CN110907513A - 干细胞的电化学检测方法 - Google Patents

Abstract

一种干细胞的电化学传感方法，其特征在于以多肽识别乳腺癌干细胞，还对所述多肽的N端进行叠氮基团修饰，通过铜催化的叠氮‑炔基Husigen环加成反应获得电化学信号。本发明提供的方法，利用所设计合成的多肽及其自组装形成的肽纤维实现乳腺癌干细胞的识别，进而借助点击化学反应引入具有电化学响应的银纳米颗粒，实现了目标乳腺癌干细胞的定量检测。该方法灵敏度高，特异性强，同时无需抗体参与，因而在临床诊断等领域有广泛的应用前景。

Description

干细胞的电化学检测方法

技术领域

本发明涉及一种干细胞的电化学传感方法，特别涉及一种基于多肽纤维定向识别检测乳腺癌干细胞的电化学传感方法。

背景技术

乳腺癌作为女性最高发的恶性疾病之一，已成为威胁女性健康的杀手。然而传统的临床治疗手段，并不能从根本上杜绝癌细胞的存在，相当一部分癌细胞可以躲过化疗放疗的作用，致使患者的疾病复发以及远处转移。肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells，CSCs)学说为乳腺癌的复发和转移研究提供了新思路。该学说指出，肿瘤组织中存在一小群数目极为稀少却具有与干细胞类似的自我更新、增殖和分化的潜能的特殊细胞，称之为肿瘤干细胞。乳腺癌是第一个被证实存在肿瘤干细胞的人类实体瘤，辨别乳腺癌干细胞的主要依据之一则是细胞表面生物标志物。其中，细胞粘附因子CD44是公认度最高、研究最为广泛的乳腺癌干细胞表面生物标志物。目前乳腺癌干细胞最常用的鉴定方法是结合流式细胞术和免疫磁珠法。然而，抗体在生物分析应用中却存在一定的局限性，例如：组织穿透性差、免疫原性强和血液清除效率较低等。相比于抗体，多肽配体是微型简化的抗体，具有更低的分子量、更高的物理稳定性、较低的免疫原性、较高的血液清除效率等优势，整体性能更为优越。同时，多肽配体可以通过自组装为纳米探针的界面富集提供平台，具有良好的可控性和有序性，并且可以根据需求灵活设计出集各项功能于一体的多功能肽。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种乳腺癌干细胞的电化学传感方法以多肽配体为识别元件，通过自组装的方式合成具有定向识别性能的多肽纤维，提高检测乳腺癌干细胞的灵敏度。

本发明的另一个目的在于提供一种乳腺癌干细胞的电化学传感方法以多肽配体为识别元件，通过自组装的方式合成具有定向识别性能的多肽纤维，提高检测乳腺癌干细胞的特异性。

本发明的再一个目的在于提供一种乳腺癌干细胞的电化学传感方法，以实现对于乳腺癌干细胞进行定量检测。

本发明的又一个目的在于提供一种电化学检测乳腺癌干细胞的方法，以多肽配体为识别元件，引入金属探针(如：银纳米颗粒)作为电化学信号报告探针，对乳腺癌干细胞进行检测。

一种乳腺癌干细胞的电化学传感方法，以SEQ ID No 1所示的多肽实施乳腺癌干细胞的识别，该多肽的N端具有通过氢键形成分子间β折叠的结构，具有自组装功能，并形成多肽纤维；多肽的C端能特异性地识别和结合乳腺癌干细胞表面的CD44蛋白。

还对该多肽的N端进行叠氮(azide)基团修饰，以利于通过铜催化的叠氮-炔基Husigen环加成反应(Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition)获得电化学信号。

另一种乳腺癌干细胞的电化学传感方法，还包括核酸适体DNA链，用于捕获被多肽识别的乳腺癌干细胞，其DNA序列如SEQ ID No 2所示，在其3’端还修饰巯基基团。

将制得的多肽和核酸适体DNA链用于电化学方法检测乳腺癌干细胞。

一种电化学检测乳腺癌干细胞的方法，包括：

N端进行叠氮基团修饰的SEQ ID No 1所示的多肽对乳腺癌干细胞进行特异性识别后，被结合于电极上的核酸适体DNA链捕获，二苯基环辛炔功能化的金属探针(如：银纳米颗粒)与多肽N端叠氮基团发生叠氮-炔基Husigen环加成反应而结合至电极表面，进而产生显著的电化学信号，通过分析金属探针电化学响应信号的强弱，实现对乳腺癌干细胞的定量检测。

