JPH10170516A - ラクトフェリンの希釈保存液 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 容器へのラクトフェリンの吸着を防止し、ラ
クトフェリン濃度を安定に保つことができるラクトフェ
リンの希釈保存液を提供する。 【解決手段】 １０ミリモル／リットルの水酸化ナトリ
ウム水溶液５０ｍｌに牛乳由来の精製カゼイン０．５ｇ
を添加して攪拌溶解後、リン酸２水素１ナトリウム塩を
少量づつ添加してｐＨ７．０とした後、イオン交換水で
全量を１００ｍｌとして、牛由来カゼイン濃度が０．５
（Ｗ／Ｖ）％の希釈保存液を得る。カゼイン濃度は０．
００１〜１５（Ｗ／Ｖ）％の範囲が用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、粉末ラクトフェリ
ンの溶解やラクトフェリンを含有する生体試料等を希釈
する場合に用いる液であり、溶解・希釈した液中のラク
トフェリン濃度を安定に保つことのできるラクトフェリ
ンの希釈保存液に関する。

【０００２】

【従来の技術】ラクトフェリンは、１９３９年ソレンセ
ン（Sφrensen et al.）らによって牛の乳汁から分離さ
れた糖蛋白質であり、人では母乳、血液、涙液等の種々
の体液中にヒトラクトフェリンが分泌されている（新飯
田裕一ら：医学のあゆみ，１３２（４），３０７頁，昭
和６０年）。

【０００３】人血液中のラクトフェリン量の変動は、膵
臓癌の発症と関連するとして、米島正廣（日本消化器病
学会誌，第７９巻，第６号，１３０９頁，昭和５７年）
の他、多くの研究者が免疫測定法を中心に、放射免疫測
定法（ＲＩＡ），酵素免疫測定法（ＥＩＡ）等を開発し
ている。免疫測定法は、抗原と抗体の高い反応特異性を
利用した同定・定量方法であり、詳細は生化学事典（株
式会社 東京化学同人，１９９０年１１月２２日発行，
第２版，第１３９頁）等に記載されている。

【０００４】たとえば、ヒトラクトフェリンの酵素免疫
測定法は、数種のヒトラクトフェリン濃度既知の標準水
溶液と測定試料を並行して該法で測定し、各標準水溶液
の吸光度測定値とヒトラクトフェリン濃度の関係図を作
成した後、測定試料の吸光度測定値をこの関係図にあて
はめてヒトラクトフェリン濃度を読みとる。

【０００５】従来、ラクトフェリンは水溶液にすると徐
々に容器に物理吸着し、水溶液中のラクトフェリン濃度
が経時的に低下するため、上記の免疫測定法等で正しい
濃度を定量することが困難であった。この事例として、
バーゲンス（Henrik S.Birgens:Danish Medical Bullet
in, 38(3),244,1991）は、ラクトフェリンがガラスやプ
ラスチック容器に強く物理吸着しやすいと報告してお
り、アントンセンら（S.Antonsen, et al.:Scand.J.Cli
n.Lab.Invest,53,133-144,1993）は、酵素免疫測定法
（ＥＩＡ）での健常者の血液中ヒトラクトフェリン量の
報告値［エステベノンら（Estevenon et al.:134±79μ
g/l），チャンら（Chung et al.:540±260μg/l）］を
紹介し、報告者により数倍も値が異なることを指摘して
いる。

【０００６】ヒトラクトフェリンの測定方法に関する公
開特許公報は、昭５８−２０１０６７（酵素免疫測定
法）や昭６０−２２４０６６（ラテックス粒子を用いた
免疫測定法）等で開示されているが、水溶液中のヒトラ
クトフェリン濃度を安定に保つ方法に関しては示してい
ない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】ラクトフェリンを定量
する方法として開発された各種の免疫測定法を利用し
て、正しいラクトフェリン量を定量するためには、ラク
トフェリン濃度が安定に保たれた標準水溶液が必要であ
る。また、高検出感度の該測定法に用いる測定試料は、
数十倍から数万倍に希釈される場合が多く、希釈した測
定試料のラクトフェリン濃度が安定に保たれないと、希
釈前の測定試料のラクトフェリン濃度を正しく算出する
ことができない。測定試料が病態判定の目的で採取した
血液や涙液の場合は、病院等での検体採取後に外部施設
へ検体輸送して、外部施設でラクトフェリン定量を行う
場合も多く、少なくとも採取後１週間程度は検体中ラク
トフェリン濃度を安定に保つ必要がある。

