CN115055216B - 捕获CTCs的微流控芯片组及基于高光谱的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种捕获CTCs的微流控芯片组及基于高光谱的检测方法，微流控芯片组包括捕获芯片和富集芯片，捕获芯片包括第一捕获部和第二捕获部，第一捕获部顶面和底面之间设置有若干分别与第一捕获部侧面平行的第一滤层，第一滤层有若干微柱等间隔排列而成，微柱的顶端和底端分别与第一捕获部顶面和底面固定连接，第二捕获部的一侧面和与第一滤层平行的第一捕获部相连通，不与第一滤层相交的第一捕获部的两个侧面相交处开设有第一进口，第一进口与相近的第一滤层相连通；本发明能够克服现有技术中无法找到CTCs特征光谱，CTCs捕获率不高的不足，能够获得CTCs特征光谱，提高了CTCs的捕获率，避免个别CTCs被遗漏。
Description
技术领域
本发明涉及生物物理技术领域，特别是涉及一种捕获CTCs的微流控芯片组及基于高光谱的检测方法。
背景技术
癌症，又名恶性肿瘤。是危害人类生命健康，全世界上导致人类死亡的第一大恶疾。癌症具有细胞分化和增殖异常、生长失去控制、浸润性和转移性等生物学特征。90％的癌症病人死于癌转移。攻克癌症是人类一项艰巨的任务。传统的治疗方法为手术治疗、化学治疗、放射线治疗、靶向治疗和免疫治疗等。传统的方法成本高，复杂，给病人带来较大痛苦且具有复发性。循环肿瘤细胞(CTCs)是从原生瘤脱落，进入血液循环系统中的肿瘤细胞。这些肿瘤细胞会在一个适合生长的地方滋生滋长，发展为新的瘤。称为癌转移。循环肿瘤细胞携带与原生瘤及其相似的成分，CTCs数目与癌症病人的病情相关，数目多，肿瘤严重，数目少，病情轻。因此，CTCs对肿瘤预后，早期诊断和抗癌治疗有着至关重要的作用。
高光谱图像集样本的图像信息与光谱信息于一体。图像信息可以反映样本的大小、形状、缺陷等外部品质特征，非常适合细胞形态的观测。由于不同成分对光谱吸收也不同，在某个特定波长下图像对某个缺陷会有较显著的反映，而光谱信息能充分反映样品内部的物理结构、化学成分的差异。因此光谱信息能够反映肿瘤细胞的构成成分如基因和蛋白质。高光谱对肿瘤细胞的分子基因学检测具有重要作用。
目前CTCs检测中人们使用的是表面拉曼散射增强(SERS)。制作纳米粒子，连接CTCs。(1)该纳米粒子如AuNP-MBA-rBSA-FA，或者磁性纳米粒子SPION-PEI@AuNPs-MBA-rBSA-FA。纳米粒子里的MBA是个拉曼报告分子。而纳米粒子最外层FA(叶酸)能够被绝大多数肿瘤细胞识别，因为接大多数肿瘤细胞过表达FR，FA和FR匹配，所以这样制作的纳米粒子能够连接绝大多数肿瘤细胞。SERS测得的是具有一点肿瘤特征的纳米粒子的光谱，而不是肿瘤细胞或CTCs(循环肿瘤细胞)特征光谱。(2)纳米粒子的制作相当复杂，而且只能检测纳米粒子最外层FA识别的肿瘤细胞，对于其他肿瘤细胞识别不了，具有局限性。不如高光谱直接检测肿瘤细胞，尤其是病人血液中循环肿瘤细胞(CTCs)特征光谱高效直接。(3)因为SERS检测的是纳米粒子的光谱信号，信号强度随每个细胞连接纳米粒子数量的不同会有所差别，所测得的信号强度与肿瘤细胞数量之间的关系不可靠，不足以令人信服。(4)高光谱检测是肿瘤病人血样中每一个肿瘤细胞的特征光谱。信号来自于病人血液中的循环肿瘤细胞，CTCs。因此信号真实反映循环肿瘤细胞数量，真实、可信。
