JPH0921804A - イムノアッセイ用のトロポニンの安定組成物およびそのような安定組成物の製法 - Google Patents
イムノアッセイ用のトロポニンの安定組成物およびそのような安定組成物の製法Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 ヒトまたは動物の血清または血漿における心
臓および／または骨格トロポニン（類）をアッセイする
ことを意図されたイムノアッセイにおいて、標準および
／または対照として供する能力を有するトロポニンの安
定組成物の提供。 【解決手段】 安定組成物は、水溶液の状態でトロポニ
ンＩ、トロポニンＴおよびトロポニンＣをＩ−Ｔ−Ｃ三
成分複合体の形態で含有する。
臓および／または骨格トロポニン（類）をアッセイする
ことを意図されたイムノアッセイにおいて、標準および
／または対照として供する能力を有するトロポニンの安
定組成物の提供。 【解決手段】 安定組成物は、水溶液の状態でトロポニ
ンＩ、トロポニンＴおよびトロポニンＣをＩ−Ｔ−Ｃ三
成分複合体の形態で含有する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトまたは動物の
血清または血漿中の心臓および／または骨格トロポニン
のアッセイを意図されたイムノアッセイにおいて、標準
および／または対照として供する能力を有するトロポニ
ンの安定組成物、およびかかる組成物の製造方法に関す
る。
血清または血漿中の心臓および／または骨格トロポニン
のアッセイを意図されたイムノアッセイにおいて、標準
および／または対照として供する能力を有するトロポニ
ンの安定組成物、およびかかる組成物の製造方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】トロポニンはトロポニンＩ、ＴおよびＣ
の３つのタンパク質からなる筋原線維タンパク質である
ことが知られている。このタンパク質複合体は、ミオシ
ンおよびアクチンと相互作用することにより、Ｃa2+イ
オンによる筋収縮の調節に寄与することができる。より
正確には、神経インパルスが筋肉の運動終板に達する
と、筋小胞体に伝達される活動電位が発生することが知
られている。次いで、Ｃa2 +が細胞質ゾル中へ遊離し、
トロポニンＣと結合し、それによりトロポニンＩおよび
トロポニンＣの間の相互作用が増強され、その結果とし
て、トロポニンＩ−Ｔ−Ｃ複合体のコンフォーメーショ
ンに変化が起こる。次いで、アクチン−ミオシン相互作
用部位の遊離が起こり、筋肉の収縮運動を起こさせる。
の３つのタンパク質からなる筋原線維タンパク質である
ことが知られている。このタンパク質複合体は、ミオシ
ンおよびアクチンと相互作用することにより、Ｃa2+イ
オンによる筋収縮の調節に寄与することができる。より
正確には、神経インパルスが筋肉の運動終板に達する
と、筋小胞体に伝達される活動電位が発生することが知
られている。次いで、Ｃa2 +が細胞質ゾル中へ遊離し、
トロポニンＣと結合し、それによりトロポニンＩおよび
トロポニンＣの間の相互作用が増強され、その結果とし
て、トロポニンＩ−Ｔ−Ｃ複合体のコンフォーメーショ
ンに変化が起こる。次いで、アクチン−ミオシン相互作
用部位の遊離が起こり、筋肉の収縮運動を起こさせる。
【０００３】心筋における心筋梗塞の間または骨格筋の
場合には長期身体活動の間に筋肉が損傷を受けると、か
くして遊離した収縮性タンパク質が多少速やかに血流中
に現れる。
場合には長期身体活動の間に筋肉が損傷を受けると、か
くして遊離した収縮性タンパク質が多少速やかに血流中
に現れる。
【０００４】かくして、最近、心筋梗塞の初期診断のた
めのトロポニンのアッセイは、サーキュレーション（Ｃ
irculation）第８３巻、第９０２−９１２頁におけるト
ロポニンＴのアッセイ、および、アメリカン・ハート・
ジャーナル（Ａm. Ｈeart Ｊ.）第１１０巻、第１３３
３−４４頁（１９８７年）およびモレキュラー・イムノ
ロジー（Ｍolecular Ｉmmunology）第２９巻（２）、第
２７１−２７８頁（１９９２年）におけるトロポニンＩ
のアッセイのどちらも推奨されてきた。同様に、心筋梗
塞後の血栓崩壊治療の成功を測定するための心臓トロポ
ニンＴのアッセイがブリティッシュ・ハート・ジャーナ
ル（Ｂr Ｈeart Ｊ）第７１巻、第２４２−２４８頁
（１９９４年）において提案されており、同様に、筋肉
損傷を測定するための骨格トロポニンＩのアッセイも提
案されている［アメリカン・アソシエイション・フォー
・クリニカル・ケミストリー（Ａmerican Ａssociation
forＣlinical Ｃhemistry）、第４６回ナショナル・ミ
ーティング（Ｎational Ｍeeting）、ニューオーリン
ズ、１９９４年７月１７−２１日の抄録番号３５］。現
在、種々の心臓および骨格トロポニンのアッセイがヒト
および動物の病理学の診断のための非常に有用な方法で
あることは、注目すべきである。
めのトロポニンのアッセイは、サーキュレーション（Ｃ
irculation）第８３巻、第９０２−９１２頁におけるト
ロポニンＴのアッセイ、および、アメリカン・ハート・
ジャーナル（Ａm. Ｈeart Ｊ.）第１１０巻、第１３３
３−４４頁（１９８７年）およびモレキュラー・イムノ
ロジー（Ｍolecular Ｉmmunology）第２９巻（２）、第
２７１−２７８頁（１９９２年）におけるトロポニンＩ
のアッセイのどちらも推奨されてきた。同様に、心筋梗
塞後の血栓崩壊治療の成功を測定するための心臓トロポ
