrediente ativo, ingredientes adicionais, tais como os agentes de dis- persão, agentes umectantes ou agentes de suspensão descritos no pre- sente documento. Tais formulações injetáveis estéreis podem ser pre- paradas com o uso de um diluente ou solvente não tóxico parenteral- mente aceitável, tal como água ou 1,3-butano diol, por exemplo. Outros diluentes e solventes aceitáveis incluem, porém sem limitação, solução de Ringer, solução isotônica de cloreto de sódio e óleos fixos, tais como mono ou diglicerídeos sintéticos. Outras formulações administráveis pa- renteralmente que são úteis incluem aquelas que compreendem o in- grediente ativo em forma microcristalina, em uma preparação lipossô- mica ou como um componente de um sistema polimérico biodegradável. As composições para liberação sustentada ou implantação podem com- preender materiais poliméricos ou hidrofóbicos farmaceuticamente acei- táveis, tais como uma emulsão, uma resina de troca iônica, um polímero moderadamente solúvel ou um sal moderadamente solúvel. Para apli- cação parenteral, os veículos adequados consistem em soluções, por exemplo, soluções oleosas ou aquosas, bem como suspensões, emul- sões ou implantes. As suspensões aquosas podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão e incluem, por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, sorbitol e/ou dextrano.

[301] De acordo com algumas modalidades, a presente divulgação fornece um método para transportar um produto celular que compre- ende a população expandida e enriquecida de SCKTCs de acordo com a presente divulgação do local de fabricação, ou um ponto de coleta conveniente, para uma instalação terapêutica. De acordo com algumas modalidades, a temperatura do produto celular é mantida durante tal transporte. De acordo com algumas modalidades, por exemplo, a com- posição farmacêutica pode ser armazenada abaixo de 0 ºC, tal como -

135ºC durante o trânsito. De acordo com algumas modalidades, as os- cilações de temperatura da composição farmacêutica são monitoradas durante o armazenamento e/ou transporte.

[302] As publicações discutidas no presente documento são forne- cidas unicamente pela sua divulgação antes da data de depósito do pre- sente pedido, e cada uma está incorporada a título de referência em sua totalidade. Nada no presente documento deve ser interpretado como uma admissão de que a invenção descrita não tem o direto à titularidade de antedatar tal publicação em virtude de invenção anterior. Ademais, as datas de publicação fornecidas podem ser diferentes das datas de publicação reais que podem precisar ser independentemente confirma- das.

[303] Muitas modificações e outras modalidades das invenções estabelecidas no presente documento virão facilmente à mente de um versado na técnica a qual essas invenções se referem, tendo o benefício dos ensinamentos apresentados nas descrições anteriores e nos dese- nhos associados. Portanto, deve-se entender que as invenções não de- vem ser limitadas às modalidades específicas divulgadas e que modifi- cações e outras modalidades são concebidas como estando incluídas dentro do escopo das reivindicações anexas. Embora termos específi- cos sejam empregados no presente documento, os mesmos são usados em um sentido genérico e descritivo apenas e não para propósitos de limitação.

EXEMPLOS

[304] Os exemplos a seguir são apresentados para fornecer àque- les de habilidade comum na técnica uma divulgação e descrição com- pletas de como produzir e usar a invenção descrita e não se destinam a limitar o escopo daquilo que os inventores consideram como sua inven- ção, nem se destinam a representar que os experimentos abaixo são todos ou os únicos experimentos realizados. Foram feitos esforços para garantir a precisão em relação aos números usados (por exemplo, quan- tidades, temperatura, etc.), mas alguns erros experimentais e desvios devem ser levados em consideração. A menos que indicado de outro modo, partes são partes em peso; peso molecular é o peso molecular ponderal médio; a temperatura está em graus centígrados, e a pressão está próxima ou à pressão atmosférica. EXEMPLO 1. ISOLAMENTO DE CÉLULAS MONONUCLEARES (MCS) DO SANGUE PERIFÉRICO

[305] O procedimento a seguir descreve o isolamento de MC do sangue, mais especificamente sangue periférico, de um sujeito humano:

[306] 1, 30 ml - 50 ml de sangue periférico humano anticoagulado com heparina foram obtidos e colocados em um tubo de centrífuga. O sangue periférico foi diluído com solução salina em uma proporção de 1:1 e misturado até ficar uniforme.

