CN105087776A - 一种基于稀有细胞检测alk基因状态的方法及相关试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于稀有细胞检测ALK基因状态的方法及其试剂盒，所述方法包括以下步骤：步骤1，血液样本或体液样本，样本中包含循环肿瘤细胞或其他稀有细胞与白细胞的混合细胞群；步骤2，用缓冲液稀释样本，去除血浆，并回收CTC或其他稀有细胞；步骤3，用红细胞裂解液裂解，去除红细胞并回收CTC或其他稀有细胞；步骤4，用包被有抗人白细胞相关抗原抗体的磁微粒同步骤3所得的回收细胞混匀孵育，结合并形成磁微粒-白细胞混合体；步骤5，离心将磁微粒-白细胞混合体与其他细胞分离，得到含有CTC或其他稀有细胞及少量白细胞的混合细胞群；步骤6，使用免疫荧光细胞化学与荧光原位杂交的相结合的方法，测定CTC或其他稀有细胞的ALK基因重排的状态。

Description

一种基于稀有细胞检测ALK基因状态的方法及相关试剂盒
技术领域
本发明涉及医学诊断学，特别涉及肿瘤细胞的检测。更具体地讲，本发明涉及检测癌症和评估患者的治疗方案的诊断方法。
背景技术
循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCell,CTC)指进入到血液循环中的肿瘤细胞，其可由原发灶或转移灶脱落入血，亦可能在形成实体瘤病灶之前进入血液中。肿瘤细胞侵入循环系统，大部分由于机体的免疫识别、机械杀伤及自身凋亡在短期内死亡，只有极少数存活下来，并在远端或原发组织及器官种植，进一步发展为转移灶，是导致肿瘤转移和复发的最直接因素。
CTC作为一种可以代表原发肿瘤的“液体活检”样本，外周血标本易获取、创伤性小、可反复采集，是临床检测更为理想的标本来源，可对肿瘤治疗进行实时全面监测。可有效实现肿瘤复发预警，疗效及时评价以及肿瘤个体化治疗用药指导，目前CTC检测已广泛运用于临床肿瘤患者的疗效实时评价、病情实时监测、耐药析因、预后判断中。
荧光原位杂交(fluorescentinsituhybridization，FISH)是一种细胞遗传学技术，可以用来对核酸进行检测和定位。目前基于脱落稀有细胞的FISH技术一般为定性检测，很难做到精准定量且保证其效果。究其根本原位在于目前适用于组织标本的FISH检测方法及普通的脱落细胞学FISH检测方法，当数量级在0-100间的细胞涂片后，无法在着色效果和有效保持细胞方面取得较好的平衡并保持较高的稳定性，更难以形成有效稳定定量检测的成型产品。目前虽有相应专利阐述一种有效方法(US6,524,798)，但需极其高昂成本的专用检测设备，无法在常规实验室完成这基于及少量稀有细胞、甚至是单细胞层面的FISH检测工作。
此前已描述了来自生物样品的肿瘤细胞、稀少细胞或其他生物实体的鉴定方法(如中国专利申请号：200810097889.4、201310057307.0)。此两步法要求有效富集以确保在分析之前获取靶细胞，同时去除大量碎片和其他干扰物质，使得可通过成像技术进行细胞检验。此方法以独特的阴性富集策略将免疫磁微粒与多密度离心方式、荧光原位杂交和免疫荧光细胞化学分析组合起来，精确定量地检测几乎所有实体肿瘤类型中脱落至含血液、胸/腹腔积液、尿液、脑脊液等多种生物体液标本中的稀有细胞(含CTC)。此组合方法用于富集和计数血样中的染色体扩增型肿瘤细胞，因此提供了一种量度癌症的工具。
ALK最早是在间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)的一个亚型中被发现的，因此定名为间变性淋巴瘤激酶(anaplasticlymphomakinase，ALK)。随后，在发现非小细胞肺癌中有ALK基因重排之前，在弥漫性大B细胞淋巴瘤和炎症性肌纤维母细胞瘤(IMT)中分别发现了有多种类型的ALK基因重排，至此证明ALK是强力致癌驱动基因。