【０００８】以上のように、ラクトフェリンを該免疫測
定法を用いて正しく定量するためには、ラクトフェリン
濃度を安定に保つことのできる溶液組成の開発が必須で
ある。

【０００９】容器に吸着しやすいタンパク質の定量を該
免疫測定法で行う場合、１（Ｗ／Ｖ）％牛血清アルブミ
ン水溶液等の既知タンパク質水溶液で測定対象のタンパ
ク質を希釈し、測定対象タンパク質の容器への物理吸着
を防止する方法が一般的である。

【００１０】この方法を応用した例として、アントンセ
ンら（S.Antonsen, et al.:Scand.J.Clin.Lab.Invest,5
3,133-144,1993）は、１９７１年以降の文献報告例を比
較検討して、ヒトラクトフェリン水溶液に牛血清アルブ
ミン、塩化ナトリウムおよび硫酸アンモニウムを添加す
ることでヒトラクトフェリンの容器への吸着が防止でき
ると報告しているが、これらを添加しても徐々に溶液中
のヒトラクトフェリン濃度が低下し、ヒトラクトフェリ
ン濃度を安定に保つことが困難である。

【００１１】以上の様に、従来の方法では水溶液のヒト
ラクトフェリン濃度を安定に保つことが困難であるた
め、正しいヒトラクトフェリン濃度を測定するために
は、測定毎にヒトラクトフェリン粉体を使用時にその都
度溶解し、標準水溶液を調製することが強いられて来
た。また、アントンセンら（S.Antonsen, et al.:Scan
d.J.Clin.Lab.Invest,53,133-144,1993）の文献報告例
の様に、免疫測定法で血液や涙液等の体液中ヒトラクト
フェリン濃度を定量する場合は、血液や涙液を数十から
数万倍に希釈して測定するため、希釈液中のヒトラクト
フェリンが容器に物理吸着し、実際のヒトラクトフェリ
ン濃度とは異なった定量値が得られる。

【００１２】本発明は、これらの問題点を鑑み、容器へ
のラクトフェリンの吸着を防止し、ラクトフェリン濃度
を安定に保つことができるラクトフェリンの希釈保存液
の提供を目的とする。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記の課
題を達成するために鋭意検討した結果、ラクトフェリン
水溶液にカゼインを添加することにより、水溶液のラク
トフェリン濃度が安定に保てることを見いだして本発明
に到達した。

【００１４】すなわち、本発明のラクトフェリンの希釈
保存液は、水とカゼインを少なくとも含有しており、カ
ゼイン濃度が０．００１〜１５（Ｗ／Ｖ）％であること
を特徴とする。

【００１５】また、前記本発明のラクトフェリンの希釈
保存液に於いては、希釈保存液のｐＨが５．０〜９．０
であることが好ましい。

【００１６】

【発明の実施の形態】本発明のラクトフェリンの希釈保
存液によれば、カゼインが特定の濃度で含有されている
ので、水溶液中のヒトラクトフェリンが容器へ物理吸着
することを防止でき、従ってヒトラクトフェリン濃度が
安定な標準水溶液が得られる。すなわち、測定毎にヒト
ラクトフェリン粉体をその都度溶解し、標準水溶液を調
製する手間を省き、免疫測定法等の測定操作を簡易にす
ることができる。また、血液や涙液等の体液を測定試料
とする場合は、測定試料を本発明の希釈保存液に添加・
希釈することにより、液中のヒトラクトフェリンが保存
容器に物理吸着して減少することを防止できるので、正
しいヒトラクトフェリン濃度が定量できる。

【００１７】本発明の希釈保存液の調製に用いるカゼイ
ンは、特に由来を限定しないが、牛由来の精製カゼイン
が安価であり、好ましく用いられる。本発明の希釈保存
液のカゼイン濃度は０．００１〜１５（Ｗ／Ｖ）％であ
ることが必要であり、カゼイン濃度が０．００１（Ｗ／
Ｖ）％より小さいと、ラクトフェリンの保存容器への物
理吸着を有効に防止することができないので好ましくな
い。カゼイン濃度が１５（Ｗ／Ｖ）％より大きい場合に
は、カゼインが溶解せず、かつどろどろの粘度の高い液
になるので、ラクトフェリンの希釈保存液としては不適
当である。カゼイン濃度は濃すぎると、保存中に自己凝
集して沈殿発生の危険性が高まるので、１（Ｗ／Ｖ）％
濃度以下がより好ましい。

