CN104950112A - FasL蛋白作为生物标记在定性检测大肠癌干细胞对阿司匹林敏感性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了FasL蛋白作为生物标记在定性检测大肠癌干细胞对阿司匹林敏感性中的应用。本发明还公开了编码所述FasL蛋白的mRNA作为生物标记在定性检测大肠癌干细胞对阿司匹林敏感性中的应用。本发明又公开了乙酰化H3K9蛋白作为生物标记在定性检测大肠癌干细胞对阿司匹林敏感性中的应用。本发明发现Aspirin选择性清除大肠癌的肿瘤干细胞，并且Aspirin明显上调大肠癌肿瘤干细胞中FasL蛋白的表达水平，因此FasL是Aspirin应答蛋白，通过检测FasL基因或FasL蛋白在肿瘤干细胞中的表达水平，可以准确、快速地评估肿瘤干细胞对Aspirin的敏感性，从而直接在基因转录与蛋白质表达或修饰水平上评价Aspirin的有效性。

Description

FasL蛋白作为生物标记在定性检测大肠癌干细胞对阿司匹林敏感性中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及人FasL蛋白作为生物标记在定性检测大肠癌干细胞对阿司匹林敏感性中的应用。

背景技术

Aspirin(阿司匹林)，化学名乙酰水杨酸，是20世纪初德国化学家Felix Hoffman合成的一个结构简单的小分子化合物。阿司匹林是世界上使用最多，使用时间最长(至今已有100多年的使用历史)，且不会产生药物依赖性的非甾体抗炎药。流行病学和临床试验表明，Aspirin除了用于解热、抗血小板凝聚等，还可防治包括结大肠癌(CRC)、食道癌、肺癌在内的多种肿瘤。其中，对大肠癌的肿瘤抑制作用尤为突出，是Lancet、New England Journal of Medcine、JAMA等权威杂志持续关注的热点。

大肠癌是一种常见的恶性肿瘤，据美国癌症协会2014年报告(CA)，美国大肠癌新发病例数及死亡病例数均居全部恶性肿瘤的第3位；在我国大肠癌发病率与死亡率亦呈明显上升趋势，且呈现出年轻化趋势。尽管我国大肠癌基础研究与早期干预有较大进步，但发病率与死亡率仍呈明显上升趋势。大约50～60％大肠癌患者出现肝转移，其5年存活率可超过40％。

研究证明大肠癌等恶性肿瘤中存在肿瘤干细胞(Cancer Stem Cell；CSC)，CSC是一群具有很强的自我更新能力和多向分化潜能的细胞，虽在肿瘤细胞中所占比例很小，但在放化疗后出现明显富集并产生治疗抗性，是大肠癌治疗和控制复发转移的难点所在。Aspirin虽然对大肠癌具有较强的肿瘤抑制作用，但是Aspirin对不同的恶性肿瘤或同种肿瘤的不同类型的个体治疗效果存在差异性。目前Aspirin用于大肠癌临床辅助治疗面临的主要难题是缺乏指导个体化用药的参考指标，对病人的用药缺乏针对性，其疗效也很难预测。此外，随着Aspirin临床应用的不断增加，其耐药性及其副作用的出现是限制其临床应用的重要原因，如何在清除肿瘤干细胞的同时尽量减少其副作用也是Aspirin临床应用中要解决的问题。

发明内容

本发明通过检测大肠癌的普通肿瘤细胞(以下简称AC细胞)和大肠癌干细胞(以下简称TC细胞)对Aspirin的敏感性发现Aspirin选择性清除TC细胞，在此基础上进一步检测TC细胞中凋亡相关基因的变化，发现Aspirin选择性上调TC细胞中FasL基因的表达水平，说明FasL蛋白是Aspirin的应答蛋白。

本发明还发现TC细胞对Aspirin的敏感性与TC细胞中FasL蛋白的表达水平呈正相关，即阻断FasL蛋白与Fas结合后，Aspirin对TC细胞的生长抑制作用消失，TC细胞凋亡减少；对TC中FasL蛋白进行封闭实验，进一步验证了阿司匹林诱导的FasL蛋白表达水平的上调为直肠癌干细胞对阿司匹林的敏感性所必须。

基于以上发现，本发明提供了FasL蛋白作为生物标记在定性检测大肠癌干细胞对阿司匹林敏感性中的应用，所述Fasl蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所述定性检测是指检测大肠癌干细胞是否对阿司匹林敏感，一般情况下，如Aspirin处理后，大肠癌干细胞中FasL蛋白的表达量是使用前的两倍，则认定该直肠癌干细胞对Aspirin敏感。

