CN105745021B - 用于分离颗粒簇的微流体方法和系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微流体方法和装置，其包括限定入口和出口的基底、在入口和出口之间在基底上排列以形成多个颗粒簇捕捉区的结构组，其中每个颗粒簇捕捉区包含限定输入流动路径的结构亚组，所述输入流动路径通过颗粒簇捕捉区中的结构之一的分开障碍而相等分成两个输出流动路径，以及在基底上限定以将流体从入口指引到颗粒簇捕捉区的输入流动路径以及从颗粒簇捕捉区的输出流动路径指引到出口的多个微流体通道。

Description

用于分离颗粒簇的微流体方法和系统
发明领域
本公开内容涉及用于分离颗粒簇的微流体方法和系统。
发明背景
认为循环肿瘤细胞簇和肿瘤-淋巴细胞混合簇的存在是患者中的转移性过程的预后中的潜在重要因素。因此，此类细胞簇的分离和回收可以容许进行疾病进展和癌症的治疗响应的研究。微流体(microfluidic)技术已经作为用于自全血分离和回收(retrieve)罕见细胞以进行诊断和生物医学研究的不可缺少的工具出现。然而，微流体芯片上俘获的细胞簇的回收可以是一项有挑战的任务，因为用于就地(in place)固定细胞簇的方法可能依赖于抗原-抗体反应的使用，这可以改变细胞行为。另外，根据构成微流体芯片的材料、样品流动速度、和芯片上的任何表面涂层材料，细胞能活跃形成具有不同强度的特异性/非特异性键。在某些情况中，这些键是如此之强，以致它们在引起附着细胞的裂解前不能用增加的流动速度破坏，如此必需对芯片应用特殊表面涂层材料和化学品，这不可避免地扰乱细胞的天然状态。
发明概述
本公开内容涉及用于自流体样品分离颗粒(例如细胞)簇的装置和方法。一般地，在第一个方面，本公开内容的主题可以体现在微流体装置，其包含：基底，其限定入口和出口；结构组，其在入口和出口之间在基底上排列以形成多个颗粒簇捕捉区，其中每个颗粒簇捕捉区包含限定输入流动路径的结构亚组，所述输入流动路径通过结构亚组中的结构之一的分开障碍而例如相等分成两个输出流动路径；和多个微流体通道，其在基底上限定以将流体从入口指引到颗粒簇捕捉区的输入流动路径以及从颗粒簇捕捉区的输出流动路径指引到所述出口。
一般地，在另一个方面，本公开内容的主题可以体现在通过在装置的运行期间将微流体装置冷却到相对较低的温度(诸如0和15摄氏度之间)来使颗粒(如细胞簇和细胞)对微流体装置壁的非特异性结合最小化的技术。
微流体装置可以包含一种或多种下述特征。例如，在一些实施方案中，结构亚组进一步排列为使得每个输出流动路径具有足够大的横截面，从而容许第一类的单一颗粒的通过，并且禁止第一类的两个或更多个颗粒的簇通过。在一些实施方案中，结构排列成两行或更多行，其中每行中的结构与相邻行中的所述结构是侧向偏移的，以形成多个颗粒簇捕捉区。结构的亚组可以包括排列成两行的三个三棱柱(triangular prism)结构，其中第一和第二三棱柱结构在第一行中排列，第一三棱柱结构的一个角与第二三棱柱结构的一个角相邻排列以限定它们之间的输入流动路径，并且第三三棱柱结构在与第一行中的第一和第二三棱柱结构偏移的第二行中排列，从而第三三棱柱结构的锐利边缘在位于第一行中的第一和第二三棱柱结构的相邻角之间排列，且其中分开障碍是第三三棱柱结构的锐利边缘(sharp edge)。颗粒可以是细胞，第三三棱柱结构的锐利边缘可以在第一和第二三棱柱结构的相邻角之间大致居中，并且第一和第二三棱柱结构的相邻角中每个与第三三棱柱结构的锐利边缘之间的距离可以是至少10微米。
在一些实施方案中，分开障碍具有小于约10微米的角半径。在一些实施方案中，相遇以形成分开障碍的结构的壁成小于或等于90度的角度。
在一些实施方案中，所有结构具有相同的横截面形状。在一些实施方案中，结构组中的结构包括两种或更多种不同横截面形状。在一些实施方案中，一个或多个结构具有选自下组的横截面形状：三角形、菱形、正方形、长方形、椭圆形或圆形。在一些实施方案中，一个或多个结构具有选自下组的形状：三棱柱、立方体、直角棱柱、菱面体(rombohedron)、圆柱或椭圆柱(elliptic cylinder)。
在一些实施方案中，每个结构具有至少10微米，例如20、30、40、50、60、70、80、90或100微米，或甚至更多，例如200或300微米的高度。
在一些实施方案中，装置包含与基底偶联的冷却装置，其中冷却装置配置为将微流体装置冷却至约0和15摄氏度之间的温度。
在一些实施方案中，颗粒簇中的颗粒包括细胞，例如白细胞、红细胞、肿瘤细胞，例如循环肿瘤细胞(CTC)、胎儿细胞、上皮细胞，或珠，例如磁珠或聚合物珠，例如与细胞结合的珠。
在另一个方面，本公开内容的主题可以体现在使用微流体装置自流体样品分离颗粒簇的方法，其中该方法包括沿着第一方向使流体样品流过微流体装置中的多个颗粒簇捕捉区，其中每个颗粒簇捕捉区包含排列成限定输入流动路径的多个结构，所述输入流动路径通过颗粒簇捕捉区中的结构之一的分开障碍而相等分成两个输出流动路径，容许来自流体样品的颗粒簇在颗粒簇捕捉区之一中的分开障碍处被俘获，并且沿着与第一方向相反的第二方向使第二流体流过多个颗粒簇捕捉区以释放俘获的颗粒簇。
方法可以包括一个或多个下述特征。例如，在一些实施方案中，颗粒簇包括细胞簇。细胞簇可以是循环肿瘤细胞(CTC)簇。
在一些实施方案中，流体样品进一步包含个体颗粒，并且个体颗粒在流体样品流过期间通过多个颗粒簇捕捉区，而不被颗粒捕捉区的分开障碍俘获。个体颗粒可以包括红细胞和/或白细胞。