微流控芯片尺寸小，与细胞尺寸匹配，可携，所需消耗试剂量小，在科研与生产中具有广泛应用。微流控芯片捕获循环肿瘤细胞应尽可能满足4个要求：高捕获率，捕获住肿瘤病人血样中每一个肿瘤细胞；高纯度，捕获的CTCs受血细胞(白细胞和红细胞)干扰小；高通量，高效快速分离出CTCs；高活性，捕获的肿瘤细胞能够培养，以便开展分子基因学的分析。
目前微流控芯片分离捕获循环肿瘤细胞主要分为两类：亲和性，在微流控芯片的微通道和微结构上修饰抗体anti-EpCAM(抗上皮粘附分子)或适配体。利用抗原于抗体的结合捕获CTCs。2007，哈佛医学院的Sunith Nagrath课题组设计了78,000圆柱形微流控芯片，利用抗原与抗体的结合捕获了100多个肿瘤病人血样里的CTCs。为了提高CTCs与微结构的碰撞几率，Stott设计了Herringbone-chip，鱼骨形的微结构。氧化石墨烯芯片，3D氧化石墨烯芯片，OncoBean芯片都是利用该原理。但该方法结构设计复杂，抗体十分昂贵。
目前唯一应用于临床的只有得到美国FDA认证的Cell Search。仅局限于乳腺癌，结直肠癌和前列腺癌。还有可能的非上皮细胞或非肿瘤上皮细胞的上皮表达所致的假阳性结果。该方法也存在半自动，高成本，低效率的缺陷。所以生产一台简单高效的CTCs高光谱产品迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的是提供一种捕获CTCs的微流控芯片组及基于高光谱的检测方法，以解决上述现有技术存在的问题，能够克服现有技术中无法找到循环肿瘤细胞特征光谱，肿瘤细胞捕获率不高的不足，可以根据需求对循环肿瘤细胞特征光谱的高光谱检测，捕获方法进行结合选用，获得了CTCs特征光谱，提高了CTCs的捕获率，避免个别肿瘤细胞被遗漏。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
一种捕获CTCs的微流控芯片组，所述微流控芯片组包括捕获芯片和富集芯片，所述捕获芯片包括第一捕获部和第二捕获部，所述第一捕获部和所述第二捕获部分别为三棱柱壳体结构，所述第一捕获部顶面和底面之间设置有若干分别与所述第一捕获部侧面平行的第一滤层，所述第一滤层有若干微柱等间隔排列而成，所述微柱的顶端和底端分别与所述第一捕获部顶面和底面固定连接，所述第二捕获部的一侧面和与所述第一滤层平行的所述第一捕获部侧面相连通，不与所述第一滤层相交的所述第一捕获部的两个侧面相交处开设有第一进口，所述第一进口与相近的第一滤层相连通；所述富集芯片的进口承接所述捕获芯片过滤后的缓冲液。
优选的，所述第二捕获部顶面和底面之间固接有若干异形块；若干所述异形块将所述第二捕获部内腔分隔为若干微通道，所述微通道内固接有若干星型柱，若干所述星型柱顶面和底面分别与所述第二捕获部顶面和底面固定连接，若干所述星型柱排列形成若干行和若干列；若干所述微通道一端和与所述第一滤层平行的所述第一捕获部侧面相连通，若干所述微通道的另一端相互连通形成第一出口。
优选的，一半层数的靠近所述第一进口的所述第一滤层的所述微柱之间的间隙为15微米，另一半层数的若干所述第一滤层的所述微柱之间的间隙为10，9，8微米。
优选的，所述星型柱截面为四角星结构，相邻两行所述星型柱为一层第二滤层，所述第二滤层中相邻两行之间的最小距离为8微米，所述第二滤层中靠近所述第一滤层的一行中相邻的两个星型柱之间最小距离为12微米，所述第二滤层中远离所述第一滤层的一行中相邻的两个星型柱之间最小距离为5微米。