【００１８】本発明の希釈保存液は、カゼインを１０ミ
リモル／リットル程度の水酸化ナトリウム水溶液で溶解
した後に、希塩酸で中和して調製することもできるが、
中和にリン酸塩（一般にＮａ塩やＫ塩が用いられる。以
下塩については同様である。）、クエン酸塩、酢酸塩、
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等の生化学分
野で汎用されているｐＨ緩衝剤を添加しても良く、ｐＨ
緩衝剤としてはリン酸塩が好ましく用いられる。ｐＨ緩
衝剤の濃度は、特に限定する必要は無いが、０．０１〜
１モル／リットル程度の濃度が好ましく用いられる。

【００１９】本発明の希釈保存液は、カゼイン以外のタ
ンパク質（例えば牛血清アルブミン等）、塩（例えば塩
化ナトリウム等）、界面活性剤（例えばポリオキシエチ
レンソルビタンモノラウレート等）など、本発明の作用
効果を阻害しない範囲で必要に応じて添加することは差
し支えない。

【００２０】本発明の希釈保存液のｐＨは、ラクトフェ
リンが加水分解せず、免疫測定法等で抗原と抗体の反応
を妨害しない弱酸性から弱アルカリ性で、ｐＨ５．０〜
９．０にすることが好ましく、ｐＨ７．０〜８．０程度
が一層好ましい。

【００２１】

【実施例】以下に本発明の理解を容易にするため、具体
的な実施例を示してより詳細に説明するが、本発明はこ
れらの実施例になんら限定されるものではない。

【００２２】（実施例１）牛由来カゼインを用いた希釈
保存液の調製 １０ミリモル／リットルの水酸化ナトリウム水溶液５０
ｍｌに牛乳由来の精製カゼイン０．５ｇを添加して攪拌
溶解後、リン酸２水素１ナトリウム塩を少量づつ添加し
てｐＨ７．０とした後、イオン交換水で全量を１００ｍ
ｌとして、牛由来カゼイン濃度が０．５（Ｗ／Ｖ）％の
希釈保存液を得た。

【００２３】（実施例２）ヒトラクトフェリンの酵素免
疫測定 抗体固定マイクロプレートの調製 酵素免疫測定用の９６穴マイクロプレート（コースター
社製）の各穴にヒツジ由来抗ヒトラクトフェリン抗体
（ＩｇＧ分画，バインディングサイト製）の１０μｇ／
ｍｌ水溶液（０．９（Ｗ／Ｖ）％塩化ナトリウム含有）
１００μｌを分注して、４℃で一昼夜静置して、マイク
ロプレートの各穴の壁面にヒツジ由来抗ヒトラクトフェ
リン抗体を固定した。その後、マイクロプレートを逆さ
まにして、分注した抗体水溶液を除去し、精製水３００
μｌを各穴に分注し、穴内に残存している抗体水溶液を
希釈洗浄した。同様の操作を３回繰り返し、十分に洗浄
して、マイクロプレートの各穴の壁面に固定されなかっ
た余分のヒツジ由来抗ヒトラクトフェリン抗体を除去し
た。つづいて、１（ｗ／ｖ）％牛血清アルブミン水溶液
（１０ミリモル／リットル リン酸緩衝液ｐＨ７．４）
３５０μｌを各穴に分注して、室温で２時間静置した。
（この操作は、抗原抗体反応により、下記のの操作で
ヒトラクトフェリンをマイクロプレートの各穴の壁面に
固定されたヒツジ由来抗ヒトラクトフェリン抗体と反応
させる際に、マイクロプレートの各穴の壁面中のヒツジ
由来抗ヒトラクトフェリン抗体が固定されていない部分
にヒトラクトフェリンが物理吸着しない様に、マスクと
して牛血清アルブミンをあらかじめ固定しておくための
操作である。）。その後、分注した牛血清アルブミン水
溶液を除去し、精製水３００μｌを各穴に分注し、穴内
に残存している牛血清アルブミン水溶液を希釈洗浄し
た。同様の操作を３回繰り返し、穴壁に固定されていな
い残存している牛血清アルブミンを十分に除去した後に
測定に用いた。

【００２４】ヒトラクトフェリンの標準水溶液の調製 ヒトラクトフェリン（シグマ社製）１ｍｇを秤量し、実
施例１で調製したラクトフェリンの希釈保存液１ｍｌで
溶解した。さらに本液を該希釈保存液で段階的に希釈す
ることにより、ヒトラクトフェリン濃度２５，５０，１
００ｎｇ／ｍｌの標準水溶液を調製した。