本发明还提供了能够与权利要求1所述FasL蛋白特异性结合的抗体在制备定性检测大肠癌干细胞对阿司匹林敏感性的试剂中的应用。

所述的抗体可以是完整的抗体分子、嵌合抗体、单链抗体、双特异性抗体、抗体重链、抗体轻链、重链和轻链的同二聚体和异二聚体，以及抗原结合片段和衍生物。完整的抗体分子可以是多抗或单抗，优选为单抗。

所述定性检测可以采用流式细胞分析，采用该方法使用的抗体需携带荧光标记，荧光标记如PE等。

蛋白表达包括转录和翻译两个过程，蛋白表达水平的提高，转录的mRNA含量也必然提高，基于此，本发明又提供了编码权利要求1所述FasL蛋白的mRNA作为生物标记在定性检测大肠癌干细胞对阿司匹林敏感性中的应用。

本发明还提供了能够与所述mRNA特异性结合的探针或引物在制备定性检测大肠癌干细胞对阿司匹林敏感性中的应用。

所采用的方法一般为定量PCR。

所述引物可以是扩增整个mRNA的引物，也可以是扩增mRNA特征区域的引物，所述探针是识别mRNA特定区域的核苷酸，一般携带标识。

根据实施例的记载，本发明提供了一对具体扩增所述mRNA的引物，如下所示：

上游引物：5’-GCAGCAGCCCTTCAATTACCCAT-3’

下游引物：5’-CACAGAGGTTGGACAGGGAAGAA-3’。

本发明还发现Aspirin主要通过促进FasL基因启动子区的H3蛋白K9乙酰化上调大肠癌干细胞中FasL基因的表达水平，基于此，本发明还提供了乙酰化H3K9蛋白作为生物标记在定性检测大肠癌干细胞对阿司匹林敏感性中的应用。

所述乙酰化H3K9蛋白是指H3蛋白的第9个氨基酸K乙酰化，所述H3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明发现Aspirin选择性清除大肠癌的肿瘤干细胞，并且Aspirin明显上调大肠癌肿瘤干细胞中FasL蛋白的表达水平，因此FasL是Aspirin应答蛋白，通过检测FasL基因或FasL蛋白在肿瘤干细胞中的表达水平，可以准确、快速地评估肿瘤干细胞对Aspirin的敏感性，从而直接在基因转录与蛋白质表达或修饰水平上评价Aspirin的有效性和毒副作用。

附图说明

图1A为用不用浓度的Aspirin处理不同来源的大肠癌干细胞与普通肿瘤细胞后的细胞存活率比较图；其中，Asp表示Aspirin(阿司匹林)，HT29为人大肠癌细胞系，P1为人大肠癌原代细胞系，TC表示大肠癌干细胞，AC表示大肠癌普通肿瘤细胞，cell Viability(％)表示细胞存活率(％)，“*”表示差异显著，下同。

图1B为用不用浓度的Aspirin处理不同来源的大肠癌干细胞后的荧光显微镜观察图；其中，Asp(mM)表示阿司匹林浓度(mM)，DAPI表示对活细胞进行细胞核染色后的荧光显微镜观察结果，TUNEL表示对凋亡细胞进行染色后的荧光显微镜观察结果，MDC表示对自噬泡进行染色后的荧光显微镜观察结果，下同。

图1C为用不用浓度的Aspirin处理不同来源的大肠癌干细胞后细胞凋亡率统计图；其中，Apoptotic Cell(％)表示细胞凋亡率(％)，下同。

图1D为利用定量PCR技术筛选Aspirin处理不同来源的大肠癌干细胞后细胞内各凋亡基因表达水平的变化；其中，TC(used as 1)表示将TC中的基因表达水平作为1，TC+Asp表示用Aspirin处理大肠癌干细胞后，Control表示Aspirin处理大肠癌干细胞前，NormalizedExpression表示标准化后表达水平，下同。

图1E为利用定量PCR技术筛选Aspirin处理不同来源的大肠癌普通肿瘤细胞后细胞内各凋亡基因表达水平的变化；其中，AC(used as 1)表示将AC中基因表达水平作为1，AC+Asp表示用Aspirin处理大肠癌普通肿瘤细胞后，Control表示Aspirin处理大肠癌普通肿瘤细胞前。