[307] 2. Um novo tubo de centrífuga de 50 ml foi preenchido com 15 ml de solução de separação de linfócitos (Ficoll-Paque); o sangue uniformemente diluído é então lentamente colocado em camadas sobre a solução de separação de linfócitos adicionando-se o mesmo ao longo da parede do tubo em uma razão entre ficoll: volume de sangue diluído de 1:2, formando uma estratificação clara entre os mesmos, e a mistura foi centrifugada a 3000 rpm por 30 min.

[308] 3. Após a conclusão da centrifugação, as células mononu- cleares na interface entre o plasma e a camada de Ficoll-Paque foram coletadas, colocadas em um novo tubo de centrífuga de 50 ml, enxa- guadas com 30 ml de meio X-VIVO-15 e centrifugadas a 800 g por 5 min. O sobrenadante foi então removido.

[309] 4. A mistura foi adicionada a 20 ml de meio X-VIVO-15, mis- turada uniformemente por pipetagem e centrifugada a 200 g à tempera- tura ambiente por 10 min, e em seguida o sobrenadante foi removido.

As células foram ressuspensas em 10 ml de meio X-VIVO-15 e conta- das. EXEMPLO 2. INDUÇÃO DE DIFERENCIAÇÃO DE CÉLULAS MONO- NUCLEARES DE SANGUE PERIFÉRICO (PBMCS) EM CÉLULAS DENDRÍTICAS (DC)

[310] O procedimento a seguir descreve um processo para a indu- ção da diferenciação de PBMCs em células dendríticas.

[311] 1. A concentração de PBMCs foi ajustada a 1×106 células/ml com meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS, e as células foram colo- cadas em placas em um frasco de cultura T25 para cultura estática em 5% de CO2 a 37 ºC por 1 h.

[312] 2. O sobrenadante contendo células não aderidas, foi remo- vido do frasco de cultura. As células que permaneceram foram enxa- guadas com meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS duas vezes, em seguida, transferidas para 5 ml de meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS, suplementadas com citocinas GM-CSF e IL-4, em concentrações de 500 U/ml e 50 ng/ml, respectivamente.

[313] 3. No dia 4, o sistema de cultura foi suplementado com 3 ml de meio contendo GM-CSF e IL-4 com a dita concentração de trabalho (50 ng/ml).

[314] 4. No dia 6, alfa-GalCer foi adicionada ao sistema de cultura até uma concentração de trabalho de 100 ng/ml ter sido satisfeita. Essa etapa foi realizada para carregar as células dendríticas com alfa-GalCer.

[315] 5. No dia 7, as células dendríticas carregadas com alfa-Gal- Cer foram coletadas. EXEMPLO 3. AMPLIFICAÇÃO IN VITRO (OU SEJA, EXPANSÃO) DE CÉLULAS T EXTERMINADORAS DE CITOCINAS (CKTCS) COM

ALTA ATIVIDADE DE EXTERMÍNIO

[316] O procedimento a seguir descreve um processo para a am- plificação in vitro de células T exterminadoras de citocinas (CKTCs) para formar CKTCs superativadas que têm alta atividade de extermínio.

[317] 1. A concentração de PBMCs foi ajustada a 3×106 células/ml com meio X-VIVO-15. Alfa-GalCer foi adicionada ao sistema de cultura até uma concentração de trabalho de 100 ng/ml ter sido satisfeita, e as células foram colocadas em uma placa de 6 poços.

[318] 2. No dia 3, o meio de cultura no sistema de cultura foi alte- rado, e alfa-GalCer foi adicionada até a concentração de trabalho de 100 ng/ml ter sido satisfeita.

[319] 3. No dia 7, as células dendríticas carregadas com alfa-Gal- Cer (cerca de 1×105 células) obtidas no Exemplo 2 foram adicionadas a um sistema de cultura que compreende uma população de CKTCs, e os seguintes fatores de estimulação foram adicionados em concentrações de trabalho da seguinte forma: 100 ng/ml de alfa-GalCer, 100 U/ml de IL-2 e 20 ng/ml de IL-7. Um tubo de PBMC foi recuperado para induzir sua diferenciação em células dendríticas para estimulação secundária de CKTCs da mesma maneira descrita no Exemplo 2.

[320] 4. No dia 10, o meio no sistema de cultura foi reabastecido, e alfa-GalCer, IL-2 e IL-7 foram adicionadas até que as respectivas con- centrações de trabalho fossem satisfeitas (100 ng/ml de alfa-GalCer, 100 U/ml de IL-2 e 20 ng/ml de IL-7).