优选的，所述富集芯片包括富集片，所述富集片中心开设有第二进口，所述第二进口侧壁开设有若干流道，若干所述流道一端连通有若干层相邻的内富集环层，远离所述第二进口的所述内富集环层通过若干所述流道连通有若干层外富集环层，远离所述第二进口的所述外富集环层连通有若干第二出口。
优选的，所述内富集环层和所述外富集环层均由若干T型柱和若干圆形柱组合而成；相邻所述T型柱的最小间隙为5微米，相邻所述T型柱相对的一端分别与所述圆形柱的最小间隙为5微米。
优选的，每层所述第一滤层中的若干所述微柱还围成不低于零个的捕获环，所述捕获环为正六边形结构，所述捕获环中心设置有中心柱。
一种基于高光谱的检测方法，包括如下步骤：
捕获CTCs：将肿瘤病人全血从所述第一进口注入，经过若干“蜂巢”状第一滤层和第二捕获部，得到肿瘤病人全血的过滤液；
反冲洗：以专用的缓冲液冲洗芯片若干次，直到将芯片上的白细胞与红细胞冲洗干净，只剩下CTCs和缓冲液的混合液，提高捕获纯度；
CTCs富集：将反冲洗步骤的混合液不断注入到富集芯片中，以实现对CTCs的富集；CTCs单层、小区域聚集于富集芯片内部。
CTCs检测：将富集芯片放到高光谱图像采集系统中进行拍照检测。
优选的，所述缓冲液冲洗芯片的速度可以在几秒内完成。肿瘤病人全血的注入速度根据捕获芯片获得高捕获效率而定。
优选的，所述富集芯片的光波采集波段为450-750nm，并分为40个波段采集，图像大小为2448*2048，所述高光谱图像采集系统采用K-means无监督和光谱角的办法进行二分类。
本发明具有如下技术效果：
1、本发明中的方法可以直接获得捕获细胞的特征光谱，高光谱技术检测微流控芯片捕获后的循环肿瘤细胞，直接获得该循环肿瘤细胞的特征光谱；
2、本发明中的方法可以分割出捕获细胞的主要结构和具体轮廓，提高平均光谱特征精度。
3、本发明芯片具有高捕获率，基于物理特征的两块芯片的不同位置处捕获，确保了高的捕获效率。
4、本发明能够通过微流控芯片对CTCs捕获，反向冲洗，将获得的CTCs悬液注入收集芯片并富集，即可获得单层、聚集、小区域内的CTCs。
5、本发明芯片实用于基于物理特性的捕获、抗体修饰的捕获与磁性捕获。
6、本发明合理设置微柱间距，确保高捕获率的同时，实现CTCs高纯度，以便于获得清晰的高光谱。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为捕获芯片的主视结构示意图；
图2为第一滤层的局部放大示意图；
图3为图1中B处微通道及星型柱的阵列的放大结构示意图；
图4为图1中A处捕获芯片的放大结构示意图；
图5为富集芯片主视结构示意图；
图6为图5中C处内富集环层局部放大示意图；
图7为采用本发明的方法拍摄的前列腺癌循环肿瘤细胞高光谱图像矩阵示例图；
图8为采用本发明的方法拍摄的前列腺癌循环肿瘤细胞高光谱图像所对应的图像示例图；
图9为本发明中利用聚类方法获得的细胞主要结构示意图；
图10为采用本发明的方法获得的前列腺癌循环肿瘤细胞平均光谱特征示例图；
图11为本发明中利用光谱角方法获得的细胞主要结构示意图；
其中，1、第一捕获部；2、微柱；3、第一进口；4、异形块；5、微通道；6、星型柱；7、第一出口；8、第二进口；9、流道；10、内富集环层；11、外富集环层；12、第二出口；13、T型柱；14、圆形柱；15、捕获环。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