在一些实施方案中，对于每个颗粒簇捕捉区，两个外出流体流以小于或等于90度的角度分开。
在一些实施方案中，方法进一步包括将微流体装置冷却至流体样品的冷冻温度和约15摄氏度之间的温度。
在一些实施方案中，流体样品通过多个颗粒簇捕捉区的总体流速小于约250ml/hr，例如200、150、100、100、50或25ml/hr。
在一些实施方案中，对于每个颗粒簇捕捉区，流体样品通过颗粒簇捕捉区的流速小于约10微升/hr，例如9、8、7、6、5、4、3、2或1微升/hr。
在一些实施方案中，对于每个颗粒簇捕捉区，流体样品通过每个外出流体流的剪切流小于约10、20、30、40或50s-1。
在一些实施方案中，颗粒簇包含第一类的两个或更多个颗粒的簇，且结构亚组进一步排列为使得每个输出流动路径具有足够大的横截面，从而容许第一类的单一颗粒的通过，并且禁止颗粒簇的通过。
出于本公开内容的目的，颗粒簇理解为意指例如通过化学键(例如离子键、共价键、范德华力等)、磁力、和/或静电力保持在一起的两个或更多个颗粒的组。
出于本公开内容的目的，个体颗粒理解为意指不与其它颗粒保持在一起的颗粒。
出于本公开内容的目的，分开障碍理解为意指作为颗粒簇捕捉区的一部分，并且为了保留颗粒簇而定尺寸并且定位的结构或的结构部分，例如边缘。分开障碍位于两个出口流动路径之间的颗粒簇捕捉区中。
本文中描述的主题的实施方案可以包括几个优点。例如，可以使用本文中描述的装置在不需要抗体-抗原反应的情况下俘获并分离细胞簇。因而，可以在无需担心此类抗体-抗原反应会改变细胞行为的情况下研究细胞簇。另外，一旦俘获，可以在不需要使用高剪切力或可能扰乱或损害细胞天然状态的其它技术的情况下容易地取出分离的细胞簇。此外，通过相对于环境，降低装置的温度以及如此流体样品和流体样品内的颗粒的温度，可以降低非特异性结合的发生，这可以导致分离的细胞或细胞簇的纯度的升高。
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然可以在本发明的实施或测试中使用与本文中描述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料，但是下文描述了合适的方法和材料。通过提及完整收录本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献。在冲突的情况下，应当以本说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实施例仅是例示性的，而并不意图为限制性的。
本发明的其它特征和优点从以下详细描述以及从权利要求书看会是明显的。
附图简述
图1A是显示用于分离颗粒簇的微流体装置的例子的示意图。
图1B-1D是显示使用微流体装置分离颗粒簇的三种不同阶段的示意图。
图2是显示微流体装置的颗粒簇捕捉区的顶视图的示意图。
图3是显示对颗粒簇捕捉区中的颗粒簇的作用力和颗粒簇捕捉区中的流体速度的示意图。
图4A-4C是示意图，其显示了结构具有不同外形(profile)的颗粒簇捕捉区的几个例子。
图5是微流体装置的扫描电子显微镜照片，所述微流体装置包含多个颗粒簇捕捉区中排列的三角形结构。
图6是微流体芯片的照片，所述微流体芯片制作为包含多个微流体通道，其导致具有颗粒簇捕捉区的芯片上的不同区域。
图7是示意图，其显示了在冷却的情况下使用含有颗粒簇捕捉区的微流体装置以改善簇回收和纯度的方案。
图8是显示经由含有颗粒簇捕捉区的微流体装置在血液样品的不同总体流速时自血液样品捕获簇的速率的图。
图9是显示患者百分比的图，使用含有颗粒簇捕捉区的微流体装置发现所述患者在其血液中具有癌性细胞簇。
图10是显示自微流体装置的颗粒簇捕捉区的细胞簇的释放速率的图。
图11是示意图，其显示了于室温和4摄氏度使缓冲溶液通过装置后装置的颗粒簇捕捉区。
图12是显示用具有颗粒簇捕捉区的微流体装置处理的细胞(“释放后”)和不在微流体装置中处理的细胞(“掺杂(spike)前”)的细胞存活力的图。
发明详述
图1A是显示能够自流体样品分离颗粒簇的微流体装置100的例子的示意图。装置100包含基底102，在该基底上排列多个柱样结构106。具体地，柱样结构106排列为在基底102的最上表面上形成多个簇捕捉区104。在装置100的运行期间，使用者将含有一个或多个颗粒簇110(例如循环肿瘤细胞簇)的流体样品108(例如血液)导入装置100中，使得流体样品流过颗粒簇捕捉区104。捕捉区102内的每个簇捕捉区104包含漏斗(funnel)部分，其将流体样品的引入流体流指引入两个分开的开口中以形成两个外出流体流。每个颗粒簇捕捉区104中的开口在区104内的柱样结构106之一的分开障碍周围排列。由于流体样品中的颗粒簇110流入颗粒簇捕捉区104之一的漏斗部分中，颗粒簇可以在锐利边缘处被俘获。由于包括摩擦力和剪切流力在内的力的平衡，颗粒簇在分开障碍上就地保持。然而，缺口可以仍然在颗粒簇捕捉区104的开口中，其容许个体颗粒(即不成簇保持在一起的颗粒，诸如白细胞和/或红细胞)以继续通过而不被俘获。如此，多个颗粒簇捕捉区104充当滤器，其分离颗粒簇与流体样品中的个体颗粒。在一些实施方案中，在分开障碍的任一侧形成流动路径的结构可以排列为使得那些流动路径中的每个具有足够大的横截面，从而容许单一类型的单一颗粒的通过，并且禁止第一类的颗粒的簇的通过。在流体样品108通过颗粒簇捕捉区104并且俘获一个或多个颗粒簇110后，可以反转流体流过装置100(使用相同的初始流体样品或不同流体)以释放颗粒簇捕捉区104中俘获的颗粒簇。