[321] 5. No dia 14, as células dendríticas carregadas com alfa-Gal- Cer foram novamente adicionadas ao sistema de cultura de células CKTC, os fatores estimuladores alfa-GalCer, IL-2 e IL-7 foram suple- mentados às respectivas concentrações de trabalho, e IL-15 foi adicio- nada ao sistema de cultura até 20 ng/ml.

[322] 6. No dia 17, o meio de cultura no sistema de cultura foi rea- bastecido e alfa-GalCer, IL-2, IL-7 e IL-15 foram adicionadas até que as respectivas concentrações de trabalho fossem satisfeitas (100 ng/ml de alfa-GalCer, 100 U/ml de IL-2 e 20 ng/ml de IL-7).

[323] 7. No dia 20, o meio de cultura no sistema de cultura foi rea- bastecido e alfa-GalCer, IL-2, IL-7 e IL-15 foram adicionadas até que as respectivas concentrações de trabalho fossem satisfeitas (100 ng/ml de alfa-GalCer, 100 U/ml de IL-2 e 20 ng/ml de IL-7), e IL-12 foi adicionada até uma concentração de trabalho de 20 ng/ml ter sido satisfeita.

[324] 8. No dia 21, as células foram coletadas. 100 µl do produto de células CTKC superativadas expandidas foram removidos e transfe- ridos para o seguinte anticorpo fluorescente: anti-TCR Vα-PE (Beckman Coulter, clone nº C15), anti-TCR Vβ-FITC (Beckman Coulter, clone nº C21), anti-CD3-PB (BD Pharmingen, clone nº SP34-2), anti-CD56-PE- Cy7 (BD Pharmingen, clone nº NCAM16.2). Após a incubação a 4 ºC por 30 min, a proporção de CKTCs superativadas expandidas alvo que expressam marcadores de células do tipo 1 NKT foi medida por citome- tria de fluxo com o uso de bitmap de Dispersão Direta (FS) versus Dis- persão de Luz de 90º da população de linfócitos intactos. A comutação (retangular) nesse bitmap, CD56 versus CD3, foi medida. A comutação nos positivos duplos, Vα24 versus Vβ11 foi medida. Conforme mostrado na Figura 1, o produto de CKTC superativado expandido compreende uma população de células que expressam marcadores NKT CD3+CD56+, com até 56,8% das células expressando marcadores do tipo 1-NKT. Em resumo, cerca de 90% da população de SCKTCs compreende cé- lulas T CD3+, e cerca de 50% da população de SCKTCs compreende células do tipo 1 NKT (dados não mostrados). EXEMPLO 4. EFEITOS DO TEMPO DE ADIÇÃO DAS CITOCINAS IL- 2 E IL-7 NA AMPLIFICAÇÃO/EXPANSÃO DE CKTCS

[325] Sob as mesmas condições de cultura (37 ºC, concentração de CO2 de 5%), o efeito de IL-2, IL-7 ou tanto IL-2 quanto IL-7 em CKTCs cultivadas por diferentes processos A, B, C e D foi testado, em que alfa- GalCer foi adicionada no início da cultura e mantida até a conclusão da cultura. Para o Grupo A, a IL-2 foi adicionada simultaneamente no início da cultura; para o Grupo B, IL-2 e IL-7 foram adicionadas simultanea- mente no início da cultura; para o Grupo C, IL-2 e IL-7 foram adicionados no dia 3; e para o Grupo D, IL-2 e IL-7 foram adicionados no dia 7.

[326] No dia 21, 100 µl das CKTCs expandidas pelos processos A, B, C e D foram removidos e incubados com os seguintes anticorpos flu- orescentes, respectivamente: TCR Vα-PE e TCR Vβ-FITC. Após incu- bação a 4ºC por 30 min, a proporção de células-alvo foi medida por ci- tometria de fluxo com o uso de bitmap de Dispersão Direta (FS) versus Dispersão de Luz de 90º da população de linfócitos intactos. A comuta- ção (retangular) nesse bitmap, CD56 versus CD3, foi medida. A comu- tação nos positivos duplos, Vα24 versus Vβ11 foi medida. Conforme mostrado na Figura 2, a proporção de células CKTC que expressam marcadores de células do tipo I NKT nas CKTCs dos Grupos A a D au- mentou gradualmente. Os resultados mostraram que a adição de citoci- nas IL-2 e IL-7 no dia 7 pode levar à expansão preferencial das células CKTC que expressam marcadores de células do tipo I NKT e melhorou significativamente a pureza dessa população de células na população expandida de células CKTC. EXEMPLO 5. EFEITOS DO TEMPO DE ADIÇÃO DE CITOCINA IL-15