ニンＴのアッセイがブリティッシュ・ハート・ジャーナ
ル（Ｂr Ｈeart Ｊ）第７１巻、第２４２−２４８頁
（１９９４年）において提案されており、同様に、筋肉
損傷を測定するための骨格トロポニンＩのアッセイも提
案されている［アメリカン・アソシエイション・フォー
・クリニカル・ケミストリー（Ａmerican Ａssociation
forＣlinical Ｃhemistry）、第４６回ナショナル・ミ
ーティング（Ｎational Ｍeeting）、ニューオーリン
ズ、１９９４年７月１７−２１日の抄録番号３５］。現
在、種々の心臓および骨格トロポニンのアッセイがヒト
および動物の病理学の診断のための非常に有用な方法で
あることは、注目すべきである。
【０００５】生物分析学研究室で行われるイムノアッセ
イは、該アッセイに必要な試薬（いわゆる抗体、標識化
試薬またはそうでなければ視覚化試薬、および希釈溶
液）に加えて、研究試料の条件と同様の条件下で用いら
れる場合に結果の計算のための参照および／または陽性
対照として供するであろう測定されるべき化合物の標準
を供給するための製造業者を必要とすることがよく知ら
れている。
イは、該アッセイに必要な試薬（いわゆる抗体、標識化
試薬またはそうでなければ視覚化試薬、および希釈溶
液）に加えて、研究試料の条件と同様の条件下で用いら
れる場合に結果の計算のための参照および／または陽性
対照として供するであろう測定されるべき化合物の標準
を供給するための製造業者を必要とすることがよく知ら
れている。
【０００６】測定されるべき化合物の標準および／また
は対照を入手するために、該精製化合物を凍結乾燥形態
（該化合物が使用前に使用者によって溶解される溶媒が
付属している）で、またはすぐ使用できる形態で使用す
ることができる。
は対照を入手するために、該精製化合物を凍結乾燥形態
（該化合物が使用前に使用者によって溶解される溶媒が
付属している）で、またはすぐ使用できる形態で使用す
ることができる。
【０００７】生物学的試薬は不安定であるので、凍結乾
燥物から調製された標準または対照溶液は、１回分ずつ
冷凍され、−８０℃で保存される。さらにまた、これら
の溶液は、プロテアーゼ阻害剤または抗菌剤がそれらに
添加されていたとしても、＋４℃では数時間以上は安定
ではないことが判明した。従って、このことにより、使
用者は、使用時にそれらの検量用溶液を調製せざるを得
ない。
燥物から調製された標準または対照溶液は、１回分ずつ
冷凍され、−８０℃で保存される。さらにまた、これら
の溶液は、プロテアーゼ阻害剤または抗菌剤がそれらに
添加されていたとしても、＋４℃では数時間以上は安定
ではないことが判明した。従って、このことにより、使
用者は、使用時にそれらの検量用溶液を調製せざるを得
ない。
【０００８】イムノアッセイのためのトロポニンＩまた
はＴの安定組成物であって、該組成物がトロポニンＣと
混合されたトロポニンＩまたはトロポニンＴをより詳細
にはトロポニンＩまたはＴの等量あたり１ないし１０モ
ル等量のトロポニンＣの割合で含有する水溶液およびＣ
aＣl2からなると特徴付けされた組成物を開示する番号
ＦＲ−Ａ−２,７０１,９５４の下に公開された特許出願
は、従来技術において知られている。この技術により、
トロポニンＩまたはＴの希釈標準溶液を＋４℃で数日間
保存することが多少可能になる。
はＴの安定組成物であって、該組成物がトロポニンＣと
混合されたトロポニンＩまたはトロポニンＴをより詳細
にはトロポニンＩまたはＴの等量あたり１ないし１０モ
ル等量のトロポニンＣの割合で含有する水溶液およびＣ
aＣl2からなると特徴付けされた組成物を開示する番号
ＦＲ−Ａ−２,７０１,９５４の下に公開された特許出願
は、従来技術において知られている。この技術により、
トロポニンＩまたはＴの希釈標準溶液を＋４℃で数日間
保存することが多少可能になる。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題および課題を解決するた
めの手段】本発明は、一方では、＋４℃で数日間安定で
ある標準または対照溶液を得ることを可能にし、他方で
は、製造コストおよび使用コストの両面において多くの
利点を有する。それは、事実上、１つまたはいくつかの
パラメーターの同時または同時ではないアッセイのため
の該溶液の簡便な使用を可能にする。本発明者は、驚く
べきことに、混合されたトロポニンＩ、トロポニンＴお
よびトロポニンＣによって形成される三成分複合体が溶
液中で安定であること、ならびに、これにより得られ
た、特異性および感受性が精製された成分の溶液と比較
して変化しないままであるトロポニンの安定溶液を、１
つ以上のトロポニンの所望により同時のイン・ビトロで
の診断試験において標準および／または対照として使用
できることを示した。
めの手段】本発明は、一方では、＋４℃で数日間安定で
ある標準または対照溶液を得ることを可能にし、他方で
は、製造コストおよび使用コストの両面において多くの
利点を有する。それは、事実上、１つまたはいくつかの
パラメーターの同時または同時ではないアッセイのため
の該溶液の簡便な使用を可能にする。本発明者は、驚く
べきことに、混合されたトロポニンＩ、トロポニンＴお
よびトロポニンＣによって形成される三成分複合体が溶
液中で安定であること、ならびに、これにより得られ
た、特異性および感受性が精製された成分の溶液と比較
して変化しないままであるトロポニンの安定溶液を、１
つ以上のトロポニンの所望により同時のイン・ビトロで
の診断試験において標準および／または対照として使用
できることを示した。