《中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断专家共识》中指出，随着分子医学进展和靶向药物的不断涌现，晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗已进入到个体化治疗的时代。目前临床应用的个体化靶向治疗主要针对EGFR突变型和ALK融合基因型肺癌,这两种基因变异型肺癌均具有明确的分子靶点、靶点检测技术及上市的靶向药物，临床疗效得到明显提高。其他基因变异型肺癌的靶向药物和伴随分子诊断(companiondiagnostics)技术正在快速研发中。肺癌中ALK变异主要为ALK基因发生重排与其他基因融合。其中，EML4-ALK(棘皮动物微管结合蛋白样4-间变性淋巴瘤激酶)融合基因变异是其主要类型，约占所有NSCLC的5％左右。肺癌中与ALK基因融合的其他基因还包括TFG、KIF5B等。
针对ALK靶点的小分子抑制剂克唑替尼(Crizotinib)是一种ATP竞争性酪氨酸激酶抑制剂，可特异性靶向抑制ALK激酶，也可抑制c-MET和ROS1等信号通路。临床试验显示对于ALK阳性的晚期NSCLC患者，克唑替尼的疗效显著优于传统化疗，二线单药治疗患者的中位PFS为7.7个月，有效率达到65.3％。基于其良好的疗效和耐受性，2013年初，中国食品和药品监督管理总局(CFDA)已批准克唑替尼用于治疗ALK融合阳性的局部晚期或转移性NSCLC患者。
检测基因融合(genefusion，又称基因重排，generearrangement)的方法有多种，包括原位杂交技术、蛋白表达检测技术和PCR检测技术。目前针对ALK融合基因检测常用的方法有三种——荧光原位杂交(FISH)、基于PCR扩增技术(RACE-PCR或RT-PCR联合测序技术、qRT-PCR等)和免疫组织化学法(IHC)。上述三种方法各有其优缺点。FISH是经过大规模临床试验验证的金标准方法，但价格昂贵，操作规范要求较高；RT-PCR对标本取材要求较高，需专用的试剂盒进行检测；IHC简便易行，但阳性标准不统一。
但是临床检测时，会由于例如已手术切除、患者主观意愿不胁从等诸多无法有效获得肿瘤组织的情况，而存在以下局限性：
1、作为有创性且受限于病灶位置的组织学检测，存在标本取材不易或无法取材等局限性，且术后不能反复取材，导致组织取材无法提供实时性的监测信息。
2、且受治疗的影响等，肿瘤细胞的分子信息有可能发生动态改变。如：有研究报道，接受新辅助化疗的乳腺癌患者，在化疗前接受活检，并将结果与术后病理进行对照，发现存在治疗前后ALK表达不一致的情况。
3、肿瘤组织异质性的存在以及单点活检造成的只是局部信息反映的现状，使得传统组织学检测缺乏全面整体性的评价，如原发灶、多发转移灶信息的综合评价等。
本发明在于提供了一种检测ALK重排状态的方法。以获得更加全面的信息。本发明在分离获取血液中CTC(或其他稀有细胞)的基础上，进行单细胞分子分析，检测ALK表达情况，以此来从单细胞水平上，即时地发现ALK的分子信息，以便对患者的状态进行实时观察。
发明内容
本发明提供一种对ALK重排状态进行检测的方法。直接帮助临床医师了解肿瘤患者实时的基因状态，以辅助预测生存情况并拟定下一步治疗方案。
本发明的方法包括以下全部及部分步骤：
步骤1，从患者获得血液样本或其他含有稀有细胞的体液样本，样本中包含CTC或其他稀有细胞与白细胞的混合细胞群；
步骤2，用缓冲液稀释样本，离心去除血浆，并回收CTC或其他稀有细胞；
步骤3，用红细胞裂解液裂解，离心去除红细胞并回收CTC或其他稀有细胞；