本发明技术方案实现的有益效果：

本发明的检测乳腺癌干细胞的电化学传感方法，利用所设计合成的多肽及其自组装形成的肽纤维实现乳腺癌干细胞的识别，进而借助点击化学反应引入具有电化学响应的银纳米颗粒，实现了目标乳腺癌干细胞的定量检测。该方法灵敏度高，特异性强，同时无需抗体参与，因而在临床诊断等领域有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明建立的基于多肽纤维定向识别的乳腺癌干细胞电化学传感方法的原理图；

图2为设计合成的多肽纤维的透射电子显微镜(TEM)表征图谱；

图3为电极处于不同表面状态时的电化学交流阻抗图谱；其中，曲线a为裸金电极，曲线b为核酸适体DNA功能化电极，曲线c和曲线d分别对应于核酸适体DNA功能化电极依次与乳腺癌干细胞和多肽纤维作用后的状态；

图4为检测每毫升5×10⁴个乳腺癌干细胞及对照实验中所得到的线性伏安扫描图谱；其中，“a”表示对照组，样品中不含乳腺癌干细胞；“b”表示实验组，样品中含有每毫升5×10⁴个乳腺癌干细胞；“c”表示对照组，未加入多肽纤维，样品中含有每毫升5×10⁴个乳腺癌干细胞；

图5A为检测不同浓度乳腺癌干细胞时得到的线性伏安扫描图谱，由a至h分别为每毫升10、5×10、10²、5×10²、10³、5×10³、10⁴和5×10⁴个乳腺癌干细胞；

图5B为线性伏安扫描峰电流值与乳腺癌干细胞浓度的关系，内嵌图为细胞浓度在每毫升10到5×10⁴个范围内时，线性伏安扫描峰电流值与细胞浓度对数值之间的线性关系；

图6为检测不同细胞时得到的线性伏安扫描峰电流值。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

实施例1多肽链P1及其自组装

设计并合成一条氨基端修饰叠氮(azide)基团的多肽链P1，其序列为：(NH2)Azide-KLVFFGGRLVSYNGIIFFLK(COOH)。该序列由三个功能片段组成，即自组装功能片段(KLVFF)、间隔功能片段(GG)和识别功能片段(RLVSYNGIIFFLK)；多肽链P1的化学合成由专业的多肽合成公司完成。

多肽链P1借助自组装功能片段形成多肽纤维，叠氮基团和识别功能片段分别位于多肽纤维的两端。具体步骤为：取多肽链P1贮存液于微量管中，使用一定溶液将其稀释，并反应，使P1自组装形成纤维状结构。使用的多肽链P1的浓度为500～1000μM，体积分别为50μL；使用的稀释溶液为双蒸水(pH 7.0)，体积为450μL；反应温度为30～40℃；反应时间为1～2小时。

实施例2制取核酸适体DNA功能化电极

为了实现对于乳腺癌干细胞的捕获，核酸适体DNA链序列中应包含GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG。其次，为了实现核酸适体DNA链在电极界面的有效固定和捕获活性保持，序列的3′端应存在多个连续的腺嘌呤碱基以及在6位碳原子上进行巯基(记为：C₆-SH)修饰。核酸适体DNA链的化学合成由专业的DNA合成公司完成。

金电极的预处理：首先在丝绸上依次使用粒度为1μm、0.3μm和0.05μm氧化铝粉末将金电极抛光至镜面；随后将金电极依次置于乙醇和超纯水中超声3分钟，去除残留的杂质；使用双蒸水冲洗干净后，进一步地将金电极放置于0.5M H₂SO₄中进行循环伏安扫描，设置扫描电压范围0～1.6V，扫描速度100mV/s，得到表面处理干净的金电极。

将预处理过的金电极置于浓度为1μM～2μM核酸适体DNA链(序列为5′-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGAAAAAAAA-C₆-SH-3′)的固定缓冲液(含有2.5mM的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)的10mM磷酸盐缓冲，pH7.4)中，于0～5℃反应16小时～18小时，再置于的浓度为0.5mM～1mM巯基己醇水溶液中，于20℃～30℃处理0.5小时～1小时后，用超纯水冲洗、吹干。

实施例3乳腺癌干细胞的电化学传感及检测

将90μL包含待测的乳腺癌干细胞的样品溶液与实施例2所得的核酸适体DNA功能化电极相互作用，通过靶细胞与核酸适体DNA间的特异性分子识别，实现目标乳腺癌干细胞在电极表面的捕获；反应时间为1～2小时，反应温度为30℃～40℃。

将所得到的捕获有目标乳腺癌干细胞的电极与50μL～150μL多肽纤维于30℃～40℃反应1小时～2小时，以实现多肽纤维对于乳腺癌干细胞的定向识别。

制备二苯基环辛炔(DBCO)功能化银纳米颗粒：取100mL含有0.4mM硝酸银和0.4mM柠檬酸三钠的混合溶液置于锥形瓶中，磁力搅拌10分钟～15分钟。随后向其中加入3mL、10mM NaBH₄(冰水溶解)溶液，搅拌30分钟～45分钟后于0℃～5℃避光反应12小时～14小时，制备得到未功能化的裸银纳米颗粒。最后，取1mL裸银纳米颗粒依次与2μL、0.5mM巯基丙酸和2μL、0.5mM DBCO-氨基衍生物反应2小时～4小时，得到DBCO功能化银纳米颗粒。