【００１０】本発明の主題は、水溶液の状態でトロポニ
ンＩ、トロポニンＴおよびトロポニンＣをＩ−Ｔ−Ｃ三
成分複合体の形態で含有するトロポニンの安定組成物で
ある。
ンＩ、トロポニンＴおよびトロポニンＣをＩ−Ｔ−Ｃ三
成分複合体の形態で含有するトロポニンの安定組成物で
ある。
【００１１】トロポニンＩ、ＴおよびＣはヒトまたは動
物起源のものであり、より詳細には、心臓および／また
は筋肉起源のものであってもよい。トロポニンＩ、Ｔお
よびＣは、心臓または筋肉の摩砕調製物の抽出物または
予め精製された３種類のトロポニンＩ、ＴおよびＣの混
合物のいずれかから得られる。製造コストの理由で、心
臓または筋肉の粗抽出物から本発明のトロポニンＩ、Ｔ
およびＣの安定組成物を製造することが当然好ましい。
３種類のトロポニンの混合物の起源に依存して、組成物
中で多少量変化のある該トロポニンを得ることが可能で
ある。好ましくは、本発明による溶液は、形成されたＩ
−Ｔ−Ｃ三成分複合体の最大量を得るために、等モル量
のトロポニンＩ、トロポニンＴおよびトロポニンＣを含
有する。
物起源のものであり、より詳細には、心臓および／また
は筋肉起源のものであってもよい。トロポニンＩ、Ｔお
よびＣは、心臓または筋肉の摩砕調製物の抽出物または
予め精製された３種類のトロポニンＩ、ＴおよびＣの混
合物のいずれかから得られる。製造コストの理由で、心
臓または筋肉の粗抽出物から本発明のトロポニンＩ、Ｔ
およびＣの安定組成物を製造することが当然好ましい。
３種類のトロポニンの混合物の起源に依存して、組成物
中で多少量変化のある該トロポニンを得ることが可能で
ある。好ましくは、本発明による溶液は、形成されたＩ
−Ｔ−Ｃ三成分複合体の最大量を得るために、等モル量
のトロポニンＩ、トロポニンＴおよびトロポニンＣを含
有する。
【００１２】このＩ−Ｔ−Ｃ三成分複合体は、本発明に
よるトロポニン組成物の安定性の基礎である。さらにま
た、トロポニンの製造方法に従って、タンパク質をさら
にお互いに安定化させ合うために、二価の陽イオン、よ
り詳細には、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムの
形態で供給されるカルシウムおよびマグネシウムを添加
してもよい。
よるトロポニン組成物の安定性の基礎である。さらにま
た、トロポニンの製造方法に従って、タンパク質をさら
にお互いに安定化させ合うために、二価の陽イオン、よ
り詳細には、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムの
形態で供給されるカルシウムおよびマグネシウムを添加
してもよい。
【００１３】本発明による溶液中のトロポニンＩ、Ｔお
よびＣの濃度は、一般にイムノアッセイで使用される濃
度に対応する。すなわち、０.０１ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ
／ｍｌ、好ましくは、０.１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍ
ｌであってもよい。有利な変法によると、本発明による
安定組成物は、好ましくは、トロポニンＩ−Ｔ−Ｃ複合
体の１０2〜５×１０6重量倍に等しい、１００μｍ〜１
００ｍＭのＣaＣl2またはＭgＣl2濃度を含有する。さら
に好ましくは、本発明による組成物は、２ｍＭ ＣaＣl2
を含有する。
よびＣの濃度は、一般にイムノアッセイで使用される濃
度に対応する。すなわち、０.０１ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ
／ｍｌ、好ましくは、０.１ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍ
ｌであってもよい。有利な変法によると、本発明による
安定組成物は、好ましくは、トロポニンＩ−Ｔ−Ｃ複合
体の１０2〜５×１０6重量倍に等しい、１００μｍ〜１
００ｍＭのＣaＣl2またはＭgＣl2濃度を含有する。さら
に好ましくは、本発明による組成物は、２ｍＭ ＣaＣl2
を含有する。
【００１４】もう一つの好ましい変法によると、本発明
による安定組成物は、０.２〜２％、好ましくは０.４〜
２％の比率でタンパク質負荷（protein loading）を含
有する。このタンパク質負荷は、例えば、ウシアルブミ
ン、ウシ胎児血清または正常ヒト血清のものである。さ
らに好ましくは、１０％の濃度で存在する正常ヒト血清
が組成物中で使用され、それは０.８％のオーダーのタ
ンパク質負荷に対応する。
による安定組成物は、０.２〜２％、好ましくは０.４〜
２％の比率でタンパク質負荷（protein loading）を含
有する。このタンパク質負荷は、例えば、ウシアルブミ
ン、ウシ胎児血清または正常ヒト血清のものである。さ
らに好ましくは、１０％の濃度で存在する正常ヒト血清
が組成物中で使用され、それは０.８％のオーダーのタ
ンパク質負荷に対応する。
【００１５】好ましくは、本発明による安定組成物は、
ｐＨ５.５〜６.５に、さらに好ましくはｐＨ６±０.１
に緩衝化されている。使用されるかもしれない緩衝剤
は、例えば、イミダゾール緩衝溶液、リン酸カリウム緩
衝溶液またはコハク酸ナトリウム緩衝溶液である。０.
１Ｍコハク酸ナトリウム緩衝溶液を使用することが好ま
しいであろう。
ｐＨ５.５〜６.５に、さらに好ましくはｐＨ６±０.１
に緩衝化されている。使用されるかもしれない緩衝剤
は、例えば、イミダゾール緩衝溶液、リン酸カリウム緩
衝溶液またはコハク酸ナトリウム緩衝溶液である。０.