图1B-1D是一系列的三幅示意图，其显示了用于分离颗粒簇的方法的不同阶段时图1A的微流体装置的顶视图。在第一个“簇俘获”阶段中(图1B)，沿着第一方向将含有颗粒簇110的流体样品(例如血液)导入在多个颗粒簇捕捉区104中排列的结构106。然后，在簇颗粒捕捉区中俘获一个或多个颗粒簇110。在使流体样品流过结构后，在“清洗”阶段期间沿着与流体样品相同的方向用第二溶液(例如缓冲溶液)清洗装置100以自装置100清除流体样品(参见图1C)。随后，在“释放”阶段期间以相反方向使第三溶液(例如另一种缓冲溶液)通过结构106以释放俘获的颗粒簇110(参见图1D)。然后，可以收集释放的颗粒簇用于进一步研究。在一些实施方案中，避免包括以相反方向使溶液通过以释放俘获颗粒簇的第三阶段，并且在捕捉装置自身中研究俘获的颗粒簇。或者，分离和俘获颗粒簇的目的是自流体样品取出颗粒簇以转而研究个体颗粒。
图2是图1A的簇捕捉区104之一的顶视图。一般地，装置100中的其它颗粒捕捉区具有相同的排列，如图2中显示，并且以重复的样式定位于基底102的最上表面上。如此，颗粒簇捕捉区104含有装置100中的结构106的亚组。在本例子中，颗粒簇捕捉区104包含三个结构106a、106b、106c，其限定了分成两个输出流动路径202a，202b的输入流动路径200。亚组中的两个结构(106a，106b)在第一行中(例如在簇捕捉区104的顶部)排列，而第三个结构106c在与第一行相邻的第二行中(例如在簇捕捉区104的底部)排列。为了形成每个颗粒簇捕捉区104，装置的结构106排列成两行或更多行(参见图1A)，其中每个后续行中的结构与前一行中的结构是侧向偏移的。
第一行中的两个结构106a，106b限定漏斗区206，其指引输入流动路径200和输入流动路径200内含有的颗粒朝向输出流动路径202a，202b。也就是说，结构106a，106b的壁排列为使得输入流动路径200的宽度从捕捉区104的顶部向底部区106c变窄(即第一三棱柱结构106a的一个角与第二三棱柱结构106b的一个角相邻排列)。
顶部结构106a和106b之间的间隔或缺口以底部结构106c的分开障碍204分开以形成两个分开的开口206a，206b。一般地，分开障碍204基本上在顶部两个结构106a，106b之间的缺口中心对齐(align)。每个开口通向输出流动路径202a，202b之一。如此，由于输入流动路径200朝着结构106c的分开障碍204行进，流动路径200大致均匀在两个流动路径202a，202b之间分开。由于颗粒簇250沿着输入流动路径200行进，它会到达结构106c的分开障碍204，并且由于在该点处摩擦力(例如源自结构106a、106b、106c中的一个或多个)和剪切流力(例如源自流体流动)的平衡而被俘获。
图3是显示颗粒簇捕捉区的部分的顶视图的示意图，其上覆盖了描绘影响颗粒簇350的不同力的箭头。图3中显示了区的顶行中的三棱柱结构106a，106b中每个的仅一半，而图3中显示了底行的整个三棱柱结构106c。另外，使用热图显示了三角形结构间的区域以描绘经过颗粒簇捕捉区的流体流速如何随位置而变化的例子。在本例子中，流速从0变化至60μm/sec，尽管流速的其它范围也是可能的。
当颗粒簇350到达底部三棱柱结构106c的分开障碍时，由于图3中显示的力的动态平衡，在分开障碍处俘获颗粒簇350。这些力包括：摩擦力FF，其由于接触顶行中的三角形结构106a，106b的侧面的颗粒簇350而产生；剪切力FD(又称作曳力)，其源自流体沿着输出流动路径的剪切流；和由于三棱柱结构的角/壁的存在所致的反应力FR。由于底部三棱柱结构的分开障碍大致在两个相邻顶部三角形结构之间的缺口中心，由颗粒簇350经历的剪切力FD在两个输出流动路径202a，202b之间是平衡的(参见图2)。因此，防止颗粒簇350被转向到两个开口之一。然而，如果分开障碍不在缺口中心，那么由颗粒簇350经历的剪切流沿着输出流动路径中的一个或另一个会是更大的，这引起颗粒被指引到相应的开口并且可能挤过相应的开口。
在底部三角形结构106c的分开障碍处平衡颗粒簇350的剪切流力外，来自漏斗壁的摩擦力FF限制颗粒簇350的运动。此外，若颗粒簇具有不对称形状，则漏斗壁和颗粒簇350之间的接触抗衡簇350可以经历的扭矩或横向运动。当颗粒簇350与底部结构106c的分开障碍相遇时，由于捕捉区104中的每个结构的一个或多个锐利边缘所致的反应力FR提供针对流体剪切力的抵消力(countervailing force)。当单独的摩擦力大得不足以将颗粒簇350保持为动态平衡时，反应力FR可以平衡剪切力。由于主动流过装置的流体，认为平衡是“动态的”。
值得注意地，具有大体球形形状的个体颗粒在到达底部三棱柱结构106c的分开障碍后会转向到输出流动路径202a，202b中的一个或另一个。这是因为颗粒的圆形形状阻止它获得稳定平衡，从而它滚离分开障碍。比较而言，对颗粒簇作用的不同力可以引起簇中的颗粒间的界面与分开障碍对齐，从而颗粒簇可以保持为稳定平衡。
使力动态平衡以俘获颗粒簇的优点在于可以相对容易地释放颗粒簇。具体地，若仅基于摩擦力捕捉颗粒簇，则将颗粒簇从其俘获位置中逐出会需要相同量的摩擦力。然而，当反转流体流动时(即当流体以与输入流动路径相反的方向流动时)，反应力是缺乏的。如此，逐出俘获的颗粒簇需要的聚合力(aggregate force)小于在正向流动下俘获颗粒簇的聚合力。