将实施例2制得的金电极浸入50μL～150μL的DBCO功能化银纳米颗粒溶液中，于20℃～30℃反应1小时～2小时。反应结束后，使用双蒸水将电极冲洗干净，使用电化学工作站记录银纳米颗粒的电化学响应图谱，并根据电化学响应强度实现对目标乳腺癌干细胞的定性定量检测。

所使用的电化学工作站为CHI660c电化学工作站；所使用的电化学扫描技术为线性伏安扫描，扫描起始电位为-0.05V，扫描终止电位为0.15V。

实施例4多肽纤维的合成和表征

具体涉及多肽纤维的合成、TEM表征及其定向识别性能的表征，其步骤如下：

取50μL、500μM多肽链P1贮存液于微量管中，向其中加入450μL双蒸水(pH7.0)，混合均匀后在37℃条件下反应1小时，使用TEM对于多肽链P1自组装形成的纤维状结构进行表征。

在丝绸上依次使用粒度为1μm、0.3μm和0.05μm氧化铝粉末将金电极抛光至镜面，随后将电极依次置于乙醇和超纯水中超声3分钟，去除残留的杂质；使用双蒸水冲洗干净后，进一步地将电极放置于0.5M H₂SO₄中进行循环伏安扫描，得到预处理干净的金电极。将预处理过的金电极置于含有2μM核酸适体DNA链的固定缓冲液中，4℃下功能化16小时，再置于1mM的巯基己醇水溶液中避光处理1小时，用超纯水冲洗、吹干后得到核酸适体DNA功能化电极；将90μL包含每毫升5×10⁴个乳腺癌干细胞的样品溶液与所得到的核酸适体DNA功能化电极在37℃条件下反应1小时，实现目标乳腺癌干细胞在电极表面的捕获；随后，将电极进一步与100μL多肽纤维在37℃条件下反应1小时，以实现多肽纤维对于乳腺癌干细胞的定向识别，使用电化学交流阻抗技术对不同状态下的金电极进行表征。

TEM测定所用仪器是Tecnai G2 SpiritBiotwin，分辨率为100nm；电化学交流阻抗测定所用仪器是CHI660c电化学工作站，初始电位为0.224V，频率范围为0.1Hz～100000Hz。

TEM表征结果如图2所示。从图中可以看出，多肽链P1可以如所预期的自组装形成多肽纤维，且所形成纤维状结构空间分布和尺寸均一。

电化学交流阻抗表征结果如图3所示。从图中曲线a可以看出，裸金电极的阻抗图中不存在半圆部分，代表了电极表面电荷转移没有受到任何限制。当在电极表面固定了核酸适体DNA链后，产生了一个明显的半圆(参见曲线b)，这说明此时电极界面电荷转移阻力增大，而这是由于核酸适体DNA链在电极表面形成负电荷界面，与溶液中同样为负电性的电化学探针(铁氰化钾)发生静电排斥。由曲线c可见，当目标乳腺癌干细胞存在时，乳腺癌干细胞可以被捕获至电极表面，从而对于铁氰化钾与电极之间的电荷转移产生明显的位阻效应，引起交流阻抗图谱中半圆直径的进一步增大。最后，当电极与多肽纤维反应后，所得到的交流阻抗图谱中半圆直径进一步增大(参见曲线d)，这证明了多肽纤维能够定向识别电极表面捕获的乳腺癌干细胞。

实施例5乳腺癌干细胞的定量检测，其步骤如下：

取90μL包含不同浓度乳腺癌干细胞(每毫升10、5×10、10²、5×10²、10³、5×10³、10⁴、5×10⁴个细胞)的待测样品溶液与核酸适体DNA功能化电极在37℃条件下反应1小时，通过靶细胞与核酸适体DNA间的特异性分子识别，实现目标乳腺癌干细胞在电极表面的捕获。随后，将电极进一步与100μL多肽纤维在37℃条件下反应1小时，以实现多肽纤维对于乳腺癌干细胞的定向识别；最后，将电极浸入100μL DBCO功能化银纳米颗粒溶液中，室温条件下反应1小时。反应结束后，使用双蒸水将电极冲洗干净，使用电化学工作站记录银纳米颗粒的线性伏安扫描图谱，并根据线性伏安扫描峰电流值实现对目标乳腺癌干细胞的定性定量检测。

