CN112410302A - 基于多靶标组合的肿瘤干细胞的富集和筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于多靶标组合的肿瘤干细胞的富集和筛选方法。所述方法是将成球培养和免疫磁珠分选法联合用于肿瘤干细胞的富集和分离。具体如下：先将肿瘤细胞在无血清的成球培养基中进行初步干性成球筛选后，再结合多靶标免疫磁珠分选肿瘤干细胞。将两种方法相结合，可以显著改善肿瘤干细胞分选得率低，纯度低以及成瘤性低等问题。本方法不仅特异性、敏感性好，富集时间短，捕获效率高，并且制备方法简单，成本低，具有很强的实用性。本发明为肿瘤的诊断、治疗及预后提供有效手段。

Description

基于多靶标组合的肿瘤干细胞的富集和筛选方法

技术领域

本发明涉及生物医学检测领域，具体地说，涉及一种基于多靶标组合的肿瘤干细胞的富集和筛选方法。

背景技术

原发性肝癌是全世界最常见恶性肿瘤之一，严重威胁人类的生命和健康。在过去的几十年里，尽管在肝癌诊断及治疗上取得了巨大的进步，但绝大多数肿瘤患者仍无法获得根治，容易复发和转移，对常规化疗产生耐药，由于各治疗手段的局限性，导致肝癌患者的生存率低下，迫切需要结合肝癌的发病机制进一步研究开发新的诊疗方法。肝癌肿瘤干细胞是近年来肝癌领域的一个较为重要的发现，对肝癌的发生、发展及复发转移提供了新的理论解释，为肿瘤的诊断和治疗开辟了一条新的思路。2001年，肿瘤干细胞(Cancer stemcell，CSC)这一概念被正式提出。肿瘤干细胞(CSC)假说认为肿瘤组织中存在极少量的瘤细胞充当着干细胞的角色，它们具有自我更新能力、无限增殖能力和高致瘤性等特点，使得肿瘤组织中具有自我更新能力的肿瘤细胞的数量不断增加，肿瘤组织能够不断增大且能驱动肿瘤的形成和生长。肿瘤干细胞理论的提出为肿瘤的发生、发展乃至术后复发提供了新的研究思路，同时也为癌症的治疗带来了新的曙光。但由于肿瘤干细胞含量极低、分离困难，给肿瘤干细胞的研究带来诸多不便。目前常用的分离方法为无血清培养法与流式分选法，但二者均存在一定的缺陷，因此，亟需建立一种新型、快速、简单的CSC筛选和富集系统对于CSC的研究具有重要意义。

CD133也称为Prominin-1，是高度糖基化的五次跨膜膜糖蛋白，常表达于神经原始细胞、上皮/内皮祖细胞谱系、造血干/祖细胞等，是目前用来标记或分选干/祖细胞的最常用的膜表面标志。越来越多的证据表明CD133已经成为众多肿瘤干细胞表面的特异标记分子，CD133蛋白不仅在神经干细胞、表皮干细胞等干细胞中有表达，在白血病干细胞、大肠癌干细胞、脑肿瘤干细胞等多种肿瘤干细胞中都有表达。研究表明，CD133高表达的肝癌患者生存期明显较CD133弱表达组的短，CD133的表达与原发性肝癌(HCC)患者的总生存期相关，细胞质表达CD133是影响肝癌患者总生存的非常显著的危险因素。CD133作为多种肿瘤共同的细胞表面标志物，通过CD133特异性分选干细胞，将有助于我们研究肿瘤干细胞的生物学特性、信号传导通路和耐放化疗机制。

EpCAM是一种在人类许多上皮组织、肿瘤组织和干细胞中均有表达的跨膜糖蛋白，包括几乎所有的腺癌、某些鳞癌、视网膜细胞瘤和肝癌。EpCAM不仅是肿瘤细胞增殖的标志，也是肝癌干细胞的表面标志。研究发现，肝癌患者体内存在循环干细胞样EpCAM+细胞，可作为肝癌根治性切除术后预后不良的一个重要指标。

CD13是锌黏合金属蛋白家族氨肽酶N，与肝癌转移、化疗耐药相关，肝癌干细胞系处于半静止状态的一种标志物。CD13在许多肿瘤细胞中高表达，在肿瘤细胞生长、侵袭、转移和血管生成中发挥重要作用。最近，Haraguchi等通过基于微阵列分析的表面标记筛选，将CD13作为一种候选肝癌干细胞标志物。