步骤4，用包被有抗人白细胞相关抗原抗体的磁微粒同步骤3所得的回收细胞混匀孵育，以使磁微粒同标的白细胞充分结合并形成磁微粒-白细胞混合体；
步骤5，离心将磁微粒-白细胞混合体与其他细胞分离，得到含有CTC或其他稀有细胞及少量白细胞的混合细胞群；
步骤6，使用免疫荧光细胞化学与荧光原位杂交的相结合的方法，测定对CTC或其他稀有细胞的ALK基因重排的状态。
本发明所述的方法，其中，步骤2所述缓冲液为一种与血液密度相近的缓冲液，含有BSA、PBS等物质，pH7-8之间，能够保证去除血浆的同时，保护各种有核细胞。
本发明所述的方法，其中，步骤3所述红细胞裂解液为一种红细胞裂解液，利用等渗不等张的原理，裂解红细胞的同时，不会损伤其他有核细胞。
如以下配方的裂解液：
NH4Cl82.9g
KHCO310g
EDTA0.37g
加H2O至1000ml(高压灭菌,4℃保存)
或
红细胞裂解液(Tris-NH4Cl):称取3.735g氯化铵、三羟甲基氨基甲烷(Tris)1.3g加水溶解并稀释至500ml。0.22μm滤膜过滤除菌,4℃保存。
本发明所述的方法，其中，步骤4所述包被有抗人白细胞相关抗原抗体的磁微粒为一种包被抗白细胞共同抗原抗体的链亲和素磁珠。能够最大量地、牢固地结合白细胞，利于后续的分选处理。
本发明所述的方法，其中步骤5所述离心介质为一种密度介于1.070-1.080之间的密度梯度离心液，其中以1.072最优，可以在去除结合磁珠的白细胞的同时，保存其他单个有核细胞不丢失。
本发明所述的方法，其中，步骤6所述使用免疫荧光细胞化学与荧光原位杂交的方法，对CTC或其他稀有细胞的ALK的基因重排状态进行鉴别，方法如下：
ALK重排型CTC：将标本置于荧光显微镜相应通道下观察，当发现至少一个橙色信号点与一个绿色信号点分离时，计为一个阳性细胞。
一种用于上述方法的试剂盒一，包括如下成分：
其中，10×、20×表示浓度，即该溶液为10倍/20倍的浓度。
本发明所述的试剂盒制备方法如下：
试剂盒一包含下述富集及鉴别两部分的试剂。
富集部分：
CS1浓缩缓冲液(10×)：
每1000mL水中，含有60gBSA，5包PBS粉末(2L/包)，100mL0.5M的EDTA，0.8mLProclin300。
CS2浓缩储存液(10×)：
每1000mL水中，称取82.9gNH4Cl、10gKHCO3、0.37gEDTA，水以及0.8mLProclin300，进行充分的搅拌溶解，定容，配制为10X浓缩液。
CS3分离介质：
将密度为1.077的梯度离心液稀释，稀释过程中测试密度，使其密度在1.070-1.075之间。
磁微粒混悬液：
将CD45抗体浓度调整为1mg/mL，与链亲和素免疫磁珠按照100uL:1mL的比例进行孵育1h，即配制为磁微粒混悬液。
鉴别部分：
CF1固定液：
混合PEG和无水乙醇，使PEG终浓度为1％，无水乙醇终浓度为50％。
10×CF2固定液：
以PBS为溶剂，溶解PFA粉末，配制为5％的PFA浓缩液。
甲酰胺工作液：
将甲酰胺原液稀释为50％的工作液。
20XSSC浓缩缓冲液：
1000mL水中，加入氯化钠175.3g，柠檬酸铵88.2g。
ALK探针：
使用甲酰胺、硫酸葡聚糖钠盐将ALK探针，配制为探针工作液。
BSA粉末：
外购分装。
CD45-AF594荧光抗体：
将CD45抗体与AlexaFlour594荧光素避光孵育1h，荧光素即可与CD45抗体连接。
DAPI染色液：
使用防淬灭剂Mountingmedium将1mg/mL的DAPI原液按照1:1000进行稀释，配制为DAPI染色工作液。
本发明所述试剂盒一的使用方法，步骤如下：
(1)将0.1-5mL血液标本加入至50mL离心管中，加入稀释好的CS1工作液至45mL，650×g离心5分钟，吸弃上清并剩余约12mL液体；