本例中所采用的多肽链P1和核酸适体DNA链的序列与实施例一中相同，线性伏安扫描所采用的仪器为CHI660c电化学工作站，扫描起始电位为-0.05V，扫描终止电位为0.15V。

图3显示了本实施例建立的电化学传感方法检测每毫升5×10⁴个乳腺癌干细胞及对照实验中所得到的线性伏安扫描图谱。如图4a所示，当体系中不存在乳腺癌干细胞时，线性伏安图谱中只有一个很小的背景信号峰；而当存在每毫升5×10⁴个乳腺癌干细胞时，线性伏安图谱在0.06V附近存在一个归属于银纳米颗粒的很强的电化学响应峰(图4b)；此外，当检测体系中存在每毫升5×10⁴个乳腺癌干细胞但未加入多肽纤维时，线性伏安图谱在0.06V附近的电化学响应峰强度与空白对照组基本相同(图3c)。这些结果说明本方法可以用于乳腺癌干细胞的检测，且检测信号的产生依赖于多肽纤维对于乳腺癌干细胞的定向识别。

图5A显示了线性伏安图谱中电化学响应峰随乳腺癌干细胞浓度的变化情况。如图所示，随着乳腺癌干细胞浓度的提高，线性伏安图谱峰逐渐增大，这说明随着乳腺癌干细胞浓度的增加，越来越多的多肽纤维通过定向识别过程而被固定至电极表面，最终导致越来越多的DBCO功能化银纳米颗粒结合至电极表面并产生逐渐增强的电化学响应。图5B显示了线性伏安扫描峰电流值随乳腺癌干细胞浓度的变化情况。从图中可以看出，在每毫升10到5×10⁴个细胞浓度范围内，随着乳腺癌干细胞浓度的增加，线性伏安扫描峰电流值逐渐升高。

实施例6乳腺癌干细胞电化学传感方法的特异性

使用乳腺癌细胞BT474、宫颈癌细胞HeLa、肝细胞癌细胞HepG2和正常成人肝细胞L02等作为对照细胞，并按照实施例5中的步骤进行电化学检测。

检测结果如图6所示，当样品中存在每毫升5×10⁴个乳腺癌干细胞时，线性伏安扫描峰电流值约为6μA。而当样品中存在其他类型对照细胞时，线性伏安扫描峰电流值与空白对照组相似，仅约为0.5μA。这说明本实施例建立的电化学传感方法用于乳腺癌干细胞检测具有良好的特异性。

上述实施例的结果表明，本实施例建立的基于多肽纤维定向识别检测乳腺癌干细胞的电化学传感方法具有很好的灵敏性和特异性，且设计思路简单、无需抗体参与，在临床诊断等领域中有着很大的潜在应用价值。

序列表

<110> 章毅

朱小立

中国干细胞集团上海生物科技有限公司

重庆市干细胞技术有限公司

中国干细胞集团海南博鳌附属干细胞医院有限公司

上海市干细胞技术有限公司

陕西省干细胞技术有限公司

苏州市干细胞技术有限公司

三亚市干细胞技术有限公司

<120> 干细胞的电化学检测方法

<141> 2017-12-22

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> Atificial synthesis

<400> 1

Lys Leu Val Phe Phe Gly Gly Arg Leu Val Ser Tyr Asn Gly Ile Ile

1 5 10 15

Phe Phe Leu Lys

20

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> Atificial synthesis

<400> 2

ggtggtggtg gttgtggtgg tggtggaaaa aaaa 34

Claims (6)

1.一种用于非疾病诊断目的检测乳腺癌干细胞的电化学装置，其特征在于：

序列如SEQ ID No 1所示的多肽，所述多肽的N端具有通过氢键形成分子间β折叠的结构，具有自组装功能，并形成多肽纤维；

所述多肽的N端进行叠氮基团修饰，通过铜催化的叠氮-炔基Husigen环加成反应获得电化学信号；

序列如SEQ ID No 2所示核酸适体DNA链，用于捕获被多肽识别的乳腺癌干细胞；

二苯基环辛炔功能化的金属探针；

电极，其上结合所述的核酸适体DNA链。

2.根据权利要求1所述的电化学装置，其特征在于所述的电化学信号系与多肽N端叠氮基团发生叠氮-炔基Husigen环加成反应而结合至电极表面，进而产生电化学信号。

3.根据权利要求1所述的电化学装置，其特征在于所述的二苯基环辛炔功能化的金属探针为二苯基环辛炔功能化的银纳米颗粒。

4.根据权利要求1所述的电化学装置，其特征在于所述核酸适体DNA链的3’端还修饰C₆-SH基团。

5.根据权利要求1～4之一所述的电化学装置在制备乳腺癌干细胞定量检测产品中的应用。

6.一种用于非疾病诊断目的乳腺癌干细胞定量检测的产品，其特征在于包括权利要求1～4之一所述的电化学装置。

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