图1F为利用流式细胞术检测Aspirin处理大肠癌干细胞后FasL表达水平的改变。

图1G为利用流式细胞术检测Aspirin处理大肠癌干细胞后FasL表达水平统计图。

图1H为利用流式细胞术检测Aspirin处理大肠癌普通肿瘤细胞后FasL表达水平的改变。

图1I为利用流式细胞术检测Aspirin处理大肠癌普通肿瘤细胞后FasL表达水平统计图。

图1F、1G、1H和1I中，Cell Count表示细胞计数，Control表示空白对照组，Asp表示Aspirin处理组；FasL(％)表示FasL表达水平。

图2A为FasL中和性抗体逆转Aspirin对HT29大肠癌干细胞的杀伤效应图；Nok-1(μg/mL)为FasL中和性抗体(浓度单位为μg/mL)，Control Ab表示对照抗体。

图2B为FasL中和性抗体逆转Aspirin对P1大肠癌干细胞的杀伤效应图；Nok-1(μg/mL)为FasL中和性抗体(浓度单位为μg/mL)，Control Ab表示对照抗体。

图2C为流式细胞术检测Aspirin单独处理、FasL中和性抗体和Aspirin共同处理大肠癌干细胞后细胞的凋亡率；其中，Control表示空白对照组，Asp表示Aspirin单独处理组，Asp+Nok-1表示FasL中和性抗体和Aspirin共同处理组，PI-A(×10⁴)表示PI染色的荧光强度，下同。

图2D为TUNEL染色法检测Aspirin单独处理、FasL中和性抗体和Aspirin共同处理大肠癌干细胞后细胞的凋亡率。

图2E为TUNEL染色法检测Aspirin单独处理、FasL中和性抗体和Aspirin共同处理大肠癌干细胞后细胞凋亡率统计图。

图3A为免疫印迹法检测不同浓度的Aspirin处理大肠癌干细胞后各组蛋白的乙酰化水平；其中，Asp(mM)表示阿司匹林浓度(mM)，HT29为人结肠癌细胞系，P1为人结肠癌原代细胞系，TC表示大肠癌干细胞，AC表示大肠癌普通肿瘤细胞，下同；Ac-H2A、Ac-H2B、Ac-H3、Ac-H4分别表示乙酰化的组蛋白H2AK5，H2BK5，H3K9，H4K8，GAPDH为内参基因，下同；

图3B体现了染色质免疫沉淀发现Aspirin处理大肠癌干细胞后FasL启动子区的H3K9乙酰化促进FasL表达上调；

图3C体现了不同来源的大肠癌干细胞与普通肿瘤细胞中FasL启动子区H3K9的甲基化程度；

其中，Mono-Meth-H3K9表示单甲基化的H3K9；

图3D体现了甲基化程度对H3K9乙酰化的影响；

其中，Ac-H3K9表示乙酰化的H3K9，Con表示空白对照组，Asp表示阿司匹林处理组，5-aza表示5-氮杂-2′-脱氧胞苷处理组，Asp+5-aza表示阿司匹林、5-氮杂-2′-脱氧胞苷共同处理组，下同；

图3E体现了对H3K9进行去甲基化处理后FasL表达量的变化；

其中，FasL Expression(％)表示FasL表达量。

具体实施方式

(1)细胞系和试剂

本实施例的试验用细胞系包括：

HT29，人大肠癌细胞系，上皮来源，ATCC编号HTB-38；

P1，人大肠癌原代细胞系，上皮来源。

本实施例所用的主要试剂包括：

(2)无血清培养富集大肠癌干细胞

将大肠癌细胞系HT29以及原代大肠癌细胞P1分别接种在含有10％FBS和1×青-链霉素的完全培养基中，待细胞处于对数生长期，PBS清洗，胰酶消化，将细胞重悬于无血清培养基中，台盼兰染色计数活细胞后以10⁴/mL细胞数接种于无血清培养基中，置于低粘附培养板培养14天。每3-4天在水平离心机上以1000rpm离心5分钟，收集沉淀细胞，重悬于2ml新鲜培养基中。

无血清培养基的配方为：

DMEM/F12(1∶1)，青-链霉素(1∶100)，非必需氨基酸(1∶100)，N2添加物(1∶100)，B27添加物(1∶50)，表皮生长因子(20ng/mL)，碱性生长因子(10ng/mL)，肝素(4μg/mL)。