１Ｍコハク酸ナトリウム緩衝溶液を使用することが好ま
しいであろう。
【００１６】本発明の主題は、所望により０.２ないし
２％のタンパク質負荷および塩化カルシウムまたは塩化
マグネシウムを含有していてもよい、好ましくは凍結乾
燥形態の、トロポニンの粉末状安定組成物でもある。
２％のタンパク質負荷および塩化カルシウムまたは塩化
マグネシウムを含有していてもよい、好ましくは凍結乾
燥形態の、トロポニンの粉末状安定組成物でもある。
【００１７】本発明による組成物は、トロポニンＩ、ト
ロポニンＴもしくはトロポニンＣ、またはトロポニン
Ｉ、ＴおよびＣのうちの２もしくは３種類についてのイ
ン・ビトロでの検量および／または対照診断試験のため
に有用である。
ロポニンＴもしくはトロポニンＣ、またはトロポニン
Ｉ、ＴおよびＣのうちの２もしくは３種類についてのイ
ン・ビトロでの検量および／または対照診断試験のため
に有用である。
【００１８】本発明の主題は、ヒトまたは動物の心臓ま
たは筋肉の摩砕調製物からのトロポニンＩ、トロポニン
ＴおよびトロポニンＣの抽出を行い（ここで、該抽出
は、プロテアーゼ阻害剤および二価の陽イオン、詳細に
は塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムの形態で供給
されるカルシウムおよびマグネシウムの存在下で行われ
る）、所望により、上記で得られた抽出物を、有利には
ｐＨ５.５ないし６.５の、プロテアーゼ阻害剤および二
価の陽イオン、詳細には塩化カルシウムまたは塩化マグ
ネシウムの形態で供給されるカルシウムおよびマグネシ
ウムからなる緩衝液に対して透析し、適切な濃度のトロ
ポニンＩ、Ｔおよび／またはＣを得るために、上記で得
られたトロポニンＩ、ＴおよびＣの溶液を、有利にはｐ
Ｈ５.５ないし６.５の、プロテアーゼ阻害剤、タンパク
質負荷および二価の陽イオン、詳細には塩化カルシウム
または塩化マグネシウムの形態で供給されるカルシウム
およびマグネシウムからなる緩衝液において希釈する
か、または、精製された等モル量のトロポニンＩ、Ｔお
よびＣを、有利にはｐＨ５.５ないし６.５の、タンパク
質負荷および二価の陽イオン、詳細には塩化カルシウム
または塩化マグネシウムの形態で供給されるカルシウム
およびマグネシウムからなる緩衝液中で混合することか
らなるトロポニンの安定組成物の製造方法でもある。
たは筋肉の摩砕調製物からのトロポニンＩ、トロポニン
ＴおよびトロポニンＣの抽出を行い（ここで、該抽出
は、プロテアーゼ阻害剤および二価の陽イオン、詳細に
は塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムの形態で供給
されるカルシウムおよびマグネシウムの存在下で行われ
る）、所望により、上記で得られた抽出物を、有利には
ｐＨ５.５ないし６.５の、プロテアーゼ阻害剤および二
価の陽イオン、詳細には塩化カルシウムまたは塩化マグ
ネシウムの形態で供給されるカルシウムおよびマグネシ
ウムからなる緩衝液に対して透析し、適切な濃度のトロ
ポニンＩ、Ｔおよび／またはＣを得るために、上記で得
られたトロポニンＩ、ＴおよびＣの溶液を、有利にはｐ
Ｈ５.５ないし６.５の、プロテアーゼ阻害剤、タンパク
質負荷および二価の陽イオン、詳細には塩化カルシウム
または塩化マグネシウムの形態で供給されるカルシウム
およびマグネシウムからなる緩衝液において希釈する
か、または、精製された等モル量のトロポニンＩ、Ｔお
よびＣを、有利にはｐＨ５.５ないし６.５の、タンパク
質負荷および二価の陽イオン、詳細には塩化カルシウム
または塩化マグネシウムの形態で供給されるカルシウム
およびマグネシウムからなる緩衝液中で混合することか
らなるトロポニンの安定組成物の製造方法でもある。
【００１９】本発明に記載した方法による心臓または筋
肉の摩砕調製物からの抽出により、安定組成物を得るこ
とができ、心臓トロポニンＩまたは心臓トロポニンＴの
ごとき分析物をアッセイするために使用してもよく、あ
るいは、同じ組成物について、例えば、心臓トロポニン
Ｉおよび心臓トロポニンＴのごとき２つの分析物をアッ
セイするために使用してもよい。
肉の摩砕調製物からの抽出により、安定組成物を得るこ
とができ、心臓トロポニンＩまたは心臓トロポニンＴの
ごとき分析物をアッセイするために使用してもよく、あ
るいは、同じ組成物について、例えば、心臓トロポニン
Ｉおよび心臓トロポニンＴのごとき２つの分析物をアッ
セイするために使用してもよい。
【００２０】以下に、本発明の具体例および比較安定性
試験の結果を記載する。
試験の結果を記載する。
【００２１】
【実施例】本発明によるトロポニンの安定組成物の製造
方法を以下の実施例に示す。これらの実施例において、
濃度は、得られた溶液の最終濃度によって表す。
方法を以下の実施例に示す。これらの実施例において、
濃度は、得られた溶液の最終濃度によって表す。
【００２２】安定組成物の製造に用いるプロトコールの
前に、以下の緩衝液を調製する： 抽出緩衝液： ９Ｍ 尿素 ７５ｍＭ トリス−ＨＣl、ｐＨ８ １ｍＭ ＣaＣl2 ６０ｍＭ β−メルカプトエタノール プロテアーゼ阻害剤 透析緩衝液： ０.１Ｍ コハク酸ナトリウム、ｐＨ６ ２ｍＭ ＣaＣl2 プロテアーゼ阻害剤 希釈緩衝液： ０.１Ｍ コハク酸ナトリウム、ｐＨ６ 正常ヒト血清（ＮＨＳ）、１０％ ２ｍＭ ＣaＣl2 プロテアーゼ阻害剤。
前に、以下の緩衝液を調製する： 抽出緩衝液： ９Ｍ 尿素 ７５ｍＭ トリス−ＨＣl、ｐＨ８ １ｍＭ ＣaＣl2 ６０ｍＭ β−メルカプトエタノール プロテアーゼ阻害剤 透析緩衝液： ０.１Ｍ コハク酸ナトリウム、ｐＨ６ ２ｍＭ ＣaＣl2 プロテアーゼ阻害剤 希釈緩衝液： ０.１Ｍ コハク酸ナトリウム、ｐＨ６ 正常ヒト血清（ＮＨＳ）、１０％ ２ｍＭ ＣaＣl2 プロテアーゼ阻害剤。
【００２３】上記の３つの緩衝液中で用いたプロテアー
ゼ阻害剤は、例えば、ＳＢＴＩ（シグマ（Ｓigma）社、
Ｔ９００３）、ＴＬＣＫ（シグマ社、Ｔ７２５４）、ペ
プスタチンＡ（シグマ社、Ｐ４２６５）、ＰＭＳＦおよ
びアンチカテプシンから選択されたものであってよい。