NA PROPORÇÃO DE CKTCS EXPANDIDAS

[327] Sob as mesmas condições de cultura (37 ºC, concentração de CO2 de 5%), o efeito de IL-15 em CKTCs cultivadas por diferentes processos A, B, C e D foi testado, em que alfa-GalCer foi adicionada no início da cultura, e IL-2 e IL-7 adicionadas no dia 7, até a conclusão da cultura. Para o Grupo A, nenhuma IL-15 foi adicionada; para o Grupo B, IL-15 foi adicionada simultaneamente no início da cultura; para o Grupo C, IL-15 foi adicionada no dia 7; e para o Grupo D, IL-15 foi adicionada no dia 14.

[328] No dia 21, 100 µl da população de CKTC expandida pelos processos A, B, C e D foram removidos e incubados com o seguinte anticorpo fluorescente, respectivamente: Vα-PE anti-TCR, Vβ-FITC anti-TCR, anti-CD3-PB e anti-CD56-PE-Cy7. Após incubação a 4 ºC por 30 min, a proporção de células CKTC que expressam marcadores de células do tipo I NKT em cada grupo foi medida por citometria de fluxo com o uso de bitmap de Dispersão Direta (FS) versus Dispersão de Luz de 90º da população de linfócitos intactos. A comutação (retangular) nesse bitmap, CD56 versus CD3, foi medida. A comutação nos positivos duplos, Vα24 versus Vβ11 foi medida. Conforme mostrado na Figura 3, a proporção de células que expressam marcadores de células do tipo I NKT na população de CKTC do Grupo D é superior à proporção de cé- lulas que expressam marcadores de células do NKT tipo 1 nos outros três grupos. EXEMPLO 6. EFEITO DO TEMPO DE ADIÇÃO DE CITOCINA IL-15 NA CAPACIDADE DE POPULAÇÕES AMPLIFICADAS/EXPANDI-

DAS DE CÉLULAS CTKC PARA SECRETAR CITOCINAS

[329] A razão de IFN-γ para IL-4 no sobrenadante da população de células CTKC expandida foi usada como um indicador para avaliar a função efetora da população de células CTKC expandida.

[330] Com o uso de CBA (Arranjo de Microesferas Citométricas), a razão de IFN-γ:IL-4 em cada um dos quatro grupos de sobrenadante de cultura no Exemplo 5 foi medida, pela qual, foi avaliada a capacidade das CKTCs expandidas que expressam marcadores NKT para secretar citocinas efetoras. Os resultados são mostrados na Tabela 2.

[331] Tabela 2. Efeito do tempo de adição de citocinas IL-15 na capacidade de populações de CKTC amplificadas que expressam mar- cadores NKT para secretar citocinas Grupo A Grupo B Grupo C Grupo D IFN-γ (pg/ml) >5000 >5000 >5000 >5000 IL-4 (pg/ml) 4,47 3,21 3,07 1,84 IFN-γ: IL-4 >1118 >1558 >1629 >2717

[332] Os resultados mostram que a adição de IL-15 no dia 14 em cultura (Grupo D) aumentou significativamente a razão de IFN-γ:IL-4 no sobrenadante da população expandida de CTKCs de modo que a capa- cidade da população expandida de CTKCs para secretar citocinas efe- toras seja melhorada, em comparação com os controles. EXEMPLO 7. EFEITO DO TEMPO DE ADIÇÃO DE CITOCINA IL-15

NA CAPACIDADE DE EXTERMÍNIO DA POPULAÇÃO EXPANDIDA DE CTKCS

[333] A lactato desidrogenase (LDH) é uma enzima citoplasmática estável, que pode ser liberada no meio extracelular após a lise de uma célula e catalisar um sal de tetrazólio (INT) em seu substrato para pro- duzir produtos vermelhos, cuja quantidade é proporcional à esta dos li- satos celulares. Nesse exemplo, medindo-se a quantidade de INT no sistema de extermínio, a atividade da população expandida de CTKCs para exterminar células-alvo foi avaliada. Um kit LDH (#CK12, DO- JINDO) foi usado para a medição, de acordo com as instruções forneci- das pelo produtor ou fornecedor.