(3)细胞增殖实验

1)将HT29细胞系和P1细胞系的普通大肠癌细胞(以下简称AC细胞)分别以1×10⁴/mL细胞数接种到3块96孔板中，种板后第1天，去除培养基，更换为含有不同浓度梯度Aspirin的培养基；

HT29细胞系和P1细胞系的大肠癌干细胞(以下简称TC细胞)以相同的数量接种到3块低粘附的96孔板中，同样给与不同浓度梯度Aspirin的培养基；

每板中每个剂量的Aspirin分别设6个复孔，96孔板在二氧化碳培养箱培养过夜；

2)分别在培养24hr、48hr后取出96孔板，每孔中加入20μl的MTS，轻轻摇晃后将培养板至于细胞培养箱；4小时后将培养板至于680型酶标仪检测490nm吸光度值；检测结果见图1A。

由图1A可见，TC细胞和AC细胞对Aspirin敏感性不同，对于HT29以及P1细胞系，Aspirin均选择性杀伤TC细胞。

(4)TUNEL凋亡分析

HT29细胞系以及P1细胞系的TC细胞和AC细胞(浓度均为1×10⁶/mL)经过5mM Aspirin处理48hr后，用ACCUTASE酶消化，1000rpm离心5分钟收集细胞；细胞沉淀以PBS重悬后进行计数；将细胞密度稀释到2×10⁴/mL，细胞甩片；4％的多聚甲醛室温固定30min，PBS漂洗3次；用细胞通透液室温处理8min，PBS漂洗3次；制备TUNEL反应混合液，处理组用50μl TdT+450μl荧光素标记的dUTP液混匀；而阴性对照组仅加50μl荧光素标记的dUTP液；阳性对照组先加入100μl DNase 1，室温反应10min，待玻片干后，加50μl TUNEL反应混合液于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中37℃反应1hr，PBS漂洗3次；在荧光显微镜下计数凋亡细胞，观察结果见图1B和图1C。

由图1B和图1C可见，Aspirin诱导TC细胞发生凋亡。

(5)基因定量PCR检测

1)TRIzol总RNA抽提：

①分别取5mM Aspirin处理48hr前后HT29细胞系和P1细胞系的AC细胞和TC细胞吸去培养基，2ml PBS洗涤2次，加入1ml TRIzol，移液枪反复吹打20下，确保细胞全部裂解，然后吸至1.5ml eppendorf管中；

②室温放置5分钟，使样品充分裂解，加入0.2ml氯仿，猛烈晃动10秒钟，室温放置2分钟；

③12000g 4℃离心15分钟，吸取上层无色水相移至新的eppendorf管，加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀，冰上放置10分钟；

④12000g 4℃离心10分钟，可见管底的RNA沉淀，小心吸去上清；

⑤加入1ml 75％乙醇(DEPC水配制)，颠倒混匀，7500g 4℃离心5分钟，小心吸去上清；

⑥加入20μl DEPC水溶解，Nanodrop分光光度计定量并质检，-80℃保存待用。

2)定量PCR检测

①吸取约2μg步骤1)制备的RNA样本(5μl)混于2μl Oligo dT18、3μl DEPC水中，充分混匀，8000rpm离心3秒钟，置于70℃5分钟，结束后迅速置于冰上；

②吸取1μl 10mM dNTP、5μl 5×M-MLV RT Buffer、0.5μl RNase抑制剂、7.5μl DEPC水、1μl M-MLV逆转录酶混匀，将混合液与①充分混匀；

③42℃水浴60分钟、70℃10分钟后移至4℃待用；

④SYBR Green定量PCR反应体系：

0.4μl上游引物(10μM)、0.4μl下游引物(10μM)、10μl 2×SYBR Green qPCR SuperMix、2μl cDNA模板、6.8μl DEPC水，反应体系配置好后，加入到反应管中，微量离心机离心3秒钟，将所有液体离心至反应管底部，避免产生气泡，然后放置于荧光定量PCR仪器的反应板上，压紧；

⑤PCR反应程序：

每个样本均以GAPDH为内参基因，以2-ACT mean计算法来分析各基因的表达水平，分析结果见图1D和图1E。

如图1D和图1E所示，基因水平的验证结果为：Aspirin通过上调大肠癌干细胞中FasL基因的表达而促使TC细胞凋亡，然而，Aspirin不能上调AC细胞中FasL基因的表达，从而难以促使AC细胞凋亡。