有效分离和富集肿瘤干细胞是对其深入研究的前提，但由于肿瘤干细胞含量低和缺乏特异性的标志物，它的分离、富集已成为肿瘤干细胞研究的瓶颈和难点之一。现有方法主要包括流式分选、免疫磁珠分选、侧群分选和悬浮球培养等方法，但都存在一定的缺陷性，不能有效地分离和富集肿瘤干细胞。目前所有的流式分选和磁分选技术都是基于抗体进行分选检测，但抗体分子量和空间位阻大导致多个抗体不适合同时进行多靶点分选。近年来多肽配体在生化分析、肿瘤诊疗等方面彰显出很强的优越性，与抗体相比结构更加稳定、成本低、分子量小，更容易与纳米材料整合如用于循环肿瘤细胞(CTC)的分离检测。CSCs筛选和富集方法系统对于CSCs的研究具有重要意义。因此，建立一种新型、简单快速、可靠的肿瘤干细胞分离富集方法，在不改变肿瘤干细胞表观遗传的基础上，分离和纯化肿瘤干细胞为后续的深入研究奠定基础，以便开展更有针对性的研究是目前肿瘤干细胞研究的热点之一。目前，已经报道的肝癌CSCs的生物标志物主要包括CD133、EpCAM、CD13和α2δ1等。然而，目前为止在肝癌中尚未有特异性干细胞标志物得到国际广泛认可。而仅以一个标志物来确定肿瘤干细胞是不够的，因此通过联合几种肝癌干细胞表面标志物组合来更准确地分离和鉴别肝癌干细胞，通过对它们的检测，表征和监测来更好地理解这些特殊细胞在肿瘤发生、转移中的生物学作用。而由于个体差异的存在，并非所有CSCs均一高表达同一种标志物，因此在使用特异性标记物筛选法时，需要多标志物联合使用，以提高筛选出CSCs的可能性。单一CSCs体外富集方法存在一定的局限性，因此，多种富集法联合应用使提高CSCs的富集效率和准确度成为可能。

发明内容

本发明的目的是针对肝癌干细胞标志物表达的复杂性和多样性以及抗体捕获技术本身存在不足，提出利用组合多肽来替代抗体作为靶向分子的新的复合式肿瘤干细胞的富集和筛选方法，实现对微量CSCs高效、特异性地分离和检测。

本发明构思如下：CD133、EpCAM和CD13均可作为独立的干细胞标志物，但其独立仍有较大的局限性，存在一定的假阴性率。本发明将这三种肿瘤标志物联合起来，共同作为肝癌干细胞检测的指标，可更好地评估肝癌干细胞的生物学行为，使分离检测结果更准确，预后更精准。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种多肽-磁性纳米颗粒(多肽免疫磁珠)，所述多肽-磁性纳米颗粒为偶联有靶向肿瘤干细胞标志物CD133、EpCAM和CD13的多肽的氧化铁磁性纳米颗粒。

针对肝癌干细胞标志物表达的复杂性和多样性，发明人选择目前公认的肝癌干细标志物CD133、CD13和EpCAM，设计合成其相应的交叉靶向多肽Pep-1：YEVHTYYLDGGCGGYRYEWEPIY和Pep-2：YIPEWEYRYEGGCGGLHYEVY(SEQ ID NO:1-2)，并将其修饰于磁性氧化铁颗粒表面用于肿瘤干细胞(特别是肝癌肿瘤干细胞)的分离纯化。

多肽Pep-1和Pep-2对CD133、CD13和EpCAM具有高特异性亲和能力。其中，多肽Pep-1与CD133、CD13的亲和系数Kd分别为35.6nM和86.3nM，多肽Pep-2与CD133和EpCAM的亲和系数Kd分别为35.6nM和14.2nM。

所述多肽-磁性纳米颗粒是由所述多肽的半胱氨酸侧链上的巯基与表面修饰有聚乙二醇马来酰亚胺基团的氧化铁磁性纳米颗粒通过迈克尔加成反应得到的。所述多肽-磁性纳米颗粒可以是多价体，所述多价体是通过氧化铁颗粒表面多肽之间的酰胺键连接分子共价连接形成的。

所述表面修饰有聚乙二醇马来酰亚胺基团的氧化铁磁性纳米颗粒的粒径大小为50-300nm，优选为200nm左右。

所述多价体具有靶向CD133、CD13和EpCAM阳性的肿瘤干细胞的特性。分选到的不同亚型的干细胞样细胞群分别为CD133+CD13+、CD133+EpCAM+、CD133+CD13+EpCAM+。