ゼ阻害剤は、例えば、ＳＢＴＩ（シグマ（Ｓigma）社、
Ｔ９００３）、ＴＬＣＫ（シグマ社、Ｔ７２５４）、ペ
プスタチンＡ（シグマ社、Ｐ４２６５）、ＰＭＳＦおよ
びアンチカテプシンから選択されたものであってよい。
【００２４】心臓または筋肉からの抽出を行うために用
いられる方法は、アメリカン・ハート・ジャーナル（Ａ
merican Ｈeart Ｊournal）、クリニカル・インベステ
ィゲーションズ（Ｃlinical Ｉnvestigations）、１９
８７年６月、第１１３巻、第６号「カルディアック−ス
ペシフィック・トロポニン−Ｉ・ラジオイムノアッセイ
・イン・ジ・ディアグノシス・オブ・アキュート・マイ
オカルディアル・インファークション（Ｃardiac-speci
fic ｔroponin-Ｉ radioimmunoassay in the diagnosis
of acute myocardial infarction）」、第１３３４頁
にさらに詳細に開示されている。
いられる方法は、アメリカン・ハート・ジャーナル（Ａ
merican Ｈeart Ｊournal）、クリニカル・インベステ
ィゲーションズ（Ｃlinical Ｉnvestigations）、１９
８７年６月、第１１３巻、第６号「カルディアック−ス
ペシフィック・トロポニン−Ｉ・ラジオイムノアッセイ
・イン・ジ・ディアグノシス・オブ・アキュート・マイ
オカルディアル・インファークション（Ｃardiac-speci
fic ｔroponin-Ｉ radioimmunoassay in the diagnosis
of acute myocardial infarction）」、第１３３４頁
にさらに詳細に開示されている。
【００２５】実施例１：ヒト心臓トロポニンＩ−Ｔ−Ｃ
組成物の調製 トロポニンＩ、Ｔ、Ｃの混合物を、上記抽出緩衝液３０
ｍｌ中のヒト心臓の摩砕調製物１グラムから抽出する。
混合物を棒磁石を用いて１５分間撹拌し、１０,０００
ｇで２０分間遠心する（＋１０℃で）。上清を回収し、
透析緩衝液に対して２時間、次いで、緩衝液を交換して
＋４℃で一晩透析する。次いで、得られた溶液を希釈緩
衝液で１／５０に希釈する。濃度６３ｎｇ／ｍｌのトロ
ポニンＩを含有する組成物が得られる。
組成物の調製 トロポニンＩ、Ｔ、Ｃの混合物を、上記抽出緩衝液３０
ｍｌ中のヒト心臓の摩砕調製物１グラムから抽出する。
混合物を棒磁石を用いて１５分間撹拌し、１０,０００
ｇで２０分間遠心する（＋１０℃で）。上清を回収し、
透析緩衝液に対して２時間、次いで、緩衝液を交換して
＋４℃で一晩透析する。次いで、得られた溶液を希釈緩
衝液で１／５０に希釈する。濃度６３ｎｇ／ｍｌのトロ
ポニンＩを含有する組成物が得られる。
【００２６】実施例２：ヒト心臓トロポニンＩ−Ｔ−Ｃ
組成物の調製 実施例１に記載したと同様のプロトコールを用いるが、
上清は、抽出後に透析しない。濃度８２ｎｇ／ｍｌのト
ロポニンＩを含有する組成物が得られる。
組成物の調製 実施例１に記載したと同様のプロトコールを用いるが、
上清は、抽出後に透析しない。濃度８２ｎｇ／ｍｌのト
ロポニンＩを含有する組成物が得られる。
【００２７】実施例３：ヒト心臓トロポニンＩ−Ｔ−Ｃ
組成物の調製 実施例１と同様のプロトコールを用いるが、抽出、透析
および希釈緩衝液にさらに４ｍＭ ＭgＣl2を添加す
る。濃度３１ｎｇ／ｍｌのトロポニンＩを含有する組成
物が得られる。
組成物の調製 実施例１と同様のプロトコールを用いるが、抽出、透析
および希釈緩衝液にさらに４ｍＭ ＭgＣl2を添加す
る。濃度３１ｎｇ／ｍｌのトロポニンＩを含有する組成
物が得られる。
【００２８】実施例４：ヒト心臓トロポニンＩ−Ｔ−Ｃ
組成物の調製 実施例２に記載したと同様のプロトコールを用いるが、
抽出および希釈緩衝液にさらに４ｍＭ ＭgＣl2を添加
する。濃度４６ｎｇ／ｍｌのトロポニンＩを含有する組
成物が得られる。
組成物の調製 実施例２に記載したと同様のプロトコールを用いるが、
抽出および希釈緩衝液にさらに４ｍＭ ＭgＣl2を添加
する。濃度４６ｎｇ／ｍｌのトロポニンＩを含有する組
成物が得られる。
【００２９】実施例５：精製したトロポニンからのトロ
ポニンＩ−Ｔ−Ｃ組成物の調製 濃度１０μｇ／ｍｌのトロポニンＩ溶液１０μｌ、濃度
１０μｇ／ｍｌのトロポニンＣ溶液１０μｌおよび濃度
５μｇ／ｍｌのトロポニンＴ溶液２０μｌを、１０％正
常ヒト血漿およびＣaＣl2・２Ｈ2Ｏ ２２２μｇを含有
するコハク酸ナトリウム（０.１Ｍ、ＰＨ６）を含有す
る緩衝液９６０μｌ中に導入する。これらの操作は、例
えば孔径０.２２μｍのフィルターを通過させることな
どによって滅菌されたトロポニンＩ、トロポニンＴおよ
びトロポニンＣ溶液を用いて無菌環境下で行うことが好
ましい。得られた、濃度１００ｎｇ／ｍｌのトロポニン
Ｉ、濃度１００ｎｇ／ｍｌのトロポニンＴおよび１００
ｎｇ／ｍｌのトロポニンＣを有する溶液を用いて、貯蔵
緩衝液（最終濃度１％になるように抗菌剤を添加した希
釈緩衝液）で０.１ないし５０ｎｇ／ｍｌのトロポニン
Ｉの一連の希釈物を調製する。同じシリーズをトロポニ
ンＴおよびＣについて調製してもよい。
ポニンＩ−Ｔ−Ｃ組成物の調製 濃度１０μｇ／ｍｌのトロポニンＩ溶液１０μｌ、濃度
１０μｇ／ｍｌのトロポニンＣ溶液１０μｌおよび濃度
５μｇ／ｍｌのトロポニンＴ溶液２０μｌを、１０％正
常ヒト血漿およびＣaＣl2・２Ｈ2Ｏ ２２２μｇを含有
するコハク酸ナトリウム（０.１Ｍ、ＰＨ６）を含有す
る緩衝液９６０μｌ中に導入する。これらの操作は、例
えば孔径０.２２μｍのフィルターを通過させることな
どによって滅菌されたトロポニンＩ、トロポニンＴおよ
びトロポニンＣ溶液を用いて無菌環境下で行うことが好
ましい。得られた、濃度１００ｎｇ／ｍｌのトロポニン
Ｉ、濃度１００ｎｇ／ｍｌのトロポニンＴおよび１００
ｎｇ／ｍｌのトロポニンＣを有する溶液を用いて、貯蔵
緩衝液（最終濃度１％になるように抗菌剤を添加した希
釈緩衝液）で０.１ないし５０ｎｇ／ｍｌのトロポニン
Ｉの一連の希釈物を調製する。同じシリーズをトロポニ
ンＴおよびＣについて調製してもよい。