(6)流式检测

分别取HT29细胞系的AC细胞和TC细胞(1×10⁶/mL)，经过5mM Aspirin处理48hr后，ACCUTASE酶消化，1000rpm离心5分钟收集细胞。细胞沉淀以100μl的PBS重悬，加入人FasL-PE单抗5μl混匀，4℃避光孵育10分钟；未经5mM Aspirin处理的AC细胞和TC细胞(1×10⁶/mL)以100μl的PBS重悬细胞，加入鼠IgG1-PE单抗和鼠IgG1-APC单抗5μl混匀，4℃避光孵育10分钟，作为流式检测/分选的同型对照；未经5mM Aspirin处理的AC细胞和TC细胞(1×10⁶/mL)以100μl的PBS重悬，作为流式检测的空白对照。抗体孵育结束后，1ml的PBS洗涤2次，处理好的细胞经过FACSCanto II flow cytometer检测，检测结果见图1F和图1G，图1H和图1I。

由图1F和图1G，图1H和图1I可见，蛋白水平的验证结果为：Aspirin通过上调TC细胞中FasL蛋白的表达而促使TC细胞凋亡；然而，Aspirin不能上调AC细胞中FasL蛋白的表达，从而难以促使AC细胞凋亡。

以上检测和分析结果均表明，TC细胞对Aspirin相对敏感，且Aspirin通过上调FasL蛋白的表达，诱导TC细胞凋亡。

实施例2

(1)细胞增殖实验

1)分别取HT29细胞系和P1细胞系的TC细胞(1×10⁴/mL)以相同的数量接种到3块低粘附的96孔板中，设立五个试验组：①空白组，②Aspirin(5mM)组，③对照抗体(IgG)组，④FasL中和性抗体Nok-1(1μg/mL)和Aspirin(5mM)组，⑤FasL中和性抗体Nok-1(2μg/mL)和Aspirin(5mM)组，每组分别设6个复孔，96孔板在二氧化碳培养箱培养过夜；

2)取出96孔板，每孔加入20μl的MTS，轻轻摇晃后将培养板至于细胞培养箱；4小时后将培养板至于680型酶标仪检测490nm吸光度值；检测结果见图2A和2B。

如图2A和2B所示，在HT29细胞以及P1细胞中，FasL中和性抗体Nok-1均可逆转Aspirin对TC细胞的杀伤。

(2)TUNEL凋亡分析

分别对HT29细胞系的TC细胞(1×10⁶/mL)作如下处理：①空白组，②Aspirin(5mM)组，③FasL中和性抗体Nok-1(2μg/mL)和Aspirin(5mM)组；处理48hr后ACCUTASE酶消化，1000rpm离心5分钟收集细胞；细胞沉淀以PBS重悬，细胞计数；将细胞密度稀释到2×10⁴/mL，细胞甩片；4％的多聚甲醛室温固定30min，PBS漂洗3次；用细胞通透液室温处理8min，PBS漂洗3次；制备TUNEL反应混合液，处理组用50μl TdT+450μl荧光素标记的dUTP液混匀；而阴性对照组仅加50μl荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100μlDNase 1，室温反应10min；玻片干后，加50μl TUNEL反应混合液于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中37℃反应1hr，PBS漂洗3次；在荧光显微镜下计数凋亡细胞，统计结果见图2C。

如图2C所示，Nok-1逆转了Aspirin对HT29TC细胞的诱导凋亡作用。

(3)细胞周期分析

分别对HT29细胞系的TC细胞(1×10⁶/mL)作如下处理：①空白组，②Aspirin(5mM)组，③FasL中和性抗体Nok-1(2μg/mL)和Aspirin(5mM)组；处理48hr后，ACCUTASE酶消化，1000rpm离心5分钟收集细胞；细胞沉淀用预冷的PBS洗两次后，用5ml预冷的80％乙醇/ddH₂O溶液重悬，边缓慢往收集细胞的离心管中滴入75％乙醇/ddH₂O溶液边在振荡器下振荡，4℃固定过夜。

