CN111763712A - 一种使用辣根过氧化物酶定量检测双链dna扩增产物的方法 - Google Patents

一种使用辣根过氧化物酶定量检测双链dna扩增产物的方法 Download PDF

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张道虹
李超灿
王雨菲
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Abstract

本发明涉及一种检测方法，具体涉及一种使用辣根过氧化物酶定量检测双链DNA扩增产物的方法。其特点为，使用生物素修饰的引物进行特定DNA序列的扩增，利用中性亲和素捕获扩增产物，并使用链霉亲合素‑辣根过氧化物进行标记，结果由辣根过氧化物酶的底物试剂进行检测，表现为颜色变化或化学发光。本发明方法便于操作，适用于环境、食品安全、或人体血液/血清中的特定DNA序列的定量检测，结果可通过肉眼观察，或拍照并进行定量分析。

Description

一种使用辣根过氧化物酶定量检测双链DNA扩增产物的方法
技术领域
本发明用于环境、食品安全、或人体血液/血清中的特定DNA序列的定量检测。
背景技术
DNA是生物体内的遗传信息携带者，因此DNA非常稳定，并具有高度辨识性，是作为物种检测的一个强大的工具。而在DNA样品量比较少的时候，可采用DNA扩增手段，将目标DNA序列进行复制。该方法可信度高，能够极大程度上提高检测限，因此被广泛应用于医疗、食品、生物安全等行业。
最常用的DNA扩增技术，如聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)，能够将目标DNA序列数量扩增106倍以上，该DNA扩增结果通常使用DNA凝胶电泳进行定性或半定量检测，在各个领域都有非常广泛的应用。随着DNA扩增技术的发展，也可使用荧光标记进行DNA扩增产物的实时定量(即实时定量荧光PCR，real-time PCR)，但该方法需要特殊仪器在进行DNA扩增的同时观测荧光数据，该仪器价格昂贵，其中的一些方法需要特殊的DNA引物设计(如使用Taqman探针)，材料价格高昂。
发明内容(目的、技术路线和发明效果)
本发明的目的在于联合现有的DNA扩增技术，只在引物上加入生物素，就可以使用96孔板对特定DNA序列的双链扩增产物进行定量检测。目标物由辣根过氧化物酶进行标记，结果由辣根过氧化物酶的底物试剂进行检测，表现为颜色变化或化学发光，可进行拍照分析，无需使用大型仪器。
本发明的技术方案概述如下：
一种使用辣根过氧化物酶定量检测双链DNA扩增产物的方法，包括如下步骤：
(1)合成有生物素标记的上游引物、上游引物互补链和下游引物，并利用该引物进行DNA扩增；
(2)在96孔板中加入0.1mg/mL的中性亲和素50μL，在4摄氏度反应过夜；
(3)倒出溶液并清洗96孔板，加入1％奶粉150μL，室温反应1小时；
(4)倒出溶液并清洗96孔板，加入双生物素短DNA双链(0-400nM，至少四个点)及DNA扩增产物(不同稀释倍数)各50μL；每个浓度做三次重复实验；室温反应2小时；
(5)倒出溶液并清洗96孔板，加入链霉素亲和素-辣根过氧化物酶50μL，室温反应2小时；
(6)倒出溶液并清洗96孔板，加入显色液；
(7)中止反应，进行结果读取，或拍照进行颜色分析。
所述显色液可以为TMB、DAB等不同辣根过氧化物酶的显色试剂。
本发明的优点：
1、利用已有的DNA扩增技术，无需重新设计引物序列和改变操作步骤；
2、检测成本低廉，操作简单；
3、结果可拍照分析，无需大型仪器；
4、能够对DNA扩增产物进行定性和定量分析。
附图说明
图1为采用本方法分析短DNA目标的标准曲线和计算结果。
具体实施方式
实施例1：
对随机双链短DNA模板扩增产物进行分析，包括如下步骤：
(1)合成引物、互补链、短DNA模板和短DNA模板互补链，序列如下表所示：
Figure BSA0000181324720000021
(2)DNA扩增：
0.2mL离心管中的各试剂初始浓度为：dNTP mix(0.2mM)；上游引物(0.5μM)；下游引物(0.5μM)；双链短DNA模板含量(即短DNA模板与短DNA模板互补链杂交得到的双链DNA，1管PCR试剂中含量为1.0ng)；Mg2+(1.5mM)；Taq酶(0.05U)；加ddH2O至50μL。
扩增步骤为：预变性1分钟(95℃)，30个循环(95℃反应15秒，55℃反应30秒，72℃反应30秒)，最后延伸5分钟(72℃)，扩增产物保存在4℃；
(3)在96孔板中加入0.1mg/mL的中性亲和素50μL，在4摄氏度反应过夜；
(4)倒出溶液并清洗96孔板，加入1％奶粉150μL，室温反应1小时；
(5)将上游引物与互补链进行DNA杂交，形成双生物素短DNA双链；
(6)倒出溶液并清洗96孔板，加入双生物素短DNA双链(浓度分别为0，10，20，30，40，100，200，400nM)及DNA扩增产物(1∶10，1∶100和1∶1000稀释)各50μL；每个样品做三次重复实验；室温反应2小时
(7)倒出溶液并清洗96孔板，加入链霉素亲和素-辣根过氧化物酶(1*)50μL，室温反应2小时；
(8)倒出溶液并清洗96孔板，加入TMB显色液；
(9)中止反应，并使用酶标仪在450nm测定吸光度。
(10)根据标准曲线和样品的吸光度，计算双链短DNA模板扩增产物的浓度：得到的标准曲线为y＝0.059x-0.424；由于双链短DNA模板扩增产物(1∶10，1∶100和1∶1000)吸光度分别为2.12，1.63和0.07，计算1∶100稀释的扩增产物浓度为34.8nM，因此该双链短DNA模板扩增产物浓度为3.48μM，即69.6ng/μL(相对分子量20kDa)。
上述实施例仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，凡在本发明的原则之内，所做的任何修改和变化，均在本发明的保护范围之内。
所述显色液可以为TMB、DAB等不同辣根过氧化物酶的显色试剂。