【００３０】精製したトロポニンの組成物を用いて比較
安定性試験を行うために、実施例１〜４において調製し
た組成物を以下の様式：溶液の形態で貯蔵されるであろ
うシリーズについて、無菌条件下、滅菌ナルゲン（Ｎal
geneR）バイアル中に、凍結乾燥されるであろうシリー
ズについて、無菌条件下、滅菌ガラスバイアル中に分配
する。
安定性試験を行うために、実施例１〜４において調製し
た組成物を以下の様式：溶液の形態で貯蔵されるであろ
うシリーズについて、無菌条件下、滅菌ナルゲン（Ｎal
geneR）バイアル中に、凍結乾燥されるであろうシリー
ズについて、無菌条件下、滅菌ガラスバイアル中に分配
する。
【００３１】本発明によるトロポニンの安定組成物は、
上記文献に開示されたプロトコール［アメリカン・ハー
ト・ジャーナル（Ａmerican Ｈeart Ｊournal）、クリ
ニカル・インベスティゲーションズ（Ｃlinical Ｉnves
tigations）、１９８７年６月、第１１３巻、第６号
「カルディアック−スペシフィック・トロポニン−Ｉ・
ラジオイムノアッセイ・イン・ザ・ディアグノシス・オ
ブ・アキュート・マイオカルディアル・インファークシ
ョン（Ｃardiac-specific troponin-Ｉ radioimmunoass
ay in the diagnosis of acute myocardial infarctio
n）」、第１３３４頁］を用いて、ヒト由来の筋肉また
は動物由来の心臓もしくは筋肉から製造してもよい。
上記文献に開示されたプロトコール［アメリカン・ハー
ト・ジャーナル（Ａmerican Ｈeart Ｊournal）、クリ
ニカル・インベスティゲーションズ（Ｃlinical Ｉnves
tigations）、１９８７年６月、第１１３巻、第６号
「カルディアック−スペシフィック・トロポニン−Ｉ・
ラジオイムノアッセイ・イン・ザ・ディアグノシス・オ
ブ・アキュート・マイオカルディアル・インファークシ
ョン（Ｃardiac-specific troponin-Ｉ radioimmunoass
ay in the diagnosis of acute myocardial infarctio
n）」、第１３３４頁］を用いて、ヒト由来の筋肉また
は動物由来の心臓もしくは筋肉から製造してもよい。
【００３２】比較安定性試験の実施：実施例１〜４に記
載した濃縮溶液から、１ｎｇ／ｍｌオーダーのトロポニ
ンＩ濃度を含有するトロポニン溶液を調製する。このた
めに、該溶液を貯蔵緩衝液（最終濃度１％になるように
カーソン（ＫathonR）を添加した希釈緩衝液）で適当に
希釈する。ハース（Ｈaas）社によって販売されている
抗菌剤であるカーソンは、５−クロロ−２−メチル−４
−イソチアゾリン−３−オンおよび２−メチル−４−イ
ソチアゾリン−３−オン（１.５％）からなる。
載した濃縮溶液から、１ｎｇ／ｍｌオーダーのトロポニ
ンＩ濃度を含有するトロポニン溶液を調製する。このた
めに、該溶液を貯蔵緩衝液（最終濃度１％になるように
カーソン（ＫathonR）を添加した希釈緩衝液）で適当に
希釈する。ハース（Ｈaas）社によって販売されている
抗菌剤であるカーソンは、５−クロロ−２−メチル−４
−イソチアゾリン−３−オンおよび２−メチル−４−イ
ソチアゾリン−３−オン（１.５％）からなる。
【００３３】各実施例について、液体および凍結乾燥物
のバイアルが利用可能である。凍結乾燥物のバイアル
は、再構成後に安定性をモニターするために、再水和さ
れる。０日（Ｄ０）は、再水和された日に対応する。表
１において、これらのバイアルをＬyoph. liq.と記す。
液体のバイアルは、４℃で保存され、安定性についてモ
ニターされる。０日（Ｄ０）は、調製日に対応する。表
２において、これらのバイアルをＬiq.と記す。
のバイアルが利用可能である。凍結乾燥物のバイアル
は、再構成後に安定性をモニターするために、再水和さ
れる。０日（Ｄ０）は、再水和された日に対応する。表
１において、これらのバイアルをＬyoph. liq.と記す。
液体のバイアルは、４℃で保存され、安定性についてモ
ニターされる。０日（Ｄ０）は、調製日に対応する。表
２において、これらのバイアルをＬiq.と記す。
【００３４】定性的対照は、正常ヒト血清中の精製トロ
ポニンＩからなる凍結乾燥参照物で行われる（表１にお
いて「参照」と記す）。この参照は必要なときに調製さ
れ、使用される。
ポニンＩからなる凍結乾燥参照物で行われる（表１にお
いて「参照」と記す）。この参照は必要なときに調製さ
れ、使用される。
【００３５】各試験において、調製されたシリーズのポ
イントを、ＦＲ−Ａ−２,７０１,９５４の下に公開され
た特許出願において調製されたもののごとき凍結乾燥ト
ロポニンＩシリーズについて測定する（トロポニンＩお
よびＣaＣl2の等量当たり５モル等量のトロポニン
Ｃ）。比較方法によって、ＦＲ−Ａ−２,７０１,９５４
の下に公開された特許出願において記載された発明に従
って調製された液体トロポニンＩの溶液を４℃で安定性
についてモニターする。表１および２において、この比
較溶液を「ＦＲ−Ａ−２,７０１,９５４」と記す。
イントを、ＦＲ−Ａ−２,７０１,９５４の下に公開され
た特許出願において調製されたもののごとき凍結乾燥ト
ロポニンＩシリーズについて測定する（トロポニンＩお
よびＣaＣl2の等量当たり５モル等量のトロポニン
Ｃ）。比較方法によって、ＦＲ−Ａ−２,７０１,９５４
の下に公開された特許出願において記載された発明に従
って調製された液体トロポニンＩの溶液を４℃で安定性
についてモニターする。表１および２において、この比
較溶液を「ＦＲ−Ａ−２,７０１,９５４」と記す。
【００３６】表１および２は、各々、上記参照組成物と
比較した、凍結乾燥形態および液体形態での本発明組成
物の安定性についての結果を示す（濃度測定値は、ｎｇ
／ｍｌで示す）。
比較した、凍結乾燥形態および液体形態での本発明組成
物の安定性についての結果を示す（濃度測定値は、ｎｇ
／ｍｌで示す）。
【００３７】本方法によるトロポニンのアッセイは、特
許出願ＦＲ−Ａ−２,７０１,９５４に開示されている。
