CN112462064A

CN112462064A - 一种标志物或其特异性识别试剂在制备诊断胃癌试剂盒中的应用和诊断试剂盒

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Publication number: CN112462064A
Application number: CN202011074601.9A
Authority: CN
Inventors: 王大广; 所剑; 李伟; 都业超; 潘国强
Original assignee: First Hospital Jinlin University
Current assignee: First Hospital Jinlin University
Priority date: 2020-10-09
Filing date: 2020-10-09
Publication date: 2021-03-09

Abstract

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种标志物或其特异性识别试剂在制备诊断胃癌试剂盒中的应用和诊断试剂盒。该标志物包括精胺、肠抑素、硫酸肝素、三酰甘油中的一种或几种。本发明具有如下有益效果：利用该标志物对早期胃癌进行筛查，具有低侵入性、简单高效且费用低廉的优点。

Description

一种标志物或其特异性识别试剂在制备诊断胃癌试剂盒中的应用和诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种标志物或其特异性识别试剂在制备诊断胃癌试剂盒中的应用和诊断试剂盒。

背景技术

胃癌(gastric carcinoma)是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，在我国各种恶性肿瘤中发病率居首位，胃癌发病有明显的地域性差别，在我国的西北与东部沿海地区胃癌发病率比南方地区明显为高。好发年龄在50岁以上，男女发病率之比为2：1。由于饮食结构的改变、工作压力增大以及幽门螺杆菌的感染等原因，使得胃癌呈现年轻化倾向。胃癌可发生于胃的任何部位，其中半数以上发生于胃窦部，胃大弯、胃小弯及前后壁均可受累。绝大多数胃癌属于腺癌，早期无明显症状，或出现上腹不适、嗳气等非特异性症状，常与胃炎、胃溃疡等胃慢性疾病症状相似，易被忽略，因此，目前我国胃癌的早期诊断率仍较低。

早期胃癌预后较中晚期胃癌好，因此，诊断早期胃癌极为重要。目前早期胃癌的诊断主要依赖于内镜技术，但内镜属于侵入性检查，存在痛苦大、医从性差、费用高等局限性，因此受筛查条件、人群接受程度以及就医成本等因素的制约，尚无法成为大规模筛查的检查手段。

代谢组学(metabonomics)是主要研究生物体内小分子物质(相对分子质量不超过1000)种类及数量变化规律的新兴学科，它可以放大基因组和蛋白质组的微小变化，反映基因功能活动的终点和生物化学表型的变化，也直接关系到这些活动的最终效果。因此，代谢组学被认为是组学研究的最终方向。机体健康状态的变化可以通过对血液、尿液、脑脊液以及唾液等体液变化进行研究，可以利用代谢组学对体液进行研究从而寻找到疾病重要的标志性代谢物。近年来在研究乳腺癌、肝癌、前列腺癌、肺癌和脑肿瘤的发生发展过程中，代谢组学对潜在生物信息的发掘和发病机制的研究方面提供了坚实的理论支持：如YueX等发现43种精氨酸代谢物有助于准确诊断小细胞肺癌；Zhang发现代谢产物的水平(如谷氨酸和谷氨酰胺)，在癌组织和正常组织明显不同，这种差异是与病理特点淋巴结转移和术后生存时间密切相关的。但代谢组学在诊断早期胃癌方面的作用尚不十分明确。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种标志物或其特异性识别试剂在制备诊断胃癌试剂盒中的应用和诊断试剂盒。利用该标志物对早期胃癌进行筛查，具有低侵入性、简单高效且费用低廉的优点。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种标志物在制备诊断胃癌试剂盒中的应用，该标志物包括精胺、肠抑素、硫酸肝素、三酰甘油中的一种或几种。

本研究收集了吉林大学第一医院63例胃癌患者的血样及相关临床资料，应用液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)进行检测，获得其代谢图谱及数据。采用支持向量机(SVM)筛选血样中权重为100％的差异代谢物；采用总离子流图、主成分析和方差分析(ANOVA)鉴定差异性代谢产物；采用聚类分析(PCA)、偏最小二乘判别分析评价样本间的相似性；采用受试者特性曲线(ROC曲线)评价分析代谢产物的诊断能力，从而能筛选出区分能力强的差异性代谢产物。将筛选出的代谢产物的质核比导入人类代谢组数据库(HMDB)对其进行结构鉴定确定对应物质后，再利用验证组检验已确定代谢产物的准确性。最后得出，精胺、肠抑素、硫酸肝素、三酰甘油是诊断早期胃癌潜在标志物。