图3的热图部分显示了通过颗粒簇捕捉区的流体流动速度的变化。由于输入流动路径在漏斗往下至底部三棱柱结构106c行进，流体可以在其内流动的区域变窄。因此，流体流动速度增加。如图3的例子中显示的，与颗粒簇捕捉区内的最大流体流动速度相应的区域在与每个三棱柱结构的角相遇的地方(即流体流动区最窄的地方)最接近的区域中发生。比较而言，与角相遇的区域更远离，流体流动速度降低，即在流体流动区较宽的地方降低。
虽然图1-3中显示的结构106具有三棱柱形状，但是结构106也可以具有其它形状，只要与颗粒簇相比要作为分开障碍使用的结构的部分是相对较小的(例如角)，以提供可以平衡来自输入流体流动的剪切力的反应力。例如，在循环肿瘤细胞(CTC)(其是约5-25微米)的情况中，分开障碍应当具有约1-2微米的曲率半径(radius of curvature)，使得CTC簇具有沿着至少一个维度的平均大小，其是分开障碍的曲率半径的至少2.5倍。或者/另外，相遇以形成分开障碍的结构的壁相对于彼此可以成小于或等于90度的角度。例如，如果使用等边三棱柱作为结构，那么相遇以形成分开障碍的壁相对于彼此会成60度的角度。在一些实施方案中，分开障碍可以甚至是直边缘，只要相对于俘获的颗粒簇，边缘的长度是短的。因而，如本文中就结构而言使用的，术语“分开障碍”不一定意指达到细点(fine point)的结构部分。
图4是一幅示意图，其显示了颗粒簇捕捉区的几个例子，其中结构具有不同外形(如从装置的顶视图看到，即结构也具有扩展到页中的厚度)。结构可以是菱面体形状(参见图4A，其中顶视图中的结构的外形是菱形形状)，使得菱面体的角充当分开障碍，在该分开障碍上颗粒簇可以由摩擦力、剪切力和反应力平衡。在一些实施方案中，结构可以是非常薄的。例如，图4B显示了颗粒簇捕捉区，其由作为薄直角棱柱的结构构成。直角棱柱结构的短侧可以具有约1至2μm的边缘。图4C是颗粒簇捕捉区的一个例子，其中结构具有圆形外形。圆形的曲率半径是约1-2微米。在图4C的例子中，如此，分开障碍对应于整个结构自身。当使用结构的角作为分开障碍时，优选地，分开障碍的曲率半径是小于10微米，包括例如5微米、2微米、1微米或0.5微米。也可以使用其它曲率半径。在一些实施方案中，每个颗粒簇捕捉区内的所有结构，或者颗粒簇捕捉区中使用的微流体装置内的所有结构具有相同的形状。或者，颗粒簇捕捉区内的结构可以具有不同形状。例如，一些颗粒簇捕捉区可以含有具有三棱柱形状的结构，而其它颗粒簇捕捉区可以含有具有菱面体形状或薄直角棱柱形状的结构。
在另一个例子中，形成颗粒簇捕捉区的分开障碍可以是第一形状(例如三棱柱)，而颗粒簇捕捉区的其它两个结构可以是第二不同形状(例如直角棱柱、菱面体或圆柱体)。在一些实施方案中，每个颗粒簇捕捉区内的所有结构，或微流体装置内的所有结构具有相同的形状和大小。或者，颗粒簇捕捉区内的结构可以具有相同的形状(例如圆柱体、直角棱柱、三棱柱、菱面体、立方体)，但不同大小(例如不同直径、不同体积、不同横截面面积、如沿着与流体样品流动的方向平行或垂直的平面测定的不同面积)。例如，颗粒簇捕捉区中的每个结构可以是圆柱体，但是与分开障碍对应的圆柱体的直径可以小于颗粒簇捕捉区内的其它两个结构的直径。
在一些实施方案中，微流体装置可以包含别的微流体通道，其引导入颗粒簇捕捉区中和/或自颗粒簇捕捉区引导。图5是微流体装置的扫描电子显微镜照片，所述微流体装置包含多个颗粒簇捕捉区中排列的三棱柱结构。照片中的比例尺代表100μm。如图5中显示的，微流体装置还包括与三角形结构流体偶联的一系列微流体通道。具体地，通过第一延长障碍502将入口微流体通道500分成两个别的微流体通道504a，504b，其流入形成多个颗粒簇捕捉区的三棱柱结构中。同样地，颗粒簇捕捉区输出处的两个微流体通道506a，506b合并在一起以围绕第二延长障碍508形成出口微流体通道510。
为了增加流体通量，可以在微流体装置上形成多个微流体通道和含有颗粒簇捕捉区的区域。例如，图6是微流体芯片的例子的照片，所述微流体芯片制作成包括多个微流体通道，其通向具有颗粒簇捕捉区的芯片上的不同区域。使用输入管道600使流体样品流入芯片中。芯片还包含与颗粒簇捕捉区的输出流体偶联的多个微流体通道。使用输出管道602自芯片除去流体。图6的插图显示了可以如何偶联微流体通道与含有多个颗粒簇捕捉区的区域的近视图(close-up view)。因而，通过使用构造，诸如图6的典型装置中显示的构造，可以使用颗粒簇捕捉区过滤较大量的流体样品。
颗粒簇捕捉区中的结构，诸如图1中的结构106的高度/厚度(如从基底102的最上表面起测量的)可以在约10μm至约500μm的范围中，包括例如约50μm、约100μm、约150μm、约200μm、约250μm、约300μm、约350μm、约400μm、或约450μm。也可以使用其它高度。结构106的表面积(如沿着与基底102的最上表面平行的平面测量的)可以在约78μm2至0.125μm2的范围中，包括例如约200μm2、约500μm2、约1000μm2、约5000μm2、约0.01μm2、约0.05μm2、或约0.1μm2。也可以使用其它面积。