測定した溶液の初期濃度が同じではないことに注意する
べきである。結果として、安定性に関する結論に達する
ためには、同じ溶液についてずっと観察された濃度の変
動を考慮した。
許出願ＦＲ−Ａ−２,７０１,９５４に開示されている。
測定した溶液の初期濃度が同じではないことに注意する
べきである。結果として、安定性に関する結論に達する
ためには、同じ溶液についてずっと観察された濃度の変
動を考慮した。
【００３８】
【表１】
【００３９】
【表２】
【００４０】実施された試験の結果により、本発明によ
る実施例１〜４の組成物が、１ヶ月（Ｄ＋３０）で、対
照のＦＲ−２,７０１,９５４と比較して高い安定性を示
すことが判明する。従って、本発明組成物は、すべて、
４℃で数時間のみの安定性を示す精製トロポニンＩの標
準組成物と比較してより安定である。これらの結果は、
本発明のＩ−Ｔ−Ｃトロポニン組成物が増強された安定
性を示し、かくして、ヒトまたは動物の血清または血漿
における心臓および／または骨格トロポニン（類）をア
ッセイするために意図されたイムノアッセイにおいて、
標準および／または対照として使用できる。
る実施例１〜４の組成物が、１ヶ月（Ｄ＋３０）で、対
照のＦＲ−２,７０１,９５４と比較して高い安定性を示
すことが判明する。従って、本発明組成物は、すべて、
４℃で数時間のみの安定性を示す精製トロポニンＩの標
準組成物と比較してより安定である。これらの結果は、
本発明のＩ−Ｔ−Ｃトロポニン組成物が増強された安定
性を示し、かくして、ヒトまたは動物の血清または血漿
における心臓および／または骨格トロポニン（類）をア
ッセイするために意図されたイムノアッセイにおいて、
標準および／または対照として使用できる。
Claims (15)
- 【請求項１】 水溶液の状態でトロポニンＩ、トロポニ
ンＴおよびトロポニンＣをＩ−Ｔ−Ｃ三成分複合体の形
態で含有することを特徴とするイムノアッセイ用のトロ
ポニンの安定組成物。 - 【請求項２】 二価の陽イオンを含有する請求項１記載
の組成物。 - 【請求項３】 ＣaＣl2またはＭgＣl2を含有する請求項
１記載の組成物。 - 【請求項４】 Ｉ−Ｔ−Ｃ三成分複合体の濃度が０.０
１ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌであり、ＣaＣl2の濃度が
１００μＭ〜１００ｍＭである請求項３記載の組成物。 - 【請求項５】 ５.５〜６.５のｐＨに緩衝化された水溶
液の状態である請求項１〜４のいずれか１項記載の組成
物。 - 【請求項６】 ０.２〜２重量％のタンパク質負荷を含
有する請求項１〜５のいずれか１項記載の組成物。 - 【請求項７】 タンパク質負荷が１０容量％の濃度の正
常ヒト血清の形態である請求項１〜６のいずれか１項記
載の組成物。 - 【請求項８】 トロポニンＩ、トロポニンＴおよびトロ
ポニンＣがヒトまたは動物の心臓の摩砕調製物の抽出に
より得られる請求項１記載の組成物。 - 【請求項９】 トロポニンＩ、トロポニンＴおよびトロ
ポニンＣがヒトまたは動物の筋肉の摩砕調製物の抽出に
より得られる請求項１記載の組成物。 - 【請求項１０】 トロポニンＩ、トロポニンＴおよびト
ロポニンＣが精製トロポニンＩ、精製トロポニンＴおよ
び精製トロポニンＣの混合物から得られる請求項１記載
の組成物。 - 【請求項１１】 トロポニンＩ、トロポニンＴ、トロポ
ニンＣおよび所望により０.２〜２％のさらなるタンパ
ク質負荷および二価の陽イオンを含有することを特徴と
する、請求項１〜１０のいずれか１項記載の組成物の製
造用の粉末組成物。 - 【請求項１２】 凍結乾燥形態である請求項１１記載の
組成物。 - 【請求項１３】 トロポニンＩ、トロポニンＴもしくは
トロポニンＣについて、またはトロポニンＩ、Ｔおよび
Ｃのうち２または３種類についてのイン・ビトロでの検
量および／または対照診断試験のための請求項１〜１２
のいずれか１項記載の組成物の使用であって、該トロポ
ニンが心臓または骨格起源のものであってもよい使用。 - 【請求項１４】 トロポニンＩ、トロポニンＴおよびト
ロポニンＣの抽出がヒトまたは動物の心臓または筋肉の
摩砕調製物について行われ（該抽出は、プロテアーゼ阻
害剤および二価の陽イオンの存在下で行われる）、 上記で得られた抽出物が、所望により、二価の陽イオン
からなる緩衝液に対して透析され、 上記で得られたトロポニンＩ、ＴおよびＣの溶液が、適
切な濃度のトロポニンＩ、Ｔおよび／またはＣを得るた
めに、プロテアーゼ阻害剤、タンパク質負荷および二価
の陽イオンからなる緩衝液において希釈されることを特
徴とする、請求項１〜９のいずれか１項記載の組成物の
製造方法。 - 【請求項１５】 透析および希釈がｐＨ５.５〜６.５で
行われる請求項１４記載の組成物の製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9505788 | 1995-05-16 | ||
| FR9505788A FR2734267B1 (fr) | 1995-05-16 | 1995-05-16 | Composition stabilisee de troponine pour immunoessais et procede de preparation d'une telle composition stabilisee |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0921804A true JPH0921804A (ja) | 1997-01-21 |
| JP3672672B2 JP3672672B2 (ja) | 2005-07-20 |
Family
ID=9479025
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15877096A Expired - Lifetime JP3672672B2 (ja) | 1995-05-16 | 1996-05-15 | イムノアッセイ用のトロポニンの安定組成物およびそのような安定組成物の製法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20010006683A1 (ja) |