第二方面，本发明提供多肽-磁性纳米颗粒(多肽免疫磁珠)的制备方法，包括：

(1)采用固相肽合成方法合成多肽，得到多肽溶液；

(2)制备表面修饰有聚乙二醇马来酰亚胺基团的氧化铁磁性纳米颗粒(Fe₃O₄-PGE-MAL)溶液；

(3)将(1)的多肽溶液和(2)的氧化铁磁性纳米颗粒溶液混合孵育。

其中，所述多肽为靶向肿瘤干细胞标志物CD133、EpCAM和CD13的多肽。

前述的方法，所述多肽溶液与所述氧化铁磁性纳米颗粒溶液在25-37℃混合振荡4-24h(优选37℃混合振荡4h)。

优选地，振荡转速为200-250rpm。

优选地，氧化铁磁性纳米颗粒和多肽的质量比为1:0.05-1。

本发明的多肽免疫磁珠(多肽纳米免疫磁珠)可检测识别CD133、EpCAM和CD13任一阳性肿瘤干细胞的组合。

第三方面，本发明提供所述多肽-磁性纳米颗粒或按照上述方法制备的多肽-磁性纳米颗粒在肿瘤干细胞的富集和筛选中的应用。

第四方面，本发明提供基于多靶标组合的肿瘤干细胞的富集和筛选方法，所述方法是将成球培养和免疫磁珠分选法联合用于肿瘤干细胞的富集和分离。包括：

1)将肿瘤细胞进行体外成球培养，然后将成球细胞消化成单细胞悬液；

2)向1)的单细胞悬液中加入所述多肽-磁性纳米颗粒或按照上述方法制备的多肽-磁性纳米颗粒，在外加磁场的作用下进行分选。

具体如下：先将肿瘤细胞在无血清的成球培养基中进行初步干性成球筛选后，再结合多靶标免疫磁珠分选肿瘤干细胞。将两种方法相结合，可以显著改善肿瘤干细胞分选得率低，纯度低以及成瘤性低等问题。

所述肿瘤细胞可选自肝癌、神经胶质瘤、非小细胞肺癌、结直肠癌、胰腺癌等，优选CD133、CD13和EpCAM过表达的肝癌。

本发明提供的肿瘤干细胞的富集和筛选方法，将成球培养和免疫磁珠分离法联合用于肿瘤干细胞的富集和筛选，具体方法如下：将肿瘤细胞在无血清的成球培养基中进行连续成球培养，并采用qPCR法检测肿瘤干细胞标志物的相对表达水平，当其特异性标志物表达量处于相对最高时，辅以免疫磁珠阳性单选、双选或三选筛选肿瘤干细胞。

例如，成球培养包括以下步骤：肝癌细胞系Huh-7按照2×10⁵细胞/mL浓度接种到含有EGF(100μg/mL)和bFGF(20ng/mL)和1×B27的无血清培养基的低吸附6孔板中，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，每3天半量换液。当细胞形成悬浮的细胞球2周后，进行传代培养。将细胞成球扩大培养至4代成球细胞约100个细胞球，可满足磁珠筛选的起始数目要求。

在本发明的一个具体实施方式中，利用免疫磁珠分选三阳肿瘤干细胞的方法如下：

免疫磁珠分离法使用的免疫磁珠为表面分别包被有CD133、CD13和EpCAM等不同类型肿瘤干细胞标志物靶向多肽的磁性纳米颗粒。

将成球细胞消化成约1×10⁶个单细胞悬液，1000rpm离心5min，弃上清，加入700μL的PBS缓冲液重悬细胞，再加入300μL的多肽纳米磁珠，置于磁力架上于37℃缓慢振荡30min，收集磁场捕获的阳性细胞即肿瘤干细胞，阳性细胞进行流式检测进一步验证。加入含EGF(100μg/mL)、bFGF(20ng/mL)和1×B27及双抗的DMEM/F12培养基进行培养。

第五方面，本发明提供含有所述多肽-磁性纳米颗粒的用于肿瘤干细胞富集和筛选的试剂盒。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明的多肽-磁性纳米颗粒选择性强，纯度高，分子量小，特异性强，无免疫原性，安全可靠，可以采用化学合成的方法制备，简单易行，适于作为化疗的预测和伴随诊断试剂。