参考图2，颗粒捕捉区104中的开口206a，206b的宽度(如沿着与流动路径202a，202b垂直的平面测量的)经常是大致相同的，从而确保源自流过路径202a，202b的剪切力在分开障碍204处俘获的簇颗粒上平衡。可以基于形成要俘获的颗粒簇的分开颗粒的大小设置缺口的宽度。也就是说，宽度可以设置为大致等于构成簇的颗粒之一的直径，从而抑制具有两个或更多个颗粒的簇流过开口206a，206b中的一个或多个。例如，对于由具有约12μm的近似直径的CTC细胞形成的CTC颗粒簇，每个缺口的宽度可以在约8至14μm的范围中，包括例如10μm、11μm、12μm或13μm。对于其它细胞直径，也可以使用其它宽度。然而，在一些情况中，分开障碍204的位置可以偏离缺口中心，从而开口206a，206b的宽度彼此不同。在此类情况中，经过较小开口的剪切流会小于经过较宽开口的剪切流，并且由于对簇应用的力的不平衡，颗粒簇可能不被俘获。
与清洗流体反向应用以释放俘获的簇的速率相比，样品流体通过颗粒簇捕捉区的速率相对较慢。对流体样品使用较慢的流速，从而使得颗粒簇上的剪切力不高得使力会将簇推过颗粒簇捕捉区的输出流动路径。然而，对于释放俘获的颗粒，使用高得多的流速来洗去可能已经与装置壁较弱结合的个体颗粒，并且帮助释放也可能已经与装置壁较弱结合的簇。例如，在捕捉阶段期间流体样品经过含有颗粒簇捕捉区的装置的总体积流动可以例如在约0.1ml/hr至约3ml/hr的范围中，而当释放俘获的簇时缓冲溶液经过装置的总体积流动可以例如在20ml/hr至约250ml/hr中。当然，经由装置的总体积也可以基于装置的流动路径的总体大小和/或数目而增加或减少。通过用总流体流速除以微流体装置中的颗粒簇捕捉区数目测定流体流过每个颗粒簇捕捉区的速率。例如，假设特定的微流体装置包含4000个颗粒簇捕捉区，并且经过装置的总体流速在簇俘获阶段期间是2.5ml/hr，那么经过每个颗粒簇捕捉区的平均流速是约0.625μl/hr。在俘获阶段期间流体样品经过颗粒簇捕捉区的流速可以在例如约0.1μl/hr至约10μl/hr的范围中，包括0.5μl/hr、1μl/hr、2μl/hr、4μl/hr、6μl/hr或8μl/hr。在俘获阶段期间用于流体样品的其它流速也是可能的。流体样品经由颗粒簇捕捉区的流速也对应于剪切力。例如，对于每个颗粒簇捕捉区，在每个输出流动路径中在“捕捉”阶段期间流体样品的剪切流可以小于约50s-1，包括例如40s-1、30s-1、20s-1、10s-1、10s-1、或0.5s-1。也可以使用其它剪切流值。
颗粒簇可以包括细胞，诸如CTC、白细胞、红细胞、白细胞和CTC聚集体、循环上皮细胞(CEC)、浆细胞、巨核细胞、祖细胞、核仁、血红素(生成)细胞、或血红素(生成)细胞亚组。在CTC的情况中，认为细胞簇从肿瘤组织中分离。一般地，CTC中的细胞通过其界面上的化学键而保持在一起，其中此类键可以在组织生成期间形成。在一些实施方案中，颗粒簇包括珠，诸如聚苯乙烯珠或磁珠。可以将珠与抗体缀合，使得它们结合分析物，诸如细胞，和/或彼此结合。
由于装置中的流体的相对较慢流动，在一些实施方案中，重力可以引起来自流体样品的颗粒在与基底的界面附近积累，引起装置的堵塞。为了避免此类堵塞，可以将装置在其侧面放置，使得重力为微流体装置的输出的方向，而不是朝向基底。
处理微流体装置以抑制非特异性颗粒结合
如上文解释，可以使用含有颗粒簇捕捉区的微流体装置自流体样品俘获并随后分离颗粒簇，而不需要颗粒簇结合装置的表面。然而，在一些情况中，其它不想要的颗粒特异性或非特异性结合微流体装置的区域，如此降低分离的颗粒簇的纯度。或者/另外，颗粒簇自身可以非特异性结合微流体装置的部分，使得在以与初始流体样品流动的方向相反的方向使溶液通过后更难以释放俘获的簇。
存在有几种可以用来避免或抑制此非特异性结合的技术。例如，一种用于限制颗粒对微流体装置表面的不想要结合的量的技术包括降低溶液和溶液内含有的颗粒的温度。如果流体样品内的颗粒是细胞，那么较低的温度(相对于环境，例如室温)导致细胞与表面键形成的减少。因而，形成的键越少，结合装置表面的细胞越少。如此，在配置为俘获并分离特定一种或多种细胞类型的微流体装置中，可以减少无意结合装置表面的不想要细胞的数目，如此增加期望细胞的分离纯度。
冷却的技术在含有颗粒簇捕捉区的微流体装置中可以是非常有效的。如本文中解释，颗粒簇捕捉区配置为机械俘获颗粒簇，即基于机械力的平衡。当于室温操作装置时，含有细胞的簇可以与装置的壁活跃形成非特异性结合。因此，当使溶液通过装置以释放俘获的簇时，相对大量的簇的结果是粘于装置表面。然而，当于低于环境室温，但高于装置内的流体样品的冷冻点的温度操作装置时，可以减少非特异性结合装置表面的颗粒簇的数目，这容许从装置回收更大百分比的簇。在簇回收率的增加外，较低的温度还可以降低个体细胞与装置壁的非特异性结合，使回收簇的纯化能够得到改善。
可以改变用于降低非特异性结合的温度，但是应当高于含有颗粒/细胞的溶液的冷冻点并且低于环境室温。例如，温度范围可以介于约0摄氏度和15摄氏度之间，包括例如2℃、4℃、6℃、8℃、10℃、12℃或14℃的温度。也可以使用其它温度。
图7是示意图，其显示了在冷却的情况下使用含有颗粒簇捕捉区的微流体装置以改善簇回收和纯度的方案。如图7中显示，将25℃的流体样品702，如全血导入含有颗粒簇捕捉区的微流体装置100中，如本文中描述的。在本例子中，微流体装置100在与热电冷却单元704的接触中，尽管也可以使用任何可适用的冷却机械。冷却单元704将芯片冷却到4℃。由于装置100相对较薄，假设热量传递过程引起流体和流体内的颗粒也冷却到冷却单元的温度，即约4℃。在运行过程中，然后在第一阶段中(参见图7中的“I-捕捉”)使流体样品通过第一颗粒簇捕捉区。然后，在第二阶段中(参见图7中的“II-清洗”)与流体样品沿着相同的方向使磷酸盐缓冲溶液(PBS)通过颗粒簇捕捉区。最后，在第三阶段中(参见图7中的“III-释放”)以相反的方向使PBS通过颗粒簇捕捉区。在每个阶段期间，于较冷的温度维持装置，从而使簇和/或个体颗粒的结合最小化。