细胞周期分析使用CycleTEST PLUS DNAReagent Kit(BD公司，美国)，包括以下步骤：

1)固定好的细胞以4000rpm离心5分钟，收集细胞沉淀；

2)加入2ml PBS，洗涤细胞沉淀；

3)重复步骤1)；

4)加入50μl PBS重悬细胞；

5)加入250μl溶液A(胰酶溶液)，轻轻用手震动，使其混匀；

6)室温放置10分钟；

7)加入200μl溶液B(胰酶抑制剂和RNA酶溶液)，室温放置10分钟；

8)加入200μl 4℃预冷的溶液C(PI染料溶液)，冰上放置10分钟；

9)50-μm尼龙筛过滤细胞悬液，去除细胞团块；

10)处理好的细胞悬液避光放置于4℃，直至上机检测；

11)染好的细胞用FACScan Calibur流式细胞仪收集荧光信号；

12)FCS Express软件分析流式数据。

结果如图2D和2E所示。由图2D和2E可见，Nok-1逆转了Aspirin对HT29TC细胞的诱导凋亡作用。以上检测和分析结果均表明，FasL的表达水平为大肠癌干细胞对Aspirin的药物敏感所必须。

实施例3

(1)Western Blotting蛋白质免疫印迹实验

HT29细胞系以及P1细胞系的TC细胞和AC细胞(浓度均为1×10⁶/mL)经过不同浓度Aspirin处理48hr后，后ACCUTASE酶消化细胞，进行总蛋白提取：

1)离心收集细胞沉淀，PBS洗涤细胞；

2)细胞裂解液M-PER放置于4℃预冷，使用前加入100×蛋白酶抑制剂混合液，混合均匀；

3)每1×106细胞加入50μl裂解液，移液枪反复吹打后置于冰上充分裂解30分钟；

4)13000rpm离心1分钟，收集上清至新的1.5ml eppendorf管中，置于冰上备用。

SDS-PAGE不连续电泳胶配置如下：

1)配置好分离胶，混匀，灌入制胶板后，缓慢从制胶板边缘加入1ml异丙醇，以除去气泡并压平胶的接触面；

2)待分离胶凝固后配置上层浓缩胶，配置好浓缩胶后，倒去分离胶上异丙醇，并尽量用干净的吸水纸吸去残余的异丙醇；

3)倒入混匀的浓缩胶，并放置10孔梳子，待浓缩胶凝固后连制胶板一起用保鲜膜包好，放置于4℃备用。

蛋白质凝胶电泳及免疫印迹：

1)组装好电泳装置后，加入1×电泳缓冲液。20μl样本完全上样后，以70V电压恒压进行电泳，直到样本完全浓缩并进入分离胶；

2)升高电压至120V，恒压运行约1.5小时，直到标记染料电泳到分离胶的底部，停止电泳；

3)将分离好的分离胶转移到转膜装置中，在1×转膜缓冲液中以260mA电流恒流转膜2小时，将蛋白完全转印到PVDF膜上；

4)含有蛋白的PVDF膜在5％脱脂奶粉的TBST膜封闭液中封闭1小时；

5)取出PVDF膜，放入含有适当稀释比例的一抗溶液(CST公司Ac-H2A、Ac-H2B、Ac-H3、Ac-H4、抗体，景杰生物公司Mono-Meth-H3K9抗体)中，4℃滚动孵育过夜；

6)取出PVDF膜，用TBST洗涤3次，每次在水平摇床上缓慢摇动5分钟；

7)将PVDF膜放入1∶5000稀释的二抗溶液(羊抗兔二抗)，室温滚动孵育1小时；

8)重复步骤6)；

9)混合显色底物ECL，20×A液和20×B液以ddH2O稀释至1×，移液枪吸取混合好的底物，小心滴加到膜上，避光孵育1分钟；

10)弃去膜上多余的显色底物，将膜安置在曝光盒中；

11)在暗室中放入曝光底片，曝光时间分别1分钟、3分钟、5分钟；

12)取出底片，用柯达显影液和定影液洗出底片；

13)挑选曝光度最合适的底片，标记好后，扫描仪扫描、存档。

结果如图3A、3C、3D、3E所示。由图1A可见，Aspirin促进TC细胞中H3K9的乙酰化；由图3C、3D、3E可见，当采用5-aza对AC细胞中H3K9进行去甲基化处理后，Aspirin可以促进AC细胞中H3K9的乙酰化，可以促进FasL表达上调。这是因为AC细胞中H3K9的甲基化程度高于TC细胞，阻碍了H3K9的乙酰化。