(二)本发明将肿瘤干细胞分选的成球分选和免疫磁珠分选两种经典方法结合使用，首先将肿瘤细胞在无血清的成球培养基中进行连续成球培养，结合免疫磁珠阳性单选、双选或三选，两种筛选方法结合起来，从而显著提高肿瘤干细胞分选效率，获得肿瘤干细胞纯度较高，且多肽可自行降解，不影响后续实验的正常进行。此外CD133、CD13和EpCAM多靶标可以捕获到处于不同表型的肿瘤干细胞，扩大捕获和富集CSCs细胞的覆盖范围，同时特异性、敏感性好，而且磁响应迅速、富集时间短，捕获效率高，进而提高筛选的效率和减少假阳性率。

(三)本发明原料简单易得，成本低，工艺步骤简单，多肽包被量大，具有很强的实用性。多肽介导的靶向纳米磁珠相比抗体用于肿瘤诊疗具有独特优势。多肽作为天然的优良两亲性分子，可通过特定的序列设计来自组装形成规整有序的纳米结构。因其良好的生物相容性、易降解、可调的机械性能以及环境响应性，在肿瘤诊疗领域具有很强的实用性。

(四)本发明中采用多种亲和多肽纳米磁珠对CSCs进行多靶标识别、捕获和检测，相较现有的基于抗体识别的方法，小分子多肽的作用位点简单、特异，分子间干扰小，胞膜占位程度低，多肽在纳米颗粒表面组装的拓扑结构和多价结合能力可以实现细胞水平的多靶标同时检测。由于肝癌干细胞标志物表达的复杂性和多样性，多靶点多肽分离肿瘤干细胞是一种简单易行、经济、可重复性强和分离效率高的策略。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中多肽-磁性纳米颗粒的DLS和TEM图。其中，(a)：DLS测定的多肽纳米磁珠的水合粒径；(b)：TEM表征多肽纳米磁珠的形貌。

图2为本发明较佳实施例中多肽-磁性纳米颗粒分选后的阳性细胞形成的肿瘤干细胞球。其中，(a)：肿瘤干细胞的磁分选过程；(b)：磁分选后肿瘤干细胞的标志物的免疫荧光染色结果。图3为本发明较佳实施例中CD133+CD13+EpCAM+三阳性肿瘤干细胞的qPCR检测结果。其中，(a)：磁分选后单个阳性肿瘤干细胞的克隆成球能力；(b)：肿瘤干细胞干性相关基因的qPCR检测结果。CSC：肿瘤干细胞；non-CSC：普通的肿瘤细胞系。

图4为本发明较佳实施例中分选的三阳性肿瘤干细胞体内致瘤性检测结果。其中，(a)：普通肿瘤和肿瘤干细胞的体内致瘤性检测；(b)：肿瘤干细胞成瘤后肿瘤组织的免疫组化染色结果。

图5为本发明多肽-磁性纳米颗粒的结构示意图以及肿瘤干细胞的富集和筛选过程。

图6为本发明较佳实施例中多肽-磁性纳米颗粒分选的脑胶质瘤肿瘤干细胞。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1多肽-磁性纳米颗粒的制备

1、实验仪器与材料

N-甲基吗啉(NMM)，哌啶，三氟乙酸(TFA)，二氯甲烷(DCM)，茚三酮，维生素C，苯酚，四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，六氢吡啶，三异丙基硅烷(TIS)，乙二硫醇(EDT)，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，无水乙醚，树脂，甲醇，各种Fmoc保护氨基酸，CD133抗体，多肽合成管，摇床，真空水泵，旋转蒸发仪，上述试剂和材料均从商业途径获得。

2、多肽Pep-1和Pep-2的合成

采用Fmoc固相肽合成方法合成多肽(Pep-1和Pep-2，SEQ ID NO:1-2)，具体方法如下：称取200mg的wang-NH₂树脂，按照上述固相多肽合成程序循环，依次加入氨基酸依次进行反应，脱保护后进行混合均分合成。待偶联完毕后，树脂经TFA裂解后。经过HPLC和质谱鉴定后备用。

3、Fe₃O₄-PGE-MAL的合成

聚乙二醇马来酰亚胺(PGE-MAL)的分子量为6500Da左右(PGE-MAL购自西安瑞禧生物科技有限公司)，Fe₃O₄磁性纳米颗粒通过高温热分解法制备得到，然后经PGE-MAL配体交换得到水相的Fe₃O₄-PGE-MAL。Fe₃O₄磁性纳米颗粒的制备方法可参见TimelyVisualization of the Collaterals Formed during Acute Ischemic Stroke withFe₃O₄ Nanoparticle-based MR Imaging Probe，2018。