冷却微流体装置以抑制细胞对装置壁的结合的技术不限于本文中描述的装置。取而代之，在寻求细胞结合(非特异性或特异性)的降低的情况下，可以对其它不同微流体装置应用冷却技术。
另外，在冷却微流体装置外或者作为冷却微流体装置的备选，可以使用用于降低细胞和细胞簇的结合的其它技术。例如，在一些情况中，可以用降低细胞结合的涂层材料，例如凝胶涂层材料包被装置运行期间暴露于流体样品的装置的表面。例如，凝胶包被技术，诸如那些由Shah et al.于“Biopolymer System for Cell Recovery from MicrofluidicCell Capture Devices,”Analytical Chemistry,Volume 84,pp.3682-3688(2012)讨论的技术(其通过提及完整收入本文)可以适用于微流体通道的表面和微流体装置的簇颗粒捕捉区。
其它技术包括特定的表面处理，其可以用于使颗粒簇捕捉区中的结构的内部壁的表面对细胞结合有抗性。此类技术是本领域技术人员已知的。
微流体装置制作
作为一个例子，可以使用下述软平版印刷术(soft lithography)方法制备本文中描述的微流体装置(例如微流体装置100)。首先，获得限定装置100的特征的模(mold)。例如，可以通过依照已知的方法使用两个光刻术掩模(photolithography mask)在硅片上应用两层光致抗蚀剂(例如SU8,Microchem,Newton,MA)并序贯形成图案来形成模。掩模可以含有特征，其限定装置100的不同方面，诸如输入微流体通道、颗粒簇捕捉区和输出微流体通道。然后，可以使用具有形成图案的光致抗蚀剂的晶片作为主模来形成微流体部分。然后，将聚合物(例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基甲丙烯酸酯(PMMA)或聚碳酸酯(PC))溶液应用于主模，并固化(例如通过加热)。在固化后，聚合物层凝固，并且可以脱落主模。凝固的聚合物层包含与颗粒簇捕捉区的流体通道和流体路径对应的凹口(recess)。然后，聚合物层与基底(诸如玻璃载玻片)键合。例如，聚合物层的底部表面可以经等离子体处理以增强聚合物的键合特性。然后，将经等离振子处理的聚合物层置于玻璃载玻片上，并且加热以诱导键合。在聚合物与玻璃载玻片键合后，可以将覆盖载玻片(例如玻璃载玻片)与聚合物层的顶部键合以封入微流体通道和颗粒簇捕捉区。在与覆盖物键合前，也可以将接触覆盖载玻片的聚合物层的表面用等离子体处理。
上文描述的微流体装置100的例子包括玻璃的基底层、限定微流体通道和颗粒簇捕捉区的聚合物层、和由玻璃制成的覆盖层。在其它实施方案中，基底层和/或覆盖层可以是聚合物底物或其它类似的材料。
前述技术仅仅是微流体装置的制作方法的一个例子。也可以使用其它技术。例如，可以使用诸如热压纹(hot embossing)、LIGA、或注射模塑(injection molding)等技术来制作包含颗粒簇捕捉区的微流体装置的一层或多层。
微流体学(microfluidics)
在一些实施方案中，本文中描述的微流体装置的微流体通道和/或颗粒簇捕捉区是较大的、任选的微流体通道网络的部分。可以使用此类微流体网络来促进小体积液体的控制和操作(例如分离，分开)，并且帮助自复杂的亲本样本分离靶分析物。在分离过程期间，微流体元件提供至关重要的功能，例如处理生物学流体或者可再现混合磁性颗粒与样品。关于微流体通道网络及其制作的更多信息可以参见例如美国专利申请公开文本No.2011/0091987，美国专利No.8,021,614，和8,186,913，每篇通过提及完整并入本文。
应用
例如，生物学研究中越来越需要操作和分离靶颗粒和细胞群体的更准确且有效的方法。范围从免疫学和癌症医学至干细胞生物学的纪律高度依赖于鉴定特定颗粒和细胞亚组的未污染的群体以进行详细表征。在临床上，出于诊断目的，微生物学家常规分离细菌细胞和白细胞亚组。可以在癌症患者的循环血液中发现肿瘤抗原特异性调节T细胞，呈现了用于转移性黑素瘤的免疫疗法的新潜在靶物。环境感测需要对水、食物和饮料加工监督特定细菌细胞污染。疫苗开发人员在很大程度上用抗原特异性T淋巴细胞(罕见的细胞，其可以彼此相差仅仅细胞表面上呈递的肽片段中的单个氨基酸)工作。在这些不同应用中，呈现了常见的问题：需要分离、分开并表征异质的复杂流体内存在的细胞亚群。在这些样品的加工期间，必须非常小心处理靶细胞群体，防止细胞的生理学状态变化以容许后续的表达序型分析和分子研究。此外，感兴趣的细胞可以以极低频率存在，经常是在10,000,000个细胞中的小于1个细胞(对于循环肿瘤细胞或疾病特异性T淋巴细胞)，这增加了挑战的复杂性。
可以使用本文中描述的含有颗粒簇捕捉区的装置作为分离流体样品中找到的细胞簇的手段以进行上文提及的研究和分析。例如，在一些实施方案中，自患者提取的血液样品可能含有或不含许多循环肿瘤细胞(CTC)簇，该循环肿瘤细胞(CTC)簇可以指示患者中癌症转移的发生。对鉴定CTC簇的存在感兴趣的使用者可以使用微流体装置来分离血液样品中存在的CTC簇与个体细胞(例如个体白细胞或个体红细胞)，其不是簇的一部分。一旦已经分离出细胞簇，然后使用者可以对分离的簇进行分析(例如计算血液样品中存在的CTC簇的数目以诊断患者，以研究疾病进展，或者研究患者对治疗的响应)。本文中描述的装置不限于牵涉分离CTC簇的用途，并且可以在一大批应用中使用，所述应用需要颗粒簇的计数、分选、浓缩和排序(ordering)或者自流体样品除去不想要的颗粒簇。