由图1-10所示的一种捕获CTCs的微流控芯片组，微流控芯片组包括捕获芯片和富集芯片，捕获芯片包括第一捕获部1和第二捕获部，第一捕获部1和第二捕获部分别为三棱柱壳体结构，第一捕获部1顶面和底面之间设置有若干分别与第一捕获部1侧面平行的第一滤层，第一滤层有若干微柱2等间隔排列而成，微柱2的顶端和底端分别与第一捕获部1顶面和底面固定连接，第二捕获部的一侧面和与第一滤层平行的第一捕获部1侧面相连通，不与第一滤层相交的第一捕获部1的两个侧面相交处开设有第一进口3，第一进口3与相近的第一滤层相连通；富集芯片的进口承接捕获芯片过滤后的缓冲液。第二捕获部顶面和底面之间固接有若干异形块4；若干异形块4将第二捕获部内腔分隔为若干微通道5，微通道5内固接有若干星型柱6，若干星型柱6顶面和底面分别与第二捕获部顶面和底面固定连接，若干星型柱6排列形成若干行和若干列；若干微通道5一端和与第一滤层平行的第一捕获部1侧面相连通，若干微通道5的另一端相互连通形成第一出口7。
进一步优化方案，一半层数的靠近第一进口3的第一滤层的微柱2之间的间隙为15微米，另一半层数的若干第一滤层的微柱2之间的间隙按照由第一进口3指向第一出口7逐层递减。。
进一步的，第一滤层优选为6层，靠近第一进口3的3层第一滤层的微柱2之间的间隙为15微米，其余3层的第一滤层的微柱2之间的间隙分别为10微米、9微米、8微米。
进一步的，微柱2的截面形状优选为正六边形。
进一步优化方案，星型柱6截面为四角星结构，相邻两行星型柱6为一层第二滤层，第二滤层中相邻两行之间的最小距离为8微米，第二滤层中靠近第一滤层的一行中相邻的两个星型柱6之间最小距离为12微米，第二滤层中远离第一滤层的一行中相邻的两个星型柱6之间最小距离为5微米。
进一步的，微通道5的侧壁与相近的星型柱6最小间距为12微米。
进一步优化方案，富集芯片包括富集片，富集片中心开设有第二进口8，第二进口8侧壁开设有若干流道9，若干流道9一端连通有若干层相邻的内富集环层10，远离第二进口8的内富集环层10通过若干流道9连通有若干层外富集环层11，远离第二进口8的外富集环层11连通有若干第二出口12。
进一步的，内富集环层10优选设置有3层，外富集环层11优选设置有2层，外富集环层11之间通过若干流道9相连通，内富集环层10和外富集环层11的中心点重合设置。
进一步优化方案，内富集环层10和外富集环层11均由若干T型柱13和若干圆形柱14组合而成；相邻T型柱13的最小间隙为5微米，相邻T型柱13相对的一端分别与圆形柱14的最小间隙为5微米。
进一步的，T型柱13底为40微米，高30微米，圆形柱14直径20微米。
进一步优化方案，每层第一滤层中的若干微柱2还围成不低于零个的捕获环15，捕获环15为正六边形结构，捕获环15中心设置有中心柱。
一种基于高光谱的检测方法，包括如下步骤：
捕获CTCs：将肿瘤病人全血从第一进口3注入，经过若干蜂巢状第一滤层和第二捕获部，得到肿瘤病人全血的过滤液；
反冲洗：以专用的缓冲液冲洗芯片若干次，直到将芯片上的白细胞与红细胞冲洗干净，只剩下CTCs和缓冲液的混合液，提高捕获纯度；
CTCs富集：将反冲洗步骤的混合液不断注入到富集芯片中，以实现对CTCs的富集，并且CTCs单层、小区域聚集于富集芯片内部。；
CTCs检测：将富集芯片放到高光谱图像采集系统中进行拍照检测。
进一步优化方案，缓冲液冲洗芯片的速度与肿瘤病人全血的注入速度相同。