作为优选，上述标志物包括精胺、肠抑素、硫酸肝素、三酰甘油中的至少两种。

作为优选，肠抑素为APGPR肠抑素。

作为优选，三酰甘油为甘油三油酸酯。

在本发明中，胃癌为早期胃癌或进展期胃癌。

本发明还提供了一种特异性识别标志物的试剂在制备诊断胃癌试剂盒中的应用，该标志物包括精胺、肠抑素、硫酸肝素、三酰甘油中的一种或几种。

作为优选，肠抑素为APGPR肠抑素。

在本发明中，胃癌为早期胃癌或进展期胃癌。

本发明还提供了一种诊断胃癌的试剂盒，试剂盒包括特异性识别标志物的试剂，该标志物包括精胺、肠抑素、硫酸肝素、三酰甘油中的一种或几种。

作为优选，特异性识别标志物的试剂为特异性抗体。

作为优选，试剂盒还包括用于免疫检测的其它试剂。

作为优选，免疫检测选自免疫组化、免疫荧光、免疫沉淀、免疫流式细胞学或免疫杂交。

本发明提供了一种标志物或其特异性识别试剂在制备诊断胃癌试剂盒中的应用和诊断试剂盒。该标志物包括精胺、肠抑素、硫酸肝素、三酰甘油中的一种或几种。本发明具有如下有益效果：利用该标志物对早期胃癌进行筛查，具有低侵入性、简单高效且费用低廉的优点。

附图说明

图1示进展期胃癌(A)、早期胃癌(B)和健康人(C)的总离子流图，横坐标表示离子的保留时间，纵坐标表示离子的峰值强度，红色箭头表示在同一保留时间下三组样本的峰值存在差异；

图2示2D模式(A)和3D模式(B)对进展期胃癌组、早期胃癌组、健康人组及QC组进行主成分分析，红色代表进展期胃癌组，绿色代表早期胃癌组，黄色代表健康人组，蓝色代表QC组；样本之间的距离越远，说明组间的代谢产物的差距越大；

图3示对进展期胃癌组、早期胃癌组、健康人组进行偏最小二乘判别分析，红色代表进展期胃癌组，绿色代表早期胃癌组，蓝色代表健康人组；左图可以看出三组样本可以很好的区分开；

图4示实验组VIP值，对进展期胃癌、早期胃癌和健康人进行VIP值计算；横坐标是权重值，纵坐标是质核比，共可以筛选出5个权重值＞1的代谢物；

图5示进展期胃癌、早期胃癌和健康人的聚类分析；图中红色表示峰度值相对大的，蓝色表示峰度值相对小的，白色表示峰度值接近为零；颜色越深表示化合物峰度值越大，颜色越相似表示峰度值越相近；可以看到，在两组之间存在具有明显差异的化合物，且部分化合物之间存在相似性；但总体几种产物可以在组间分开；

图6示4种代谢物在胃癌患者和健康人的ROC曲线图(A)、4种代谢物在早期胃癌患者和健康人的ROC曲线图；纵坐标是敏感性，代表真阳性率，横坐标是以1-特异性，代表假阳性率；曲线越靠近左上角，说明对应的代谢物质在该组患者样本中含量高，曲线越靠近右下角，说明对应的代谢物质在健康组患者样本中含量高；

图7示4个代谢产物在进展期胃癌、早期胃癌和健康组的柱状图，从柱状图可以看到4中代谢物含量具有明显的统计学差异，并呈现出相应的变化趋势；

图8示验证组进展期胃癌、早期胃癌和健康人的聚类分析，结果显示4种代谢物在各组存在明显分布差异，可以根据这4种代谢物对各组可以实现较好分组；

图9示验证组4种代谢物在胃癌和健康人样本的ROC曲线图(A)，验证组4种代谢物在早期胃癌和健康人样本的ROC曲线图(B)。

具体实施方式

本发明公开了一种标志物或其特异性识别试剂在制备诊断胃癌试剂盒中的应用和诊断试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的标志物或其特异性识别试剂在制备诊断胃癌试剂盒中的应用和诊断试剂盒中所用试剂或仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

一、材料和方法：

本研究收集吉林大学第一医院2019年10月至2020年1月确诊的63例胃癌患者(包括进展期胃癌26例、早期胃癌37例)及健康人18例的静脉血样本和相关临床资料，此前已与家属签署知情同意书，经我院伦理委员会批准。胃癌患者纳入标准如下：1、病理诊断为胃癌；2、为初发、单发的恶性肿瘤；3、尚未接受中医治疗、化疗等手术以外的治疗手段；4、年龄超过70岁，临床病理资料完整。排除标准为：1、确定已知的先天性疾病；患有代谢性疾病、严重心、肺、肝、肾和神经、精神疾病等；2、酗酒者、药瘾者、长期服用质子泵抑制剂、激素或非甾体抗炎药者；3、近2周内有任何急性病症表现者或重大应激反应者(如精神创伤、烧伤)；4、患有血液病，包括各种白血病和各种贫血等病例。