| EP (1) | EP0743522B1 (ja) |
| JP (1) | JP3672672B2 (ja) |
| AT (1) | ATE169740T1 (ja) |
| CA (1) | CA2176655C (ja) |
| DE (1) | DE69600512T2 (ja) |
| DK (1) | DK0743522T3 (ja) |
| ES (1) | ES2122768T3 (ja) |
| FR (1) | FR2734267B1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012115221A1 (ja) | 2011-02-25 | 2012-08-30 | 三菱化学メディエンス株式会社 | 心筋トロポニンの測定法 |
| JP2012188403A (ja) * | 2011-03-11 | 2012-10-04 | Sanyo Chem Ind Ltd | 凍結乾燥方法 |
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|---|---|---|---|---|
| EP0938678B1 (en) * | 1996-06-25 | 2003-09-03 | OY Aboatech AB | Method and kit for the diagnosis of troponin i |
| US7285418B2 (en) | 1996-06-25 | 2007-10-23 | Hytest Ltd. | Method and kit for the diagnosis of troponin I |
| DE19647927A1 (de) * | 1996-11-20 | 1998-05-28 | Bayer Ag | Verfahren zur Herstellung einer stabilen Troponin I Präparation und dessen Verwendung als Kalibrator in Immunoassays |
| US5834210A (en) * | 1997-05-23 | 1998-11-10 | Spectral Diagnostics, Inc. | Stable troponin subunits and complexes |
| US6248869B1 (en) | 1997-05-29 | 2001-06-19 | Medical Analysis Systems, Inc. | Troponin I forms and use of the same |
| EP0983299A1 (en) * | 1997-05-29 | 2000-03-08 | Medical Analysis Systems, Inc. | Covalently coupled troponin complexes |
| EP1000140A1 (en) * | 1997-06-13 | 2000-05-17 | Medical Analysis Systems, Inc. (MAS) | Stabilized compositions of cardiac markers |
| WO2006116005A2 (en) * | 2005-04-28 | 2006-11-02 | Abbott Laboratories | Stabilization of cardiac troponin |
| CN113125745B (zh) * | 2019-12-31 | 2022-10-28 | 瑞博奥(广州)生物科技股份有限公司 | 一种心脏功能检测试剂盒 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2027434C (en) * | 1990-10-12 | 1999-01-05 | George Jackowski | Diagnostic kit for diagnosing and distinguishing chest pain in early onset thereof |
| DE4243648A1 (de) * | 1992-12-23 | 1994-07-07 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur Bestimmung von Herzmuskelnekrosen mittels Antikörper gegen das N-terminale Troponin I-Peptid |
| FR2701954B1 (fr) * | 1993-02-23 | 1995-07-07 | Pasteur Sanofi Diagnostics | Composition stabilisée de troponine pour immunoessais et procédé de stabilisation de troponine pour immunoessais. |
| JPH09503050A (ja) * | 1993-05-17 | 1997-03-25 | フォートロン バイオサイエンス インク． | 心臓トロポニン▲ｉ▼のアッセイ |
| DE4420742A1 (de) * | 1993-10-20 | 1995-04-27 | Boehringer Mannheim Gmbh | Synthetischer Standard für Immunoassays |
-
1995
- 1995-05-16 FR FR9505788A patent/FR2734267B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-05-13 ES ES96401041T patent/ES2122768T3/es not_active Expired - Lifetime
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