(4)染色质免疫沉淀

1)准备90％，70％的乙醇，1.25M甘氨酸，TE buffer(PH＝8)；

2)在试剂盒提供的12连管中用150μl CP1清洗一次；

3)在每管中加入100μl CP2，然后取一管中加入1μl Mouse IgG作为阴性对照，另一管加入1μl Anti-RNA Polymerase II作为阳性对照，其他管加入目的抗体Ac-H3；

4)用保鲜膜盖上12连管室温放置60-90min；

5)收集2×106的经过Aspirin处理后大肠癌干细胞至15mL离心管中，1000rpm 5min，弃上清，加入10mL的PBS洗涤一次，1000rpm 5min，弃上清；

6)向细胞沉淀中加入9mL含有1％福尔马林的新鲜培养基，摇床上室温孵育10分钟；

7)向3)中加入1mL的1.25M甘氨酸，混匀，1000rpm 5min离心，弃上清，加入10mL的冷的PBS洗涤一次，1000rpm 5min；

8)用200μl CP3A重悬细胞沉淀，并将细胞悬液转到1.5ml离心管中，冰上孵育10min，涡旋10s后5000rpm 5min；

9)去除上清，用100μl含有蛋白酶抑制剂的CP3B重悬，冰上孵育10min，并涡旋混匀；

10)超声，14,000rpm离心10minutes；

11)将上清转移到1.5ml离心管中，用CP41∶1稀释；

12)取5μl步骤11)中的稀释液作为input；

13)去除步骤4)中的抗体，用150μl CP2洗3次；

14)取100μl步骤11)中的稀释液至12连管中，盖上保鲜膜，摇床上50-100rpm室温孵育60-90min；

15)弃上清，用150μl CP1洗6次，每次摇床上洗2min，用150μl 1X TE Buffer摇床上洗2min；

16)将含有Proteinase K的CP5 40μl加入到每管，盖上盖子65℃热水浴15min；

17)再加入40μl CP6，盖上盖子65℃热水浴90min；

18)加入150μl CP7至样品中，混匀后加入2ml的柱子上，12,000rpm离心20s；

19)弃流出液，加入200μl 70％酒精至柱子中，12,000rpm离心15s；

20)弃流出液，换收集管，加入200μl 90％酒精至柱子中，12,000rpm离心20s；

21)弃流出液，加入200μl 90％酒精至柱子中，12,000rpm离心35s；

22)弃流出液，加入200μl 90％酒精至柱子中，12,000rpm离心35s；

22)将柱子置于1.5ml的离心管中，加入10-20μl CP8，12,000rpm离心20s；

23)SYBR Green定量PCR反应体系：

0.4μl上游引物(10μM)、0.4μl下游引物(10μM)、10μl 2×SYBR Green qPCR SuperMix、2μl cDNA模板、6.8μl DEPC水，反应体系配置好后，加入到反应管中，微量离心机离心3秒钟，将所有液体离心至反应管底部，避免产生气泡，然后放置于荧光定量PCR仪器的反应板上，压紧；

24)PCR设置：

结果如图3B所示。由图3B可见，Aspirin处理HT29细胞系的TC细胞和AC细胞后，TC细胞FasL启动子区的H3K9乙酰化促进FasL表达上调；而AC细胞后中FasL表达未上调。

以上检测和分析结果均表明，大肠癌干细胞对Aspirin的敏感性与FasL启动子区的H3K9乙酰化相关。

Claims (10)

1.FasL蛋白作为生物标记在定性检测大肠癌干细胞对阿司匹林敏感性中的应用。

2.能够与权利要求1所述FasL蛋白特异性结合的抗体在制备定性检测大肠癌干细胞对阿司匹林敏感性的试剂中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的抗体为单抗。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗体携带荧光标记。

5.如权利要求1～4任一所述的应用，其特征在于，所述定性检测的方法为流式细胞分析。

6.编码权利要求1所述FasL蛋白的mRNA作为生物标记在定性检测大肠癌干细胞对阿司匹林敏感性中的应用。

7.能够与权利要求5所述mRNA特异性结合的探针或引物在制备定性检测大肠癌干细胞对阿司匹林敏感性中的应用。

8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述定性检测的方法为定量PCR或基因测序。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述引物为：

上游引物：5’-GCAGCAGCCCTTCAATTACCCAT-3’

下游引物：5’-CACAGAGGTTGGACAGGGAAGAA-3’。

10.乙酰化H3K9蛋白作为生物标记在定性检测大肠癌干细胞对阿司匹林敏感性中的应用。