【００２５】また、上記の希釈保存液に代えて、比較の
ため、１（Ｗ／Ｖ）％牛血清アルブミン水溶液を用い、
上記希釈操作に従ってヒトラクトフェリン濃度２５，５
０，１００ｎｇ／ｍｌの標準水溶液を調製した。

【００２６】測定試料（涙液）の調製 ヒト涙液を濾紙片で１０μｌ採取し、実施例１の希釈保
存液１ｍｌ中に濾紙片を投入した。静かに攪拌後、該液
１０μｌをマイクロピペットで取り、前記の希釈保存液
１ｍｌと十分混合した。

【００２７】涙液中ラクトフェリン濃度の定量操作 で調製した抗体固定マイクロプレートの穴に、それぞ
れ、上記で調製した本発明の希釈保存液で調製した標
準水溶液および牛血清アルブミン水溶液を用いて調製し
た標準水溶液、ヒトラクトフェリンが添加されていない
ブランクの本発明の希釈保存液、ヒトラクトフェリンが
添加されていないブランクの１（Ｗ／Ｖ）％牛血清アル
ブミン水溶液、およびで調製した測定試料の各５０μ
ｌを別々に加え、マイクロプレート用攪拌器で１分間攪
拌した後、室温で３０分間静置した。静置後、マイクロ
プレートを逆さまにして、各穴に分注した液を除去し、
０．９（Ｗ／Ｖ）％塩化ナトリウム水溶液３００μｌを
各穴に分注し、マイクロプレート用攪拌器で１分間攪拌
した後、上記操作に従って液を除去した。この操作を３
回繰り返した後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ由来抗ヒト
ラクトフェリン抗体水溶液（１０ミリモル／リットル
リン酸緩衝液ｐＨ７．４，０．９（Ｗ／Ｖ）％塩化ナト
リウム，０．０５（Ｖ／Ｖ）％ポリオキシエチレンソル
ビタンモノラウレート含有）１００μｌを各穴に分注
し、マイクロプレート用攪拌器で１分間攪拌した後、室
温で３０分間静置した。静置後、マイクロプレートを逆
さまにして、各穴に分注した液を除去し、０．９（Ｗ／
Ｖ）％塩化ナトリウム水溶液３００μｌを各穴に分注
し、マイクロプレート用攪拌器で１分間攪拌した後、上
記操作に従って液を除去した。この操作を５回繰り返し
た後、十分に穴内の残液を除去した。次に、ペルオキシ
ダーゼの発色剤であるオルトフェニレンジアミン溶液
（１ｍｇ／ｍｌ，５０ミリモル／リットル リン酸クエ
ン酸緩衝液ｐＨ４．８，０．５μｌ／ｍｌ過酸化水素水
含有）５０μｌを各穴に分注し、マイクロプレート用攪
拌器で１分間攪拌した後、暗所、室温で２０分間静置し
た。引き続いて、４モル／リットル 硫酸水溶液を各穴
に分注することにより反応を停止し、マイクロプレート
用攪拌器で１分間攪拌した後、マイクロプレート用吸光
度測定器で吸収波長４９２ｎｍの吸光度を測定した。

【００２８】吸光度測定値とヒトラクトフェリン濃度
の関係図作成 本発明の希釈保存液で調製した標準水溶液と本発明の希
釈保存液（測定ブランク）の吸光度測定値を用い、吸光
度測定値とヒトラクトフェリン濃度の関係図（横軸：ヒ
トラクトフェリン濃度、縦軸：吸光度測定値）を作成し
た。測定試料のヒトラクトフェリン濃度は、の操作に
よる測定試料の吸光度測定値をこの関係図に当てはめて
読み取った。希釈倍率（１０，０００倍希釈）を換算し
た涙液中のヒトラクトフェリン濃度は、２．３ｍｇ／ｍ
ｌであった。

【００２９】（実施例３）標準水溶液の経時的変化比較 希釈保存液として従来の一般的な物理吸着の防止方法で
ある１（Ｗ／Ｖ）％牛血清アルブミン水溶液を用いる方
法と本発明の希釈保存液を用いる方法で、水溶液中ラク
トフェリン濃度を安定に保てる程度を比較した。

【００３０】すなわち、実施例２のの本発明の希釈保
存液で調製した標準水溶液、および牛血清アルブミン水
溶液で調製した標準水溶液を冷蔵で７日間保管した。
尚、いずれの標準水溶液もガラス製の容器に入れて保管
したものである。