(2)轻摇混匀，加入稀释好的CS2裂解工作液至45mL，混匀8-10分钟，650×g离心5分钟，吸弃上清液体；
(3)加入CS1工作液适量并轻摇混匀，再次加入一定量CS1工作液，加入清洗过的磁微粒混悬液200uL，水平摇匀(120rpm)20分钟；
(4)吸取全部混匀后液体，叠加至CS3分离介质上，300×g离心5分钟；
(5)吸取除磁微粒沉淀以外的上两层液体至15mL离心管中，加入CS1工作液至15mL，950×g离心5分钟，吸弃上清；
(6)加入1mLCS1工作液，吹打混匀并加入至新2mL离心管中，磁力分选2分钟。转移上清至1.5mL离心管中，放置在15mL离心管上，3400rpm离心3分钟。
(7)吸弃上清，加入CF1固定液，吹打混匀并涂片，自然晾干；
(8)加入CF2固定工作液，计时8-10分钟；
(9)吸弃液体，放入已预热的2×SSC染缸10分钟；
(10)依次放入75％、85％、无水乙醇中2-5分钟；
(11)加入10uLALK探针，盖上盖玻片，封片并放入杂交仪或其他控温装置，76℃5分钟，37℃4-20小时；
(12)取出标本，撕下封片物质，放入已预热的甲酰胺工作液，计时15分钟；
(13)置于2×SSC中5-10分钟；
(14)取出，加入配制好的CD45-AF594荧光抗体(20uL抗体+180uL2％BSA)，每玻片200uL，避光反应1-5小时；
(15)吸弃多余液体，0.2％BSA清洗1-3次，加入DAPI复染剂10uL，封片。本发明还提供另外一种用于本发明方法的试剂盒二，包括如下成分：
其中，10×、20×表示浓度，即该溶液为10倍/20倍的浓度。
试剂盒二包含下述鉴别部分的试剂。
鉴别部分：
CF1固定液：
混合PEG和无水乙醇，使PEG终浓度为1％，无水乙醇终浓度为50％。
10×CF2固定液：
以PBS为溶剂，溶解PFA粉末，配制为5％的PFA浓缩液。
甲酰胺工作液：
将甲酰胺原液稀释为50％的工作液。
20XSSC浓缩缓冲液：
1000mL水中，加入氯化钠175.3g，柠檬酸铵88.2g。
ALK探针：
使用甲酰胺、硫酸葡聚糖钠盐将ALK探针，配制为探针工作液。
BSA粉末：
外购分装。
CD45-AF594荧光抗体：
将CD45抗体与AlexaFlour594荧光素避光孵育1h，荧光素即可与CD45抗体连接。
DAPI染色液：
使用防淬灭剂Mountingmedium将1mg/mL的DAPI原液按照1:1000进行稀释，配制为DAPI染色工作液。
所述试剂盒二的使用方法，步骤如下：
(1)将本方法步骤(7)或其他方法获得的细胞悬液，涂于载玻片或膜片上，并自然晾干。加CF2固定工作液，计时8-10分钟；
(2)吸弃液体，放入已预热的2×SSC染缸10分钟；
(3)依次放入75％、85％、无水乙醇中2-5分钟；
(4)加入10uLALK探针，盖上盖玻片，封片并放入杂交仪或其他控温装置，76℃5分钟，37℃4-20小时；
(5)取出标本，撕下封片物质，放入已预热的甲酰胺工作液，计时15分钟；
(6)置于2×SSC中5-10分钟；
(7)取出，加入配制好的CD45-AF594荧光抗体(20uL抗体+180uL2％BSA)，每玻片200uL，避光反应1-5小时；
(8)吸弃多余液体，0.2％BSA清洗1-3次，加入DAPI复染剂10uL，封片。
封片后即可利用显微镜进行结果的判别，即可对CTC或其他稀有细胞的ALK重排状态进行鉴别。
注：处理过程中，可视实际情况，使用TritonX-100、Saponin等打孔剂(但不限于这两种打孔剂)对细胞进行打孔处理，以减小探针进入细胞的阻力。
本发明进一步提供本发明试剂盒的用途，即在鉴别CTC或其他稀有细胞的ALK重排结果，为此，本发明可以测定ALK结果以判断肿瘤患者实时的基因状态中的应用。