[334] As células-alvo K562 foram obtidas e centrifugadas, e a den- sidade das células-alvo foi ajustada a 1×105 células/ml. A população ex- pandida e ativada de células efetoras CTKC cultivadas nos processos A e D acima foi coletada por centrifugação, e as razões de Efetoras:Alvo ajustadas a 5:1, 10:1 e 20:1. Para cada grupo, poços duplicados foram fornecidos. Após incubação em 5% de CO2 a 37 ºC por 4 h e dissolução suficiente de precipitados, a absorbância foi detectada por um leitor de ensaio imunossorvente ligado à enzima, e a taxa de extermínio foi cal- culada. A taxa de extermínio é determinada com o uso da seguinte fór- mula: Taxa de Extermínio (%) = (OD490 poço experimental - OD490 poço negativo) / (OD490 poço positivo - OD490 poço negativo) ×100%. Os resultados são mostrados na Tabela 3.

[335] Tabela 3. Efeito das citocinas IL-15 na capacidade de exter- mínio de CKTCs expandidas ativadas Razão de Efetoras:Alvo 5:1 10:1 20:1 Grupo A 12,41 24,1 37,09 Grupo D 32,341 46,7 58,75

[336] Os resultados mostraram que a adição de IL-15 no dia 14 de cultura (Grupo D) melhorou significativamente a capacidade de extermí- nio da população expandida e ativada de CKTCs. EXEMPLO 8. EFEITO DO TEMPO DE ADIÇÃO DE CITOCINA IL-12

NA PROPORÇÃO DE CKTCS QUE EXPRESSAM MARCADORES DE CÉLULAS DO TIPO I NKT NA POPULAÇÃO EXPANDIDA DE CKTCS

[337] Sob as mesmas condições de cultura (37ºC, concentração de CO2 de 5%), a função efetora de CKTCs cultivadas pelos diferentes processos dos Grupos A, B, C e D foi testada, em que alfa-GalCer foi adicionada no início da cultura, IL-2 e IL-7 foram adicionadas no dia 7, e IL-15 foi adicionada no dia 14, até a conclusão da cultura. Para o Grupo A, nenhuma IL-12 foi adicionada; para o Grupo B, IL-12 foi adici- onada simultaneamente no início da cultura; para o Grupo C, IL-12 foi adicionada no dia 7; e para o Grupo D, IL-12 foi adicionada no dia 20.

[338] No dia 21, 100 µl da população de CKTCs expandidas pelos processos A, B, C e D foram removidos e adicionados ao seguinte anti- corpo fluorescente, respectivamente: TCR Vα-PE e TCR Vβ-FITC. Após incubação a 4ºC por 30 min, a proporção de células-alvo nos produtos celulares foi medida por citometria de fluxo com o uso de bitmap de Dis- persão Direta (FS) versus Dispersão de Luz de 90º da população de linfócitos intactos. A comutação (retangular) nesse bitmap, CD56 versus CD3, foi medida. A comutação nos positivos duplos, Vα24 versus Vβ11 foi medido. Conforme mostrado na Figura 4, a proporção de células CTKC que expressam marcadores NKT tipo I do Grupo D foi superior aos outros três grupos, na medida em que a adição anterior de IL-12 pode ter feito com que a proporção fosse reduzida. Se a adição de IL- 12 for exigida, a mesma pode ser adicionada em um estágio posterior. EXEMPLO 9. EFEITO DO TEMPO DE ADIÇÃO DE CITOCINA IL-12

NA CAPACIDADE DE EXTERMÍNIO DA POPULAÇÃO EXPANDIDA DE CKTCS

[339] As células-alvo K562 foram tomadas e usadas para medir a capacidade de extermínio das células CKTC expandidas no Grupo A e Grupo D no Exemplo 8. Os resultados são mostrados na Tabela 4.

[340] Tabela 4. Efeito das citocinas IL-12 na capacidade de exter- mínio da população expandida de CTKCs Razão de Efetoras:Alvo 5:1 10:1 20:1 Grupo A 10,36 19,78 33,92 Grupo D 42,19 60,57 63,71

[341] Os resultados mostram que a adição de IL-12 no dia 20 (Grupo D) melhorou significativamente a capacidade de extermínio da população expandida de CTKCs. EXEMPLO 10. CITOTOXICIDADE IN VITRO EM CÉLULAS DE CÂN- CER DE PULMÃO DE CÉLULAS NÃO PEQUENAS HUMANAS A549