进一步优化方案，富集芯片的光波采集波段为450-750nm，并分为40个波段采集，图像大小为2448*2048，高光谱图像采集系统采用K-means无监督和光谱角的办法进行二分类。
所述高光谱图像采集系统由显微镜、AOTF适配器、SPF型AOTF控制器、1/1.8英寸光学系统、高密度冷却电荷耦合器件探测器(CCD)，数据采集和控制模块，以及电脑组成，其为现有技术，在此不再赘述。
进一步的，循环肿瘤细胞的直径为10微米-20微米，红细胞的直径为4微米-6微米，白细胞的直径为7微米-12微米，由此可见，循环肿瘤细胞与白细胞的尺寸有部分重合，但白细胞相对循环肿瘤细胞容易变形，第一捕获部1的正六边形的微柱2阵列构成的微柱通道(即相邻微柱之间的间隙)利用物理尺寸大小对细胞进行初级筛选，本实施例中第一捕获部的最小的微柱2之间间隙为8微米，流道9内的最小星型柱6之间的捕获间隙为5微米，基于物理特性捕获时，对于尺寸略大、不易形变的循环肿瘤细胞，5微米和8微米的捕获间隙通道用于捕获循环肿瘤细胞；尺寸略小、易形变的血细胞通过间隙通道流走；捕获之后，用缓冲液(PBS)冲洗1-3遍，提高捕获的纯度。
本实施例的工作过程如下：
将肿瘤病人的全血注入第一进口3，经过正六边形的微柱2阵列过滤，然后进入线性的微通道5中的星型柱6的阵列再次过滤，实现CTCs的第二次的捕获。CTCs就被高捕获率地捕获在捕获芯片内。结合图5和图6，本实施例的富集芯片，优选为5层微柱过滤层，即包括3层内富集环层10和2层外富集环层11，内富集环层10和2层外富集环层11均是由T型柱13和圆形柱14组成，内部3层微柱主要富集捕获芯片捕获的CTCs至单层、聚集和小区域。便于高光谱的特征光谱检测。
本实施例的有益效果：
1、本发明的第一捕获部和第二捕获部两部分均设有微柱阵列以实现对循环肿瘤细胞的多次捕获，提高了CTCs的捕获率，避免个别循环肿瘤细胞被遗漏。
2、本发明捕获芯片内设置正六边形微柱结构阵列结构，相邻两层正六边微柱结构交错排列，不同层的第一滤层微柱间距减小。线性的微通道内设置星型柱微结构，相邻4个星形微结构构成一个捕获腔，实现对循环肿瘤细胞的二次捕获。
3、本发明富集芯片通过T型柱和圆形柱阵列结构，将捕获的循环肿瘤细胞单层、聚集、小区域富集在富集芯片上，便于高光谱的特征光谱检测。
4、本发明的高光谱技术检测微流控芯片的方法，包括获取细胞结构和特征光谱两个部分。通过两个部分的结合能实现对肿瘤细胞的准确检测，提高了对CTCs的检测精度，避免特征光谱的失真。
5、本发明的高光谱技术检测微流控芯片的方法，首先通过高光谱图像采集系统拍摄到捕获的细胞后，采用聚类或者光谱角的办法，获得清晰的细胞结构图和分割出细胞所在区域。随后通过平均区域内所有像素点的光谱曲线，获得捕获细胞的光谱特征。通过对光谱特征图的检测，实现对循环肿瘤细胞的判别。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (7)
1.一种捕获CTCs的微流控芯片组，其特征在于，所述微流控芯片组包括捕获芯片和富集芯片，所述捕获芯片包括第一捕获部(1)和第二捕获部，所述第一捕获部(1)和所述第二捕获部分别为三棱柱壳体结构，所述第一捕获部(1)顶面和底面之间设置有若干分别与所述第一捕获部(1)侧面平行的第一滤层，所述第一滤层有若干微柱(2)等间隔排列而成，所述微柱(2)的顶端和底端分别与所述第一捕获部(1)顶面和底面固定连接，所述第二捕获部的一侧面和与所述第一滤层平行的所述第一捕获部(1)侧面相连通，不与所述第一滤层相交的所述第一捕获部(1)的两个侧面相交处开设有第一进口(3)，所述第一进口(3)与相近的第一滤层相连通；第二捕获部内设置星型微柱结构，用于捕获从第一捕获部漏出的CTCs；所述富集芯片的进口承接所述捕获芯片过滤后的CTCs缓冲液；