名词解释：
稀有细胞：其在体液样本内的所有有核细胞中的占有比例小于0.1％。包括CTC，循环内皮细胞，胎儿细胞，肿瘤干细胞，干细胞，及某些免疫细胞等。
循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCell,CTC)：指进入到血液循环中的肿瘤细胞。
表格中的名词：
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
使用试剂盒一对血液样本进行检测
如上述试剂盒使用方法1-6步所示，测试30例正常人、40例肺部良性疾病、40例非小细胞肺癌患者血液样本，方法为将3.2mL血液标本加入至50mL离心管中，加入CS1工作液，650×g离心5分钟，吸弃上清；加入CS2工作液裂解8分钟，650×g离心5分钟，吸弃上清液体；再次加入一定量CS1工作液，加入磁微粒混悬液200uL，摇匀20分钟；吸取全部混匀后液体，叠加至CS3分离介质上，300×g离心5分钟；吸取除磁微粒沉淀以外的液体至15mL离心管中，加入CS1工作液至15mL，950×g离心5分钟，吸弃上清；加入1mLCS1工作液，吹打混匀并加入至新2mL离心管中，磁力分选2分钟。转移上清至1.5mL离心管中，放置在15mL离心管上，3400rpm离心3分钟。吸弃上清，加入CF1固定液，吹打混匀并涂片，自然晾干；加入CF2固定工作液8分钟；吸弃液体，放入已预热的2×SSC染缸10分钟；依次放入75％、85％、无水乙醇中脱水2分钟；加入10uLc-MET/CEP7探针，盖上盖玻片，封片并放入杂交仪或其他控温装置，76℃5分钟，37℃4小时；取出标本，揭去盖玻片，放入已预热的甲酰胺工作液中15分钟；置于2×SSC中洗涤5分钟；加入配制好的CD45-AF594荧光抗体(20uL抗体+180uL2％BSA)，每玻片200uL，避光反应1小时；吸弃多余液体，0.2％BSA清洗1-3次，加入DAPI复染剂10uL，封片。
结果显示恶性患者中1人发现ALK重排型CTC，3个/3.2mL，同时组织表现为ALK阳性。
实施例2
本发明试剂盒的制备
试剂盒一：
CS1浓缩缓冲液(10×)：
每1000mL水中，含有60gBSA，5包PBS粉末(2L/包)，100mL0.5M的EDTA，0.8mLProclin300。
CS2浓缩储存液(10×)：
每1000mL水中，称取82.9gNH4Cl、10gKHCO3、0.37gEDTA，水以及0.8mLProclin300，进行充分的搅拌溶解，定容，配制为10X浓缩液。
CS3分离介质：
将密度为1.077的梯度离心液稀释，稀释过程中测试密度，使其密度在1.070-1.075之间。
磁微粒混悬液：
将CD45抗体浓度调整为1mg/mL，与链亲和素免疫磁珠按照100uL:1mL的比例进行孵育1h，即配制为磁微粒混悬液。
CF1固定液：
混合PEG和无水乙醇，使PEG终浓度为1％，无水乙醇终浓度为50％。
10×CF2固定液：
以PBS为溶剂，溶解PFA粉末，配制为5％的PFA浓缩液。
甲酰胺工作液：
将甲酰胺原液稀释为50％的工作液。
20XSSC浓缩缓冲液：
1000mL水中，加入氯化钠175.3g，柠檬酸铵88.2g。
ALK探针：
使用甲酰胺、硫酸葡聚糖钠盐将ALK探针，配制为探针工作液。
BSA粉末：
外购分装。
CD45-AF594荧光抗体：
将CD45抗体与AlexaFlour594荧光素避光孵育1h，荧光素即可与CD45抗体连接。
DAPI染色液：
使用防淬灭剂Mountingmedium将1mg/mL的DAPI原液按照1:1000进行稀释，配制为DAPI染色工作液。