如此，本文中描述的系统和方法提供了可以连续且以高速率分选、分离、计数和分析罕见细胞(诸如CTC簇)的方式。可以以至少两种不同方式观察特定细胞簇是否是罕见的细胞簇。在将细胞簇表征为罕见的第一种方式中，罕见细胞簇可以说成是不以给定样品的相当大的分数天然存在的任何细胞。例如，对于人或哺乳动物(manlillalian)血液，罕见细胞簇可以是除了受试者的正常血液细胞(诸如非癌性红细胞和非癌性白细胞)外的任何细胞簇。在此观点中，会认为血液中存在的癌症或其它细胞是罕见的细胞。在将细胞簇表征为罕见的第二种方式中，可以考虑细胞簇在样品中出现的频率。例如，罕见的细胞簇可以是以每ml血液约1至50个细胞的频率出现的细胞簇。或者，含有非罕见细胞的给定群体内罕见的细胞簇频率可以包括但不限于100个细胞中的小于约1个细胞簇的频率；1,000个细胞中的1个细胞簇；10,000个细胞中的1个细胞簇；100,000个细胞中的1个细胞簇；1,000,000个细胞中的1个细胞簇；10,000,000个细胞中的1个细胞簇；100,000,000个细胞中的1个细胞簇；或者1,000,000,000个细胞中的1个细胞簇。
实施例
在下述实施例中进一步描述本发明，所述实施例不限制权利要求书中描述的本发明的范围。
如下进行获得下述实施例中讨论的数据的实验。首先，如下制作微流体通道和颗粒簇捕捉区的模，首先使用软平版印刷术用SU-8和掩模将通道和捕捉区设计蚀刻到硅主体(silicon master)中。然后，将未硬化的PDMS倒到膜上，并且于65℃硬化约8小时。然后，将含有通道轮廓的PDMS与玻璃基底键合。对于每个装置，在与基底键合前用O2等离子体处理PDMS。将覆盖玻璃与PDMS层的表面键合。覆盖层包括开口，其可以分别与入口微流体通道和出口微流体通道流体偶联。然后，将入口和出口管偶联于覆盖层中的开口。
进行两类实验：用于表征装置性能的掺杂细胞实验以及鉴定患者样品中的CTC簇。在掺杂细胞实验中，使用癌细胞系诸如LNCaP、H1650、MDA-MB-213细胞系创建人工细胞簇。用细胞示踪剂荧光探针染色这些人工簇，并且掺入自健康供体获得的全血中。然后，使用芯片加工掺入的血液。在需要精确控制流速(例如以测定流速对CTC簇捕捉率的影响)的实验中，可以使用注射泵，其可以精确控制体积流速。在其它掺杂细胞实验中，使用恒定的压力源，其中流速控制不是至关重要的。在加工掺杂血液后，以2.5ml/hr用磷酸盐缓冲溶液清洗芯片达1小时。然后，使用荧光显微镜进行细胞的成像和计数以表征芯片。
在用于鉴定来自患者样品的CTC簇的实验中，使用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管自患者收集血液。对于这些实验，使用恒定压力源，并且设置为0.43psi。此压力大致给出2.5ml/hr体积流速，但是随血液血流比容计(hematocrit)/粘性而变化。不断摇动血液样品以防止血液沉降和凝固。使用微流体芯片加工血液，然后以2.5ml/hr用磷酸盐缓冲溶液清洗1小时。为了进行免疫染色，首先在4％低聚甲醛(PFA)中固定细胞，然后使用混合抗体染料对核、白细胞和CTC染色。然后，使用荧光显微镜对染色的CTC簇成像。当细胞要从芯片中释放时，通过转换入口和出口管道反转溶液流动。对于释放实验，在热电冷却仪上操作仪器以增加CTC簇释放过程的效率。在一些释放实验中，在芯片上在表面肿瘤标志物方面染色细胞，之后释放它们，从而可以容易地鉴定CTC簇。
实施例1：簇捕捉率
图8是显示经由含有颗粒簇捕捉区的微流体装置在血液样品的不同总体流速时自血液样品捕获CTC簇的速率的图。如图8中显示，随着经过装置的流体样品的总体流速增加，装置对细胞簇的捕捉效率降低，尤其是对于较小尺寸的簇(即含有较少细胞的簇)。这是因为由簇经历的剪切力在大流速时高得多，从而较小的簇被“推”过颗粒簇捕捉区中的开口，而不是被机械力平衡。如图8的图中显示的，较小的总体流速更好地适合于实现高捕捉效率。具体地，当此类簇具有5或更多个细胞时，低至2.5ml/hr的流速适合于捕捉100％颗粒簇。
实施例2：簇检测技术的比较
图9是显示使用含有颗粒簇捕捉区的微流体装置发现在其血液中具有CTC簇的患者百分比的图。从具有转移性癌症的患者和没有转移性癌症的患者抽取血液样品。经由免疫染色鉴定CTC簇，并且使用荧光显微术手动或用自动化扫描系统计数。如可以从这些结果看到，本文中描述的微流体装置可用于鉴定来自流体样品的细胞簇。
实施例3：CTC簇释放
图10的图显示了“释放”阶段后自微流体装置的颗粒簇捕捉区的CTC簇的释放率，在所述释放阶段期间以相反方向使缓冲溶液流过装置。于室温(介于约20和23℃之间)用微流体装置和用冷却至4摄氏度的装置进行实验。如图10中显示的，仅当缓冲溶液的相反流速于室温达到250ml/hr时，俘获簇的释放率确实达到接近40％。另一方面，当使装置变冷时释放率有显著增加，当以250ml/hr使缓冲溶液流过装置时显示多达80％释放率。如此，装置的冷却可以是一种可用于降低细胞结合的技术。
图11是示意图，其显示了当于室温使缓冲溶液流过装置时和在于4摄氏度使缓冲溶液流过装置时在释放阶段后的颗粒簇捕捉区。如与室温过程对应的示意图中显示，大量的CTC簇由于对微流体装置表面的非特异性结合而仍然粘住。比较而言，与冷却过程对应的示意图显示了与装置保持结合的非常少的细胞簇。照片右侧的图显示了自于室温和4摄氏度操作装置获得的相对产物纯度。如可以从图中看到，将装置冷却到4摄氏度可以显著改善俘获的细胞簇的纯度。