4、多肽与氧化铁磁性纳米颗粒偶联

取0.5mg/mL的Fe₃O₄-PGE-MAL与Pep-1和Pep-2按1:0.8:0.8(质量比)混合后37℃、200rpm缓慢振荡4h，然后12000rpm离心15min，弃上清，用1×PBS洗三次，最终悬浮于500μL的PBS缓冲液中，得到多肽-磁性纳米颗粒(多肽-Fe₃O₄)溶液，取一部分样品进行多肽光散射(DLS)和透射电子显微镜检测(TEM)。由图1可以看出多肽修饰的磁性纳米颗粒具有良好的均一性和分散性，尺寸在200nm左右。

多肽在纳米颗粒表面组装的拓扑结构及多价结合能力：通过SPRi亲和力测试，结果显示纳米颗粒表面组装多肽亲和力比单独游离多肽亲和力高4.2倍，同时偶连Pep-1和Pep-2的纳米颗粒比单独偶连Pep-1或Pep-2的纳米颗粒对细胞的识别能力更好。

实施例2多靶标多肽纳米磁珠用于肿瘤干细胞的高效分离

人肝癌细胞系Huh-7用添加1×B27、EGF(100μg/mL)和bFGF20 ng/mL)的无血清DMEM/F12培养基在超低粘附6孔板中培养7-14天(37℃，5％CO₂培养箱)。显微镜下观察，肿瘤干细胞样细胞随培养时间的延长开始克隆生长，逐渐生长成立体、悬浮的细胞球，而非干细胞样细胞逐渐死亡，从而初步富集干性样细胞。收集第1代细胞球，消化成单细胞悬液后用实施例1制备的多肽磁性纳米颗粒进行分选。由图2可以看出，孵育后含多肽磁珠离心管置于磁力架上。阳性细胞受磁力影响吸附于离心管侧壁，而阴性细胞由于重力沉降在EP管底。向分选后的细胞中依次加入终浓度为1μmol/L的Hoechst 33342和5μg/mL PE-anti-CD133、Cy5.5-anti-CD13和FITC-anti-EpCAM抗体(购自Biolegend公司)，4℃避光孵育60min后，用预冷1×PBS洗涤3次。用激光扫描共聚焦显微镜(ZEISS LSM 710)检测干细胞中的荧光分布。随后通过流式细胞术对分选的肿瘤干细胞纯度进行评估阳性率约为85％，并进行免疫荧光分析，结果显示分选到了不同亚型的干细胞样细胞群分别是CD133+CD13+、CD13+EpCAM+、CD133+CD13+EpCAM+。以上结果表明，基于多肽组合方法筛选和富集到了不同亚型的肝癌肿瘤干细胞。

实施例3分选肿瘤干细胞的qPCR验证

为了评估CD133+EpCAM+CD13+肿瘤球的干性，经多肽磁珠流式分选肿瘤干细胞用含1×B27、EGF(100μg/mL)和bFGF20 ng/mL)的干细胞完全培养基于37℃培养24h后，使用TRizol(Invitrogen Inc.，USA)从肿瘤球中提取总RNA。使用PrimeScript TM RT试剂盒(Takara，中国)将总RNA转化为cDNA。然后用SYBR Green PCR Master Mix进行qPCR定量。Sox-2、Oct-4、ABCG2、CD133 mRNA表达水平基于内参GAPDH经归一化处理。结果如图3所示，实时定量PCR检测发现干细胞自我更新和多能潜能性相关通路的基因ABCG2、Sox-2、Notch-1、Bmi-1、Oct-4和LGR5的表达量均发生明显上调，说明分离到了高纯度和活性的肿瘤干细胞。

实施例4肿瘤干细胞体内成瘤性验证

目前，表征肿瘤干细胞肿瘤形成能力及干细胞特性的“金标准”就是CSC在体内的成瘤能力。将分选的CSCs与Huh-7细胞分别以不同密度接种于雄性BALB/c裸鼠(6周龄，体重约18g)皮下，接种密度为1×10³、1×10⁴、1×10⁵个细胞/只的CSCs，观察动物成瘤情况。从图4中可以看出，接种密度为1×10⁵CSCs细胞/只的老鼠，其成瘤时间为12d，接种密度为1×10⁵个细胞/只的Huh-7细胞，在3周的观察时间内未见成瘤出现。由此可见裸鼠成瘤瘤体大小反应出联合筛选的肝癌干细胞比单纯代成球筛选以及单纯肿瘤细胞在相同注射细胞浓度下具有更强的致瘤能力。肿瘤干细胞在少量细胞是也具有更高的成瘤性。采用引颈法处死动物后取肿瘤进行组织切片染色也表明肿瘤组织恶性程度更高，也表达肿瘤干细胞的标志物。