试剂盒二仅包含5)-12)部分，制备方法相同。
实施例3
用本发明的试剂盒一对其他体液样本进行检测
说明：本试剂盒不仅适用于血液，也适用于其他体液中稀有细胞的检测，例如胸水、腹水、盥洗液、羊水等，但不限于这几种体液。
使用本试剂盒对6例肺癌胸水进行检测，1例发现ALK重排型阳性细胞，数量为4个。
实施例4
使用试剂盒二对其他方法获取到的CTC进行检测
说明：试剂盒二中组份，即ALK探针、CD45-AF594荧光抗体、DAPI染色液等，也适用于其他方法获取到的CTC，例如过滤法、ChIP法等等，但不限于这两种方法。
使用膜过滤法对7例肺癌周血标本进行处理，将直径为8um的IsporeTMMembraneFilters配合SWINNEX滤器配合使用。具体方法为，首先将5mL血液标本与10mLPBS混匀，加入至过滤器中，通过重力作用自然沉降，CTC因体积较大，留在膜表面，将滤膜转移至标准载玻片上。干燥后，按照试剂盒二的操作方法对CTC进行染色处理，方法如下：将干燥后的标本经过CF2固定工作液8分钟；吸弃液体，放入已预热的2×SSC染缸10分钟；依次放入75％、85％、无水乙醇中脱水2分钟；加入10uLc-MET/CEP7探针，盖上盖玻片，封片并放入杂交仪或其他控温装置，76℃5分钟，37℃4小时；取出标本，揭去盖玻片，放入已预热的甲酰胺工作液中15分钟；置于2×SSC中洗涤5分钟；加入配制好的CD45-AF594荧光抗体(20uL抗体+180uL2％BSA)，每玻片200uL，避光反应1小时；吸弃多余液体，0.2％BSA清洗1-3次，加入DAPI复染剂10uL，封片，并在荧光显微镜下观察。结果统计，9例表现出CEP17扩增型CTC阳性，2例HER-2扩增型阳性。
结果统计，1例表现出ALK阳性。
实施例5
本试剂盒一同样适用于其他肿瘤的稀有细胞的检测
说明：各癌种体液中所含有的ALK重排型稀有细胞均可被检测。
使用本试剂盒对50例乳腺癌患者进行了CTC的检测，其中1例检测出ALK重排型CTC2个。

Claims (10)

1.一种基于稀有细胞检测ALK基因状态的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1，从患者获得血液样本或其他含有稀有细胞的体液样本，样本中包含CTC或其他稀有细胞与白细胞的混合细胞群；
步骤2，用缓冲液稀释样本，离心去除血浆，并回收CTC或其他稀有细胞；
步骤3，用红细胞裂解液裂解，离心去除红细胞并回收CTC或其他稀有细胞；
步骤4，用包被有抗人白细胞相关抗原抗体的磁微粒同步骤3所得的回收细胞混匀孵育，以使磁微粒同标的白细胞充分结合并形成磁微粒-白细胞混合体；
步骤5，离心将磁微粒-白细胞混合体与其他细胞分离，得到含有CTC或其他稀有细胞及少量白细胞的混合细胞群；
步骤6，使用免疫荧光细胞化学与荧光原位杂交的相结合的方法，测定CTC或其他稀有细胞的ALK重排的状态。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2所述缓冲液为与血液密度相近、包含BSA及PBS、PH7-8的缓冲液，其中，步骤3所述红细胞裂解液为任意一种红细胞裂解液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4所述包被有抗人白细胞相关抗原抗体的磁微粒为一种包被抗白细胞共同抗原抗体的链亲和素磁珠，能够牢固地结合白细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5所述离心介质为一种密度介于1.070-1.080之间的密度梯度离心液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6所述使用免疫荧光细胞化学与荧光原位杂交的方法，测定ALK，对CTC或其他稀有细胞进行鉴别，方法如下：