[342] A citotoxicidade de CKTCs ativadas e expandidas ex vivo produzidas de acordo com os métodos descritos no presente docu- mento é caracterizada contra alvos de câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC). Em suma, as CKTCs são expandidas e ativadas conforme apresentado nos métodos acima. As células tumorais de NSCLC A549 (número ATCC CCL-185) são cultivadas de acordo com as condições de crescimento padrão. As células A549 são coletadas e ressuspensas em PBS a 1 x 106 células/ml. Um corante fluorescente de células vivas CMFDA (Life Technologies Corp.) foi adicionado a uma concentração final de 1 μM e incubado a 4ºC por 10 minutos. As células tumorais são lavadas e inoculadas em placas de 96 poços a cerca de 1 x 104 células/poço. Células CKTC são adicionadas a uma razão entre efetoras e alvo de 5:1, 10:1 ou 20:1 nos poços que são inoculados com as células-alvo antecipadamente. Cada experimento é executado em triplicata. Após as células efetoras e as células-alvo serem cocultivadas por 24 horas, as células restantes em cada grupo são coletadas e mar- cadas com 7-aminoactinomicina D (7-AAD). Após incubação a 4ºC por 10 minutos, a razão entre células positivas para 7-AAD e células totais nas células-alvo marcadas foi detectada por citometria de fluxo para de- terminar o extermínio de células efetoras para células-alvo.

[343] Embora a presente invenção tenha sido descrita em referên- cia a modalidades específicas da mesma, deve ser entendido por aque- les versados na técnica que várias alterações podem ser feitas e equi- valentes podem ser substituídos sem se afastar do espírito e escopo verdadeiros da invenção. Adicionalmente, muitas modificações podem ser feitas para adaptar uma situação particular, material, composição de substância, processo, etapa ou etapas de processo, ao objetivo, espírito e escopo da presente invenção. Todas tais modificações destinam-se a serem abrangidas pelo escopo das reivindicações anexas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para preparar uma composição farmacêutica que compreende um produto celular que contém uma população expandida e enriquecida de células T exterminadoras de citocina superativadas (SCKTCs) que compreende, na ordem: (a) isolar uma população de células mononucleares (MCs) que compreende uma população de células T exterminadoras de citocina (CKTCs); (b) transportar, opcionalmente, a preparação de (a) para uma instalação de processamento sob condições estéreis; (c) cultivar a população de MCs em um sistema de cultura; (d) colocar o sistema de cultura da etapa (c) em contato com alfa-galactosilceramida (αGalCer), ou análogo ou equivalente funcional da mesma, e com uma população de células que compreende CD1d e αGalCer, ou análogo ou equivalente funcional dos mesmos, sendo que o contato é suficiente para estimular a expansão da população de CKTCs; (e) colocar o sistema de cultura da etapa (d) em contato com IL-2, IL-7, IL-15 e IL-12, em uma ordem e um tempo predeterminados de adição, juntamente com uma população nova de células que com- preende CD1d e αGalCer, ou análogo ou equivalente funcional dos mes- mos, sendo que o contato é suficiente para estimular a ativação de uma parte da população de CTKCs expandidas, formando a população ex- pandida e enriquecida de SCKTCs; e (f) coletar a população expandida e enriquecida de SCKTCs do sistema de cultura para formar um produto celular de SCKTC; em que o produto celular que compreende a população ex- pandida e enriquecida de SCKTCs da etapa (f) é caracterizado pelo fato de que tem uma ou mais dentre uma capacidade melhorada de secretar citocinas efetoras ou uma citotoxicidade melhorada em comparação com a população de CKTCs da etapa (a); e (g) formular o produto celular que compreende a população expandida e enriquecida de SCKTCs da etapa (f) com um carreador far- maceuticamente aceitável, para formar uma composição farmacêutica que compreende o produto celular que compreende a população ex- pandida e enriquecida de SCKTCs.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma fonte de células mononucleares (MCs) na etapa (a) é o sangue.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende transportar, entre as etapas (e) e (f), a cultura da instalação de processamento para uma instalação de trata- mento.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a etapa de transporte é iniciada dentro de cerca de 1 hora a cerca de 24 horas após a adição de IL12.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) compreende, opcionalmente, a ressus- pensão das MCs e o ajuste das MCs a uma faixa de concentração de cerca de 5×105 células/ml a cerca de 3×106 células/ml antes de realizar a etapa (d).

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (e) compreende a adição de uma nova popu- lação de células que compreendem CD1d e αGalCer t, ou análogo ou equivalente funcional dos mesmos, ao sistema de cultura.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que αGalCer, ou análogo ou equivalente funcional do mesmo, é mantido em uma concentração constante da etapa (d) à etapa (f).