本发明的多肽-磁性纳米颗粒的结构示意图以及肿瘤干细胞的富集和筛选过程如图5所示。

综上，本发明的基于CD133、EpCAM和CD13多靶标组合多肽纳米磁珠可以更特异和高效识别分离CD133、EpCAM和CD13三阳性的肿瘤干细胞，而且该类细胞的干性更强，更能代表真正的肿瘤干细胞，而且分离的肿瘤干细胞具有更高的活性，不仅特异性、敏感性好、富集时间短、捕获效率高，并且制备方法简单，成本低，具有很强的实用性。为后续肝癌的诊断，治疗及预后提供有效手段。

实施例5脑胶质瘤肿瘤干细胞的分选

选用脑胶质瘤细胞系GL261和U87，采用实施例2中同样的方法进行了分选，最后得到了较高纯度和干性的脑胶质瘤干细胞。通过体外克隆成球实验，由图6可以看出，分选后的细胞同样具有很强的肿瘤干细胞特性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 福建医科大学

<120> 基于多靶标组合的肿瘤干细胞的富集和筛选方法

<130> KHP201117507.4

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Tyr Glu Val His Thr Tyr Tyr Leu Asp Gly Gly Cys Gly Gly Tyr Arg

1 5 10 15

Tyr Glu Trp Glu Pro Ile Tyr

20

<210> 2

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Tyr Ile Pro Glu Trp Glu Tyr Arg Tyr Glu Gly Gly Cys Gly Gly Leu

1 5 10 15

His Tyr Glu Val Tyr

20

Claims (10)

1.多肽-磁性纳米颗粒，其特征在于，所述多肽-磁性纳米颗粒为偶联有靶向肿瘤干细胞标志物CD133、EpCAM和CD13的多肽的氧化铁磁性纳米颗粒。

2.根据权利要求1所述的多肽-磁性纳米颗粒，其特征在于，所述多肽为Pep-1和Pep-2，它们的氨基酸序列如SEQ ID NO:1-2所示。

3.根据权利要求2所述的多肽-磁性纳米颗粒，其特征在于，所述多肽-磁性纳米颗粒是由所述多肽的半胱氨酸侧链上的巯基与表面修饰有聚乙二醇马来酰亚胺基团的氧化铁磁性纳米颗粒通过迈克尔加成反应得到的。

4.根据权利要求3所述的多肽-磁性纳米颗粒，其特征在于，所述表面修饰有聚乙二醇马来酰亚胺基团的氧化铁磁性纳米颗粒的粒径大小为50-300nm，优选为200nm。

5.多肽-磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括：

(1)采用固相肽合成方法合成多肽，得到多肽溶液；

(2)制备表面修饰有聚乙二醇马来酰亚胺基团的氧化铁磁性纳米颗粒溶液；

(3)将(1)的多肽溶液和(2)的氧化铁磁性纳米颗粒溶液混合孵育；

其中，所述多肽为靶向肿瘤干细胞标志物CD133、EpCAM和CD13的多肽。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述多肽溶液与所述氧化铁磁性纳米颗粒溶液在25-37℃混合振荡4-24h；

优选地，振荡转速为200-250rpm。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，氧化铁磁性纳米颗粒和多肽的质量比为1:0.05-1；和/或

所述多肽同权利要求2-4任一项中所述。

8.权利要求1-4任一项所述多肽-磁性纳米颗粒或按照权利要求5-7任一项所述方法制备的多肽-磁性纳米颗粒在肿瘤干细胞的富集和筛选中的应用。

9.基于多靶标组合的肿瘤干细胞的富集和筛选方法，其特征在于，包括：

1)将肿瘤细胞进行体外成球培养，然后将成球细胞消化成单细胞悬液；

2)向1)的单细胞悬液中加入权利要求1-4任一项所述多肽-磁性纳米颗粒或按照权利要求5-7任一项所述方法制备的多肽-磁性纳米颗粒，在外加磁场的作用下进行分选。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述肿瘤细胞选自肝癌、神经胶质瘤、非小细胞肺癌、结直肠癌、胰腺癌。

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