二、血样本的采集和处理：

患者采集前一日清淡饮食，采集血样后立即3500r/min离心5min，上清液-80℃保存。标本收集完成后从冰箱中取出室温下溶解，每个样本各取100ul分别加入500ul乙腈，涡旋混匀，4℃、14000r/min离心5min。取上清液加入C8色谱柱(2.1×150mm，3.5μmThermoFisherEclipse Plus C18，Thermo Fisher，USA)。柱温维持在45℃，进样量为每次20ul。正离子的流动相A为水+0.1％甲酸，流动相B为乙腈+0.1％甲酸；负离子的流动相A为水，流动相B为乙腈。实验前将流动相置于数控超声波清洗器中超声，排净气体。

三、数据分析：

采用方差分析(ANOVA)分别对阳离子模式和阴离子模式数据进行分析，以F值>1和P<0.05为标准筛选出具有统计学差异的代谢物；采用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和支持向量机分析(SVM)后分别以VIP值>1、权重值等于100％为标准筛选出具有高度特异性的代谢产物；通过聚类分析确定代谢物在不同组内的分布情况；ROC曲线以真阳性率为横坐标，以假阳性率为纵坐标绘制曲线，通过对曲线下的面积(AUC值)的计算，判定代谢物进行分组的准确性，再将筛选出的代谢产物质核比导入人类代谢组数据库(HMDB)对其进行结构鉴定确定对应物质，最后用验证组对筛选出的差异性代谢产物进行验证，检验差异性代谢产物的可靠性和敏感性。

四、结果：

1、早期胃癌患者血样中不同水平的代谢物

根据临床资料将样本分为3组，A组为18名进展期胃癌患者、B组为29名早期胃癌患者，C组为10名健康人。代谢产物的质谱数据由LC-MS分析后得出。总离子流图(total ioncurrent，TIC)发现三个组之间的峰值存在明显差异(图1)；PCA发现组间代谢产物分类差异性明显(图2)；方差分析(ANOVA)以F值>1且P<0.05为筛选标准，得出316个具有统计学意义的代谢物，见附表1。

表1支持向量机结果

2、筛选权重为100％的胃癌患者血样本差异性代谢物

采用偏最小二乘判别分析和方差分析对代谢物进行进一步分析，得到其得分图(图3)和VIP值图(图4)。根据VIP图和表(附表2)发现VIP值大于1的代谢产物共5个。应用BRB-array软件中的支持向量机方法进行进一步判定，发现权重为100％的差异性代谢产物共4种(表1)，对上述4种代谢物在整体胃癌(A组和B组)和健康人(C组)、早期胃癌(B组)和健康人(C组)两组中分别进行了灵敏度、特异度的计算(表2、表3)。对上述4种物质进行聚类分析，结果显示(图5)各组之间存在差异性代谢产物。将4种代谢物导入人类代谢组学数据库(HMDB)，利用质量荷电比(M/Z)可对其进行结构鉴定(表4)，确定对应的物质。

表2 4种代谢物对胃癌与健康人区分灵敏度、特异度

表3 4种代谢物对早期胃癌与健康人区分灵敏度、特异度

表4 4个代谢物的名称和分子式

3、差异代谢物对早期胃癌患者具有良好的诊断能力

ROC曲线分析表明精胺、肠抑素、硫酸肝素、三酰甘油在整体胃癌(A组和B组)和健康人(C组)、早期胃癌(B组)和健康人(C组)中均具有良好的诊断能力(图6、表5、表6)。进一步绘制4个差异性代谢物在三个组的均值柱形图(图7)，结果表明：4个代谢产物在各组具有明显的统计学差异。

表5 4种代谢物在胃癌患者和健康人的ROC曲线面积值(AUC)

表6 4种代谢物在胃癌患者和健康人的ROC曲线面积值(AUC)

4、4种代谢物的验证

将验证组样本分成A、B、C三个组，分别为进展期胃癌患者、早期胃癌患者和健康志愿者，每组8人。对三个组24例患者的血样本分别进行LC-MS处理后得到质谱数据后再进行聚类分析，分析结果与已知的分组结果吻合(图8)。同时为确保验证实验结果具有可靠性，对实验结果分别进行灵敏度、特异度检验(表7、表8)和ROC曲线分析(图9、表9、表10)，结果证明验证组实验具备良好的可靠性。

表7验证组4种代谢物对胃癌与健康人区分灵敏度、特异度

表8验证组4种代谢物对早期胃癌与健康人区分灵敏度、特异度

表9验证组4种代谢物在胃癌和健康人样本的ROC曲线表

表10验证组4种代谢物在早期胃癌和健康人样本的ROC曲线表

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。