Claims (3)

1.一种使用辣根过氧化物酶定量检测双链DNA扩增产物的方法，其特征在于在DNA扩增中引入生物素，对特定扩增产物进行辣根过氧化物酶标记，从而定量检测。
2.如权利要求1所述一种使用辣根过氧化物酶定量检测双链DNA扩增产物的方法，其特征在于：
(1)使用生物素修饰的引物进行DNA特定序列的扩增，得到具有两个生物素的双链DNA扩增产物，利用生物素-中性亲和素/链霉素亲和素的高亲和力，一个生物素用于DNA捕获，另一个用于辣根过氧化物酶标记；
(2)该辣根过氧化物酶标记可由不同试剂进行检测，如TMB显色液、DAB显色液等。
3.如权利要求1或2所述的所述一种使用辣根过氧化物酶定量检测双链DNA扩增产物的方法，其特征在于：它由以下步骤组成：
(1)使用生物素标记的上游和下游引物进行DNA扩增；
(2)在96孔板中加入0.1mg/mL的中性亲和素50μL，在4摄氏度反应过夜；
(3)倒出溶液并清洗96孔板，加入1％奶粉150μL，室温反应1小时；
(4)倒出溶液并清洗96孔板，加入双生物素短DNA双链(0-400nM，至少四个点)及DNA扩增产物(不同稀释倍数)各50μL；每个浓度做三次重复实验；室温反应2小时；
(5)倒出溶液并清洗96孔板，加入链霉素亲和素-辣根过氧化物酶50μL，室温反应2小时；
(6)倒出溶液并清洗96孔板，加入显色液；
(7)中止反应，进行结果读取，或拍照进行颜色分析。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995006753A1 (en) * 1993-09-03 1995-03-09 The United States of America, represented by The Secretary, Department of Health & Human Services Method and compositions for primer specific solid-phase detection of pcr products
CN107356642A (zh) * 2017-07-27 2017-11-17 西安交通大学 一种基于双标记扩增的血浆循环甲基化dna电化学检测方法及试剂盒
CN108444992A (zh) * 2018-02-09 2018-08-24 河南工业大学 一种黄曲霉毒素定量检测试剂盒及其检测方法

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