ALK重排型CTC：将标本置于荧光显微镜相应通道下观察，当发现至少一个橙色信号点与一个绿色信号点分离时，计为一个阳性细胞。
6.一种用于权利要求1方法的试剂盒，其特征在于，包括如下成分：
CS1浓缩缓冲液(10×)
CS2浓缩储存液(10×)
CS3分离介质
磁微粒混悬液
CF1固定液
10×CF2固定液
DAPI染色液
ALK探针
CD45-AF594荧光抗体
甲酰胺工作液
20×SSC浓缩缓冲液
BSA。
7.权利要求6所述试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将0.1-5mL血液标本加入至50mL离心管中，加入稀释好的CS1工作液至45mL，650×g离心5分钟，吸弃上清并剩余约12mL液体；
(2)轻摇混匀，加入稀释好的CS2裂解工作液至45mL，混匀8-10分钟，650×g离心5分钟，吸弃上清液体；
(3)加入CS1工作液适量并轻摇混匀，再次加入一定量CS1工作液，加入清洗过的磁微粒混悬液200uL，水平摇匀(120rpm)20分钟；
(4)吸取全部混匀后液体，叠加至CS3分离介质上，300×g离心5分钟；
(5)吸取除磁微粒沉淀以外的上两层液体至15mL离心管中，加入CS1工作液至15mL，950×g离心5分钟，吸弃上清；
(6)加入1mLCS1工作液，吹打混匀并加入至新2mL离心管中，磁力分选2分钟。转移上清至1.5mL离心管中，放置在15mL离心管上，3400rpm离心3分钟；
(7)吸弃上清，加入CF1固定液，吹打混匀并涂片，自然晾干；
(8)加入CF2固定工作液，计时8-10分钟；
(9)吸弃液体，放入已预热的2×SSC染缸10分钟；
(10)依次放入75％、85％、无水乙醇中2-5分钟；
(11)加入10uLALK探针，盖上盖玻片，封片并放入杂交仪或其他控温装置，76℃5分钟，37℃4-20小时；
(12)取出标本，撕下封片物质，放入已预热的甲酰胺工作液，计时15分钟；
(13)置于2×SSC中5-10分钟；
(14)取出，加入配制好的CD45-AF594荧光抗体(20uL抗体+180uL2％BSA)，每玻片200uL，避光反应1-5小时；
(15)吸弃多余液体，0.2％BSA清洗1-3次，加入DAPI复染剂10uL，封片。
8.一种用于权利要求1方法的试剂盒，其特征在于包括如下成分：
CF1固定液
10×CF2固定液
DAPI染色液
ALK探针
CD45-AF594荧光抗体
甲酰胺工作液
20×SSC浓缩缓冲液
BSA。
9.权利要求8所述试剂盒的使用方法，其特征在于步骤如下：
(1)将本方法步骤(7)或其他方法获得的细胞悬液，涂于载玻片或膜片上，并自然晾干，加CF2固定工作液，计时8-10分钟；
(2)吸弃液体，放入已预热的2×SSC染缸10分钟；
(3)依次放入75％、85％、无水乙醇中2-5分钟；
(4)加入10uLALK探针，盖上盖玻片，封片并放入杂交仪或其他控温装置，76℃5分钟，37℃4-20小时；
(5)取出标本，撕下封片物质，放入已预热的甲酰胺工作液，计时15分钟；
(6)置于2×SSC中5-10分钟；
(7)取出，加入配制好的CD45-AF594荧光抗体(20uL抗体+180uL2％BSA)，每玻片200uL，避光反应1-5小时；
(8)吸弃多余液体，0.2％BSA清洗1-3次，加入DAPI复染剂10uL，封片。
10.权利要求6或8任意一项试剂盒在测定稀有细胞的同时，检测ALK基因重排状态的应用。
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