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a concentração de αGalCer, ou análogo ou equivalente funcional do mesmo, está entre cerca de 50 ng/ml e cerca de 500 ng/ml.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a IL-2 é mantida em uma concentração constante da etapa (e) à etapa (f).

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a concentração de IL-2 está na faixa de cerca de 10 U/ml a cerca de 100 U/ml.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a IL-7 é mantida em uma concentração constante da etapa (e) à etapa (f).

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a concentração de IL-7 está na faixa de cerca de 20 ng/ml a 200 ng/ml.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que IL-2 e IL-7 são adicionadas por volta do dia 7 de cultivo.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a IL-15 é adicionada por volta do dia 14 de cultivo.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a IL-12 é adicionada por volta do dia 20 de cultivo.

16. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (f) é realizada pelo menos cerca do dia 21 de cultivo.

17. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a IL-15 é mantida em uma concentração constante da etapa (e) à etapa (f).

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a concentração de IL-15 está na faixa de cerca de 10 U/ml a cerca de 100 U/ml.

19. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a IL-12 é mantida em uma concentração constante da etapa (e) à etapa (f).

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a concentração de IL-12 está na faixa de cerca de 10 ng/ml a cerca de 100 ng/ml.

21. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa de caracterizar a ex- pressão de marcadores de superfície celular pela população expandida e enriquecida de SCKTCs por citometria de fluxo.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que uma subpopulação da população expandida e enrique- cida de SCKTCs compreende uma ou mais dentre células CD3+Vα24+ células Vβ11, células CD3+ Vα24- ou células CD3+CD56+.

23. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a subpopulação de SCKTCs compreende ainda células Vβ11 +.

24. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a população expandida e enriquecida de SCKTCs com- preende de cerca de 40% a cerca de 60% da população total de CKTCs.

25. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que IL-2 e IL-7 são adicionadas à cultura simultaneamente.

26. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que IL-2, IL-7 e IL-15 são adicionadas à cultura simultane- amente.

27. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a população de MCs na etapa (c) compreende de cerca de 5 × 105 células/ml a cerca de 3 × 106 células/ml.

28. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula que compreende CD1 e alfa-galactosilceramida (αGalCer) é uma célula apresentadora de antígeno.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a célula de apresentação de antígeno é uma célula dendrítica (DC).

30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a célula dendrítica é carregada com αGalCer.

31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a célula dendrítica carregada com αGalCer é derivada das MCs e é uma célula aderente.

32. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a célula dendrítica carregada com αGalCer é preparada por um método que compreende: (a) isolar uma população de células mononucleares (MCs); (b) cultivar a população de MCs em um sistema de cultura; (c) colocar o sistema de cultura em contato com IL-4 e GM- CSF, em que o contato é suficiente para induzir a diferenciação das MCs em células dendríticas; (d) colocar o sistema de cultura em contato com αGalCer, em que o contato é suficiente para carregar as células dendríticas com αGalCer.

33. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a concentração de IL-4 é 500 U/ml.

34. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a concentração de GM-CSF é de 50 ng/ml.

35. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a etapa (d) é realizada de cerca de 5 dias a cerca de 7 dias após a etapa (b).

36. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a população de MCs na etapa (b) compreende de cerca de 1 × 105 células/ml a cerca de 5 × 106 células/ml.

37. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que as etapas (b) - (d) são realizadas em um meio de cultura selecionado a partir do meio RPMI 1640 que contém 10% de soro fetal bovino ou 10% de soro autólogo.

38. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa de reabastecimento do meio de cultura no sistema de cultura a cada 2 a 3 dias.

39. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as MCs são derivadas de um ser humano.

40. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as MCs são isoladas do sangue total por centrifugação em gradiente de Ficoll-Paque.

41. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as etapas (c) - (f) são realizadas em um meio de cultura selecionado a partir do meio isento de soro X-VIVO-15 e do meio RPMI 1640 que contém 10% de soro fetal bovino ou 10% de soro autólogo.

42. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um carreador farmaceuticamente aceitável e uma pop- ulação melhorada e enriquecida de células T exterminadoras de citocina superativadas (SCKTCs) produzidas pelo método, como definido na reivindicação 1.

43. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 42, caracterizada pelo fato de que a população melhorada e en- riquecida de SCKTCs compreende uma subpopulação de um ou mais células CD3+Vα24+ Vβ11, CD3+Vα24-, células CD3+CD56+.

44. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 43, caracterizada pelo fato de que a subpopulação compreende ainda células Vβ11+.

45. Composição farmacêutica que compreende um carreador farmaceuticamente aceitável e um produto celular que com- preendem células T exterminadores de citocina superativadas

(SCKTCs) expandidas, ativadas e enriquecidas derivadas de uma pop- ulação de células T exterminadoras de citocina (CKTCs), sendo que as SCKTCs são caracterizadas pelo fato de que têm duas ou mais dentre uma secreção induzida de uma citocina, uma proliferação estimulada das SCKTCs, uma melhor citotoxicidade das SCKTCs e expressão modulada de um ou mais marcadores na superfície das SCKTCs, em comparação a uma população de controle de células T exterminadoras de citocina não estimulada e não ativada.

46. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 45, caracterizada pelo fato de que a citocina, cuja expressão é modulada, é uma ou mais selecionadas do grupo que consiste em IL-4, IL-5, IL-6 ou IL-10 e IFNγ.

47. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 46, caracterizada pelo fato de que compreende baixa expressão de uma ou mais citocinas selecionadas do grupo que consiste em IL-4, IL-5, 1L-6 e IL-10, e alta expressão de IFNγ.

48. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 46, sendo que a produção de citocinas pela população enrique- cida de SCKTCs é caracterizada pelo fato de que é como IL-5-, IL-6-, IL-10-, IL-4 baixo, IFNγ alto.

49. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 48, caracterizada pelo fato de que a quantidade de IFN-γ produzida pela população de SCKTCs é de cerca de 5000 pg/ml ou ma- ior.

50. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 48, caracterizada pelo fato de que a quantidade de IL-4 produzida pela população de SCKTCs é inferior a 5 pg/ml.

51. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 48, caracterizada pelo fato de que uma razão de IFNγ: IL-4 em sobrenadantes de cultura é igual ou superior a 1000.

52. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 45, caracterizada pelo fato de que uma taxa de extermínio de uma célula-alvo pela população enriquecida de SCKTCs varia de cerca de 25% a cerca de 75%, inclusive.

53. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 45, caracterizada pelo fato de que a taxa de extermínio da popu- lação de SCKTCs é pelo menos 1,5 vezes maior do que a taxa de ex- termínio de células de controle de células T exterminadoras de citocina não expandidas e não ativadas.

54. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 45, caracterizada pelo fato de que uma razão de IFN-γ: IL-4 é de pelo menos 1000, e a taxa de extermínio é aumentada pelo menos 1,5 vezes mais do que a taxa de extermínio de células de controle de células T exterminadoras de citocina não expandidas e não ativadas.

55. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 45, caracterizada pelo fato de que a população expandida e en- riquecida de SCKTCs compreende uma subpopulação de SCKTCs que expressam marcadores de células NKT.

56. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 55, caracterizada pelo fato de que a população expandida e en- riquecida de células SCKTCs compreende uma subpopulação que com- preende uma ou mais dentre células CD3+Vα24+, células CD3+Vα24- ou células CD3+CD56+.

57. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 55, caracterizada pelo fato de que a população expandida e en- riquecida de SCKTCs compreende uma subpopulação de SCKTCs que são CD3+ CD56+.

58. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 55, caracterizada pelo fato de que a população expandida e en- riquecida de SCKTCs compreende uma subpopulação de SCKTCs que expressam marcadores de células do tipo 1-NKT.

59. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 58, caracterizada pelo fato de que os marcadores de células do tipo 1-NKT compreendem marcadores TCR Vα e TCR Vβ.

60. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 58, sendo que a subpopulação de SCKTCs que expressam mar- cadores de células do tipo 1-NKT compreende uma população de célu- las caracterizada pelo fato de que tem a expressão de um ou mais mar- cadores CD3+Vα24+, CD3+Vα24- ou CD3+CD56+.

61. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 45, caracterizada pelo fato de que a população expandida e en- riquecida de SCKTCs derivadas de uma população de células T extermi- nadoras de citocina (CKTCs) constitui de cerca de 40% a cerca de 60% da população total de CKTC.

62. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 45, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica compreende uma quantidade estabilizadora de soro que é eficaz para a retenção da atividade efetora de células T pela população expandida e enriquecida de SCKTCs.

63. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 62, caracterizada pelo fato de que a quantidade estabilizante de soro é de pelo menos 10%.

64. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindi- cação 62, caracterizada pelo fato de que o soro é soro humano.