每层所述第一滤层中的若干所述微柱(2)还围成不低于零个的捕获环(15)，所述捕获环(15)为正六边形结构，所述捕获环(15)中心设置有中心柱；
所述第二捕获部顶面和底面之间固接有若干异形块(4)；若干所述异形块(4)将所述第二捕获部内腔分隔为若干微通道(5)，所述微通道(5)内固接有若干星型柱(6)，若干所述星型柱(6)顶面和底面分别与所述第二捕获部顶面和底面固定连接，若干所述星型柱(6)排列形成若干行和若干列；若干所述微通道(5)一端和与所述第一滤层平行的所述第一捕获部(1)侧面相连通，若干所述微通道(5)的另一端相互连通形成第一出口(7)；
所述富集芯片包括富集片，所述富集片中心开设有第二进口(8)，所述第二进口(8)侧壁开设有若干流道(9)，若干所述流道(9)一端连通有若干层相邻的内富集环层(10)，远离所述第二进口(8)的所述内富集环层(10)通过若干所述流道(9)连通有若干层外富集环层(11)，远离所述第二进口(8)的所述外富集环层(11)连通有若干第二出口(12)。
2.根据权利要求1所述的一种捕获CTCs的微流控芯片组，其特征在于：一半层数的靠近所述第一进口(3)的所述第一滤层的所述微柱(2)之间的间隙为15微米，另一半层数的若干所述第一滤层的所述微柱(2)之间的间隙按照由所述第一进口(3)指向所述第一出口(7)逐层递减。
3.根据权利要求1所述的一种捕获CTCs的微流控芯片组，其特征在于：所述星型柱(6)截面为四角星结构，相邻两行所述星型柱(6)为一层第二滤层，所述第二滤层中相邻两行之间的最小距离为8微米，所述第二滤层中靠近所述第一滤层的一行中相邻的两个星型柱(6)之间最小距离为12微米，所述第二滤层中远离所述第一滤层的一行中相邻的两个星型柱(6)之间最小距离为5微米。
4.根据权利要求1所述的一种捕获CTCs的微流控芯片组，其特征在于：所述内富集环层(10)和所述外富集环层(11)均由若干T型柱(13)和若干圆形柱(14)组合而成；相邻所述T型柱(13)的最小间隙为5微米，相邻所述T型柱(13)相对的一端分别与所述圆形柱(14)的最小间隙为5微米。
5.一种基于高光谱的检测方法，基于权利要求1-4任意一项所述的一种捕获CTCs的微流控芯片组，其特征在于：包括如下步骤：
捕获CTCs：将肿瘤病人全血从所述第一进口(3)注入，经过若干第一滤层和第二捕获部，得到肿瘤病人全血的过滤液；
反冲洗：以专用的缓冲液冲洗芯片若干次，直到将芯片上的白细胞与红细胞冲洗干净，只剩下CTCs和缓冲液的混合液；
CTCs富集：将反冲洗步骤的混合液不断注入到富集芯片中，以实现对CTCs的富集；
CTCs检测：将富集芯片放到高光谱图像采集系统中进行拍照检测。
6.根据权利要求5所述的一种基于高光谱的检测方法，其特征在于：所述缓冲液冲洗芯片的速度与肿瘤病人全血的注入速度相同。
7.根据权利要求5所述的一种基于高光谱的检测方法，其特征在于：所述富集芯片的光波采集波段为450-750nm，并分为40个波段采集，图像大小为2448*2048，所述高光谱图像采集系统采用K-means无监督和光谱角的办法进行二分类。
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