实施例4：细胞存活力
图12是显示用具有颗粒簇捕捉区的微流体装置处理的细胞(“在释放后”)和不在微流体装置中处理的细胞(“掺杂(spike)前”)的细胞存活力的图。使用来自LifeTechnologies的LIVE/细胞存活力测定法测定细胞存活力。如可以从此图中看到，通过装置后存活的细胞正如那些没有导入装置中的细胞的活细胞数目一样多。
其它实施方案
应当理解，虽然本发明已经结合其详细描述进行了描述，但是前述描述意图例示而不限制本发明的范围，其以所附权利要求书的范围限定。其它方面、优点和修改在所附权利要求书的范围内。

Claims (23)

1.一种微流体装置，其包含：
基底，其限定入口和出口；
结构组，其在所述入口和所述出口之间在所述基底上排列以形成多个颗粒簇捕捉区，
其中每个颗粒簇捕捉区包含排列成限定输入流动路径的结构亚组，所述输入流动路径通过所述颗粒簇捕捉区中的结构之一的分开障碍而分成两个输出流动路径，且
其中每个颗粒簇捕捉区的所述结构亚组进一步排列为使得每个输出流动路径具有足够大的横截面，从而容许第一类的单一颗粒的通过，并且禁止所述第一类的两个或更多个颗粒的簇通过，和
当所述簇沿着所述输入流动路径行进时，所述簇到达所述分开障碍并由于源自所述亚组的结构的摩擦力和剪切流力的平衡而被俘获；和
多个微流体通道，其在所述基底上限定以将流体从所述入口指引到所述颗粒簇捕捉区的所述输入流动路径以及从所述颗粒簇捕捉区的所述输出流动路径指引到所述出口。
2.权利要求1的微流体装置，其中所述结构排列成两行或更多行，其中每行中的所述结构与相邻行中的所述结构是侧向偏移的，以形成所述多个颗粒簇捕捉区。
3.权利要求2的微流体装置，其中结构的亚组包括排列成两行的三个三棱柱结构，其中第一和第二三棱柱结构在第一行中排列，所述第一三棱柱结构的一个角与所述第二三棱柱结构的一个角相邻排列以限定它们之间的输入流动路径，并且第三三棱柱结构与所述第一行中的所述第一和第二三棱柱结构偏移在第二行中排列，从而所述第三三棱柱结构的锐利边缘在位于所述第一行中的所述第一和第二三棱柱结构的相邻角之间排列，其中所述分开障碍是所述第三三棱柱结构的锐利边缘。
4.权利要求3的微流体装置，其中所述第一类的颗粒是细胞，并且所述第三三棱柱结构的所述锐利边缘在所述第一和第二三棱柱结构的相邻角之间大致居中，并且所述第一和第二三棱柱结构的相邻角中每个与所述第三三棱柱结构的所述锐利边缘之间的距离是至少10微米。
5.权利要求1的微流体装置，其中所述分开障碍具有小于10微米的角半径。
6.权利要求1的微流体装置，其中形成所述分开障碍的结构的壁以小于或等于90度的角度相遇。
7.权利要求1的微流体装置，其中所有所述结构具有相同的横截面形状。
8.权利要求1的微流体装置，其中所述结构组中的结构包含两种或更多种不同横截面形状。
9.权利要求1的微流体装置，其中一个或多个所述结构具有选自下组的横截面形状：三角形、菱形或圆形。
10.权利要求1的微流体装置，其中每个结构具有至少10微米的高度。
11.权利要求1的微流体装置，其进一步包含与所述基底偶联的冷却装置，其中所述冷却装置配置为将所述微流体装置冷却至0和15摄氏度之间的温度。
12.权利要求1的微流体装置，其中所述颗粒簇中的所述第一类的颗粒包含细胞或与细胞结合的珠。
13.一种使用微流体装置从流体样品分离颗粒簇的方法，所述方法包括：
沿着第一方向使所述流体样品流过微流体装置中的多个颗粒簇捕捉区，其中每个颗粒簇捕捉区包含排列成限定输入流动路径的多个结构，所述输入流动路径通过所述颗粒簇捕捉区中的结构之一的分开障碍而分成两个输出流动路径；
由于源自所述结构的摩擦力和剪切流力的平衡，容许来自所述流体样品的颗粒簇在所述颗粒簇捕捉区之一中的所述分开障碍处被俘获；并且
沿着与所述第一方向相反的第二方向使第二流体流过所述多个颗粒簇捕捉区以释放俘获的颗粒簇。
14.权利要求13的方法，其中所述颗粒簇包含细胞簇。
15.权利要求14的方法，其中所述细胞簇是循环肿瘤细胞(CTC)簇。
16.权利要求13的方法，其中所述流体样品进一步包含个体颗粒，并且所述个体颗粒在所述流体样品流过期间通过所述多个颗粒簇捕捉区，而不被所述颗粒捕捉区的所述分开障碍俘获。
17.权利要求16的方法，其中所述个体颗粒包含红细胞和/或白细胞。
18.权利要求13的方法，其中对于每个颗粒簇捕捉区，两个外出流体流以小于或等于90度的角度分开。
19.权利要求13的方法，其进一步包括将所述微流体装置冷却至所述流体样品的冷冻温度和15摄氏度之间的温度。
20.权利要求13的方法，其中所述流体样品通过所述多个颗粒簇捕捉区的总体流速小于250ml/hr。
21.权利要求13的方法，其中对于每个颗粒簇捕捉区，所述流体样品通过所述颗粒簇捕捉区的流速小于10微升/hr。
22.权利要求13的方法，其中对于每个颗粒簇捕捉区，所述流体样品通过每个所述输出流动路径的剪切流小于50s-1。
23.权利要求13的方法，其中所述颗粒簇包含第一类的两个或更多个颗粒的簇，且其中所述结构亚组进一步排列为使得每个输出流动路径具有足够大的横截面，从而容许第一类的单一颗粒的通过，并且禁止颗粒簇的通过。
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