【００３１】冷蔵保管した両標準水溶液は、使用時調製
した該両標準水溶液と共に、実施例２の酵素免疫測定法
で吸光度を測定した。表１は、上記操作により得られた
吸光度測定値とヒトラクトフェリン濃度の関係を示して
いる。本発明の希釈保存液を用いた標準水溶液では、吸
光度測定値とヒトラクトフェリン濃度の関係に大きな変
化は観られない。しかし、１（Ｗ／Ｖ）％牛血清アルブ
ミンを用いた標準水溶液では、７日保管で吸光度測定値
が使用時調製の１／４程度に低減した。

【００３２】すなわち、本発明の希釈保存液を用いた標
準水溶液は安定であるが、１（Ｗ／Ｖ）％牛血清アルブ
ミンを用いた標準水溶液では、水溶液中のヒトラクトフ
ェリンが容器に吸着してヒトラクトフェリン濃度が低減
した。

【００３３】

【表１】

【００３４】（実施例４）ヤギ由来カゼインを用いた牛
ラクトフェリンの希釈保存液 実施例１で使用する牛由来カゼインをヤギ由来カゼイン
に、実施例２で使用するヤギ由来抗ヒトラクトフェリン
抗体およびペルオキシダーゼ標識ヤギ由来抗ヒトラクト
フェリン抗体を、ウサギ由来抗牛ラクトフェリン抗体お
よびペルオキシダーゼ標識ウサギ由来抗牛ラクトフェリ
ン抗体に替え、実施例１〜３の操作を行った結果、本発
明の希釈保存液を用いた標準水溶液は、吸光度測定値と
牛ラクトフェリン濃度の関係に経時的な変化が観られな
かった。 （実施例５）希釈保存液の牛由来カゼイン濃度の検討 実施例１と同様の手順で０．５（Ｗ／Ｖ）％牛由来カゼ
イン濃度の希釈保存液を調製し、精製水で希釈して下記
表２に示した牛カゼイン濃度に希釈した。そして、各液
を用いてヒトラクトフェリン濃度が５０ｎｇ／ｍｌのヒ
トラクトフェリン水溶液を調製し、ガラス製とプラスチ
ック（ポリプロピレン）製容器に分注して冷蔵７日間保
管した。冷蔵保管後の各水溶液のヒトラクトフェリン濃
度は、使用時調製した標準水溶液を基準に、実施例２の
酵素免疫測定法で測定した。

【００３５】表２は、冷蔵７日間保管した該水溶液のラ
クトフェリン濃度算出値と希釈保存液の牛カゼイン濃度
との関係を示している。すなわち、冷蔵保管した各水溶
液のヒトラクトフェリン濃度は、ガラス製容器でカゼイ
ン濃度０．０１（Ｗ／Ｖ）％以上、プラスチック製容器
でカゼイン濃度０．００１（Ｗ／Ｖ）％以上で安定に保
たれていることが確認できた。よって、使用する容器の
材質に合わせて希釈保存液として０．００１（Ｗ／Ｖ）
％以上の適当なカゼイン濃度を選択すれば、溶液中のラ
クトフェリン濃度を安定に保つことができることが分か
る。

【００３６】

【表２】

【００３７】

【発明の効果】本発明のラクトフェリンの希釈保存液
は、容器へのラクトフェリンの物理吸着を防止するの
で、ラクトフェリン水溶液のラクトフェリン濃度を安定
に保つことができる。このことにより、ラクトフェリン
濃度が安定な標準水溶液が得られるので、測定時毎に標
準水溶液の調製を行う必要が無くなり、測定操作を大幅
に簡易化することができる。また、血液や涙液等の測定
試料を本発明の希釈保存液に添加・希釈することによ
り、測定試料中のラクトフェリンが経時的に保存容器に
物理吸着することが無くなるので、採取から時間を経て
も、測定試料の正しいラクトフェリン濃度を定量するこ
とができる。

【００３８】以上のように、本発明のラクトフェリンの
希釈保存液により、初めて簡易に、正しくラクトフェリ
ン濃度が定量できるようになる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 水とカゼインを少なくとも含有してお
   り、カゼイン濃度が０．００１〜１５（Ｗ／Ｖ）％であ
   ることを特徴とするラクトフェリンの希釈保存液。
2. 【請求項２】 希釈保存液のｐＨが５．０〜９．０であ
   る請求項１に記載のラクトフェリンの希釈保存液。